PT85826B - Moleculas paratopicas monoclonais e processo de ensaio de apolipoproteina a-i e hibridomas produtores das referidas celulas - Google Patents

Description

presente invento refere-se à apolipoproteína A-I e, em particular aos hibridomas e a moléculas paratópicas monoclonais para determinação da apolipoproteína A-I numa amostra líquida, bem como a um processo de diagnóstico e sistema para re alizar a referida determinação.

Antecedentes do Invento

A. Aterosclerose e Lipoproteínas

A aterosclerose é uma doença na qual o colesterol e outros lípidos, acumulando-se nas paredes das artérias formam placas volumosas que inibem o fluxo do sangue e podem conduzir à formação de um coágulo que pode obstruir uma artéria e provo, car uma doença embólica ou trombótica como o ataque cardíaco ou apoplexia. Cerca de 50% de todas as mortes nos Estados Uni, dos são causadas pela aterosclerose e pelas suas complicações secundárias.

A aterosclerose humana é definida como a acumulação de dje terminados lípidos, incluindo o colesterol, e de células nas paredes das artérias, que com o tempo produzem lesões oclusivas. Ainda que a etiologia da aterosclerose seja devida a múltiplos factores, um vasto campo de provas clínicas, patológicas, gené ticas e experimentais sugerem que as anormalidades do metabolismo das lipoproteínas podem contribuir para □ desenvolvimento da aterosclerose. Estes lípidos são transportados na correji te sanguínea sob a forma de complexos lípido-proteína chamados lipoproteínas.

A aterosclerose e em particular a forma conhecida por dei ença das artérias coronárias (CAD = coronary artery disease) é um problema grave da saúde. A aterosclerose e as doenças vasculares com ela relacionadas foram responsáveis por 983.000 mortes em 1983; a CAD sozinha é responsável por mais mortes anualmente que todas as formas juntas de cancro. Nos Estados

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-4Unidos mais de um milhão de ataques de coração ocorrem em cada ano e mais de 500.000 pessoas morrem em resultado desta doença. Em matéria de custos de cuidados de saúde directos, a CAD custa, aos Estados Unidos, mais de 60 biliões de dólares por ano. Esta enorme perda tem chamado a atenção para os processos de identificar populações particularmente em risco de CAD de modo a que esta doença possa ser controlada com dietas, modificação do comportamento (exercício) e agentes terapêuticos específicos.

Devido à grande implicação do colesterol na CAD, aquela molécula e as suas proteínas plasmáticas associadas, têm sido intensamente estudadas. Foram definidas quatro classes princi pais de partículas de lipoproteínas plasmáticas associadas ao colesterol que têm a sua origem no intestino ou no fígado. Es_ tas partículas estão envolvidas no transporte de lípidos neutros incluindo o colesterol e os triglicéridos. Todos os tipos de lipoproteínas plasmáticas têm apolipoproteínas associadas com o complexo lípido-proteína; e as apolipoproteínas desempenham um papel especial na função destas lipoproteínas.

primeiro tipo ou classe é o dos quilomicrons. Eles constituem a maior parte das lipoproteínas e são ricos em triglicéridos. 0 local de origem dos quilomicrons é o intestino.

Apesar das apolipoproteínas estarem numa proporção quanti tativa pequena em relação à massa dos quilomicrons, as apolipo. proteínas A-I, A-II e A-IV têm sido referidas como significati vamente associadas aos quilomicrons e verificou-se a síntese intestinal destas apolipoproteínas A. Os quilomicrons também contêm apolipoproteína Β-4Θ. Quando se expõem in vitro quilomícrons ao plasma ou a lipoproteínas de elevada densidade (HDL), perde-se grande parte do complemento quilomícron das apolipoproteínas A e adquirem-se apolipoproteínas C e E. A produção intestinal das apolipoproteínas A (apo A) pode ser r_e guiada por factores diferentes da absorção de gorduras e da formação de quilomicrons.

segundo tipo ou classe de lipoproteínas é o das lipoproteínas de muito baixa densidade, VLDL (very Iouj density li66 716

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-5poproteins). A partícula VLDL está envolvida no metabolismo dos triglicéridos e no transporte destes lípidos a partir do fígado. As apolipoproteínas apo B-100 e apo-E são as principais constituintes da partícula VLDL.

A terceira lipoproteína é chamada lipoproteína de baixa densidade (LDL - low density lipoprotein) e é um produto específico do catabolismo da VLDL. A apolipoproteína predominante na partícula LDL è a apolipoproteína B-100 ou apo B-100.

Os resultados do já clássico estudo de Framingham (1971) mostraram uma nítida correlação entre o risco de CAD e os níveis de colesterol no soro. Este estudo também demonstrou que os elevados níveis de colesterol na lipoproteína de baixa densidade (LDL) estão associados com o aumento de risco de CAD. Um estudo recente da Lipid Research Clinics Coronary Primary Prevention Trial (1984·) demonstrou que os níveis de colesterol e de colesterol LDL no plasma podem ser reduzidos por um regime combinado de drogas e de dieta e que esta redução do colesterol no plasma resulta numa redução da incidência da mortalidade por CAD.

A LDL é a lipoproteína com mais colesterol no plasma. A LDL é uma partícula esférica grande cujo núcleo oleoso é composto por cerca de 1500 moléculas de colesterol, estando cada uma ligada por uma ligação éster a um ácido gordo de cadeia longa. Este núcleo de ésteres de colesterilo está encerrado numa camada de fosfolípido, de moléculas de colesterol não esterificadas e uma só molécula de apolipoproteína B-100. Os fosfolípidos estão dispostos de modo a que os terminais hidrofílicos fiquem virados para o exterior, permitindo que a LDL esteja em suspensão hidratada no sangue ou nos fluidos extrace lulares.

colesterol passa para as células no LDL via um receptor de LDL específico e é libertado das partículas de LDL em lisosso mas onde pode controlar o metabolismo do colesterol das células. Uma acumulação de colesterol intracelular modula três processos:

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-6Primeiro, reduz a capacidade da célula de produzir o seu próprio colesterol ao eliminar a síntese de uma enzima, a HMG CoA redutase, que catalisa um passo do processo da biossíntese do colesterol. A supressão da enzima deixa a célula dependente do colesterol externo derivado da tomada de LDL, mediada por receptor.

Em segundo lugar, a entrada de colesterol derivado da LDL promove a armazenagem de colesterol nas células por activ£ ção de uma enzima denominada lipoproteína aciltransferase. Es. te enzima esterifica os ácidos gordos em excesso em relação às moléculas de colesterol, produzindo ésteres de colesterilo que são depositados em armazenagem como gotículas.

Em terceiro lugar, e o mais significativo, a acumulação de colesterol dentro da célula conduz a um mecanismo de retroalimentação que faz com que a célula pare de sintetizar novos receptores de LDL. Assim as células ajustam o seu complemente de receptores externos de modo a que seja levado às células c.o lesterol suficiente para satisfazer variadas necessidades das células mas não em quantidade tal que as sobrecarregue. Por exemplo, os fibroblastos, que se estão dividindo activamente, de modo que é necessário novo material de membrana, mantêm um complemento máximo de receptores de LDL de cerca de 40.000 por célula. Em células que não estejam em crescimento, o colesterol entrado começa a acumular-se, o sistema de retroalimentação reduz a produção de receptores e o complemento de receptores é reduzido até cerca de 10 vezes.

Por outro lado, verificou-se que uma outra lipoproteína circulante, a partícula de lipoproteína de elevada densidade (HDL) está implicada no estado de colesterol elevado associado a um risco de aterosclerose inferior. A apolipoproteína A-I é uma proteína estrutural e o ligando da partícula HDL. A quantidade de HDL determina uma correlação inversa com a incidência de aterosclerose prevista.

A lipoproteína de elevada densidade (HDL) contém duas ap£ lipoproteínas principais, a apolipoproteína A-I (apo A-I) e a apolipoproteína A—II (apo A-Il). A apolipoproteína A-I é o com

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-7ponente proteico principal de todas as HDL. Todas as partículas HDL contêm apo A-I e portanto a imunoquantificação das HDL envolve usualmente a quantificação da apo A-I. Cerca de 80% das partículas de HDL também contêm apo A—II, mas ainda não fo ram descritas partículas HDL contendo apenas apo Α-Π.

Uma função da apo A-I é a activação do enzima do plasma, a lecitina-colesterol-aciltransferase (LCAT). Este enzima é necessário para esterificar o colesterol livre da HDL para transporte para o fígado. Na ausência da apo A-I, o colesterol do sangue não é esterificado e portanto o colesterol não é eli. minado do sangue. 0 papel específico da apo A-II no metabolis mo da HDL não foi ainda definido.

Muitos estudos mostraram que os níveis elevados da HDL estão relacionados com uma incidência reduzida da CAD.

Alguns autores sugeriram que a HDL remove o colesterol dos locais periféricos, como as paredes das artérias, atribuín do portanto à HDL propriedades anti-aterogénicas. Concentrações mais elevadas do colesterol da HDL estão correlacionadas com um metabolismo dos lípidos relativamente normal e com uma incidência mais baixa e/ou uma menor gravidade da doença cardiovascular, enquanto que elevados níveis de colesterol da LDL estão associados com um metabolismo de lípidos anormal e um risco maior de CAD. Para o tratamento adequado de pacientes com hiperlipidémia (excesso de lípidos no sangue) e de pacientes em risco especial de CAD, é frequentemente desejável detejr minar os níveis de colesterol da LDL e da HDL. Até agora as avaliações do colesterol da HDL têm-se mostrado trabalhosas e imprecisas na determinação dos níveis de HDL no sangue.

B. Estrutura e Função da Lipoproteína z

E importante entender que o colesterol não existe no plasma no estado livre mas sim transportado pelas lipoproteínas para os tecidos do corpo. 0 colesterol pode ser obtido a partir da síntese celular directa ou por dieta. 0 colesterol pode contudo ser removido do hospedeiro somente através do fígado onde é convertido em ácidos da bílis e excretado.

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-8Os quilomícrons transportam colesterol e triglicéridos para o fígado para subsequente processamento enquanto que a LDL envia o colesterol para tecidos extrahepáticos, incluindo as artérias coronárias. Assim, a lipoproteína LDL/apo B está envolvida no fenómeno da deposição de colesterol mau” em teci, dos periféricos. De modo oposto, a lipoproteína HDL/apo A retira o colesterol bom dos tecidos e envia o colesterol para o fígado para o excretar.

Ao longo dos tempos têm sido desenvolvidos muitos sistemas para isolar e caracterizar as lipoproteínas. Estas técnicas baseiam-se geralmente nas propriedades físico-químicas das partículas de lipoproteínas. As duas técnicas mais frequentemente usadas são a ultracentrifugação e a electroforese.

A ultracentrifugação de gradiente de densidade diferenci. al tira vantagem do facto das lipoproteínas serem mais leves ou menos densas do que outras proteínas do plasma e é relativa mente fácil, ainda que demorado e trabalhoso, separar quilomícrons (as proteínas mais leves), VLDL, LDL e HDL uns dos outros. As técnicas de electroforese têm sido úteis na classifi cação de pacientes com hiperlipidémias. Estas técnicas não são contudo fáceis de realizar num laboratório clínico vulgar.

Pode também ver-se que a simples quantificação do colesterol e dos triglicéridos do sangue, não dá ao médico informação sobre quais as lipoproteínas que conduzem estes lípidos e a sua quantificação.

C. Lipoproteínas do Plasma

Foram definidas quatro classes principais de lipoproteínas do plasma, isto é, quilomícrons, VLDL, LDL e HDL e existem, sem dúvida, subclasses dentro delas. Todas as lipoproteínas têm a sua origem no intestino ou no fígado ou em ambos, e pare cem ter uma estrutura pseudomicelar. Os lípidos neutros e em particular os ésteres de colesterol e os triglicéridos, são mantidos no núcleo das lipoproteínas numa forma solúvel e está vel por meio de interacções com os constituintes polares de su perfície, apolipoproteínas e fosfolípidos.

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-9Também está presente nestes complexos colesterol não esterificado. A sua polaridade situa-se entre a dos lípidos neu. tros (ésteres de colesterilo e triglicéridos) e a das apolipoproteínas e fosfolípidos mais polares, e encontra-se tanto no núcleo como na superfície.

Uma superfície exterior constituída por apolipoproteínas, colesterol não esterificado e por fosfolípidos, envolve o núcleo insolúvel em água,de ésteres de colesterilo e de triglicéridos, protegendo os lípidos apoiares do meio aquoso. Este conceito estrutural geral tem sido apoiado por estudos de dispersão de raios X de baixo ângulo e por outros métodos físicos em que se têm usado diversos tipos de sondas para explorar a estrutura das lipoproteínas. Assim, uma função importante das lipoproteínas do plasma é a solubilização e transporte de lípidos do plasma neutro.

D. Apolipoproteínas

As apolipoproteínas são os componentes proteicos, isentos de lípidos, das lipoproteínas do plasma, obtidos por trata mento com solventes orgânicos, detergentes e agentes caotrópicos de lipoproteínas intactas isoladas. Nem todas as proteínas capturadas com lipoproteínas têm necessariamente um papel a desempenhar no transporte de lípidos. Um exemplo pertinente é o reconhecimento recente de que as proteínas A do soro amiloide, reagentes de fase aguda, são transportadas no plasma li gadas a HDL. Estas proteínas de baixo peso molecular podem incluir até 30% de apo-HDL em estados inflamatórios, mas é duvidoso que possuam funções específicas de transporte de lípidos .

A apolipoproteína A-I (apo A-I) presente nas partículas HDL, é a proteína que interessa ao presente invento. A apo A-I é considerada seguir.

A apo A-I que é o principal componente proteico de todas as HDL primitivas, está presente em todas as partículas HDL e há várias, isto é cerca de 7-8, moléculas apo A-I por partícula de HDL. Verificou-se estar presente em quantidades relati66 716

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vamente menores nos quilomicrons, ULDL e LDL, ao passo que constitui cerca de 60-80% da proteína da HDL,

A apo-I consiste numa única cadeia de 243 a 245 resíduos; não contém cistina, cisteína, leucina ou hidratos de carbono; e existem vários isomorfos. A apo A-I apresenta-se com um teor de cerca de 55% de hélice <X no estado isento de lípidos, que aumenta até 75% após ligação a fosfolípidos. 3á foram identificados nesta apolipoproteína ciclos em hélice repetidos de 11 resíduos. Tem-se sugerido que estas unidades representam uma única cadeia ancestral que, por duplicação de genes, gerou uma unidade de repetição com 22 resíduos. Estas unidades apresentam uma estreita homologia sequencial e crê-se que representam as regiões da proteína de ligação aos lípidos.

Como anteriormente se disse, a apo A-I é um potente acti vador do LCAT, uma enzima do plasma que catalisa a conversão do colesterol e da fosfatidilcolina em éster de colesterilo e lisofosfatidilcolina, respectivamente. Verificou-se que as regiões da apo A-I de ligação específica aos lípidos activam o LCAT, tendo esta actividade sido associada com a propriedade de ligação de lípidos. Como já se fez notar, o fígado e o intestino sintetizam a apo A-I, mas ainda não foram bem definidas as suas contribuições relativas no teor do plasma total nem nos factores que modulam a produção de apo A-I.

Tipicamente mais de cerca de 90% da apo A-I do plasma es. tá associada à HDL, menos de cerca de 1% à VLDL e LDL e cerca de 10% ou menos está associada à fracção do plasma isenta de lipoproteínas. As quantidades de apo A-I em cada tipo de partícula diferem das referidas pelos dados e parecem ser função das técnicas usadas na separação das partículas.

A medição da apo-I, principal constituinte proteico da HDL, é importante sob o ponto de vista clínico. Os resultados de vários estudos demonstraram que os níveis de apo A-I estão diminuídos em pacientes com CAD. Esta observação reforça o pa pel protector da apo A-I do plasma nesse grupo de pacientes.

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-11Os resultados de diversos estudos sugerem que medindo com precisão o nível da apo A-I é possível predizer uma prognose individual em relação a metabolismo de lípidos anormal, ateros clerose e, especificamente, em relação à CAD. Contudo a quantidade de apo A-I sozinha não pode ser utilizada como marcadora de metabolismo de lípidos anormal, especialmente por dificuldades no rigor e precisão da medição. Assim, e ainda que os níveis relativamente elevados de apo A-I tendo de estar relacionados com o metabolismo de lípidos normal e com níveis de metabolismo de lípidos anormal e de CAD relativamente baixos, ainda não foi estabelecida uma linha de demarcação nítida entre pessoas normais e as que sofrem de CAD.

