PT97914B - Processo de obtencao de polipeptidos de apo ai e de quantificacao de apo ai - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

Campo Técnico

O presente invento refere-se a processos de diagnóstico e a polipéptidos úteis na determinação imunológica da quantidade de Apo AI numa amostra de fluído vascular. Adicionalmente, os polipéptidos são úteis em composições e processos terapêuticos para aumentar a esterificação do colesterol mediada por LCAT e a formação de ésteres de colesterol num paciente humano.

Antecedentes

As lipoproteínas são os transportadores primários do colesterol no plasma. Elas são complexos micelares (partículas) de lípido-proteína tendo uma película à superfície, compreendida por uma ou mais proteínas associadas a lípidos polares, que rodeia um núcleo contendo colesterol. As lipoproteínas foram originalmente classificadas com base nas suas densidades de flutuação como medido por ultracentrifugação. Por consequência, têm sido reconhecidas quatro classes de densidades principais: quilomicra, lipoproteínas de muito baixa densidade (VLDL), lipoproteínas de baixa densidade (LDL) e lipoproteínas de alta densidade (HDL).

Muitos estudos estabeleceram agora uma correlação inversa entre os níveis de colesterol-HDL no plasma e o risco de doença das artérias coronárias (CAD). Isto é, níveis elevados de colesterol no plasma encontrados em partículas de HDL correlacionam-se com um risco reduzido de CAD. Ver, por exemplo, Goldbourt et al.. Int. J. Epidemiol.. 15:51-55 (1986).

Similarmente, muitos estudos mostraram agora que os níveis no plasma de apolipoproteína AI (Apo AI), o principal componente proteico da HDL, estão também inversamente relacionados com o risco de CAD. Adicionalmente, Weisweiler et al.. Clin. Chem.. 27:348 (1981) descreveram que o conhecimento dos níveis de Apo AI podem auxiliar a predição do valor de colesterol-HDL.

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Por causa desta correlação inversa com a CAD, tem havido uma quantidade grande de pesquisa sobre a estrutura e função da Apo

AI no metabolismo dos lípidos. Funcionalmente, pensa-se que a Apo

AI medeia a remoção do colesterol dos tecidos.

Estruturalmente, a Apo AI purificada foi descrita como contendo uma elevada proporção (55%) de hélice alfa, a qual sobe para 70% quando está associada aos fosfolípidos como na partícula de HDL. As propriedades de ligação aos lípidos da Apo AI parecera ser função de uma série de segmentos, que se repetem em tandem, de 22 resíduos de aminoâcido a maioria pontuados por resíduos de prolina que são alfa-helicoidais e anfofílicos.

A sequência de resíduos de aminoâcido da Apo AI, determinada por degradação de Edman de fragmentos de brometo de cianogénio e tripsina, de Apo AI intacta, foi descrita por Brewer et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 80:623-630 (1978). De acordo com Brewer et al., a clivagem com brometo de cianogénio (CNBr) da Apo AI produziu quatro fragmentos principais, designados por CNBrl, CNBr2, CNBr3 e CNBr4, por ordem da sua ocorrência ao longo da sequência de Apo AI do terminal amino ao terminal carboxilo. Porque é de particular interesse para o presente invento, a sequência de resíduos de aminoâcido da região da Apo AI a partir da qual são produzidos o CNBr2 e CNBr3 é ilustrada na Figura 1.

A caracterização imunoquímica da Apo AI nativa, i.e., a Apo AI tal como se encontra nas partículas de HDL, tem sido problemática porque é antigenicamente heterógenea e instável. A heterogeneidade antigénica da Apo AI parece ser o resultado de alguns epitopos que são mascarados por lípidos na HDL intacta ou da capacidade de ligação ao anticorpo de alguns epitopos que são dependentes de conformações da Apo AI quando afectadas por lípidos ou outras proteínas associadas a HDL. A instabilidade antigénica da Apo AI, como manifestada pela sua imunorreactividade que se altera ao longo do tempo com anti-soros definidos, parece ser devida a fenómenos tais como auto-associação e desamidação, os quais se mostrou ocorrerem in vitro.

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-4* ........79^*

Ver Curtiss et al., Proceeding of the Workshop on Lipoprotein Heterogeneity, Ed. por Lippel, National Institutes of Health Publication n^a 87-2646, P. 363-377 (1987). De acordo cora Milthorp et al., Arterio.. 6:285-296 (1986), os efeitos do armazenamento e do tratamento com NaOH na imunorreactividade da Apo AI nativa são semelhantes mas não análogos, sugerindo que embora a perda da imunorreactividade da Apo AI durante o armazenamento seja devida em grande parte à desamidação, algo mais pode estar envolvido.

A heterogeneidade antigénica e a instabilidade da Apo AI tornaram difícil produzir sistemas de ensaio para a quantificação da Apo AI em amostras de fluído vascular de pacientes. Isto acontece porque, inter alia, tais sistemas requerem um material de referência (padrão) cuja imunorreactividade para o anticorpo anti-Apo AI primário do sistema seja compatível, no mínimo, e preferivelmente equivalente àquela da Apo AI na amostra do paciente.

Recentemente, os esforços para ultrapassar os problemas associados à heterogeneidade antigénica e à instabilidade da Apo AI têm sido focados na utilização de anticorpos monoclonais (MAB) para identificar epítopos na Apo AI nativa cuja expressão é compatível ou conservada” sob condições de isolamento e armazenamento específicas. Tais epítopos são aqui referidos como epítopos nativos conservados.

Um exemplo de epítopo de Apo AI nativo conservado, designado por epítopo A, foi definido por Milthorpe et al. , Arterio.. 6:285-296 (1986) como sendo aquela porção CNBrl da Apo AI que imunorreage com MAB 4H1. Isto estava em contraste com os epítopos designados por C, C' e C, todos localizados na região CNBr2 da Apo AI, e os quais mostraram todos ser epítopos não conservados.

Os anticorpos monoclonais AI-4 e AI-11 foram identificados como anticorpos anti-domínio de Apo AI; isto é, anticorpos que se ligam a todas ou à maioria das espécies de partículas de lipoproteína contendo Apo AI no plasma. Ver Hogle et al.. J.