Como anteriormente se disse, tem-se verificado ser extre mamente difícil quantificar, apurada e precisamente, a apo A-I num sistema de imunoensaio clinicamente útil, como o radio-imu noensaio (RIA), o electro-imunoensaio (EIA), o imunoensaio por ligação a uma enzima (ELISA), por imunodifusão radial (RID) ou por imunonefelometria (INA). Ver por exemplo o Quadro 1 de Steinberg et al. (1983) Clin. Chem. 29/3:415-426 quanto à vari ância de valores obtidos por várias técnicas.

Uma das razões alegadas para estas dificuldades analíticas é que a molécula da apolipoproteína A-I está presente no plasma e soro como parte de uma partícula bioquimicamente hete rogénea grande na qual alguns dos locais antigénicos das moléculas (epitopos) estão escondidos e marcados. Como consequência, vários autores utilizaram tratamentos para desmascarar” as suas amostras de modo a que os epitopos normalmente escondi dos sejam desmascarados” e se tornem disponíveis para uma imu no-reacção.

Steinberg et al. (1983), Clin. Chem. 29:415-426 também discutem o desmascarar de epitopos por tratamento de uma amostra de sangue, como plasma ou soro, com agentes desnaturar) tes como a ureia, a tetrametilureia e a guanidina, agentes teri sioactivos como o dodecilsulfato de sódio e o monolaurato de sorbitano e de polioxietileno (20), (Tiueen 20), aquecendo por exemplo a 523C durante 3 horas e a 37QC durante 2 horas e solventes orgânicos deslipidisantes como misturas de etanol e

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-12éter dietílico, metanol e éter dietílico, clorofórmio e metanol, e semelhantes. Outros tratamentos para desmascarar, es. pecíficos, podem ser encontrados nos trabalhos de Maciejko et al. (1982) Clin. Chem. 28:199-204 (agentes tensioactivos); de Koren et al. (1985) Clin. Chim. Acta 147:85-95 (solventes orgjâ nicos); e de Bury et al. (1985) Clin. Chem. 31:247-251 (379C, 2 horas).

Alguns dos referidos autores e outros também utilizaram preparações de anticorpos policlonais para ajudar a evitar a heterogeneidade aparente da apo A-I tal como existe no plasma e soro: Maciejko et al. (1982) Clin. Chem. 28:199-204; Koren et al. (1985) Clin. Chim. Acta 147:85-95; Bury et al. (1985) Clin. Chem. 31:247-251; e Fesmire et al. (1984) Clin. Chem.

β .30:712-716. E claro que o uso de anticorpos policlonais em imu noensaiosquantitativos, clinicamente úteis, traz consigo o inconveniente de diferenças na actividade dos anticorpos, preseji tes nos soros de vários animais e também diferenças de imunoes. pecificidade dos soros de diferentes lotes.

Além disso, Kottke et al. (1986) Mayo Clin. Proc. 61:313-320 mediu, como variáveis, os níveis das apolipoproteínas A-I, A-II e B, colesterol de HDL, triglicéridos e idades em machos e verificou serem necessárias todas estas seis variáveis para correctamente distinguir os pacientes com CAD dos controlos as. sintomáticos. Estes autores utilizaram radio-imunoensaios para as suas determinações.

Kottke et al. utilizaram anticorpos policlonais, um tempo de manutenção de 16 horas da amostra com anticorpo e um trai tamento com detergente para desmascarar, para medir, por RIA, os valores de apo A-I. Utilizaram um anticorpo monoclonal pague ra medir, por RIA, a apo B. Kottke et al. referem/os valores médios de apo A-I em pessoas normais e em pacientes com CAD não ultrapassavam um desvio padrão.

Por outro lado, àparte as moléculas paratópicas monoclonais aqui utilizadas, nenhum outro autor descreveu anticorpos monoclonais que imunorreajam de modo substancialmente igual com partículas de HDL e de apo A-I, bem como imunorreajam com

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-13praticamente toda a apo A-I presente na amostra, Curtiss et al. (1985) 0. Biol. Chem. 200:2982-2998 descreveram um anticorpo mo noclonal, designado por A-I-7 que imunorreagia quase igualmente com a apo A-I e a HDL mas que apenas era capaz de imunoprecipj. tar cerca de 60% da HDL ou apo A-I radio-marcadas, que se sabia estarem presentes nas amostras avaliadas.

Moléculas Paratópicas Monoclonais como Reagentes para a Apo A-I uso de anticorpos monoclonais ou das suas porções com locais de combinação com anticorpos, isto é, moléculas paratópicas, como reagentes para avaliar a presença da apo A-I em amostras de sangue humano, é atraente porque, uma vez obtidos, estes reagentes podem ser produzidos em quantidades relativamente grandes com qualidade consistente, e assim evitam o problema da inconsistência associado aos anticorpos policlcnais. Existem porém certos factores que são contra o uso de uma molé cuia paratópica monoclonal em particular, como componente nestes sistemas de avaliação.

Usando um anticorpo monoclonal como exemplo de uma molécula paratópica monoclonal, a arte diz que um anticorpo monoclonal pode ser demasiado imunoespecífico para ser útil, devido à heterogeneidade antigénica do seu antígeno alvo. Por exem pio, a especificidade de anti-soros contendo anticorpos policlonais convencionais depende de um consenso de centenas de mi lhar de anticorpos diferentes que se ligam a determinantes antigénicos, cobrindo a maior parte ou toda a proteína antigénica, como se tem mostrado útil nos ensaios para apo A-I. Em re sultado disso, as pequenas alterações na estrutura do antígeno devidas a polimorfismo genético, heterogeneidade de glicosilação ou a ligeira desnaturação ou a outra reacção, terão usualmente um efeito pequeno na ligação dos anticorpos policlonais. De modo análogo um subconjunto, maior ou menor, de anticorpos de anti-soros policlonais, ligar-se-ão usualmente a antígenos que se tenham modificado ou desnaturado.

Pelo contrário, os anticorpos monoclonais ligam-se usual.

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-14mente a um determinante antigénico (epítopo) na molécula do a_n tígeno. Se, por qualquer razão, esse determinante for alterado, o anticorpo pode ou não continuar a ligar-se. Se isto é um problema ou uma vantagem dependerá de circunstâncias individuais. Se, como no caso presente, o anticorpo monoclonal for usado para um ensaio de diagnóstico de uma apolipoproteína, uma pequena variação antigénica nessa proteína poderia provocar graves erros.

Em segundo lugar, devido à sua especificidade única, o sucesso do uso de um anticorpo monoclonal (Mab)é frequentemente dependente da sua afinidade para o antígeno alvo. Por exem pio, enquanto que o Mab pode ter afinidade suficiente para ser útil na ligação de antigenos em fase líquida e sólida quando o próprio Mab se encontra em fase líquida, esse mesmo anticorpo pode não ser útil como anticorpo ligado a fase sólida por sua vez útil na ligação e retenção do antígeno de uma solução.

Os problemas acima referidos são inerentes ao uso de anticorpos monoclonais. Os peritos na arte reconheceram portanto que era essencial testar e caracterizar os anticorpos monoclonais em qualquer sistema de ensaio em que sejam usados. Ver Goding, 3 ames W., Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, Academic Press, Nova Iorque (1983), pag. 40-46.

Breve Sumário do Invento presente invento trata de hibridomas e de moléculas pa ratópicas monoclonais segregadas pelos hibridomas que reagem imunologicamente com a apolipoproteína A-I bem como de processos de ensaio da presença da apolipoproteína A-I ou de HDL numa amostra líquida, e de um sistema de diagnóstico tipicamente sob a forma de conjunto útil na realização dos processos de ejn saio, particularmente numa amostra líquida de sangue.

Assim, um aspecto do invento refere-se a um hibridoma es.

colhido de entre os do grupo de hibridomas com Números de Aces. so ATCC HB 9200, HB 9201, HB 9202, HB 9203 e HB 9204. 0 inven to trata ainda de moléculas paratópicas monoclonais, segregadas por cada um daqueles hibridomas, e que reagem com a apoli-

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-15poproteína A-I. Estas moléculas paratâpicas monoclonais são de preferência anticorpos monoclonais completos.

Um outro aspecto do invento é um processo de ensaio para a presença da apolipoproteína A-I numa amostra líquida. Este processo compreende os passos de misturar uma amostra líquida a ser ensaiada com uma quantidade eficaz de uma das 5 moléculas paratâpicas monoclonais acima mencionadas, formando uma mistura. Esta mistura é mantida sob condições de ensaio biológico durante um periodo de tempo predeterminado e suficiente para que as moléculas paratâpicas imunorreajam com a apolipoproteína A-I presente na amostra e formem um imunorreagente. A presença do imunorreagente é depois determinada, determinando-se deste modo a presença de apolipoproteína A-I na amostra original. Nesta concretização do invento as moléculas paratâpicas contêm de preferência como meio indicador um elemerj to radioactivo ligado operativamente, sendo a presença da apolipoproteína A-I na amostra original determinada separando o imunorreagente do resto da mistura e determinando a radiação emitida pelo imunorreagente separado.

Numa outra concretização do processo de ensaio, as moléculas paratópicas monoclonais primeiramente referidas estão li gadas a uma matriz sólida formando um suporte sólido antes da formação da mistura. Os locais de ligação de proteína não específica desse suporte sólido são bloqueados. 0 imunorreagente que se forma após mistura da amostra líquida é ligado ao sjj porte sólido constituindo um imunorreagente ligado a uma fase sólida. Nesta concretização, prefere-se que a presença de um imunorreagente ligado a uma fase sólida seja determinada pelo uso de segundas moléculas paratâpicas monoclonais.

Nesta concretização, as segundas moléculas paratópicas monoclonais em fase líquida são misturadas com a primeira mistura referida acima, formando uma segunda mistura. Estas segundas moléculas paratâpicas imunorreagem com a apolipoproteína A-I e são escolhidas de entre as já referidas moléculas paratâpicas monoclonais mas não são as moléculas utilizadas na primeira mistura referida, nem a imunorreacção das segundas mo

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-16léculas paratópicas monoclonais é substancialmente bloqueada □u inibida pela imunorreacção das moléculas paratópicas primei, ramente referidas. As segundas moléculas paratópicas são operativamente ligadas a um meio indicador que é de preferência, uma enzima.

A segunda mistura assim formada á mantida sob condições de ensaio biológico durante um período de tempo predeterminado, suficiente para que as segundas moléculas paratópicas ligadas ao meio indicador imunorreajam com a apolipoproteína A-I presente na mistura. As fases sólida e líquida formadas após mis tura de ambas as moléculas paratópicas e formação dos imunorre agentes, são separadas e a presença da apolipoproteína A-I ligada ao meio indicador na fase sólida separada, é determinada, determinando-se assim a presença da apolipoproteína A-I na amostra.

As moléculas paratópicas monoclonais do presente invento são também úteis em ensaios quantitativos da apolipoproteína A-I numa amostra líquida, em particular numa amostra de sangue líquido como soro ou plasma. Quando se desejem resultados quantitativos seguem-se passos dum modo geral semelhantes aos acima indicados.

Assim mistura-se uma quantidade conhecida de uma amostra líquida a ser ensaiada, com um suporte sólido que consiste essencialmente numa matriz sólida com primeiras moléculas parató picas monoclonais ligadas à fase sólida que imunorreagem com a apolipoproteína A-I e são segregadas por um dos hibridomas com os Números de Acesso ATCC HB 9200 ou HB 9201, formando uma mis. tura de fases sólida-líquida. Os locais de ligação de proteína não específica na superfície do suporte sólido são bloqueados. Mantém-se a mistura de fases sólida-líquida sob condições de ensaio biológico durante um período de tempo predeterminado, suficiente para que as primeiras moléculas paratópicas imunorreajam com praticamente toda a apolipoproteína A-I presente na amostra.

A apolipoproteína A-I da amostra líquida anterior é depois misturada com as segundas moléculas paratópicas monoclo66 716

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-17nais em fase líquida que imunorreagem com a apolipoproteína A-I, e que são segregadas por um dos hibridomas com os Números de Acesso ATCC HB 9200 ou HB 9201 mas que não são as utilizadas na mistura primeiramente referida e que estão operativamente li gadas a um meio indicador enzimático para formar uma segunda mistura. Assim, as moléculas paratópicas utilizadas neste pas. so são, das duas referidas no primeiro passo de mistura, as que não foram utilizadas.

A segunda mistura assim formada é mantida sob condições de ensaio biológico durante um período de tempo predeterminado, suficiente para que as segundas moléculas paratópicas ligadas ao meio indicador formem um imunorreagente com praticamente to da a apolipoproteína A-I presente nesta amostra. As fases sólida e líquida que resultam das referidas misturas e passos de manutenção são separadas e a quantidade de imunorreagente, cori tendo apolipoproteína A-I ligada ao meio indicador, presente na fase sólida separada é determinada sendo consequentemente deter; minada a quantidade de apolipoproteína A-I na amostra.

Prefere-se especialmente que os dois passos de mistura do processo de ensaio acima referido sejam realizados praticamente ao mesmo tempo e os dois passos de manutenção se realizem conjuntamente. Quando esses passos não se realizam respectivamerj te, praticamente ao mesmo tempo e conjuntamente é preferível que as fases sólida e líquida, presentes no fim do primeiro passo de manutenção, sejam separadas antes da segunda mistura, caso em que a apolipoproteína A-I, utilizada na segunda mistura, é a que está presente no imunorreagente ligado à fase sóli da formado no primeiro passo de manutenção.

Constitui outro aspecto do invento um sistema de diagnós. tico tipicamente em forma de conjunto, adequado à determinação da presença da apolipoproteína A-I numa amostra líquida. Numa concretização do invento, o processo compreende uma embalagem que contém moléculas paratópicas, segregadas por um dos hibridomas anteriormente mencionados, em quantidade suficiente para realizar pelo menos um ensaio. Com maior vantagem o sistema de diagnóstico inclui ainda um meio indicador, operativa e directamente ligado às referidas moléculas paratópicas ou ligado

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I

-18a outras moléculas capazes de assinalar a imunorreacção das mencionadas moléculas paratópicas com a apolipoproteína A-I.

Ainda com maior preferência, o sistema de diagnóstico é adequado à determinação da quantidade de apolipoproteína A-I presente numa amostra de sangue líquido. Esse sistema de diagnóstico compreende uma primeira embalagem contendo um suporte sólido que consiste essencialmente numa matriz sólida com molé cuias paratópicas monoclonais que imunorreagem com a apolipoproteína A-I e que são segregadas por um dos hibridomas, com os números de acesso ATCC HB 9200 ou HB 9201, ligados à matriz sólida. Nesse suporte os locais de ligação de proteínas não es. pecíficas estão bloqueados. Este sistema inclui ainda uma segunda embalagem contendo moléculas paratópicas que imunorreagem com a apolipoproteína A-I, que são segregadas por um dos hibridomas com Números de Acesso ATCC HB 9200 ou HB 9201 mas que não são segregadas pelo hibridoma da primeira embalagem, e que estão operativamente ligadas a um meio indicador enzimático.

presente invento apresenta vários benefícios e vantagens .

Um desses benefícios e vantagens é o de formar reagentes capazes de imunorreagir com praticamente toda a apolipoproteína A-I ou com partículas HDL numa amostra de sangue líquido, como o soro ou o plasma.

Outro benefício e vantagem do presente invento é que, através do uso dessas moléculas paratópicas pode-se fazer uma avaliação qualitativa da presença de apolipoproteína A-I ou HDL.

Ainda outro benefício e vantagem do presente invento é o de através do uso de moléculas paratópicas, especialmente preferidas, segregadas por dois dos hibridomas do invento, poder-se realizar um ensaio muito rigoroso e preciso, para quantifi car a quantidade de apolipoproteína A-I presente numa amostra de sangue.

Ainda outros benefícios e vantagens do presente invento tornar-se-ão evidentes aos peritos na arte, a partir da descri ção pormenorizada do invento que se segue.

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-19Breve Descrição dos Desenhos

Nas figuras que fazem parte da descrição do invente:

A Figura 1 é um gráfico que ilustra a capacidade de uma quantidade conhecida e constante (0,375 yug/ml) de moléculas de AI-10 marcadas com peroxidase de rábano (HRPO) reagir com apolipoproteína A-I fixada em fase sólida, na presença de quantidades crescentes de moléculas de AI-10 ( A ) e AI-11 ( M) não marcadas. As ordenadas estão em unidades de densidade óptica enquanto que as abeissas estão em microgramas (yug) de anticorpos monoclonais de competição não marcados adicionados. Os pormenores deste estudo estão indicados na Secção de Materi ais e Processos.

gráfico mostra que aumentando a quantidade de moléculas AI-10 não marcadas na mistura de imunorreacção se dá um decrés. cimo correspondente da quantidade de AI-10 marcada ligada ao imunorreagente de fase sólida. Assim, a AI-10 não marcada com pete com a AI-10 marcada em relação à apo A-I.

gráfico mostra também que aumentando a quantidade de moléculas AI-11 não marcadas, não diminui significativamente a quantidade de moléculas AI-10 marcadas ligadas ao imunorreageri te de fase sólida. Assim, as moléculas AI-11 não marcadas não competem com as moléculas AI-10 marcadas na ligação à apolipoproteína A-I.

A Figura 2 é um gráfico que mostra que se obtêm resultados semelhantes aos da figura 1, usando HDL como antigénio ligado a fase sólida com uma quantidade constante (0,375 ^íig/ml) de moléculas AI-10 marcadas com HRPO, de moléculas AI-11 não marcadas ( H ) e de moléculas AI-10 ( ) não marcadas.

As moléculas AI-10 e AI-11 ligam-se portanto aos diferentes epítopos que estejam suficientemente afastados na superfície da apolipoproteína A-I ou da HDL para permitirem a ligação de ambas as moléculas de anticorpo monoclonal a uma única molécula de apo A-I sem competição estereo e sem inibição mútua da ligação de cada uma delas.

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-20Descrição Pormenorizada do Invento

I. DISCUSSÃO

A. Definições termo anticorpo refere-se a uma molécula que faz pa_r te de uma família de proteínas glicosiladas chamadas imunaglobulinas, que pode combinar-se especificamente com um antigénio. Este anticorpo combina-se com o seu antigénio por uma interacção de ligação imunológica específica entre o determinante antigénico do antigénio e o local de combinação de anticorpos do anticorpo.

Um local de combinação de anticorpo é a parte estrutural de uma molécula de anticorpo constituída por regiões variá veis e hipervariáveis de cadeia leve ou pesada que se liga especificamente ao antigénio. Usando a nomenclatura de Oerne, (1974) Ann, Immunol. (Inst. Pasteur), 125C:373-389, um local de combinação de um anticorpo é aqui referido como paratopo.

As porções de polipeptídeo dos anticorpos que contém locais de combinação de anticorpo (isto é que contêm paratopos) são as porções das moléculas do anticorpo que contêm o paratopo e que se ligam a um antigénio e incluem, por exemplo, porções Fab, Fab', F(ab')2 ^e ^(v) de anticorpos. As porções Fab e F(ab’)2 dos anticorpos são preparadas por reacção proteolítica respectivamente de papaína e pepsina sobre anticorpos subs. tancialmente intactos, por métodos já bem conhecidos. Ver por exemplo a Patente Americana Na. 4 342 566 de Theofilopoulos e Dixon. As partes de anticorpo Fab’ são também já conhecidas e obtêm-se a partir de partes FCab’^, seguindo-se a redução das ligações dissulfuradas que unem as duas porções de cadeia pesja da, p. ex. com mercaptoetanol, alquilando em seguida o mercapta no de proteína resultante com um reagente como a iodoacetamida. Preferem-se anticorpos intactos que são utilizados neste invejn to como exemplos de moléculas monoclonais ligandos.

A palavra antigeno tem sido usada, ao longo dos tempos, para designar uma entidade que é ligada por um anticorpo

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-21e designa também a entidade que induz a produção de um anticor. po. Mais frequentemente limita-se o significado de antigénio à entidade ligada por um anticorpo, enquanto que a palavra imunogénio é utilizada para a entidade que induz a produção de anticorpos. Sempre que a entidade aqui tratada for não só imunogénica como antigénica, será considerada como um antigénio.

A frase determinante antigénico refere-se à porção estrutural real do antigénio que está ligada imunologicamente por um local de combinação de um anticorpo. A nomenclatura de Ger, ne redefine o determinante antigénico como epítopo.

termo biologicamente activo refere-se, pelo menos, à capacidade de uma molécula proteica se ligar a um antigénio ou a um local de combinação específica de anticorpo ainda que nes. sa molécula possam haver outras capacidades gerais ou efectoras. A actividade biológica de uma molécula paratópica conteri do um local de combinação de anticorpo é evidenciada pela rea£ ção imunológica do paratopo (local de combinação do anticorpo) com o seu epítopo (determinante antigénico) após a sua mistura num meio aquoso para formar um imunorreagente, a valores de pH e de concentrações iónicas pelo menos fisiológicos. De preferência a actividade biológica ocorre sob condições de ensaio biológico, isto é, condições em que uma molécula monoclonal pa ratópica utilizada neste invento se liga ao epítopo (determinante antigénico) a um valor de pH na gama de cerca de 5 a ce£ ca de 9, a concentrações iónicas entre a da água destilada e a de uma solução de cloreto de sódio cerca de um molar e a temp£ raturasentre cerca de 4SC e cerca de 459C. As moléculas monoclonais paratópicas que são úteis neste invento são todas biologicamente activas.

ELISA refere-se a um ensaio com imuno-sorvente ligado a uma enzima que emprega um antigeno ou anticorpo ligado a uma fase sólida e um conjugado de antígeno-enzima ou de anticorpo-enzima, para detectar e quantificar a quantidade de antigeno ou de anticorpo presente numa amostra. Pode encontrar-se uma descri, ção da técnica do ELISA no Capítulo 22 da edição da Basic and Clinicai Immunology por D. P. Sites et al., publicado pela

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-22Lange Medicai Publications of Los Altos, CA em 1982 e nas Patentes Americanas N9s. 3 654 090, 3 Θ50 752 e 4 016 043 aqui citadas para referência.

Enzima” refere-se a uma proteína capaz de acelerar ou de produzir, por acção catalítica, alguma alteração num substrato para o qual ela é frequentemente específica.

termo imunorreagente aqui usado refere-se ao produto de uma reacção imunológica, isto é, a entidade produzida quando um antígeno é imunologicamente ligado por um anticorpo ou por uma molécula contendo um paratopo. Um imunorreagente é portanto um tipo específico de complexo formado entre moléculas.

Os termos meio indicador, meio indicador enzimático ou marcador são usados indistintamente sob várias formas gra. maticais de forma a incluírem átomos,moléculas e enzimas que estão directa ou indirectamente envolvidos na produção de um sinal detectável que indique a sua presença. Quaisquer meios indicadores que possam ser ligados ou incorporados num anticoj? po são úteis neste invento, podendo esses meios indicadores ser usados sozinhos ou em conjunção com reagentes adicionais. Estes grupos indicadores ou marcadores são já bem conhecidos em química imunológica e constituem parte deste invento na medida em que são utilizados com moléculas paratópicas, processos e/ou sistemas agora descobertos. As moléculas paratópicas quando ligadas a um meio indicador enzimático são aqui por vezes referidas como moléculas paratópicas ligadas a enzi, ma.

termo anticorpo inteiro é aqui usado para distinguir uma molécula intacta, completa, segregada por uma célula, de outras moléculas mais pequenas que podem também conter o paratopo necessário para a actividade biológica numa imunorreacção com um epítopo.

As moléculas paratópicas do presente invento são moléculas monoclonais paratópicas. Um anticorpo monoclonal (Mab) é um anticorpo produzido por clones de um hibridoma que segre66 716

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Λ / {«,<*

-23ga apenas uma espécie de molécula anticorpo, e uma molécula mo noclonal paratópica é um anticorpo monoclonal ou uma sua porção de polipéptido contendo um paratopo, como se descreve abai, xo. A célula do hibridoma é o resultado da fusão de uma célula produtora de anticorpo, com um mieloma ou outra linha de cé lulas que se auto-perpetuam. Estes anticorpos foram primeiramente descritos por Kohler e Milsteins, Nature, 256, 495-497 (1975) sendo esta descrição aqui incorporada para referência.

Os termos “molécula monoclonal paratópica e apenas molécula paratópica são aqui usados indistintamente e colectivji mente para designar o género de moléculas que contêm um local de combinação de um anticorpo monoclonal e incluiem um antico_r po monoclonal inteiro, um anticorpo monoclonal praticamente in teiro e uma porção, contendo um local de ligação de anticorpo, de um anticorpo monoclonal. Os anticorpos monoclonais inteiros designados por AI-10 e AI-11, AI-12, AI-13 e AI-14, são molécu. las paratópicas deste invento, assim como as porções destes ajn ticorpos inteiros que incluem o paratopo. Os termos molécula monoclonal paratópica ou molécula paratópica são aqui usados sozinhos quando se pretende designar uma molécula biologicamente activa genérica contendo o local de ligação de anticor^ po dos anticorpos monoclonais acima referidos, enquanto que os termos AI-10, AI-11, AI-12, AI-13 e AI-14 com ou sem as palavras molécula paratópica são usados quando os anticorpos específicos inteiros produzidos pelos hibridomas HB 9200, HB 9201, HB 9202, HB 9203 ou HB 9204 são referidos.

As palavras segregar e produzir são frequentemente usadas indistintamente para referir células a partir das quais se obtêm moléculas de anticorpos. As células que produzem anticorpos podem contudo não segregar aquelas moléculas no seu meio. As células de hibridomas de interesse neste invento segregam anticorpos monoclonais no seu meio. No entanto, estas células são por vezes aqui referidas como células produtoras de anticorpos, e os seus anticorpos são por vezes referidos como sendo produzidos, para estar em conformidade com os tejç mos usados na arte. De modo semelhante, as porções de poli-

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-24péptido dos anticorpos anteriores contendo paratopo são aqui referidos como sendo produzidos ou segregados, embora se deva entender que tais moléculas são preparadas a partir de an ticorpos que são, eles próprios, produzidos ou segregados.

Os termos sobrenadado e sobrenadante são aqui usados indistintamente e referem-se ao meio líquido in vitro no qual as células são cultivadas. Os anticorpos monoclonais produzidos pelas culturas de hibridomas de interesse neste invento são segregadas no seu meio de cultura. 0 sobrenadante do meio de cultura dessas células é portanto uma fonte preferida de mo léculas monoclonais paratópicas e pode ser obtido facilmente, z livre de células de hibridomas, por técnicas bem conhecidas. E exemplo destas técnicas a centrifugação a baixa velocidade para separar as células do meio líquido. Em alternativa as molé cuias monoclonais paratópicas podem ser obtidas a partir de fluido ascítico de tumor (fluido ascítico) de animais de laboratório nos quais se introduziu tecido de hibridoma. Ambos os métodos estão adiante descritos.

A frase praticamente ao mesmo tempo aqui usada em rela ção à mistura de três ou mais antígenos e de componentes de mo léculas paratópicas, para formar uma mistura de imunorreacção, significa que todos os componentes estão presentes e são juntos numa só mistura uns dos outros durante cerca de 15 minutos, de preferência durante cerca de 5 minutos para mistura de quaisquer dois dos componentes.

A frase praticamente todo é aqui usada em relação à imunorreacção de uma molécula paratópica e sua apolipoproteína A-I de antígeno para formar um imunorreagente, significa que a molécula paratópica imunorreage com cerca de 90% do antígeno presente na solução para formar o imunorreagente quando a molé cuia paratópica está presente em excesso.

B. Hibridomas e Moléculas Monoclonais Paratópicas presente invento refere-se a moléculas paratópicas que são segregadas por cinco hibridomas. Essas moléculas paratópi. cas imunorreagem com a apolipoproteína A-I. A molécula da apo.

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lipoproteína A-I é aqui também frequentemente referida como apo A-I.

Dos cinco hibridomas são particularmente preferidos os que têm as designações laboratoriais H91H4.2H8 e H1D3D8.1D11 e que segregam as moléculas paratôpicas denominadas AI-10 e AI-11, respectivamente. Cada uma das moléculas paratôpicas AI-10 e AI-11 imunorreage com um determinante antigénico conservado sobre a apolipoproteína A-l e imunorreage com pelo menos cerca / 125 de 90% de partículas I-HDL, num RIA em fase fluída. Como se pode ver do exame às figuras 1 e 2, ambas as moléculas paratópicas AI-10 e AI-11 se ligam à apo A-I, mas cada uma praticamente não interfere na ligação da outra.

Cada um dos cinco hibridomas foi depositado na American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD, em 16 de Setembro de 1986 de acordo com o Tratado de Budapeste para o Reconhe cimento Internacional do Depósito de Microrganismos para fins de Protecção de Patentes. Indicam-se a seguir as designações laboratoriais, as designações das moléculas paratôpicas e as suas classes, bem como os Números de Acesso ATCC.

Designação Laboratorial do Hibridoma

H91H4.2H8

H103D8.1D11

H105C7.1C10

H105F4.1B4

H114D12.2D8

Designação da Molé cuia Paratôpica

AI-10

AI-11

AI-12

AI-13

AI-14

Classe Número de

IgG Acesso ATCC

2a	HB	9200
1	HB	9201
1	HB	9202
1	HB	9203
2a	HB	9204

Os referidos depósitos foram feitos, de acordo com as exigências do Tratado de Budapeste, de que a duração do depôsj. to deverá ser de 30 anos a partir da data de depósito ou de 5 anos após o último pedido de depósito, na entidade depositária ou durante a vida útil de uma patente norte-americana que se inicia com este pedido, optando-se pela mais longa. Os hibridomas serão substituídos caso se tornem não viáveis no Depósito e serão postos à disposição do público pela ATCC após conces

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-26são de uma patente com base neste pedido.

Curtiss e Edgington (1985), 3« Biol. Chem. 260:2982-2993 referiram a heterogeneidade imunoqufmica da HDL humana bem como a preparação de três hibridomas cujas moléculas monoclonais paratépicas imunorreagiram com apo A-I. Estas moléculas monoclonais paratópicas, designadas por AI-4, AI-7 e AI-9, imunorreagiram cada uma com apo A-I humana e com partículas de HDL humana, em RIA de fase fluida, mas mostraram diferentes níveis de imunorreactividade.

Os estudos relatados nesse trabalho indicaram imunorrea£ tividades de imunoprecipitação indirecta em RIA de fase fluida, 125 com I-HDL em excesso de anticorpo, como percentagens do total de radiomarcador precipitável com ácido tricloroacético, de: AI-4, cerca de 44$; AI-7, cerca de 61$; e AI-9, cerca de 52$. As imunorreacções máximas de AI-4, AI-7 e AI-9 com 125

I-apo A-I isolada, em RIA de fase fluida, foi referida como sendo de cerca de 60$ para AI-4 e AI-7, e cerca de 30$ para AI-9.

Combinações de duas ou très destas moléculas monoclonais paratópicas não conseguiram imunoprecipitar 100$ da HDL marcada. Contudo, combinações de quaisquer duas destas moléculas monoclonais paratópicas com moléculas monoclonais paratópicas, tiveram sucesso na imunorreacção com a apolipoproteína A-II com 100$ de '^^I-HDL precipitável.

Como adiante se discute na Secção de Resultados, as imunorreactividades dos hibridomas recém descobertos, tanto com HDL humana e apo A-I humana, são consideravelmente melhores do que as descritas por Curtiss e Edgington (1985) 3. Biol. Chem., 260:2982-2993. Estas imunorreactividades máximas de HDL, num RIA em fase fluída, foram cerca de 30$ (ou mais) maiores do que as relatadas para a AI-7 que, de acordo com o referido,imunorreagiu com cerca de 60/á de I-HDL.

Os hibridomas deste invento foram preparados a partir de três fusões separadas de esplenócitos de ratinhos com células de mieloma de ratinho, não segregantes, da linha P3x63Ag8.653.

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-27Foram usadas como imunogénios partículas de HDL humana, nativa e fresca, ou reticulada com glutaraldeído.

C. Processos

De acordo com o processo do presente invento determina-se a presença e, se necessário, a quantidade de apolipoproteína A-I numa amostra líquida. A amostra líquida é aquosa e pode ser só água, uma composição de sais, uma solução tampão ou um fluído corporal tal como -uma amostra de sangue.

Uma amostra de sangue líquido é frequentemente utilizada num processo deste invento quando se deseja a determinação quajn titativa de apo A-I ou de HDL. A amostra pode ser quer de soro quer de plasma pois os resultados obtidos com ambos mostraram não ser distintos sob o ponto de vista estatístico. Na vejç dade, alguns resultados adiante indicados, usando o processo do invento, foram obtidos usando valores médios de ensaios realizados tanto em soro como em plasma. Independentemente de se usar soro ou plasma, a amostra de sangue líquido é preferivelmente obtida de pessoas que tenham jejuado pelo menos cerca de 12 horas, como já é conhecido da arte. Esta amostra de sangue é referida como amostra em jejum. Note-se ainda que quando se usa soro ou plasma como amostra líquida num ensaio quantita tivo, a amostra não necessita ser submetida a um processo de desmascaramento como vulgarmente se faz na determinação de apo A-I nessas amostras.