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Lipid. Res.. 29:1221-1229 (1988); e Curtiss et al. , em

Biotechnology of Dyslipoproteinemias: Clinicai Applications in

Diagnosis and Control, Lenfant et al. . eds, pgs. 217-226, Ravem

Press (New York), 1989. Contudo, não foi identificado na Apo AI o epítopo específico com o qual aqueles anticorpos imunorreagem.

-5Mostrou-se, também, que a Apo AI modula a esterificação do colesterol mediada por lecitina:colesterol-aciltransferase (LCAT). Os estudos de Pownall et al.. Biochem, Biophvs. Acta, 793:149-156 (1984) mostraram que é requerida uma interacção entre a Apo AI e a HDL para activação da LCAT que resulta na esterificação do colesterol. Além disso, foram identificadas as regiões específicas de Apo AI que activam a LCAT. Os fragmentos de polipéptido correspondentes a estas regiões foram sintetizados e testados quanto ao potencial de activação da LCAT. De acordo com Sparrow et al.. Ann. N. Y. Acad. Sei.. 384:187-208 (1980) os resíduos 148-185 do fragmento de Apo AI estavam envolvidos na activação da LCAT e na ligação aos lípidos. Estudos similares de Fukushima et al.. J. Biol. Chem. 255:10651-10657 (1980) mostraram que ura polipéptido sintético correspondente aos resíduos 121-164 da Apo AI era 30% tão eficaz como a Apo AI nativa na activação da esterificação do colesterol.

Estudos mais recentes com polipéptidos modelo sintéticos que mimetizam as propriedades físicas da Apo AI nativa mostraram que a activação da LCAT resulta se o polipéptido se associar à HDL. Ponsin et al.. Biochem.. 23:5337-5342 (1984).

Breve Sumário do Invento

Encontraram-se agora dois epítopos na Apo AI que definem os polipéptidos úteis para modular a esterificação do colesterol mediada por LCAT. Adicionalmente, os epítopos representam epítopos nativos conservados que definem polipéptidos úteis em processos de diagnóstico para detectar a Apo AI em amostras de fluído vascular.

Assim, o presente invento contempla um polipéptido de Apo AI compreendendo não mais do que 25 resíduos de aminoácido e

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incluindo uma sequência de resíduos de aminoácido representada pela fórmula: -KVQPYLDDFQKKWQEE-.

É também contemplado um polipéptido da Apo Al compreendendo não mais do que cerca de 60 resíduos de aminoácido e incluindo uma sequência de resíduos de aminoácido representada pela fórmula: -PYLDDXQKKWQEEMEL-, na qual X é E ou F, e é preferivelmente representado pela fórmula

-PYLDDXQKKWQEEMELYRQKVEP-.

Adicionalmente, o invento contempla um sistema de diagnóstico, em forma de conjunto, compreendendo, numa quantidade suficiente para realizar pelo menos um ensaio, um polipéptido de Apo AI do presente invento, preferivelmente o péptido, que está operativamente ligado a uma matriz sólida.

Numa concretização relacionada, o sistema de diagnóstico compreende adicionalmente uma molécula de anticorpo anti-Apo ai que imunorreage com o polipéptido de Apo AI do conjunto, como aqui descrito.

É ainda contemplado adicionalmente um processo para ensaiar a quantidade de Apo AI numa amostra de fluído vascular compreendendo os passos de:

(a) formação de uma mistura de imunorreacção, por mistura de uma amostra de fluído vascular com:

(i) um anticorpo anti-Apo AI do presente invento; e (ii) um polipéptido de Apo AI com o qual o anticorpo imunorreage, estando o referido polipéptido operativamente ligado a uma matriz sólida de tal modo que a mistura de imunorreacção tenha uma fase líquida e uma fase sólida;

(b) manutenção da referida mistura de imunorreacção durante um período de tempo suficiente para formar um produto de imunorreacção contendo Apo AI na fase sólida, e (c) determinação da quantidade de produto formado no passo (b).

É também contemplado um processo terapêutico para aumentar a quantidade de colesterol esterificado num paciente, o qual

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compreende a administração a um paciente de uma quantidade elevadora do colesterol esterificado de um polipéptido de Apo AI deste invento.

Breve Descrição das Figuras

Nas Figuras que formam uma parte desta descrição;

A Figura 1 ilustra a sequência de resíduos de aminoácido de Apo AI, como descrita por Brewer et al., Biochem. Biophvs. Res. Comm., 80:623-630 (1978), dos resíduos de aminoácido das posições 85 a 148 utilizando o código de uma letra. O CNBr 2 da Apo AI, que é formado por clivagem nos resíduos metionina (M) localizados nas posições 86 e 112, corresponde na sequência às posições 87 a 111 sendo a metionina do terminal carboxilo convertida em lactona da homosserina.

CNBr3 da Apo AI, que é formado por clivagem nos resíduos metionina (M) localizados nas posições 112 e 148, corresponde na sequência às posições 113 a 147 sendo a metionina do terminal carboxilo convertida na lactona da homosserina.

epítopo nativo conservado na Apo AI que é definido pelos MAB AI-4 abarca os fragmentos 2 e 3 de CNBr e é compreendido pela sequência de resíduos de aminoácido 99-114. 0 epítopo nativo conservado na Apo AI que é definido pelo MAB AI-11 está confinado ao CNBr2 da sequência de resíduos de aminoácido 96-111.

A Figura 2 ilustra a capacidade da Apo ΑΙ/HDL, HDL presente no plasma fresco e polipéptido AI96-111 para inibirem competitivamente o MAB AI-11 da imunorreacção com AI96-111. As concentrações da proteína foram determinadas de acordo com o processo de Markwell et al.. Anal. Biochem.. 87:206-220 (1978). As unidades no eixo X variam linearmente no que se refere aos três competidores utilizados no ensaio. Os dados indicam que a Apo AI/HDL corresponde a uma concentração de partida de 1 mg/ml seguida por 5 séries de diluições de 2 vezes. Os dados indicam que a HDL presente no plasma fresco corresponde a uma diluição de partida de 1:10 seguida por 6 séries de diluições de 2 vezes. 0

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-8— polipéptido AI96-111 é diluído como acima para o plasma com uma concentração de partida de 1 mg/ml.