Foi surpreendente verificar que se podem obter resultados rigorosos e precisos utilizando os métodos ELISA particularmente preferidos aqui descritos usando uma amostra de sangue líquido, como o plasma ou soro, porque estas amostras contêm proteínas, lípidos e outros compostos que seriam de esperar que interferissem no ensaio. Ver, por exemplo, Maggio, Enzyme-Immunoassay, CRC Press, Inc. Boca Raton, FL, 1980, pag. 65.

Para mediçães quantitativas a quantidade de apolipoproteína A-I é determinada usando uma quantidade predeterminada de amostra líquida. Quando a amostra líquida for uma amostra de sangue líquido, como plasma ou soro, não é necessário um tratamento de desmascaramento, como é usual para medir a apo

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-28A-I, e essa amostra pode ser usada sem esses tratamentos de desmascaramento.

Quando se deseja um ensaio qualitativo não é absolutamejn te necessário que o utilizador conheça o volume da amostra liz quida usada. E evidente contudo que o volume da amostra e a concentração de apo A-I utilizados não devem ser tão grandes que se sobreponham aos reagentes utilizados, nem tão pequenos que se procure a presença de uma quantidade irrisória de apo A-I. Por exemplo, as determinações quantitativas rigorosas e precisas são rotineiramente executadas pelo método ELISA usando amostras que contêm entre cerca de 10 a cerca de 200 nanogramas de apo A-I. As determinações qualitativas podem porta_n to ser realizadas com quantidades ainda mais pequenas de apo A-I.

Dum modo genérico, o processo compreende os passos de misturar a amostra líquida a ensaiar com uma quantidade eficaz de moléculas paratópicas escolhidas de entre as do grupo que consiste nas cinco moléculas monoclonais paratópicas mencionadas acima para formar uma mistura. Esta mistura é mantida sob condições de ensaio biológico durante um período de tempo predeterminado suficiente para que as moléculas paratópicas imuno_r reajam com a apolipoproteína A-I presente na amostra e se forme um imunorreagente. A presença do imunorreagente é depois detej? minada, determinando-se assim a presença de apolipoproteína A-I na amostra original.

Note-se que o ensaio acima referido pode ser em fase sóli. da ou líquida ou qualquer outro imuno-ensaio como é conhecido. São dados adiante exemplos de ensaios em fase líquida e sólida. Adicionalmente para os ensaios em fase sólida quer a apo A-I (HDL) competitiva quer as moléculas paratópicas,podem ser liga das à fase sólida.

A presença do imunorreagente pode ser determinada de vários modos cada um deles utilizando geralmente um meio indicador como aqui se descreveu.

Nesta perspectiva, contudo, as moléculas paratópicas coji têm de preferência um elemento radioactivo ligado operativameri

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-29te coma meio indicador e a presença de apolipoproteína A-I na amostra original é determinada por separação do imunorreagente da restante mistura e ensaiando a radiação emitida pelo imunojç reagente separado.

Numa outra concretização do processo de ensaio^as molécu. las monoclonais paratópicas primeiramente referidas são ligadas a uma matriz sólida formando um suporte sólido antes da mistura se realizar. Bloqueiam-se os locais de ligação não es. pecíficos de proteína. 0 imunorreagente formado após mistura é ligado ao suporte sólido como imunorreagente ligado à fase sólida. Nesta concretização prefere-se que a presença de um imunorreagente ligado à fase sólida seja determinado pelo uso de moléculas, contendo um meio indicador, que são as segundas moléculas monoclonais paratópicas, como adiante se descreve. Aqui, as moléculas contendo um meio indicador em fase líquida são misturadas com a primeira mistura para formar uma segunda mistura.

As moléculas contendo meios indicadores imunorreagem com um segundo epítopo de apolipoproteína A-I que não tenha si. do substancialmente bloqueado pela imunorreacção das primeiras moléculas monoclonais paratâpicas, e são escolhidas entre as moléculas monoclonais paratópicas anteriormente mencionadas mas que não são as moléculas utilizadas na mistura primeirameri te referida. Um par de moléculas monoclonais paratópicas particularmente útil é o das moléculas segregadas por hibridomas com Números de Acesso ATCC HB 9200 e HB 9201. Estas segundas moléculas paratópicas estão operativamente ligadas a um meio indicador, de preferência uma enzima. 0 meio indicador ligado pode ser qualquer meio marcador aqui referido.

A segunda mistura assim formada é mantida sob condições de ensaio biológico durante um período de tempo pré-determinado, suficiente para que as segundas moléculas paratópicas liga, das a um meio indicador possam imunorreagir com a apolipoproteína A-I presente na mistura. As fases sólida e líquida, foj? madas após mistura de ambos os tipos de moléculas paratópicas, são então separadas. A presença da apolipoproteína A-I, liga66 716

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-30da a um meio indicador, na fase sólida separada é determinada₅ determinando-se assim a presença de apolipoproteína A-I na amostra. 0 imunorreagente formado entre uma molécula paratópi. ca ligada à fase sólida, o antígeno da apo A-I e a segunda molécula paratópica ligada ao marcador é aqui por vezes referido como um imunorreagente sanduíche.

As moléculas paratópicas monoclonais do presente invento são também úteis em ensaios quantitativos para a determinação da quantidade de apolipoproteína A-I numa amostra líquida, em particular numa amostra de sangue líquido, como o soro ou o plasma, como se referiu anteriormente. Quando se pretendem re sultados quantitativos, seguem-se passos geralmente semelhantes aos acima delineados para o ensaio em fase sólida.

Assim, na análise quantitativa da quantidade de apolipoproteína A-I, forma-se uma primeira mistura de fase sólida-líquida juntando uma quantidade conhecida e predeterminada de uma amostra líquida, como plasma ou soro, que esteja isenta de tratamentos de desmascaramento, a um suporte sólido que consi£ te essencialmente numa matriz sólida com primeiras moléculas monoclonais paratópicas ligadas à fase sólida que imunorreagem com a apo A-I. Estas primeiras moléculas monoclonais paratópi, cas ligadas à fase sólida estão presentes em excesso em relação à quantidade de apo A-I esperada na amostra e são segregadas por um dos hibridomas com os números de Acesso ATCC HB 9200 ou HB 9201. Antes de realizar essa mistura, os locais de liga ção não específicos de proteína na superfície do suporte sólido, são bloqueados.

Essa primeira mistura de fases sólida-líquida é mantida sob condições de ensaio biológico durante um período de tempo predeterminado, suficiente para que as primeiras moléculas paratópicas imunorreajam com a apolipoproteína A-I presente na alíquota de amostra e formem um imunorreagente, ligado à fase sólida, que contém praticamente toda a apolipoproteína A-I presente na amostra.

A apo A-I da amostra é também misturada com segundas moléculas paratópicas monoclonais, em fase líquida, que imunor66 716

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-31reagem com a apolipoproteína A-I formando uma segunda mistura. Estas segundas moléculas monoclonais paratópicas são segregadas por um dos hibridomas com os números de Acesso ATCC HB 9200 ou HB 9201, mas não são as utilizadas na primeira mistura. Estas segundas moléculas paratópicas estão também operativamente ligadas a um meio indicador enzimático. Assim, as moléculas paratópicas usadas neste passo são diferentes das duas moléculas paratópicas referidas no primeiro passo de mistura.

A segunda mistura assim formada é mantida sob condições de ensaio biológico durante um período de tempo predeterminado, suficiente para que as segundas moléculas paratópicas ligadas a uma enzima formem um imunorreagente sanduíche que contém pra ticamente toda a apolipoproteína A-I da alíquota de amostra.

As fases sólida e líquida, que resultam da mistura de am bas as moléculas paratópicas e da formação de imunorreagentes entre ambas as moléculas paratópicas e a apo A-I, são separadas, por exemplo por lavagem, e a quantidade de imunorreagente sanduíche, contendo apolipoproteína A-I ligada a um meio indicador, presente na fase sólida separada é então determinada. Devido ao facto de cada um dos dois tipos de moléculas monoclonais pa ratópicas imunorreagir com praticamente toda a apo A-I presente na alíquota de amostra e porque pelo menos uma das moléculas paratópicas imunorreage com um epítopo conservado, não reactivo cruzadamente, da apo A-I, a determinação da quantidade de apo A-I, ligada a uma enzima, no imunorreagente permite a determinação da quantidade de apolipoproteína A-I presente na alíquota de amostra. A quantidade de apolipoproteína A-I na amostra pode ser facilmente calculada por conhecimento do volu me predeterminado da alíquota de amostra líquida, originalmente utilizado.

Pode realizar-se cada um dos ensaios em fase sólida para apolipoproteína A-I, discutidos acima, efectuando sequencialmeri te cada um dos passos de mistura e de manutenção ou efectuando praticamente ao mesmo tempo os dois passos de mistura de cada ensaio, sendo os dois passos de manutenção de cada ensaio executados conjuntamente, como foi referido.

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-32Quando os passos são executados sequencialmente, prefere -se misturar as moléculas monoclonais paratópicas ligadas à fa se sólida e a mistura formada antes da mistura das moléculas paratópicas ligadas a meios indicadores enzimáticos e do perlo do de manutenção da mistura resultante. Quando se opta pelos passos sequenciais, prefere-se ainda que as fases sólida e líquida formadas sejam separadas e que a fase sólida seja lavada para assegurar essa separação antes de mistura das moléculas paratópicas ligadas a meios indicadores enzimáticos líquidos à fase sólida separada e antes do período de manutenção dessa mistura.

Note-se também que as moléculas paratópicas ligadas a meios indicadores enzimáticos podem ser primeiro misturadas com a amostra apropriada. Quando se utiliza este método não há separação de fases antes da mistura das moléculas monoclonais paratópicas ligadas à fase sólida.

Mais preferivelmente, as moléculas monoclonais paratópicas ligadas à fase sólida, a amostra líquida e as moléculas pa ratópicas ligadas a meios indicadores enzimáticos são misturadas em separado, praticamente ao mesmo tempo, e as misturas de fase sólida-líquida resultantes são mantidas em conjunto. Assim, a mistura é mantida durante um período de tempo suficiente para que as moléculas monoclonais paratópicas ligadas à fase sólida formem imunorreagentes ligados à fase sólida com pra ticamente toda a apo A-I, e suficiente para que as moléculas paratópicas ligadas a meios indicadores enzimáticos, em fase líquida, imunorreajam também com praticamente toda a apo A-I da amostra. 0 imunorreagente assim formado é aqui referido como imunorreagente sanduíche ligado à fase sólida. Está também presente uma fase líquida.

Obtêm-se resultados semelhantes quando se usa nos respe£ tivos ensaios qualquer dos dois tipos de moléculas monoclonais paratópicas como moléculas paratópicas ligadas à fase sólida. A maior parte do trabalho aqui apresentado foi porém realizado usando moléculas segregadas pelo hibridoma com número de Acesso ATCC HB 9200 (AI-10) ligado à matriz de fase sólida para o

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-33ensaio para a apolipoproteína A-I.

Exemplos de matrizes sólidas, úteis para os processos re feridos, são já bem conhecidos na arte e incluem uma matriz só, lida como a placa de micro-titulação de 96 cavidades vendida sob a designação de Falcon Microtest III Flexible Assay Plates (Falcon Plastics, Oxnard, CA) ou uma fita de microtitulação contendo 12 cavidades dispostas ern fila, como as que são vendi, das sob a designação Immulon I e II (Dynatech, Alexandria, VA). A fita ou a placa de microtitulação são feitas de material piás, tico transparente, de preferência poli(cloreto de vinilo) ou po. liestireno. Outras matrizes sólidas para utilização no proces. so deste invento descrito acima, incluem: esferas de poliesti reno com cerca de 1 micron até cerca de 5 milímetros de diâmetro, que se podem obter em Abbott Laboratories, North Chicago, IL; tubos, barras ou almofadas de poliestireno de qualquer ta manho conveniente; e látex de poliestireno cujas partículas de poliestireno têm um tamanho de cerca de 1 micron e podem ser separados, por centrifugação, da restante parte do látex.

As matrizes sólidas podem também ser feitas de uma varie dade de materiais como: dextrano recticulado, p. ex. Sephadex G-25, -50, -100, -200 e outros semelhantes que se podem obter na Pharmacia Fine Chemicals of Piscataujay, NJ; agarose e agarose recticulada, p. ex., Sepharose 6B, CL6B, 4B, CL46 e outros semelhantes que também se podem obter na Pharmacia Fine Chemicals.

meio indicador pode ser ligado directamente a uma molé cuia paratópica deste invento, a um antígeno útil ou pode compreender uma molécula separada. 0 meio indicador pode ser uma molécula separada tal como os anticorpos que se ligam a molécu las paratópicas deste invento, por exemplo anticorpos de cabra ou de coelho anti-ratinho. A proteína A do Staphylococcus aureus, aqui por vezes designada por proteína A, também pode ser usada como meio indicador ou marcador de molécula separada quando se utilizam as moléculas paratópicas inteiras ou praticamente inteiras deste invento, isto é, quando se usam moléculas contendo a porção das regiões Fc das moléculas paratópicas

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X

-34que estão ligadas pela proteína A. Nestes casos, a proteína A contém ela própria um marcador como por exemplo um elemento radioactivo ou um corante de fluorocromo.

Os elementos radioactivos constituem uma classe de marca dores particularmente útil. Um exemplo de agente radio-marcador que pode ser utilizado neste invento é um elemento radioaç. tivo que produza emissão de raios gama. Os elementos que por , . . 124_T 125_T 128_T131 si próprios emitem raios gama, como I, 1, 1,1,

13251

I e Cr, representam uma classe de grupos indicadores de elementos radioactivos produtores de emissão de raios gama. Ou. tra classe de grupos indicadores úteis são os elementos ^C, 18 15 13

F, 0 e N, que emitem eles próprios positrões. Os positrães emitidos assim produzem raios gama após colisão com os electrães presentes na mistura.

Uma molécula monoclonal paratópica radioactiva pode ser tipicamente preparada por isolamento da molécula monoclonal pa. ratópica que depois se marca com um dos elementos radioactivos acima referidos ou com outros apropriados, como se descreve na Patente Americana N9. 4 381 292. Um exemplo de meio marcador indicador é um agente marcador fluorescente que se pode ligar quimicamente a anticorpos ou antígenos sem os desnaturar, para formar um fluorocromo (corante) que é um marcador imunofluores. cente útil. São agentes adequados de marcação fluorescente os fluorocromos como o isocianato de fluoresceína (FIC), o isotio cianato de fluoresceína (FITC), o cloreto de dimetilamino-naftaleno-S-sulfonilo (DANSC), o isotiocianato de tetrametilroda. mina (TRITC), o cloreto de lissamina-rodamina 8200-sulfonilo (RB 200 SC) e outros semelhantes. Pode ver-se uma descrição das técnicas de análise imunofluorescentes em DeLula, Immunofluorescence Analysis, em Antibody As A Tool, Marchalonis et al., eds., Oohn Wiley & Sons, Ltd, pp. 189-231 (1982) que é aqui incorporada apenas para referência.

Uma enzima é um meio indicador particularmente preferido. Quando se usa a enzima esta é de preferência ligada directamen te à molécula paratópica deste invento, formando um conjugado.

Note-se que as moléculas enzimáticas ou outros meios in66 716

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-35dicadores úteis, ligados a uma molécula paratópica devem estar ligados de modo operativo. Assim, nem a função da enzima ou de outro marcador é substancialmente enfraquecida pela ligação ou pela molécula paratópica nem a função da molécula monoclonal paratópica, à qual a enzima ou outro marcador estão ligados, é substancialmente enfraquecida pela ligação ou pela presença da enzima ou de outro marcador.

meio indicador enzimático é uma enzima biologicamente activa como a peroxidase do rábano (HRPO) ou a glucose-oxidase ou outros semelhantes. Como se sabe, quando o meio indicador é uma enzima como a HRPO ou a glucose-oxidase, são necessários reagentes adicionais para se visualizar a formação de um comple xo anticorpo-antígeno. Estes reagentes adicionais para a HRPO incluem o peróxido de hidrogénio e um precursor de corante de oxidação como a diaminobenzidina. Os reagentes adicionais úteis para a glucose-oxidase incluem glucose e 2,2'azino-di-(ácido 3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico) (ABTS).

As técnicas para ligar operativamente uma enzima a uma molécula paratópica, para formar um conjugado, são bem conheci, das da arte. Discutem-se exemplos destas técnicas em Maggio, Enzyme-Immunoassay, capitulo 4 por Kabakoff, CRC Press, Boca Raton, FL (1980), pag 71-104.

As moléculas monoclonais paratópicas podem ser utilizadas tal como são obtidas de sobrenadantes de hibridomas ou de asei, tes. Prefere-se contudo utilizar moléculas paratópicas purifi cadas.