A Figura 3 ilustra a capacidade da Apo AI/HDL e dos polipéptidos AI94-125 e AI99-121 para inibirem competitivamente o MAB AI-4 da imunorreacção com Apo AI/HDL. Os polipéptidos AI90-111, AI93-111 e AI96-111 não são inibidores competitivos. A concentração do competidor é mostrada em pg de proteína/ml determinada como descrito na Figura 2.

A Figura 4 ilustra a sequência de resíduos de aminoácido de uma porção da Apo AI como descrita na Figura 1. Um epítopo nativo conservado é definido por MAB AI-4 e o epítopo é mimetizado imunologicamente pelo polipéptido AI99-121 que é mostrado como uma linha cheia. Os polipéptidos AI94-125 e AI99-121, também a cheio, imunorreagem também com MAB AI-4 e mimetizam o epítopo. Os polipéptidos derivados de Apo AI que não imunorreagem com MAB AI-4 nem mimetizam o epítopo são mostrados como linhas finas. Os alinhamentos das linhas finas com as sequências reais da Apo AI são aproximados no que se refere à sequência de resíduos de aminoácido da Apo AI e é indicada numericamente a amplitude dos resíduos de aminoácido que compreendem os polipéptidos de linha fina.

A Figura 5 ilustra a capacidade da Apo AI/HDL e dos polipéptidos AI90-111, AI93-111 e AI96-111 para inibirem competitivamente o MAB AI-11 da imunorreacção com Apo AI/HDL. O polipéptido AI99-121 não é um inibidor competitivo.

A Figura 6 ilustra a sequência de resíduos de aminoácido de uma porção de Apo AI descrita como na Figura 1. Um epítopo nativo conservado é definido por MAB AI-11 e o epítopo é mimetizado imunologicamente pelo polipéptido AI96-111, que é mostrado como uma linha cheia. Os polipéptidos AI84-111, AI85-111, AI90-111, AI93-111, AI94-111 e AI94-125, também a cheio, imunorreagem também com o MAB AI-11 e mimetizam o epítopo. Os polipéptidos derivados da Apo AI que não imunorreagem com MAB AI-11 nem mimetizam o epítopo são mostrados como linhas finas. Os

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alinhamentos dos polipéptidos que não reagem com o MAB AI-ll são como descritos na Figura 4.

A Figura 7 ilustra a capacidade dos MAB AI-4 e AI-ll para inibirem a esterificação do colesterol mediada por LCAT comparada com PBS e com os MAB Al-9, Al-16 e Al-18.

Descrição Detalhada do Invento

A. Definições

Resíduo de Aminoâcido; os resíduos de aminoâcido aqui descritos são preferidos na forma isomérica L. Contudo, os resíduos na forma isomérica D podem ser substituídos por um qualquer resíduo de L-aminoácido, desde que seja mantida no polipéptido a propriedade funcional desejada. O NH₂ refere-se ao grupo amino livre presente no terminal amino de um polipéptido. 0 COOH refere-se ao grupo carboxilo livre presente no terminal carboxilo de um polipéptido. De forma a manter a nomenclatura de padrão de polipéptidos J.Biol, Chem.. 243:3552-59 (1969), as abreviaturas para os resíduos de aminoâcido são mostradas na Tabela de Correspondência seguinte:

Tabela de Correspondência _SÍMBOLO_ Aminoâcido

1-letra 3-letras

¥	Tyr	Tirosina
G	Gly	Glicina
F	Phe	Fenilalanina
M	Met	Metionina
A	Ala	Alanina
S	Ser	Serina
I	Ile	Isoleucina
L	Leu	Leucina
T	Thr	Treonina
V	Vai	Valina
P	Pro	Prolina
K	Lys	Lisina
H	His	Histidina
Q	Gin	Glutamina
E	Glu	Ácido glutâmico
W	Trp	Triptofano
R	Arg	Arginina
D	Asp	Ácido aspártico
N	Asn	Asparagina
C	Cys	Cisteína

_73θ

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-10Deve ser observado que todas as sequências de resíduos de aminoãcido são aqui representadas por fórmulas cuja orientação da esquerda para a direita está na direcção convencional do terminal amino para o terminal carboxilo. Além disso, deve ser observado que um travessão no começo ou no fim de uma sequência de resíduos de aminoácido indica uma ligação peptidica ou uma sequência adicional de um ou mais resíduos de aminoácido ou uma ligação covalente a um grupo terminal carboxilo ou hidroxilo.

Apo AI/HDL: designa a Apo AI quando está presente em partículas de HDL.

Apo AI Deslipidada: refere-se à Apo AI que está substancialmente isenta de lípidos associados.

Apo AI Isolada: Designa a Apo AI que está substancialmente isenta de lípidos associados e de outras proteínas, tais como aquelas, como a Apo AII, que se encontram tipicamente na HDL para além da Apo AI.

Polipéptido e Péptido: polipéptido e péptido são termos aqui utilizados de modo permutável para designar uma série linear de resíduos de aminoácido ligados uns aos outros por ligações peptídicas entre os grupos amino alfa e carboxilo de resíduos adj acentes.

Proteína; Proteína é um termo aqui utilizado para designar uma série linear com mais do que cerca de 50 resíduos de aminoácido ligados uns aos outros como num polipéptido.

Péptido Sintético: Refere-se a uma cadeia quimicamente produzida de resíduos de aminoácido ligados uns aos outros por ligações peptídicas que está isenta de proteínas que ocorrem naturalmente e de seus fragmentos.

B. Polipéptidos

Como aqui utilizada, a frase polipéptido de Apo AI referese a um polipéptido cuja sequência de resíduos de aminoácido corresponde, e preferivelmente é idêntica, a uma porção da molécula da Apo AI.