São conhecidos na técnica diversos meios de purificação de moléculas paratópicas que, tipicamente, utilizam técnicas cromatográficas. A cromatografia líquida rápida de proteína, é a técnica de purificação aqui escolhida.

Os conjugados de moléculas paratópicas ligadas a enzima são fornecidos às misturas na fase líquida. Tipicamente dissolvem-se estas moléculas numa composição aquosa. As composições típicas Gontêm sais tampão, como é o caso dos exemplos de composições contendo anticorpos monoclonais purificados, usados

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-36aqui que contêm como diluente solução salina tamponada com fos. fatos (PBS) também é útil fluido ascítico diluído.

Como atrás se disse, os locais de ligação não específicos de proteínas da superfície de um suporte de fase sólida são bloqueados. Assim as moléculas paratópicas ligadas à fase sólida são ligadas por adsorpção ou por outros meios conhecidos de fixação à matriz sólida. Depois mistura-se com a fase sólida uma solução aquosa de uma proteína que não interfira com o ensaio, como a albumina do soro bovino, de cavalo, ou cu tra que esteja livre de contaminação com apo A-I humana, com o fim de adsorver a proteína misturada sobre a superfície do suporte sólido contendo as moléculas paratópicas, nos locais de ligação de proteína, à superfície, que não estão ocupados pelas moléculas monoclonais paratópicas.

Uma solução aquosa de proteína, típica, contém cerca de 3 a cerca de 10/ em peso de albumina de soro bovino em PBS com um pH de 7,1-7,5. A mistura de solução aquosa de proteína-suporte sólido é tipicamente mantida durante um período de tempo de pelo menos uma hora, a 372C, e a fase sólida resultante é depois lavada para se libertar de proteína não ligada.

A amostra de sangue líquido pode ser plasma ou soro, como já se fez notar. De preferência, a amostra é diluída de cerca de 1:2500 a cerca de 1:20000, de preferência a cerca de 1:5000, antes de se usar, para se obterem resultados lineares nos ensaios especificamente descritos em seguida. 0 uso de uma diluição menor pode fornecer à mistura demasiado antígeno da apolipoproteína e prejudicar a linearidade dos resultados do ensaio bem como reduzir ou eliminar o excesso de moléculas para tópicas ligadas à fase sólida, em relação ao antígeno misturado. 0 usa de uma diluição superior a 1:20000 tende a baixar a precisão.

0s tempos de manutenção utilizados podem variar largameri te com pequena variância nos resultados desde que se utilize um tempo mínimo de cerca de 30 minutos à temperatura ambiente (cerca de 20-259C). Quando se deseja utilizar um tempo de ma66 716

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I

-37nutenção mínimo de 30 minutos, prefere-se que a mistura em manutenção seja agitada durante esse período de tempo para assegurar uma imunorreacção praticamente completa entre o antigeno da apolipoproteína A-I e as moléculas monoclonais paratópicas. Quando se utilizarem tempos de manutenção mais prolongados, co mo uma hora ou mais, à temperatura ambiente, a agitação não é necessária. A agitação desejada pode ser facilmente conseguida por meio de um giro-agitador operando a cerca de 100 rpm. Pode realizar-se qualquer dos ensaios utilizados no processo quantitativo usando tempos de manutenção da mistura de amostra-moléculas paratópicas de cerca de 30 minutas a cerca de 60 minutos à temperatura ambiente.

A quantidade de antigeno da apolipoproteína A-I presente no imunorreagente ensaiado é determinada por mistura da fase sólida separada contendo apolipoproteína ligada a uma enzima com uma quantidade predeterminada de reagente ou reagente de visualização. Quando se usa a HRPO como meio indicador enzimá tico, os reagentes de visualização, como o peróxido de hidrogé. nio e um precursor de corante de oxidação como a .o-fenilenodia mina (OPD) presentes num meio aquoso, são misturados com o imu norreagente ligado à fase sólida separada. A mistura assim formada é mantida sob condições de ensaio biológico durante um período de tempo predeterminado, p. ex. pelo menos cerca de 30 minutos à temperatura ambiente para a cor se desenvolver. 0 desenvolvimento da cor é depois parado por mistura com um reagente de paragem como o ácido sulfúrico 4 N. A densidade ópti ca da composição é depois lida, comparada com o valor da curva padrão e determina-se a quantidade de apolipoproteína como é bem conhecido.

Assim, logo que o suporte sólido e a amostra de sangue líquido estejam preparados, pode realizar-se um ensaio quantitativo à temperatura ambiente num período de tempo de cerca de uma hora, isto é, um período de manutenção de 30 minutos, com agitação da mistura formada a partir das moléculas paratópicas e da amostra e outro período de manutenção de 30 minutos para desenvolvimento da cor. De facto não é necessário preparar o

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-38suporte sólido imediatamente antes do seu uso mas de preferência tais suportes, como aqui se descreveu, podem ser preparados e guardados húmidos e cobertos, sob as condições habituais de refrigeração, durante um período de pelo menos um mês, antes do seu uso.

ensaio quantitativo da apo A-I utiliza um padrão em re lação ao qual se comparam os valores da densidade óptica obtidos nos ELISA para calcular as concentrações de apolipoproteína. 0 ensaio utiliza um padrão secundário. Quer dizer, o ensaio em vez de utilizar como padrões uma HDL ou apo A-I espec_í fica, utiliza, como padrão, HDL humana combinada. Utilizam-se estes padrões secundários devido à relativa instabilidade da apolipoproteína A-I ou da HDL primárias sob armazenagem. Kottke e colaboradores também notaram a degradação da apo A-I purific^ da usada como o padrão primário e utilizaram o padrão secundário nos seus RIA com soro policlonal para a determinação de apo A-I. Au et al. (1986), Clin. Chem. 32:1394-1397.

Os padrões secundários são fornecidos sob a forma de pias, ma combinado e liofilizado, recolhido de vários seres humanos em jejum,contendo HDL (apo A-l) e são reconstituídos antes de serem usados. Cada um destes padrões é por seu turno padronizado em relação aos padrões primários de HDL ou apo A-I. A Secção de Materiais e Processos refere como exemplo, um procedimento para a apolipoproteína A-I.

D. Sistemas de Diagnóstico presente invento refere-se também a um sistema de diagnóstico, tipicamente sob a forma de conjunto, que pode ser usai do na realização dos processos descritos anteriormente. 0 sis. tema inclui uma embalagem que contém um tipo das moléculas paratópicas monoclonais que imunorreage com apo A-I descritas acima. A embalagem contém essas moléculas paratópicas em quaji tidade suficiente para realizar pelo menos um ensaio de apo A-I.

De preferência o sistema de ensaio inclui ainda um meio indicador ligado operativamente e directamente às referidas mo

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-39léculas paratópicas ou ligado a outra molécula capaz de assinalar a imunorreacção das referidas moléculas paratópicas com apo A-I.

Ainda com maior preferência, o processo é adequado para determinar quantitativamente a apo A-I presente na amostra de sangue líquido. Este sistema compreende uma primeira embalagem contendo um suporte sólido que consiste essencialmente numa matriz sólida tendo moléculas monoclonais paratópicas ligadas que imunorreagem com a apo A-I e em cuja superfície os locais de ligação não específicos de proteínas estão bloqueados. 0 sistema inclui ainda uma segunda embalagem que contém um cori jugado de moléculas monoclonais paratópicas ligadas a uma enzj. ma que imunorreage com apo A-I. Utilizam-se os mesmos dois ti pos de moléculas paratópicas neste sistema, como anteriormente se referiu em relação à determinação quantitativa da apo A-I.

As matrizes de fase sólida do citado sistema de diagnóstico podem ser quaisquer das matrizes de fase sólida anteriojç mente apresentadas. São particularmente preferidas as cavidades de microtitulação como as das fitas com 12 cavidades e as das placas com 96 cavidades, anteriormente descritas. Como atrás se disse, os locais de ligação não específicos dos supo_r tes sólidos são bloqueados.

A matriz sólida pode constituir um recipiente para as mo léculas monoclonais paratópicas ligadas à fase sólida, desta concretização. São recipientes característicos para as molécu las monoclonais paratópicas ligadas a uma enzima, os frascos ou garrafas feitos em vidro ou plástico como o polietileno ou o polipropileno.

Usando uma placa de microtitulação como exemplo de matriz sólida, e anticorpos monoclonais inteiros AI-10, como moléculas monoclonais paratópicas ligadas à fase sólida, soro, como amos, tra de sangue líquido, e anticorpos monoclonais inteiros AI-11, ligados a HRPO, um sistema de diagnóstico preferido, em forma de conjunto incluirá, por exemplo:

a) um suporte sólido que consiste essencialmente numa placa de microtitulação com anticorpos monoclonais AI-10 a ela

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-40ligados, numa quantidade suficiente para realizar um ensaio de uma amostra de soro, para determinação da quantidade de apolipoproteína A-I aí presente, e cujos locais de ligação não espe. cíficos de proteína, da sua superfície, estão bloqueados; e

b) uma embalagem separada que contém uma solução aquosa com anticorpos monoclonais AI-11 operativamente ligados a HRPG, em quantidades suficientes para realizar o ensaio de uma amostra de soro para determinação da quantidade de apo A-I aí presente.

sistema de diagnóstico inclui, ainda com maior preferência, os componentes referidos acima e um ou mais dos seguin tes: (i) uma fonte de peróxido de hidrogénio de concentração conhecida; (ii) um precursor de corante oxidante de visualização, como o OPD; (iii) uma solução de um agente de paragem como o ácido sulfúrico 4N para parar a reacção de formação de cor; (iv) um ou mais tampões sob forma líquida ou seca para utilização no ensaio; (v) produtos para preparar curvas padrão de referência; e (vi) instruções para realizar os ensaj. os. Cada um destes componentes enumerados imediatamente acima está presente, no sistema de diagnóstico, numa quantidade sufi ciente para realizar pelo menos um ensaio, estando estes compçj nentes embalados separadamente de modo apropriado.

II. RESULTADOS

Como anteriormente se fez notar, as moléculas paratópicas segregadas por cada um dos hibridomas depositados imunorreage tanto com a HDL como com a apo A-I. Nos Quadros IA e 1S adiante, estão indicados os resultados típicos obtidos num RIA em fase líquida, da imunorreacção de cada uma daquelas moléculas monoclonais paratópicas com a HDL e com a apo A-I, em per125 centagem do total de I-HDL precipitável pelo ácido tricloro acético

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-41Quadro 1A

Imunoprecipitação	125 Máxima com	I-HDL, num RIA	em fase
	líquida (
Moléculas Monoclo		FPLC-
nais Paratópicas	Ascites2	Ascites2 *3	Sobrenadante^
AI-10	92,6	85,9	27,0
AI-11	100,0	93,0	85,0
AI-12	89,7	94,0	87,0
AI-13	95,1	93,1	81,0
AI-14	91,4	91,4	34,0
1 As moléculas	paratópicas em	fase líquida	foram mistura.

125 125 das com I-HDL, ou com I-apo A-I, em fase líquida.

Usou-se fluido ascítico de ratinho como fonte das cita das moléculas paratâpicas.

Usou-se fluido ascítico de ratinho, purificado por cro matografia líquida rápida, de proteína (FPLC) como fonte das referidas moléculas paratâpicas.

Usou-se sobrenadante de cultura de células de hibridoma como fonte das mencionadas moléculas paratâpicas.

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-42Quadro 1B

Imunoprecipitação	125 Máxima com	I-apo I, num	RIA em fase
	líquida (	a
Moléculas Monoclo		FPLC-
nais Paratópicas^	Ascites2	Ascites2’	Supernadante^
AI-10	64,7	70,2	BB,0
AI-11	48,8	60,4	41,0
AI-12	43,8	46,1	44,0
AI-13	53,0	48,1	35,0
AI-14	22,0	34,9	30,0

1,2,3,4 y_{er no}|._{as ao} Q_uacj_ro ia.

Como se pode ver dos resultados do Quadro IA anterior, as moléculas paratópicas do presente invento imunorreagem em muito

125 mais extensão com a I-HDL do que os anticorpos anteriormente referidos por Curtisse Edgington (1985) J. Biol. Chem. 260:2982-2993. Os resultados anteriores também mostram uma imunorreacti 125 vidade geralmente melhor com a I-apo A-I quando comparada com as imunorreactividades em relação ao mesmo antfgeno, referidas por Curtiss e Edgington. Além disso, outros trabalhos indicaram que a idade do padrão pode ter um efeito acentuado sei bre os resultados obtidos.

Foi também realizado um estudo usando várias combinações dos três tipos de anti-apo A-I e de anti-apo A—II, monoclonais, de Curtiss e Edgington que foram comparadas com AI-10 e fil-ll do presente invento na medição por ELISA da apo A-I em amostras de sangue. A maior parte destas comparações forneceu resultados semelhantes. Contudo, várias amostras e em particular amos tras de sangue de pacientes com CAD, mostraram resultados aber. rantes quando comparados com os ensaias aqui descritos e com ensaios por outras técnicas. No Quadro 2 adiante, mostram-se alguns desses resultados comparáveis e aberrantes, para duas combinações de moléculas monoclonais de Curtiss e Edgington.

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-43Quadro 2

Níveis comparativas de apo A-I medidos por ELISA^

Amostra de	C&E Mab	C&E Mab	AI-10
Apo A-I2	Com. I3	Com. 2^	AI-115
1 (105)	46,0	49,0	84,3
2 (120)	80,0	77,0	131
3	71,6	N.R.6	158
4	73,8	N.R.6	151
5	110	89,0	160
6	60,0	122	86,2
7	29,0	49,0	130
8	29,0	50,0	138
9 (159)	151	7	158

l Quantidade de apo A-I em miligramas por decilitro medi, da por ELISA usando as técnicas gerais de ELISA de sanduíche, aqui discutidas.

Amostras contendo apo A-I obtidas no comércio /# 1 (Cal^ biochem-Behring), #2 (International Union of Immunological Standards; IUIS), #6 (Isolab electrophoresis sample) e #=9 (Omega), de pessoas normais assintomáticas (#3, 4 e 5); ou de pacientes com CAD ($7 e 8). Os números entre parêntesis são as quantidades de apo A-I que os fornecedores declaram estar presentes.

³ ELISA realizado usando uma mistura de monoclonais de Curtiss e Edgington (C&E Mab) ΑΙ-4, AI-7 e ΑΙΙ-1 ligadas à matriz sólida, e a monoclonal AI-4 ligada a HRPO como segunda mo. noclonal contendo um meio indicador.

ELISA como na nota 3, usando moléculas monoclonais AI-7, AI-9 e AII-1 ligadas à matriz sólida e, como segunda molécula monoclonal, AI-4 ligada a HRPO.

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-44e

ELISA como na nota 3, usando as moléculas monoclonais paratópicas do invento. AI-10 foi ligada à matriz sólida enquanto que a AI-11 ligada à HRPO foi usada como segunda molécu la monoclonal paratópica.

⁸ N.R. = não realizado.

valor obtido estava acima do intervalo usado no ensaio.

Apesar dos resultados acima indicados mostrarem que o uso das moléculas paratópicas do presente invento dá resultados diferentes dos obtidos com os anticorpos de Curtiss e Edgington nas amostras aberrantes, estes resultados não indicam quais os resultados que estão correctos. Os resultados, resumidos no Quadro 3 adiante, mostram que os valores obtidos utilizando as moléculas paratópicas do presente invento estão correctos para essas amostras aberrantes quando comparados com os obtidos usan do os anticorpos de Curtiss e Edgington.

Os resultados resumidos no Quadro 3 foram obtidos usando soro e/ou plasma de 30 pessoas normais assintomáticas (15 homens e 15 mulheres) e usando o ensaio de sanduíche quantitativo, aqui descrito. Foram também realizados ensaios utilizando dois RIA (RIA-I e RIA-Il), obtidos no comércio, e dois RID (RID-I e RID-Il), também obtidos no comércio. Em cada ensaio foi medida uma amostra de cada dador.

Quadro 3

Resumo Comparativo de Valores de Apo A-I, Obtidos Usando

	ELISA2	Técnicas	Diferentes’'·
RIA-I3	RIA-Il4	RID-I5	RID-II6
MEDIA7	155	114	139	175	186
D.P.8	39,4	28,7	32,6	40,6	17,6

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X -; J

-45* Quantidades de apo A-I em miligramas por decilitro.

Ensaio por ELISA conduzido como se descreveu na nota 5 do Quadro 2, usando soro e plasma.

RIA-I utilizou plasma e fci realizado com produtos com prados na Isotex Diagnostics of Friendsiuood, TX, seguindo as instruções dos fornecedores.