Numa concretização, um polipéptido de Apo AI do presente

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-11invento compreende não mais do que 25 resíduos de aminc preferivelmente não mais do que cerca de 22 resíduos de aminoácido, e inclui uma sequência de resíduos de aminoácido representada pela fórmula: -KVQPYLDDFQKKWQEE-. Em concretizações preferidas, o polipéptido tem uma sequência de resíduos de aminoácido representada por uma fórmula seleccionada a partir do grupo consistindo em:

QEMSKDLEEVKAKVQPYLDDFQKKWQEE, EMSKDLEEVKAKVQPYLDDFQKKWQEE,

LEEVKAKVQPYLDDFQKKWQEE, VKAKVQPYLDDFQKKWQEE, KAKVQPYLDDFQKKWQEE,

KAKVQPYLDDFQKKWQEEMELYRQKVEPLRAE, e KVQPYLDDFQKKWQEE.

Numa outra concretização, um polipéptido de Apo AI deste invento não compreende mais do que cerca de 6 0 resíduos de aminoácido e inclui uma sequência de resíduos de aminoácido representada pela fórmula: -PYLDDXQKKQEEMEL-, na qual X é E ou F. Preferivelmente, o polipéptido de Apo AI inclui uma sequência de resíduos de aminoácido representada pela fórmula -PYLDDXQKKQEEMELYRQKVEP-, na qual X é E ou F. Em concretizações preferidas, o polipéptido tem um resíduo de aminoácido representado por uma fórmula seleccionada a partir do grupo consistindo em:

KAKVQPYLDDXQKKWQEEMEL,

KAKVQPYLDDXQKKWQEEMELYRQKVEPLRAE, QPYLDDXQKKWQEEMEL, QPYLDDXQKKWQEEMELYRQKVEP,

PYLDDXQKKWQEEMEL, e PYLDDXQKKWQEEMELYRQKVEP.

Os polipêptidos de Apo AI preferidos, as suas designações e as suas posições nos resíduos de aminoácido de Apo AI são mostrados na Tabela 1.

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-12Tabela 1

.....

Designação do

Polipéptido	Secruência de Resíduos de Aminoácidos
AI84-111	QEMSKDLEEVKAKVQPYLDDFQKKWQEE
AI85-111	EMSKDLEEVKAKVQPYLDDFQKKWQEE
AI87-111	SKDLEEVKAKVQPYLDDFQKKWQEE
AI90-111	LEEVKAKVQPYLDDFQKKWQEE
AI93-111	VKAKVQPYLDDFQKKWQEE
AI94-111	KAKVQPYLDDFQKKWQEE
AI94-1141	KAKVQPYLDDFQKKWQEEMEL
AI94-1251	KAKVQPYLDDFQKKWQEEMELYRQKVEPLRAE
AI96-111	KVQPYLDDFQKKWQEE
AI98-1141	QPYLDDFQKKWQEEMEL
AI98-1211	QPYLDDFQKKWQEEMELYRQKVEP
AI99-1141	PYLDDFQKKWQEEMEL
AI99-1211	PYLDDFQKKWQEEMELYRQKVEP

Um X na posição 104 de resíduo de arninoacido indica que um E para ácido glutâmico ou um F para fenilalanina está presente na posição de resíduo 104.

Preferivelmente um polipéptido de Apo AI deste invento é caracterizado adicionalmente pela sua capacidade para mimetizar imunologicamente um epítopo (determinante antigénica) expresso por Apo AI substancialmente em todas as HDL.

Como aqui utilizada, a frase mimetizar imunologicamente nas suas várias formas gramaticais refere-se à capacidade de um polipéptido de Apo AI deste invento para imunorreagir com um anticorpo do presente invento que reconhece um epítopo nativo conservado de Apo AI, como aqui definido.

Deve compreender-se que um polipéptido objecto não necessita de ser idêntico à sequência de resíduos de arninoacido da Apo AI, desde que inclua a referida sequência e seja capaz de imunorreagir com anticorpos do presente invento.

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-13Um polipéptido objecto inclui um qualquer análogo, fragmento ou derivado químico de um polipéptido cuja sequência de resíduos de aminoácido é aqui mostrada, desde que o polipéptido seja capaz de mimetizar imunologicamente um epítopo nativo conservado de Apo AI. Por consequência, um polipéptido presente pode ser submetido a várias mudanças, substituições, inserções e delecções onde tais mudanças proporcionem certas vantagens na sua utilização.

termo análogo inclui um qualquer polipéptido tendo uma sequência de resíduos de aminoácido substancialmente idêntica a uma sequência aqui mostrada especificamente na qual um ou mais resíduos tenham sido substituídos conservativamente por um resíduo funcionalmente similar e que mostra a capacidade de mimetizar a Apo AI, como aqui descrita. Exemplos de substituições conservativas incluem a substituição de um resíduo não polar (hidrofóbico) tal como isoleucina, valina, leucina ou metionina por um outro, a substituição de um resíduo polar (hidrofilico) por um outro tal como entre a arginina e a lisina, entre a glutamina e a asparagina, entre a glicina e a serina, a substituição de um resíduo básico tal como lisina, arginina ou histidina por um outro, ou a substituição de um resíduo ácido, tal como ácido aspártico ou ácido glutâmico por um outro.