RIA-II utilizou soro e foi realizado com produtos comprados nos Ventrex Laboratories, Inc. of Portland, ME, seguindo as instruções dos fornecedores.

RID-I utilizou plasma e fci realizado com produtos coni prados na Tago Inc. of Burlingame, CA, seguindo as instruções dos fornecedores.

RIA-I utilizou soro e foi realizado com produtos compra dos na Calbiochem-Behring of La Jolla, CA, seguindo as instruções dos fornecedores.

γ

Média dos valores de apo A-I de todas as 30 amostras ensaiadas.

D.P. = valor do desvio padrão do valor médio.

Como se pode ver nos resumos acima apresentados, a média obtida usando o presente ELISA está a meio caminho entre as mé dias obtidas com os dois RIA (no lado inferior) e com os dois RID (no lado superior). Assim, da validade geral dos resultados obtidos usando o presente ELISA parece concluir-se que os resultados do Quadro 2 obtidos usando AI-10 e AI-11 estão de facto correctos.

Os ensaios do presente invento, como quaisquer outros eri saios, utilizam um padrão. Os ensaios por ELISA podem utilizar um padrão primário de apo A-I ou de HDL mas, por conveniên cia e rigor, na prática utiliza-se de preferência um padrão se cundário de HDL.

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-460 padrão secundário utilizado é obtido de plasma de vários dadores em jejum combinado. Usa-se tipicamente uma mistu ra de plasma de vinte dadores. 0 padrão secundário é ele próprio padronizado em relação ao padrão primário.

Usualmente não se emprega um padrão primário de apo A-I pois estes padrões não são estáveis durante a armazenagem. Pe_n sa-se que a proteína purificada ou os resíduos glutamina ou as. paragina da proteína podem ser desaminados. Pensa-se que o mesmo ocorre com HDL purificada quando se usa como padrão primário.

Para dar maior validade aos resultados obtidos usando um padrão secundário em ELISA quantitativos deste invento, realizou-se uma série de ELISA usando AI-10 ligada à fase sólida e AI-11 ligada a HRPO, com vários padrões de apo A-I obtidos no comércio. Os resultados estão indicados no Quadro 4 abaixo.

Quadro 4

ELISA quantitativos usando	diferentes	padrões de	apo A-I'’
	Apo-A-I	Pd. primá	Pd. primá	Pd. primá
2 Amostra	3 Secundário	• γιο I	rio-II^	rio-III^
1	122	104	128	105
2	127	103	132	122
3	71,0	66,0	80,0	78,0
4	169	137	168	172
5	77,0	70,5	86,0	85,5
6	94,0	83,5	102	96,5
7	150	123	152	163
8	129	109	134	162
9	166	135	166	164
10	176	142	174	172
11	101	-	-	102
12	172	-	-	171
13	167	-	-	166
14	176	-	-	174
15	177	-		176

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141

192

141

190 ¹ Quantidades de apo A-I em miligramas por decilitro.

Amostras de preparações laboratoriais como oferta ou vindas do comércio ( $1-11) ou de dadores normais assintomáti cos (^12-17). Note-se que a amostra 12 veio da mesma pessoa que deu a amostra 3 do Quadro 2, assim como a amostra 15 é da mesma pessoa que deu a amostra 5 daquele Quadro.

Padrões secundários de HDL como foram aqui descritos.

^0 Pd. Primário-I (padrão primário I) foi obtido de Meloy Laboratories of Springfield, UA.

uPd. Primário II (padrão primário II) foi obtido de Scripps Laboratories of La Qolla, CA.

Pd. Primário III (padrão primário III) foi obtido da Chemicon International, Inc. of EI Segundo, CA.

Comparando os valores do Quadro 4, segundo a horizontal, vê-se que os resultados obtidos com todos os padrões foram semelhantes. Também se pode ver que os valores obtidos usando o padrão Meloy são em geral um pouco mais baixos do que os obtidos com outros padrões. Note-se ainda que o valor garantido p_e lo fornecedor do padrão Meloy foi de cerca de metade do obtido numa análise independente.

Foi realizada uma série de determinações ao longo de um período de cerca de três meses usando os padrões comerciais aci ma referidos para estabelecer a repetibilidade (coeficiente de variação) do ensaio quantitativo do presente invento. 0 coefi ciente de variação encontrado foi de cerca de 11-13$.

Na realização dos ensaios do presente invento são utilizadas moléculas paratôpicas, ligadas a meios indicadores, que imunorreagem com apo A-I para assinalar a imunorreacção da apo

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4'

-48A-I com outras moléculas monoclonais paratópicas. Como está presente mais de uma molécula de apo A-I por partícula de HDL, não é evidente se é necessário que as moléculas paratópicas li. gadas à Fase sólida e as moléculas paratópicas ligadas a meios indicadores imunorreajam com diferentes epítopos da apo A-I pja ra obter um resultado rigoroso e preciso no ensaio quantitativo. Uma vez que ambas as moléculas paratópicas são capazes de imunorreagir com praticamente toda a apo A-I ou HDL da amostra, prefere-se contudo que cada um dos dois tipos de moléculas mono clonais paratópicas não iniba a imunorreacção de outras molécu las monoclonais paratópicas.

Como se pode ver dos valores de competitividade imunoenzimométrica das Figuras 1 e 2, a AI-10 marcada com HRPO imunor; reage com apo A-I e HDL. Os valores da Figura 1 mostram que a imunorreacção da AI-10 marcada com a apo A-I é inibida pela presença de AI-10 não marcada mas não pela presença de AI-11 não marcada. A Figura 2 mostra um resultado semelhante quando se usa HDL como antígeno de fase sólida. Resultados comparáveis foram também obtidos usando AI-11 marcada com HRPO com AI-10 não marcada e AI-11 com apo A-I e HDL como antígeno.

Estudos adicionais de ligação em fase fluída usando

125 125

I-HDL e I-apo A-I foram realizados por técnicas de RIA, como descritas na generalidade em Tsao et al. (1982) 0. Biol. Chem. 257:15222-15228. Os resultados desses estudos estão indicados no Quadro 5, abaixo, em percentagem da radioactividade total precipitável pelo ácido tricloroacético (TCA).

66 716
EPG:11-SCRF 103.OA	·:
	·	r'
	-49-
	Quadro 5
Imunorreactividades	de AI-10 e AI-11 em fase fluida

	Ligação máxima	de antígeno (%)
Moléculas
paratópicas·*·	125 2 ^I-HDL	125I-ApO A-I2
AI-10 como:
Sobrenadante	29,2	90,3
Ascites	92,6
Ascites por FPLC	86,0	70,2
AI-11 como:
Sobrenadante	88,6	42,0
Ascites	100,0	49,0
Ascites por FPLC	93,0	60,4

* Foram usadas moléculas paratópicas, em fase fluida, do sobrenadante de uma cultura de células de hibridomas (Sobrenadante), fluido ascítico de ratinho (Ascites) e fluido ascitíco purificado por cromatografia líquida rápida de proteína (Asei tes por FPLC).

Percentagem de radiaactividade precipitável por TCA.

Os valores do Quadro 5 mostram a ligação relativamente alta de AI-10 e AI-11 inteira com HDL radiomarcada, no ensaio em fase fluida utilizado. Esses valores reflectem também a re lativa instabilidade e a resultante fraca ligação à própria apo A-I. Esta instabilidade relativa da apolipoproteína A-I implicou o uso de uma mistura de plasma liofilizado, como padrão secundário no ensaio da apo A-I como atrás se viu. Os vai lores referidos também mostram uma ligação relativamente mais baixa da AI-11 à apo A-I, do que em relação a partículas de HDL. No entanto, a comparação dos valores obtidos, utilizando

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-50o método ELISA para a apo A-I, com os valores obtidos por técni cas mais laboriosas como as do Quadro 4, indica que o método ELISA detecta quantitativamente praticamente toda a apo A-I (HDL) presente nas amostras ensaiadas.

Discutem-se adiante outros resultados obtidos usando o processo de ensaio descrito anteriormente e mais pormenorizada mente na Secção de Materiais e Processos. Como matrizes sólidas foram utilizadas placas de microtitulação em poliestireno, com 96 cavidades. Como primeiras moléculas monoclonais parató picas ligadas à fase sólida, usaram-se anticorpos monoclonais inteiros AI-10. Os locais de ligação não específicos de proteína das superfícies do suporte sólido foram bloqueados com BSA. Como segundas e quartas moléculas monoclonais paratópicas foram usados anticorpos monoclonais inteiros AI-11, ligados a HRPO, usando-se OPD como precursor de corante oxidante para visualização.

Os ensaios de determinação de apo A-I foram realizados em 37 pessoas assintomáticas sem história de CAD. Essas pessoas são referidas como normais.

Os valores de apo A-I foram obtidos usando plasma e soro diluídos como amostras de sangue líquido. Esses valores não mostraram diferenças significantes, sob o ponto de vista estatístico, entre as duas fontes de amostras, e foi usada a sua média.

No Quadro 6, abaixo, apresenta-se um resumo dos resultados para pessoas normais, 23 homens e 14 mulheres separadamente e como valores combinados. E também apresentado no Quadro 6 um resumo semelhante de valores de apo A-I no soro e plasma de 42 homens, clinicamente identificados como tendo CAD.

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I

-51Quadro 6

Níveis normais de apolipoproteína A-I

Homens'	Mulheres'	Combinados''
n = 23	n = 14	n = 37
média = 143	média = 152	média = 147
D.P. = 26,5	D.P. = 10,7	D.P. = 22,0
Zona de variação de D.P. = 116-170	Zona de variação de D.P. = 141-163	Zona de variação de D.P. = 125-169

Pacientes com	CAD
n	-	42
média		110
D.P.	=	28,8
Zona de
variação
de D.P.	=	81,2	- 139

n é o número de pessoas em cada estudo. média é o valor médio de apo A-I obtido, expresso em miligramas por deci litro. D.P. é o valor do desvio padrão da média. Zona de variação de D.P. é a amplitude do desvio padrão para cada lado da média. Os ensaios realizaram-se de acordo com o descrito na Secção de Materiais e Processos.

Revendo os valores anteriores e comparando-os com os for, necidos por Kottke et al. (1986) Mayo Clin. Proc. 61:313-320, pode ver-se que os valores médios, para pessoas normais e paci entes com ÇAD, de apo A-I no referido ensaio, são semelhantes aos apresentados por Kottke et al.. Obtiveram-se desvios padrões semelhantes para ambos os tipos de ensaio.

Esta semelhança de resultados foi surpreendente por vári as razões. Em primeiro lugar, Kottke et al. usaram nos seus eri saios um tratamento de desmascaramento com detergente (Tween 20)

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-52enquanto que no presente invento as amostras de sangue líquido não sofreram esses tratamentos. Em segundo lugar, o grupo de Kottke et al. utilizou uma radio-imunoensaio que é geralmente considerado como mais rigoroso e preciso do que o método ELISA usado aqui. Ver Voller et al. (1976) Buli. World Health Orqan. 53:55-65. Em terceiro lugar, foram usados por Kottke et al. anticorpos policlonais que são normalmente considerados como capazes de melhor imunorreacção com a apo A-I relativamente he terogénea, enquanto que no presente invento foram usados anticorpos monoclonais. Em quarto lugar, o grupo de Kottke et al. utilizou um tempo de manutenção de 16 horas à temperatura ambi ente para a imunorreacção dos seus anticorpos policlonais com apo A-I, enquanto que aqui se utilizou um período de 30 minutos à temperatura ambiente.

III - MATERIAIS E PROCESSOS

A. Lipoproteínas

Nestes estudos, as lipoproteínas foram isoladas de plasma obtido por plasmoforese de sangue de dadores normais em jejum no banco de sangue local (San Diego Plasma Center, San Die go, CA). Com esse intuito, o plasma assim obtido foi ajustado de modo a conter uma concentração final de benzamidina 5 milimolar (mM), fluorofosfato de diisopropilo 1 mM, ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA) 10 mM, inibidor de tripsina de soja, a 10 miligramas por mililitro (mg/ml) e 10.000 unidades por ml de aprotinina. As lipoproteínas foram então isoladas deste plasma ajustado, por ultracentrifugação sequencial usando brometo de potássio sólido (KBr) para ajustamento da densidade.

Primeiro, o plasma ajustado foi centrifugado a cerca de 200.000xg durante 18 a 24 horas. 3untou-se KBr sólido à camada do fundo até que a concentração fosse superior a 1,063 gramas por mililitro (g/ml). A composição resultante foi então acamada sob uma solução de EDTA a 0,1% contendo KBr à concentração de 1,063 g/ml e depois centrifugada a 200.000xg durante mais de 48 horas.

A camada do fundo foi de novo recolhida e juntou-se-lhe *7

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EPG:11-SCRF 103.OA

I

-fes.

-53KBr sólido até a concentração ser superior a 1,21 g/ml.

camada ajustada foi colocada sob uma solução de EDTA a 0,1%, contendo KBr a uma concentração de 1,21 g/ml, e foi de novo centrifugada a 200 OOOxg durante mais de 48 horas.

Recolheu-se a camada de topo e juntou-se KBr até a concentração ser superior a 1,063 g/ml. Essa camada de topo ajus tada foi colocada sob uma solução de EDTA a 0,1%, contendo KBr a uma concentração de 1,063 g/ml e ainda de novo centrifugada a 200 OOOxg durante mais de 48 horas.

A camada intermédia foi recolhida e adicionou-se-lhe KBr sólido até a concentração ser superior a 1,21 g/ml. Essa cama da intermédia ajustada foi colocada sob uma solução de EDTA a 0,1%, contendo KBr a uma concentração de 1,21 g/ml e centrífuga, da a 300 OOOxg durante mais de 48 horas.

A camada de topo foi recolhida e designada por lipoproteínas de alta densidade (HDL) com uma concentração de 1,063 a 1,21 g/ml. A HDL recolhida foi dialisada contra tampão de lipoproteína (LPB) contendo NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, alfa-tocoferol a 0,005% e benzamidina 5 mM, e armazenada em condições de esterilidade por não mais de 21 dias.

B. Isolamento de Apoproteína A-I ) A apoproteína A-I (apo A-I) foi purificada de HDL deslipidada (discutida adiante) por fraccionamento de tamanho usando cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) seguindo o método de Kinoshita et al. (1983) 3. Biochem. .94:615-617. Cerca de 300 mg de HDL deslipidada por éter:etanol foram dissolvidos em 200 microlitros (/il) de dodecilsulfato de sódio (SDS) a 0,1%, fosfato de sódio 0,1 M (pH 7,0) e fraccionada por tamanho em colunas de HPLC TSK 3000 SW - Spherogel (Beckman Instruments Inc., Fullerton, CA), as fracções contendo a apo A-I purificada foram armazenadas a -209C.

C. Produção de Moléculas Monoclonais Paratópicas

0s cinco tipos de moléculas monoclonais paratópicas foram obtidos a partir de três fusões separadas de esplenócitos

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EPG:11-SCRF 103.OA j ,.....·γδί**

-54de ratinhos imunizados Balb/c BY3 (Scripps Clinic and Research Foundation Vivarium, La Oolla, CA) utilizando os protocolos-p£ drão de fusão aqui discutidos. Os sobrenadados das culturas foram recolhidos e rastreados primeiro em fase sólida e, se po, sitiva, rastreados por radio-imunoensaio em fase fluída como se descreve adiante. Todos os hibridomas foram clonados pelo menos duas vezes regulando a diluição e armazenados congelados em azoto líquido.

Resumidamente, os ratinhos Balb/c BYO foram imunizados intraperitonealmente (i.p.) com HDL humana como imunogénio, em adjuvante completo de F_reund (CFA), seguindo-se uma segunda e terceira imunização em adjuvante incompleto de Freund (IFA), ca. da uma separada por cerca de três semanas. Somente para o hi bridoma AI-10 (ATCC HB 9200) a HDL foi primeiro recticulada com glutaraldeído e depois injectada, inicialmente com 500 uni dades de interferon-gama (IFN-Jf) em CFA, e sem IFN- Y na imuni zação em IFA subsequente. A HDL recticulada com glutaraldeído foi preparada fazendo reagir HDL fresca, em solução salina ta_m ponada com fosfato, com glutaraldeído a uma concentração final de 0,04% a 20SC por um período de 18 horas. Para os hibridomas AI-11, AI-12, AI-13 e AI-14 (ATCC HB 9201, HB 9202, HB 9203 e HB 9204) as imunizações foram feitas com HDL nativa. Em todos os casos, cerca de três meses depois da última imunização contendo adjuvante, os ratinhos receberam um reforço por perfu são de HDL, por via intravenosa (i.v.), em solução salina normal e um reforço por perfusão de um dia depois.

animais assim tratados foram sacrificados cerca de três dias depois do último reforço e o baço de cada ratinho foi retirado. Preparou-se então uma suspensão de células do ba ço. As células do baço foram extraídas da suspensão de células de baço por centrifugação durante cerca de 10 minutos a 1000 rpm a 232C. A seguir à remoção do sobrenadante, a pelota de células foi ressuspensa em 5 ml de tampão de lise frio de NH^Cl e foi incubado durante cerca de 10 minutos.

A suspensão de células lisadas juntaram-se 10 ml de Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) (Gibco) e de tampão

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EPG:11-SCRF 103.OA

-55HEPES ido 4-(2-hidroxietil-l-piperidina-etanossulfónico_7 e essa mistura foi centrifugada durante cerca de 10 minutos a 1000 rpm e a 239C.

Decantou-se o sobrenadante, a pelota foi ressuspensa em 15 ml de DMEM e HEPES e centrifugada durante cerca de 10 minutos a 1000 r.p.m. e a 2390. Repetiu-se este procedimento.

A pelota foi então ressuspensa em 5 ml de DMEM e HEPES. Para efeitos de contagem removeu-se uma alíquota da suspensão de células de baço.

As fusões foram realizadas da seguinte forma: usando a linha de células de mieloma de ratinho, não-segregante, P3x63Ag8.653.1, um sub-clone da linha P3x63Ag 8.653 (ATCC 1580). Usando uma proporção de células de mieloma (células de baço de cerca de 1 para 10 ou de cerca de 1 para 5, centrifugou-se uma quantidade suficiente de células de mieloma numa pelota, lavou, -se duas vezes em 15 ml de DMEM e HEPES, e centrifugou-se durante 10 minutos a 1000 rpm e a 239C.

As células de baço e as células de mieloma foram juntas em tubos de fundo redondo de 15 ml (Falcon). A mistura de células foi centrifugada durante 10 minutos a 1000 rpm e a 2390, e o sobrenadante foi retirado por aspiração. Depois juntaram-se 200 /ã de solução aquosa de polietileno-glicol de peso mo lecular 4000, a 30 por cento (peso por volume), (PEG; ATCC Baltimore, MD) a cerca de 379C, usando uma pipeta de 1 ml sob agitação vigorosa para desagregar a pelota e as células foram cuidadosamente misturadas durante 15 a 30 segundos. A mistura de células foi centrifugada durante 4 minutos a 700 r.p.m..

Cerca de 8 minutos depois da adição de PEG, juntaram-se lentamente 5 ml de tampão DMEM+HEPES à pelota, sem perturbar as células. Um minuto depois, a mistura resultante foi desagregada com uma pipeta de 1 ml e incubada por mais 4 minutos. Centrifugou-se esta mistura durante 7 minutos a 1000 r.p.m,. Decantou-se o sobrenadante, juntaram-se lentamente à pelota 5 ml de meio HT (hipoxantina/timidina) e manteve-se a mistura em repouso durante 5 minutos. A pelota foi então desagregada em bocados grandes e a suspensão final de células foi colocada em

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EPG:11-SCRF 103.OA

I

-56balões T75 (2,5 ml por balão) nos quais se tinha colocado ante riormente 7,5 ml de meio HT. A suspensão de células resultante foi incubada a 3790 para desenvolvimento das células fundidas. Após 24 horas juntaram-se 10 ml de meio HT aos balões, seguidos 6 horas depois de mistura com 0,3 ml de aminopterins 0,04 mM. 48 horas depois da fusão das células juntaram-se aos balões 10 ml de meio HAT (hipoxantina/aminopterina/timidina).

Três dias depois da fusão, as células viáveis foram colo, cadas em placas de cultura de tecidos, de 96 cavidades, a cer| ca de 2x10^ células viáveis por cavidade (768 cavidades ao todo), em meio tampão HAT, como foi descrito por Kennett et al., em Curr. Top. Microbicl. Immunol., 81.:77 (1978). As células fo ram alimentadas, sete dias após fusão, com meio HAT e depois a intervalo de cerca de 4-5 dias conforme necessário com meio HT. 0 crescimento foi seguido microscopicamente e os sobrenadantes da cultura que continham anticorpos foram recolhidos no 142 dia para determinação da produção de anticorpos específicos de HDL por radioimunoensaio (RIA) em fase sólida, como foi descri, to por Curtiss e Edgington (1982) 3. Siol. Chem. 257:15213-15221.

0s hibridomas que produziram estes anticorpos anti-HDL, foram rastreados, ensaiados e as suas viabilidades foram deter, minadas. Os hibridomas em causa foram escolhidos de entre cer ) ca de 30 culturas de hibridomas que segregaram anticorpos anti

-HDL nos seus meios de cultura.

D. Preparação e Purificação de Moléculas Paratópicas

Obtiveram-se fluidos ascíticos de ratinhos Balb/c com 10 semanas de idade que tinham sido primo-imunoactivados com 0,3 ml de óleo mineral e injectados intra-peritonealmente com 3-50x10^ células de hibridomas. 0 tempo médio para q desenvo.1 vimento de ascites foi de 9 dias. Depois de clarificados por centrifugação a 1500Qxg, durante 15 minutos, a 2320, os fluidos ascíticos produzidos por cada hibridoma foram misturados e armazenados congelados a -2020.

Prepararam-se moléculas monoclonais paratópicas purifica das, a partir de cada um dos cinco hibridomas, por cromatogra66 716

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-57fia liquida rápida, de proteína (FPLC) usando uma coluna permu tadora de aniões, Pharmacia Mono 0 HR5/5 (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataujay, NO), usando um gradiente de NaCl 0-0,5 molar (M) em Tris 10 mM, pH 8,0, seguindo as instruções dos fornecedores da coluna. Os Mab purificados foram concentrados, usando uma célula de ultrafiltração agitada Amicon (Danvers, MA; membrana PM 30) até uma concentração de 1 mg/ml, dialisados em PBS (solução salina tamponada com fosfato, pH 7,2) e ar, mazenados a -7O0C.

Preparam-se anticorpos monoclonais AI-4, AI-7, AI-9 e AII-1 de acordo com Curtiss e Edgington, (1985) 3. Biol. Chem. 260:2982-2993.

E. Radio-iodação

A radio-iodação de HDL, de apo A-I e de Ig de cabra anti. -ratinho purificada imunoquimicamente, foi realizada enzimaticamente utilizando o procedimento de iodação com Enzymobead e Enzymobeads obtidas de Biorad (Burlingame, CA). A iodação com Enzymobead foi utilizada para caracterizar os antígenos e anticorpos para o radio-imunoensaio em fase sólida, como abaixo se descreve.

0. Deslipidação de Lipoproteínas com solvente

Sempre que necessário, as lipoproteínas são deslipidadas por extracção orgânica e são designadas como lipoproteínas des. lipidadas. Para tal, a lipoproteína a ser analisada foi diali sada contra EDTA a 0,01%, com um valor de pH de 7,5, durante a noite (cerca de 18 horas).

A amostra resultante foi dialisada contra EDTA a 0,003% durante aproximadamente 12 horas e depois liofilizada com 10 a 20 miligramas de proteína por tubo. A cada tubo juntaram-se 35 ml de etanol absoluto/éter anidro (1:1), a 42C e misturou-se a solução resultante.

A seguir à mistura, a solução foi incubada durante 20 mi nutos a -20°C. As soluções foram então centrifugadas durante 30 minutos a lOOOxg, a zero graus C e o sobrenadante retirado.

Z'

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-58A extracção com etanol/éter acima descrita foi de novo realizada duas vezes para se obter um total de três extracções. Quntaram-se então à amostra 35 ml de éter anidro a 4SC e mante ve-se em repouso durante 30 minutos a -202C. A amostra arrefe cida foi centrifugada a lOOOxg durante 30 minutos, a -202C, e o sobrenadante retirado e descarregado. As pelotas secaram-se com azoto gasoso.

H. ELISA Quantitativo da Sanduíche de Apo A-I (HDL)

1. Padrões Primários de Apo A-I: Quantificação de HDL e de Apolipoproteína A-I Isolada

A fracção de HDL (1,063-1,21 g/ml) foi obtida a partir de plasma humano misturado, por técnicas padrão de ultracentrifug£ ção, e dialisada em PBS. Fez-se a sua filtração-estéril por uma unidade de filtração com acrodisco de 0,45 micron e guardou, -se a 42C. 0 teor de proteína da fracção de HDL foi determina do por um ensaio de Lou/ry modificado usando BSA como padrão. Fizeram-se três diluições da fracção HDL, em duplicado, para assegurar que as leituras estavam na parte linear da curva padrão. Por exemplo, a fracção de HDL foi efectuada a diluições de 1:5, 1:10 e 1:20. A concentração da proteína estava normal, mente entre 5 e 10 mg/ml. Para uma armazenagem prolongada a fracção de HDL foi diluída com PBS até uma concentração de pro teína de 1 a 2 mg/ml. Apôs diluição, a concentração da proteí. na foi de novo confirmada pelo ensaio de Loujry com diluições de 1:2, 1:5 e 1:10. Retirou-se então uma alíquota da fracção de HDL diluída e guardou-se a 49C.

A apolipoproteína A-I isolada pode ser obtida de várias fontes comerciais. Ainda que o fabricante inclua habitualmente um certificado do teor e pureza da proteína, a concentração de proteína foi sempre confirmada pelo ensaio de Lotury e se ne cessário ajustada com base nesses resultados. As diluições na preparação de apo A-I foram efectuadas como se descreveu na secção anterior. Fizeram-se alíquotas da preparação e guardaram-se de acordo com as sugestões do fabricante.

As preparações de HDL e/ou apo A-I foram então ensaiadas

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-59como amostras desconhecidas (diluídas a 1:5000), num ELISA de apo A-I (descrito adiante). Durante um período de cinco dias realizaram-se um mínimo de duas placas de ensaio por dia, contendo um conjunto completo de padrões, controlos de qualidade e diluições das preparações de HDL e/ou apo A-I. Os valores do ELISA obtidos para a HDL e/ou apo A-I concordaram a menos de 20% com os valores de ensaio de proteína de Lou/ry. Se os valores obtidos não concordavam dentro dos limites estabelecidos, o ensaio de Loiury era repetido para confirmar o valor de concentração de proteína indicado. Se os valores se mantinham ainda discrepantes, sugeria-se usualmente o envelhecimento ou contaminação da preparação, e considerava-se esta inadequada pai ra padrão primário.

A pureza do padrão primário foi também determinada por electroforese analítica de gel de poliacrilamida-dodecilsulfato de sódio (SDS-PAGE).

2. Preparação e Determinação do Valor de Apo A-I do Padrão Secundário num ELISA

a. Preparação de Plasma Padrão Misturado e Liofilizado

Recolheu-se plasma ou soro frescos de pelo menos 10 sujeitos normolipidémicos que tinham jejuado durante a noite. A felbotomia foi realizada usando tubos estéreis contendo EDTA dissódico, por venipunctura não traumática. Centrifugaram-se as amostras a 1500xg, durante 30 minutos, a 42C e transferiu-se o plasma para tubos limpos, hermeticamente rolhados e guaj? dou-se a 42C por não mais de 24 horas. Combinaram-se quantidja des iguais das amostras, colocaram-se alíquotas de 0,5 ml em pequenos frascos Wheaton de soro de 5 ml, lavados com ácido e fez-se a sua liofilização durante a noite (cerca de 16-18 horas). Os frascos foram selados e guardados a 420.

b. Reconstituição do Padrão de Plasma Misturado e Liofilizado

Antes da reconstituição, deixaram-se os frascos atingir

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1	k <-
	-60-
a temperatura ambiente.	A rolha e o anel de alumínio foram re

tirados, eliminando lentamente o vácuo do frasco. Usando uma pipeta de precisão, os padrões misturados e secos foram recons tituídos com 0,5 ml de água duplamente destilada, deixando escorrer a água lentamente pelas paredes dos frascos. As rolhas foram recolocadas, os frascos rapidamente rodados 3 a 4 vezes e mantidos à temperatura ambiente durante pelo menos 30 minutos. 0 padrão não foi agitado fortemente, nem entra em vortex, mas foi sim cuidadosamente rodado para assegurar solubilização completa.

c. Determinação do Valor de Apo A-I do Padrão Secundário valor de apo A-I do padrão secundário liofilizado é d_e terminado por ELISA de apo A-I usando o padrão primário (HDL ou apo A-I) como calibrador. 0 procedimento de ensaio do ELISA é aqui descrito.

padrão secundário liofilizado foi ensaiado em triplica do como uma amostra desconhecida num mínimo de duas placas de ensaio por dia, durante pelo menos 10 dias, dando origem a um mínimo de 20 valores (média dos triplicados). Fez-se a média de todos os valores obtidos para o padrão secundário e determi nou-se o valor de apo A-I em miligramas por decilitro (mg/dl).

Uma vez estabelecido o valor usou-se o padrão secundário para construir uma curva de padrão que foi ensaiada na mesma placa de ELISA com uma curva do padrão primário com um conjunto completo de controlos. As curvas do padrão primário e secun dário foram ensaiadas num mínimo de 2 placas de ensaio, de 96 cavidades cada, por dia e durante 5 dias.

Uma vez confirmado o valor do padrão secundário, construi ram-se e ensaiaram-se as curvas de padrão na mesma placa de ELISA com o lote confirmado de padrão liofilizado, durante 5 dias (2 placas de ensaio por dia).

3. 0 Ensaio na Generalidade

Moléculas isoladas de AI-10 foram fixadas às paredes das

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-61cavidades das placas de microtitulação de poliestireno (Nunc-Immuno Plate 1; Irving Scientific, Santa Ana, CA) misturando

0,15 ml de um tampão do 5 microgramas por dade. Mantiveram-se de bicarbonato de sódio de pH 9,0, conten mililitro (y<g/ml) de as placas durante 18

AI-1C, em cada cavihoras a 4SC e depcis lavaram-se 3 vezes com PBS contendo BSA a 0,1% e monolaurato de polioxietileno (20)-sorbitano a 0,05% (Tujeen 20). Os locais de ligação não específicos, residuais, foram então bloqueados mis turando 0,2 ml de PBS contendo BSA a 10% em cada cavidade, majo tendo a mistura durante 1 hora a 379C, seguindo-se a lavagem. As cavidades assim preparadas podem ser usadas até cerca de urr.

mês depois da preparação, quando guardadas em câmara humidifi cada.

Diluiu-se HDL humana em PBS até concentrações variando entre 1,0 e 0,031 yxg/ml para usar como soluções padrão de cori trolo. Como se fez notar anteriormente, nestes ensaios usa-se como padrão HDL humana em vez de apo fl-I humana, visto que se verificou que a apo A-I é relativamente instável durante a armazenagem enquanto que a HDL parece ser relativamente mais estável durante a armazenagem. As amostras de plasma (ou de soro) foram diluídas em PBS a 1:5000.

Cinquenta microlitros (^1) de padrão ou de amestra foram misturados nas cavidades em triplicado. Cerca de 5 minutos dei pois, misturaram-se em cada cavidade 50 /11 de PBS contendo mo léculas paratópicas AI-11 marcadas com HRPO. Mantiveram-se as misturas de imunorreacção durante 30 minutos a 259C. Separou-se então das cavidades o material não ligado, lavando como acima se descreveu.

A quantidade de imunorreagente sanduíche fixado na fase sólida contendo marcador HRPO foi então determinada misturando 0,1 ml de solução do substrato, recentemente preparada /~água destilada contendo 3,-5 de H₂0₂ e 0,67 mg/ml de ο,-fenilenodiamina_J7.

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-624. Etapas de ELISA de sanduíche de Apo A-I (HDL)

Realizaram-se os seguintes passos na execução de ELISA da sanduíche de apolipoproteína A-I. Os controlos comerciais foram reconstituídos, de acordo com a indicação da embalagem, com água desionizada. Os controlos foram cuidadosamente roda, dos e mantidos 20-30 minutos à temperatura ambiente para asse, gurar solução completa.

a. Amostras e Controlos

As amostras e controlos são diluídos em PBS a 1:5000. Po, de fazer-se uma diluição em série do modo seguinte:

ykl de amostra + 1,98 ml de PBS (1:100);

uL da diluição anterior + 1,96 ml de PBS (1:5000).

b. Diluição do Padrão padrão de apo A-I (HDL) isolada é diluído até 4 y^g/ml em PBS. Depois fazem-se diluições duplas em série até se obter

0,031 yig/ml. Por exemplo, usando uma preparação de HDL designa da por 860527 que continha 868 Ug/ml:

^g/ml = 46 yxl + 9,954 ml de PBS (1:217);

^g/ml = 1 ml da sol. anterior + 1 ml de PBS e continua, -se em diluições duplas até se obter 0,031 ml.

c. Diluição de AI-11 Marcada com HRPO

Usa-se uma diluição 1:5000 de anticorpo conjugado com HRPO, em PBS. Podem efectuar-se as seguintes diluições:

jaJ. + 1,98 ml de PBS (1:100); e

240 yl da sol. anterior + 11,76 ml de PBS (1:5000).