A frase substituição conservativa inclui também a utilização de um resíduo derivado quimicamente em vez de ura resíduo não derivado desde que tal polipéptido mostre a actividade de ligação requerida.

derivado químico refere-se a um polipéptido objecto tendo um ou mais resíduos derivados quimicamente por reacção de um grupo funcional lateral. Tais moléculas derivadas incluem, por exemplo, aquelas moléculas nas quais os grupos amino livres foram derivados para formar hidrocloretos de amina, grupos p-toluenossulfonilo, grupos carbobenzoxilo, grupos t-butiloxicarbonilo, grupos cloroacetilo ou grupos formilo. Os grupos carboxilo livres podem ser derivados para formar sais, ésteres metílicos e etílicos ou outros tipos de ésteres ou hidrazidas. Os grupos hidroxilo livres podem ser derivados para

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-14formar derivados 0-acilo ou O-alquilo. O azoto imidazol da histidina pode ser derivado para formar N-im-benzil-histidina. Também incluídos como derivados químicos estão aqueles péptidos que contêm um ou mais derivados de aminoácidos que ocorrem naturalmente de entre os vinte aminoácidos padrão. Por exemplo: a prolina pode ser substituída por 4-hidroxiprolina; a lisina pode ser substituída por 5-hidroxilisina? a histidina pode ser substituída por 3-metil-histidina; a serina pode ser substituída por homosserina; e a lisina pode ser substituída por ornitina. Os polipéptidos do presente invento incluem também qualquer polipéptido tendo uma ou mais adições e/ou delecções ou resíduos relativamente à sequência de um polipéptido cuja sequência é aqui mostrada, desde que seja mantida a actividade requerida.

termo fragmento¹ refere-se a um qualquer polipéptido objecto tendo uma sequência de resíduos de aminoácido mais pequena do que a de um polipéptido cuja sequência de resíduos de aminoácido é aqui mostrada.

Quando um polipéptido do presente invento tem uma sequência que não é idêntica à sequência de uma Apo AI porque foram feitas uma ou mais substituições conservativas ou não conservativas, não são substituídos normalmente mais do que cerca de 30 por cento, mais normalmente não mais do que 20 por cento e, preferivelmente, não mais do que 10 por cento dos resíduos de aminoácido, com a excepção de que o resíduo prolina da posição 99 não pode ser substituído ou sofrer delecção, quando foram adicionados resíduos adicionais em qualquer terminal com a finalidade de proporcionar um ligador (linker) pelo qual os polipéptidos deste invento podem ser convenientemente fixados a um marcador ou matriz sólida, ou transportador, não formando os resíduos do ligador epítopos de Apo AI, i.e., não são semelhantes em estrutura à Apo AI. Os marcadores, as matrizes sólidas e os transportadores que podem ser utilizados com os polipéptidos deste invento são descritos a seguir.

Os ligadores de resíduos de aminoácido são normalmente, pelo menos, um resíduo e podem ser 40 ou mais resíduos, mais

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-15frequentemente 1 a 10 resíduos, mas não formam epítopos de Apo AI. Os resíduos de aminoácido, típicos, utilizados para a ligação são a tirosina, cisteína, lisina, ácido glutâmico e aspártico ou semelhantes. Adicionalmente, um polipéptido objecto pode diferir, a não ser que seja especificado de outro modo, da sequência natural de Apo AI por modificação da sequência por acilação do terminal NH₂, por exemplo acetilação, ou amidação com ácido tioglicólico, por amidação do terminal carboxilo, por exemplo, com amoníaco, metilamina, e semelhantes.

Quando acoplado a um transportador para formar aquilo que é conhecido na arte como um conjugado transportador-hapteno, um polipéptido de Apo AI do presente invento é capaz de induzir anticorpos que imunorreagem com Apo AI, preferivelmente Apo AI quando faz parte de uma partícula de HDL (Apo AI/HDL). Tendo em vista o princípio bem estabelecido de reactivídade imunológica cruzada, o presente invento contempla, por consequência, variantes antigenicamente relacionadas dos polipéptidos mostrados na Tabela 1. Uma variante antigenicamente relacionada é um polipéptido objecto que é capaz de induzir moléculas de anticorpo que imunorreagem com um polipéptido da Tabela 1 e com Apo AI.

Qualquer péptido do presente invento pode ser utilizado na forma de um sal farmaceuticamente aceitável. Os ácidos adequados que são capazes de formar sais com os péptidos do presente invento incluem ácidos inorgânicos tais como ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido perclórico, ácido nítrico, ácido tiociânico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido acético, ácido propiónico, ácido glicólico, ácido láctico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido malónico, ácido succínico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido antranílico, ácido cinâmico, ácido naftaleno-sulfónico, ácido sulfanílico ou semelhantes.

As bases adequadas capazes de formarem sais com os péptidos do presente invento, incluem bases inorgânicas tais como hidróxido de sódio, hidróxido de amónio, hidróxido de potássio e semelhantes; e bases orgânicas tais como mono-, di- e trialquile aril-aminas (por exemplo, trietilamina, diisopropilamina,

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etanolaminas etanolamina, metilamina, dimetilamina e semelhantes) e opcionalmente substituídas (por exemplo, dietanolamina e semelhantes).

Um polipéptido de Apo AI do presente invento também referido aqui como um polipéptido objecto, pode ser sintetizado por qualquer uma das técnicas que são conhecidas daqueles peritos na arte de polipéptidos, incluindo as técnicas de ADN recombinante. As técnicas de química sintética, tais como uma síntese do tipo Merrifield em fase sólida, são preferidas por razões de pureza, especificidade antigénica, isenção dos produtos secundários indesejados, facilidade de produção e semelhantes. Um excelente sumário das muitas técnicas disponíveis pode ser encontrado em J. M. Steward e J.D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, W.H. Preeman Co., San Francisco, 1969; M. Bodanszky, et al., Peptide Synthesis, John Wiley & Sons, Secon Edtion, 1976 e J. Meienhofer, Hormonal Proteins and Peptides, Vol. 2, p.46, Academic Press (New York), 1983, para a síntese de péptidos em fase sólida, e E. Schroder e K. Kubke, The Peptides, Vol. 1, Academic Press (New York), 1965 para a síntese clássica em solução cada um dos quais é aqui incorporado por referência. Os grupos protectores apropriados utilizáveis em tais sínteses estão descritos nos textos anteriores e em J.F.W. McOmie, Protective Groups in Organic Chemistry, Plenum Press, New York, 1973, que é aqui incorporado para referência.

Em geral, os processos de síntese em fase sólida contemplados compreendem a adição sequêncial de um ou mais resíduos de aminoácido ou resíduos de aminoácido adequadamente protegidos, a uma cadeia peptídica em crescimento. Normalmente, o grupo amino ou o grupo carboxilo do primeiro resíduo de aminoácido é protegido por um grupo protector selectivamente removível, adequado. Um grupo protector selectivamente removível, diferente, é utilizado para aminoácidos contendo um grupo lateral reactivo tal como a lisina.