Cobre-se com folha metálica para protecção contra a luz. Esta quantidade é suficiente para 2 placas.

d. Peróxido de Hidrogénio a 3%

Diluir peróxido de hidrogénio (^02) a 30 por cento, a 1:10 em água destilada.

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e. Substrato de o-fenilenodiamina

Dissolver 1 comprimido de £-fenilenodiamina (OPD) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) em 15 ml de água destilada. Juntar 62,5 yú. de H^O^ a 3 por cento. Cobrir com folha metálica para proteger da luz. Faça substrato fresco sempre que o for usar.

5. Procedimento de Ensaio

a. Equilibre à temperatura ambiente (20-229C) durante pelo menos 20 minutos, uma placa para ELISA ligada a anticorpo. Retire a placa do saco e inverta a placa para remo, ver das cavidades resíduos de tampão. Encha as cavidades com 300 jjI de Tampão de Lavagem (PBS contendo BSA a 0,1% e Tueen a 0,05%, pH 7,2) e mantenha durante 10 minutos. Inverta a placa para remover o tampão e seque a placa sobre toalha de papel. Durante o ensaio não deixe as cavidades vazias por mais de 10 minutos.

b. Junte às cavidades 50 yxl de padrão ou de amostra, em triplicado.

padrão 0 jug/ml tem 50 yLL de PBS.

Junte 50 yj. dos padrões de HDL diluídos às cavidades com padrão (0,031; 0,062; 0,125; 0,25; 0,50; 1,0 jkg/ml).

Junte 50 ^1 dos controlos diluídos e de amostras dos pacientes às respectivas cavidades.

c. Junte 50 de anticorpo ligado a HRPO/ca vidade, a todas as cavidades.

d. Envolva a placa em folha de alumínio e coloque-a num giro-agitador (a cerca de 100 rpm) durante 30 mi nutos à temperatura ambiente (a cerca de 20-25^0).

e. Lave a placa enchendo as cavidades com 300 jXL de Tampão de Lavagem/cavidade e depois inverta a placa para remover o tampão. Repita duas vezes para obter um total de três lavagens. Enxugue a placa sobre toalha de papel após

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-64a terceira lavagem. Não permita que a placa seque completameri te.

f. Junte 100 yd de substrato de OPD prepara do de fresco/cavidade. Deixe a cor desenvolver à temperatura ambiente durante 30 minutos.

g. Pare a reacção com 50 ytl de ácido sulfúrico 4 N em todas as cavidades. Leia a densidade óptica (D.0.) a 492 nm.

I. Quantificação de Lipoproteína e Amostras de Plasma

As amostras de plasma foram obtidas de 20 pacientes com doença da artéria coronária, do laboratório de cateterização cardíaca do Hospital de San Diego VA. 0 plasma foi também obtido de 37 pessoas normais.

sangue foi recolhido em tubos contendo 1,5 mg/ml de etilenodiaminatetraacetato (EDTA) e o plasma fci imediatamente separado por centrifugação a 4^0.

Os totais de colesterol de plasma e de triglicéridos foram medidos em amostras de plasma fresco num laboratório clíni co clássico usando um analisador bicromático Abbott ABA-200, um Boehringer-Manheim high performance cholesterol reatent 236691 e um Abbot Laboratories triglycerides A-gent'*. 0 colesterol de LDL e de HDL foi medido usando as técnicas descritas em Lipid Research Clinic Procedures, HEW Pub. No. 75-628 (NIH), 2^ã. ed., Washington, D.C., Gov. Print. Off. (1974).

0s ensaios quantitativos de apolipoproteína A-I foram também conduzidos usando conjuntos de ensaio do comércio, fornecidos por Isotex Diagnostics of Friendswood, TX; Ventrex La boratories, Inc. ofPortland, ME; Tago, Inc. of Burlingame, CA; e de Colbiochem-Behring of La Jolla, CA. Nos ensaios seguirajn -se as instruçães fornecidas com cada conjunto.

Os estudos quantitativos de ELISA para a apo A-I foram realizados como aqui se descreveu em amostras de soro ou de plasma obtidos de dadores ou em amostras obtidas de preparações laboratoriais, como ofertas, ou de fornecedores do comér-

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-65cio. As amostras comerciais foram obtidas de: Meloy Laborato. ry of Springfield, VA; Scripps Laboratories of La 3olla, CA; Omega/Cooper Biomedical Inc. of Malvern, PA; Isolab Lab of Akron, OH; Calbiochem-Behring of La Oolla, CA; International Union of Immunological Standards (IUIS) disponíveis nos Centers for Disease Control, Atlanta, GA; e Chemicon International, Inc. of EI Segundo, CA. As ofertas foram amavelmente cedidas por Ortho Diagnostic Systems, Inc. of Raritan, NJ. Os padrões de apo A-I foram obtidos de Meloy Laboratories, Scripps Labora tories and Chemicon International.

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3. RIA em Fase Fluida de Antíqeno Marcado com____I

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Para determinar a fracção de partículas I-HDL e de apo A-I ligada por AI-10, AI-11, AI-12, AI-13 e AI-14, utilizou-se um RIA em fase fluida /_ Curtiss e Edgington (1985) 3. Biol. Chem. 260:2982-2993 7« Assim, a 0,1 ml de antígeno (HDL ou apolipoproteína A-l) radio-iodado juntaram-se 0,1 ml de solução salina tamponada com fosfato, pH 7,2 e 0,1 ml de di, ferentes diluições de fluido de cultura de hibridomas de ratinhos ou de fluido ascítico diluído a 1:50 em soro normal de ra tinhos. Todos os tampões continham também dextrano a 5% (peso molecular 40000). Após 18 horas, a 42C, juntou-se 0,1 ml do segundo anticorpo precipitante (soro de IgG de cabra, anti-ratinho). A seguir a uma incubação de 4 horas a 42C, juntaram-se 2 ml de PBS frio e centrifugaram-se os tubos a 2000xg, durante 30 minutos, a 49C. 0s sobrenadantes foram decantados e determinou-se, num contador de raios gama, a actividade do ¹²⁵I.

A radioactividade máxima precipitável foi determinada substituindo o segundo anticorpo por TCA a 100%. A radioactividade mínima precipitável ou a ligação não específica (NSB) foi determinada substituindo os anticorpos de hibridomas específicos por um anticorpo de hibridoma irrelevante da mesma classe de cadeia pesada.

0s valores foram calculados da seguinte forma:

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-66percentagem de ³²³I-antígeno ligado = MEDIfi-NSB x 100

TCA-NSB onde a MEDIA ê a radioactividade média precipitada na preseri ça de uma dada quantidade de anticorpo específico, NSB é a quantidade de radioactividade precipitada não especificamente ligada que foi determinada substituindo as moléculas paratópicas específicas deste invento por um anticorpo ds hibridoma ir relevante da mesma classe de cadeia pesada, e TCA é a radioactividade máxima precipitável com TCA.

K. Ensaio Competitivo Imunoenzimométrico para AI-10 e AI-11

Placas de microtitulação de cloreto de polivinilo flexível foram revestidas durante um período de tempo de cerca de 18 horas (durante a noite) a 420 com 0,2 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo 5 jug/ml de HDL ou de apo A-I purificada. As cavidades foram lavadas três vezes com 0,3 ml de PBS contendo 1,0 g de BSA e 0,5 ml de Tu/een 20 por litro. 0s locais de ligação residuais nas cavidades foram bloqueados por incubação de 0,2 ml de PBS contendo 3,0 g de BSA por litro nas cavidades, durante 1 hora à temperatura ambiente (20-255C). As cavidades foram então lavadas três vezes com tampão de lava, gem. As placas foram usadas logo a seguir.

Incubou-se PBS (0,05 ml) contendo 0,375 ^Ig/ml de AI-10 conjugada com peroxidase de rábano, nas cavidades pré-revestidas, com 0,05 ml de PBS contendo de 0 a 8,0 ^ig/ml de anticorpo monoclonal AI-10 não conjugado ou AI-11 não conjugado. 0 tempo de incubação foi de três horas à temperatura ambiente. As cavidades foram então lavadas três vezes com tampão de lavagem e juntou-se, a todas as cavidades, 0,1 ml de PBS contendo subs trato de £-fenilenodiamina e incubou-se durante 30 minutos à temperatura ambiente (20-259C). Parou-se a reacção de desenvolvimento de cor pela adição de 0,05 ml de h^SO^ 4N a todas as cavidades e determinou-se a densidade óptica (D.0.) de cada cavidade, a 490 nanómetros (nm) usando um leitor de placas de 96 cavidades Dynatech.

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-67Os resultados das placas revestidas com apo A-I estão in dicados na Figura 1 e os resultados da placa revestida com HDL estão indicados na Figura 2. Um aumento de 21 vezes de molécu las AI-11 não marcadas não revelou competição significativa com as moléculas AI-10 marcadas com peroxidase na ligação à HDL ou à apo A-I. 0 estudo foi repetido usando AI-11, marcada com peroxidase, com AI-10 e AI-11 não marcadas, às mesmas concentrações, com praticamente os mesmos resultados.

presente invento foi descrito relativamente às concretizações preferidas. Para os peritos na arte é evidente que podem ser feitas modificações e/ou variações da matéria revela da sem afastamento do âmbito do invento aqui expresso.

Claims (11)

1 - Processo de produção de moléculas paratópicas monoclo nais, que reagem imunologicamente com apolipoproteína A-I, caracterizado por se cultivar, num meio de cultura adequado, um hibridoma escolhido entre os do grupo constituído pelos hibridomas com o número de acesso ATCC HB 9200, HB 9201, HB 9202, HB 9203 e HB 9204, e em seguida se recolherem as moléculas dos sobrenadantes e, opcionalmente, se proceder à purificação das moléculas obtidas.

2 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracteriza. do por a molécula paratópica monoclonal ser um anticorpo completo.

3 - Processo de ensaio da presença de apolipoproteína

A-I numa amostra líquida, compreendendo os seguintes passos:

(a) misturar a amostra líquida a ser ensaiada, com uma quantidade eficaz de moléculas paratópicas monoclonais que imunorreagem com a apolipoproteína A-I e que são segregados por um hibridoma escolhido entre d grupo constituído pelos hibridomas com números de acesso ATCC HB 9200, HB 9201, HB 9202, HB 9203 e HB 9204, para formar uma mistura;

(b) manter a referida mistura em condições de ensaio biológico, durante um período de tempo predeterminado suficiente para que as referidas moléculas paratópicas imunorreajam com a apolipoproteína A-I presente na amostra e formem um imunorreagente ;

(c) determinar a presença de um imunorreagente.

4 - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por as referidas moléculas paratópicas conterem um elemento radioactivo operativamente ligado, e por a presença da referida apolipoproteína A-I ser determinada por separação do imunorreagente da parte restante da mistura e por ensaio da radia ção emitida pelo imunorreagente separado.

5 - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por as moléculas paratópicas monoclonais referidas em primeiro lugar estarem ligadas a uma matriz sólida formando um suporte sólido antes de se preparar a referida mistura, sendo os

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-69locais ds ligação de proteína não específicos do referido supor, te sólido bloqueados e ligando-se o referido imunorreagente formado ao referido suporte sólido como um imunorreagente liga do a uma fase sólida.

6 - Processo de accrdo com a reivindicação 5, caracterizado por a presença do referido imunorreagente ligado a uma fa se sólida ser determinado por:

(i) mistura das segundas moléculas paratópicas monoclonais em fase líquida, com a mistura referida em primeiro lugar para formar uma segunda mistura, as referidas segundas moléculas paratópicas imunorreagindo com a apolipoproteína A-I e sen do segregadas por um hibridoma escolhido entre os do grupo com números de acesso ATCC HB 9200, HB 9201, HB 9202, HB 9203 e

HB 9204, mas que não são utilizadas na mistura primeiramente referida, estando as referidas segundas moléculas paratâpicas operativamente ligadas a um meio indicador de enzima;

(ii) manter a referida segunda mistura em condições de ensaio biológico durante um período de tempo predeterminado, suficiente para que as referidas segundas moléculas paratópicas ligadas ao meio indicador imunorreajam com a apolipoproteí. na A-I presente na referida mistura e formem um imunorreagente sanduíche e uma fase líquida;

(iii) separar as fases líquida e sólida; e (iv) determinar a presença da apolipoproteína A-I ligada ao meio indicador no imunorreagente sanduíche de fase sólida separado, e portanto a presença da apolipoproteína A-I na referida amostra.

7 - Processo para determinar a quantidade de apolipoproteína A-I presente numa amostra líquida, compreendendo os seguintes passos:

(a) misturar uma quantidade predeterminada de amostra li quida com um suporte sólido consistindo essencialmente numa ma triz sólida tendo primeiras moléculas paratópicas monoclonais ligadas à fase sólida que imunorreagem com a apolipoproteína

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-70A-I e que são segregadas por um dos hibridomas com números de acesso ATCC HB 9200 ou HB 9201, para constituir uma mistura de fases sólida-líquida, tendo a superfície do referido suporte locais de ligação de proteína não específicos bloqueados;

(b) manter a referida mistura de fases sólida-líquida sob condições de ensaio biológico durante um período de tempo predeterminado, suficiente para que as referidas primeiras moléculas paratópicas imunorreajam com a apolipoproteína A-I pre. sente na amostra e formem um imunorreagente ligado à fase sóli. da, que contém praticamente toda a apolipoproteína A-I presente na amostra;

(c) misturar a apolipoproteína A-I na referida amostra líquida com as segundas moléculas paratópicas monoclonais em fase líquida que imunorreagem com a apolipoproteína A-I, que são segregadas por um dos hibridomas com números de acesso ATCC HB 9200 ou HB 9201 mas que não são utilizadas na referida primeira mistura, e que estão operativamente ligadas a um meio indicador de enzima para formar uma segunda mistura;

(d) manter a referida segunda mistura sob condições de ensaio biológico durante um período de tempo predeterminado, suficiente para que as referidas segundas moléculas paratópicas ligadas ao meio indicador formem um imunorreagente que con tém praticamente toda a apolipoproteína B-100 na amostra;

(e) separar as fases sólida e líquida resultantes dos passos (a-d) acima referidos; e (f) determinar a quantidade de imunorreagente contendo apolipoproteína A-I ligada ao meio indicador, presente na fase sólida separada, e daí a quantidade de apolipoproteína A-I na referida amostra.

8 - Processo de acordo com a reivindicação 7, onde os re feridos passos de mistura (a) e (c) se realizam praticamente ao mesmo tempo e onde os referidos passos de manutenção (b) e (d) se realizam conjuntamente.

9 - Processo para determinar a quantidade de apolipopro-

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(a) preparar uma mistura de fases sólida-líquida misturando, substancialmente ao mesmo tempo, uma amostra de sangue líquido com um suporte sólido que consiste essencialmente numa matriz sólida tendo as referidas primeiras moléculas paratópicas monoclonais ligadas à fase sólida que imunorreagem com apjo lipoproteína A-I e que são segregadas por um dos hibridomas com o número de acesso ATCC HB 9200 ou HB 9201, e as referidas segundas moléculas paratópicas monoclonais de fase líquida ope, rativamente ligadas ao meio indicador de enzima, e que são segregadas por hibridomas quer de número de acesso ATCC HB 9200 quer de número HB 9201 e que não sejam as primeiras moléculas paratópicas ligadas à matriz sólida, tendo a superfície do referido suporte locais de ligação de proteína não específicos, bloqueados;

(b) manter a referida mistura de fases sólida-líquida sob condições de ensaio biológico durante um período de tempo predeterminado, suficiente para que as referidas primeiras moléculas paratópicas e as referidas segundas moléculas paratópi. cas ligadas ao meio indicador imunorreajam com praticamente to da a apolipoproteína A-I presente na amostra, para formar um imunorreagente sanduíche, ligado à fase sólida, e uma fase líquida ;

(c) separar as fases sólida e líquida; e (d) determinar a quantidade de imunorreagente sanduíche contendo apolipoproteína A-I ligada ao meio indicador, presente na fase sólida separada, e daí a quantidade de apolipoproteína A-I na referida amostra.

10 - Processo de acordo com a reivindicação 9 onde as referidas primeiras moléculas paratópicas são segregadas pelo hibridoma com o número de acesso ATCC HB 9200.

11 - Hibridoma caracterizado por possuir o número de aces. so ATCC escolhido entre o grupo constituído por H3 9200, HB 9201,