Utilizando uma síntese em fase sólida, como exemplo, o aminoácido protegido ou derivado é ligado a um suporte sólido

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-17inerte através do seu grupo carboxilo ou amino desprotfegiddí O grupo protector do grupo amino ou carboxilo é então removido selectivamente e o amoniácido seguinte na sequência, tendo o grupo (amino ou carboxilo) complementar adequadamente protegido, é misturado e feito reagir sob condições adequadas para formar a ligação amida com o resíduo já ligado ao suporte sólido. O grupo protector do grupo amino ou carboxilo é então removido deste resíduo de aminoácido recentemente adicionado, e é então adicionado o aminoácido seguinte (adequadamente protegido), e assim consecutivamente. Depois de terem sido ligados todos os aminoácidos desejados na sequência correcta, quaisquer grupos protectores de grupo terminal e lateral restantes (e o suporte sólido) são sequencialmente ou concorrentemente removidos, para dar o polipéptido final.

Pode ser utilizado um polipéptido de Apo AI, inter alia, nos processos e sistemas de diagnóstico do presente invento para detectar a Apo AI presente numa amostra corporal, ou pode ser utilizado para preparar um inoculo como aqui descrito para a preparação de anticorpos que imunorreagem com epítopos conservados na Apo Ai.

Adicionalmente, pode ser utilizado um polipéptido de Apo AI deste invento nos processo terapêuticos do presente invento para aumentar a esterificação do colesterol num paciente.

C. Anticorpos e Anticorpos Monoclonais

O termo anticorpo nas suas várias formas gramaticais é aqui utilizado como um substantivo colectivo que se refere a uma população de moléculas de imunoglobulina e/ou porções imunologicamente activas de moléculas de imunoglobulina, i.e., moléculas que contêm um local de combinação de anticorpo ou paratopo.

Um local de combinação de anticorpo é aquela porção estrutural de uma molécula de anticorpo compreendida pelas regiões variáveis e hipervariáveis de cadeia pesada e leve que se

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-18ligam especificamente ao antigénio.

A frase molécula de anticorpo'' nas suas várias formas gramaticais como aqui utilizada contempla uma molécula de imunoglobulina intacta e uma porção imunologicamente activa de uma molécula de imunoglobulina.

Exemplos de moléculas de anticorpo para utilização nos processos e sistemas de diagnóstico do presente invento são as moléculas de imunoglobulina intactas, as moléculas de imunoglobulina substancialmente intactas e aquelas porções de uma molécula de imunoglobulina que contêm o paratopo, incluindo aquelas porções conhecidas na arte como Fab, Fab', F(ab')₂ θ F(v).

As porções Fab e F(ab')₂ de anticorpos são preparadas pela reacção proteolítica da papaína e pepsina respectivamente, em anticorpos substancialmente intactos por processos que são bem conhecidos. Ver, por exemplo, a Patente U.S. N^Q. 4 342 566 de Theofilopolous e Dixon. As porções de anticorpo Fab^z são também bem conhecidas e são produzidas a partir de porções de F(ab')₂ seguida por redução das ligações dissulfureto que ligam as duas porções de cadeia pesada como com mercaptoetanol, e seguida por alquilação do mercaptano da proteína resultante com um reagente tal como iodoacetamida. É preferido um anticorpo contendo moléculas de anticorpo intacto e é aqui utilizado como ilustração.

Numa concretização, um anticorpo do presente invento, i.e., um anticorpo anti-Apo AI, é caracterizado por ser capaz de imunorreagir com 1) Apo AI presente nas partículas de HDL (Apo AI/HDL), 2) Apo AI isolada, 3) Apo AI (CNBr2-CNBr3) e 4) O polipéptido PYLDDFQKKWQEEMELYRQKVEP, e por estar substancialmente isenta de moléculas de anticorpo que imunorreagem com 1) Apo AI CNBrl e 2) os polipéptidos:

SKDLEEVKAKVQPYLDDFEKKWQEE, LEEVKAKVQPYLDDFQKKWQEE, e

YRQKVEPLRAEL.

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Numa outra concretização, um anticorpo anti-Apo AI é caracterizado por ser capaz de imunorreagir com 1) Apo AI/HDL, 2) Apo AI isolada, 3) Apo AI CNBr2 e 4) o polipéptido KVQPYLDDFQKKWQEE, e por estar substancialmente isento de moléculas de anticorpo que imunorreagem com 1) Apo AI CNBrl, 2) Apo AI CBNr3 e 3) os polipéptidos:

SKDLEEVKAKVQPYLDDFQKKWQEE, SKDLEEVKAKVQPYLDDFQ, e

QPYLDDFQKKWQEEMELYRQKVEP.

A imunorreactividade do anticorpo com antigénios contendo Apo AI pode ser medida por uma variedade de ensaios imunológicos conhecidos na arte. Um exemplo de imunorreacção de um anticorpo anti-Apo AI com um fragmento de CNBr é descrito no Exemplo 8. A ligação directa com Apo AI/HDL, Apo AI isolada (preparada como descrito no Exemplo 4) e com polipéptidos de Apo Al pode ser ensaiada, pelo menos, pelos processos descritos no Exemplo 9.

Um anticorpo do presente invento é tipicamente produzido por imunização de um mamífero com um inoculo contendo um polipéptido de Apo AI deste invento e, por consequência, induzido nas moléculas de anticorpo de mamífero tendo imunoespecificidade para o polipéptido de Apo AI. As moléculas de anticorpo são então recolhidas do mamífero e isoladas na extensão desejada, por técnicas bem conhecidas tais como, por exemplo, por utilização de DEAE Sephadex, obter a fracção de IgG.

Para intensificar a especificidade do anticorpo, os anticorpos podem ser purificados por cromatografia de imunoafinidade utilizando um polipéptido de imunização ligado à fase sólida, o anticorpo é posto em contacto com o polipéptido de imunização ligado à fase sólida durante um período de tempo suficiente para o polipéptido imunorreagir com as moléculas de anticorpo para formar um imunocomplexo ligado à fase sólida. Os anticorpos ligados são separados do complexo por técnicas padrão.

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SCRF Case 210.0 (POR) * ²°“

O anticorpo assim produzido pode ser utilizado, inter alia, nos processos e sistemas de diagnóstico do presente invento para detectar a Apo AI presente numa amostra de corpo. Ver, por exemplo, o processo descrito no Exemplo 9.

A palavra inoculo nas suas várias formas gramaticais é aqui utilizada para descrever uma composição contendo um polipéptido de Apo AI deste invento como um ingrediente activo utilizado na preparação de anticorpos contra um polipéptido de Apo AI. Quando é utilizado um polipéptido num inoculo para induzir anticorpos, deve-se compreender que o polipéptido pode ser utilizado em várias concretizações, por exemplo, sozinho ou liqado a um transportador como um conjugado, ou como um polímero polipeptídico. Contudo, para facilidade de expressão e no contexto de um inoculo de polipéptido, as várias concretizações dos polipéptidos deste invento são colectivamente referidas aqui pelo termo polipéptido e pelas suas várias formas gramaticais.

Para um polipéptido que contenha menos do que 35 resíduos de aminoâcido, é preferivel utilizar o péptido ligado a um transportador com a finalidade de induzir a produção de anticorpos.

Podem ser adicionados um ou mais resíduos de aminoâcido adicionais aos terminais amino ou carboxilo do polipéptido para auxiliar a ligação do polipéptido a um transportador. Os resíduos de cisteína adicionados aos terminais amino ou carboxilo do polipéptido têm mostrado ser particularmente úteis na formação de conjugados através de ligações dissulfureto. Contudo podem também ser utilizados outros processos bem conhecidos na arte para a preparação de conjugados. Os exemplos de procedimentos de ligação adicionais, incluem a utilização de produtos de reacção de adição de Michael, dialdeídos tais como glutaraldeído, Klipstein, et al.. J. Infect. Dis., 147:318-326 (1983) e semelhantes, ou a utilização da tecnologia da carbodiimida como na utilização de uma carbodiimida solúvel em água para formar ligações amida com o transportador. Para revisão da conjugação de proteínas ou acoplamento através de grupos funcionais activados

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-21~«^51β|ΐι ver Aurameas, et al.. Scand. J. Immunol., 1:7-23 (1978). w»

Os transportadores úteis são bem conhecidos na arte e são eles próprios geralmente proteínas. Exemplos de tais transportadores são a hemocianina de lapa (Fissurella) (KLH), edestina, tiroglobulina, albuminas tais como albumina de soro de bovino (BSA) ou albumina de soro humano (HSA), glóbulos vermelhos tais como eritrócitos de carneiro (SRBC) toxóide do tétano, toxóide da cólera assim como poliaminoácidos tais como poli(D-lisina: ãcido D-glutâmico) e semelhantes.

A escolha do transportador está mais dependente da utilização final do inoculo e é baseada em critérios não particularmente envolvidos no presente invento. Por exemplo, deve ser seleccionado um transportador que não produza uma reacção indesejável no animal particular a ser inoculado.

O presente inoculo contém uma quantidade imunogénica, eficaz, de um polipéptido deste invento, tipicamente como um conjugado ligado a um transportador. A quantidade de polipéptido eficaz, por dose unitária, suficiente para induzir uma resposta imunitária ao polipéptido de imunização depende, de entre outras coisas, da espécie de animal inoculado, do peso corporal do animal e do regime de inoculação escolhido, como é bem conhecido na arte. Os inóculos contêm tipicamente concentrações de polipéptido de cerca de 10 microgramas a cerca de 500 miligramas por inoculação (dose), preferivelmente cerca de 50 microgramas a cerca de 50 miligramas por dose.

termo dose unitária quando se refere aos inóculos refere-se a unidades fisicamente discretas, adequadas como dosagens unitárias para animais, contendo cada unidade uma quantidade pré-determinada de material activo calculado para produzir o efeito imunogénico desejado em associação com o diluente requerido; i.e., transportador ou veículo. As especificações para a nova dose unitária de um inoculo deste invento são ditadas por, e são directamente dependentes de, (a) as caracteristicas únicas do material activo e do efeito

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imunológico particular a ser alcançado, e (b) as limitações inerentes à arte de compor um tal material activo para utilização imunológica em animais, como aqui descrito em detalhe, sendo estas caracteristicas do presente invento.

Os inóculos são tipicamente preparados a partir do polipéptido-conjugado sólido, seco, por dispersão do polipéptido-conjugado num diluente fisiologicamente tolerável (aceitável) tal como água, solução salina ou solução salina tamponada com fosfato para formar uma composição aquosa.

Os inóculos podem também incluir um adjuvante como parte do diluente. Os adjuvantes tais como adjuvante de Freund completo (CFA), adjuvante de Freund incompleto (IFA) e alumén são materiais bem conhecidos na arte e estão comercialmente disponíveis em várias fontes.

As técnicas de conjugação ou acoplamento de polipéptidos através de grupos funcionais activados presentemente conhecidas na arte são partiçularmente aplicáveis. Ver, por exemplo, Aurameas, et al.. Scand. J. Immunol.. Vol. 8, Soppl. 7:7-23 (1978) e patente U.S. N^a. 4 493 795, N^s 3 791 932 e N^a 3 839 153. Adicionalmente, pode ser realizada uma reacção de acoplamento dirigido ao local de modo a que possa ser minimizada qualquer perda de actividade devida à orientação do polipéptido após acoplamento. Ver por exemplo, Rodwell et al., Biotech.. 3:889-894 (1985) e Patente U.S. N^a 4 671 958.

Um ou mais resíduos de aminoâcido adicionais podem ser adicionados aos terminais amino ou carboxilo do polipéptido para auxiliar a ligação do polipéptido, para formar um conjugado. Os resíduos de cisteína, normalmente adicionados ao terminal carboxilo do polipéptido, mostraram ser partiçularmente úteis na formação de conjugados através de ligações dissulfureto, mas podem ser utilizados outros processos bem conhecidos na arte de preparação de conjugados.

Um anticorpo anti-Apo AI preferido é um anticorpo monoclonal

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-23e é aqui utilizado como exemplo de um anticorpo anti-Apo AI.

A frase anticorpo monoclonal nas suas várias formas gramaticais refere-se a uma população de moléculas de anticorpo que contém uma só espécie de local de combinação de anticorpo capaz de imunorreagir com um epítopo particular. Um anticorpo monoclonal mostra, assim, tipicamente uma afinidade única de ligação para qualquer epítopo com o qual imunorreage. Por consequência, um anticorpo monoclonal pode conter uma molécula de anticorpo tendo uma pluralidade de locais de combinação de anticorpo, cada um imunoespecífico para toa epítopo diferente, por exemplo, um anticorpo monoclonal bi-específico.

Numa concretização, um anticorpo monoclonal é caracterizado por ser capaz de imunorreagir com 1) AI/HDL, 2) Apo ai isolada, 3) Apo AI CNBr2-CNBr3 e 4) o polipéptido PYLDDFQKKWQEEMELYRQKVEP, e por estar substancialmente isenta de moléculas de anticorpo que imunorreagem com 1) Apo AI CNBrl e 2) os polipéptidos:

SKDLEEVKAKVQPYLDDFQKKWQEE, LEEVKAKVQPLYDDFQKKWQEE, e

YRQKVEPLRAEL.

Particularmente preferido é o anticorpo monoclonal produzido pelo hibridoma AI-4, tendo o número de acesso do ATCC HB8744.

Numa outra concretização, um anticorpo monoclonal é caracterizado por ser capaz de imunorreagir com 1) Apo AI/HDL, 2) Apo AI isolada, 3) Apo AI CNBr2 e 4) o polipéptido KVQPYLDDFQKKWQEE, e por estar substancialmente isento de moléculas de anticorpo que imunorreagem com l) Apo AI CNBrl, 2) Apo AI CNBr3 e 3) os polipéptidos:

SKDLEEVKAKVQPYLDDFQKKWQEE SKDLEEVKAKVQPYLDDFQ, e

QPYLDDFQKKWQEEMELYRQKVEP

Particularmente preferido nesta concretização é o anticorpo

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-24monoclonal produzido pelo hibridoma AI-11 tendo o número de acesso do ATCC HB9201.

Um anticorpo monoclonal é tipicamente composto por anticorpos produzidos por clones de uma única célula denominada um hibridoma que segrega (produz) apenas um tipo de molécula de anticorpo. A célula de hibridoma é formada por fusão de uma célula produtora de anticorpo e um mieloma ou outra linha de células auto-perpetuantes. A preparação de tais anticorpos foi primeiro descrita por Kohler e Milstein, Nature 256:495-497 (1975) cuja descrição é incorporada para referência. Os sobrenadantes de hibridoma assim preparados podem ser rastreados quanto à presença de moléculas de anticorpo que imunorreagem com um polipéptido de Apo AI ou quanto à inibição da ligação à HDL pelos polipéptidos de Apo AI deste invento.

Resumidamente, para formar o hibridoma a partir do qual é produzida a composição de anticorpos monoclonais, um mieloma ou outra linha de células auto-perpetuantes é fundido com linfócitos obtidos a partir do baço de um mamífero hiper-imunizado com um antigénio de Apo AI, tal como está presente em partículas de lipoproteína contendo Apo AI, ou com um polipéptido de Apo AI deste invento. A tecnologia de hibridoma induzido por polipéptido é descrita por Niman et al., Proc. Natl. Sei., U.S.A.. 80:4949-4953 (1983) cuja descrição é aqui incorporada para referência.

Prefere-se que a linha de células de mieloma utilizada para preparar um hibridoma seja da mesma espécie que os linfócitos. Tipicamente, um ratinho da estirpe 129 G1X⁺ é o mamífero preferido. Os mielomas de ratinho adequados para utilização no presente invento incluem as linhas de células sensíveis a hipoxantina-aminopterina-timidina (HAT) P3X63-Aq8.653 e Sp2/0-Agl4 que estão disponíveis na American Type Culture Collection, Rockville, MD, sob as designações CRL 1580 e CRL 1581 respectivamente.

Os esplenócitos são tipicamente fundidos com células de

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25- < ......

Sm 's mieloma utilizando polietilenoglicol (PEG) 1500. Os híbridos fundidos são seleccionados pela sua sensibilidade à HAT. Os hibridomas que produzem um anticorpo monoclonal deste invento são identificados utilizando o radio-imunoensaio (RIA) e o ensaio de imunossorção com enzima ligada (ELISA) descritos nos Exemplos 10 e 9, respectivamente.

Um anticorpo monoclonal do presente invento pode também ser produzido por iniciação de uma cultura de hibridoma monoclonal compreendendo um meio nutriente contendo um hibridoma que segrega moléculas de anticorpo com a especificidade de polipéptido apropriada. A cultura é mantida sob certas condições e durante um período de tempo suficiente para o hibridoma segregar as moléculas de anticorpo para o meio. 0 meio contendo anticorpo é então recolhido. As moléculas de anticorpo podem então ser isoladas adicionalmente por técnicas bem conhecidas.

Os meios úteis para a preparação desta composições são bem conhecidos na arte e estão disponíveis comercialmente e incluem meios de cultura sintéticos, ratinhos consanguíneos e semelhantes. Um exemplo de meio sintético é o meio essencial mínimo de Dulbecco (DMEM; Dulbecco et al.. virol. 8:396 (1959)) suplementado com 4,5 g/1 de glucose, glutamina 20 mM e 20% de soro de vitelo fetal . Um exemplo de uma estirpe de ratinho consanguíneo é a Balb/c.

Os anticorpos monoclonais deste invento podem ser utilizados da mesma maneira que a aqui descrita para os anticorpos do presente invento.

Por exemplo, o anticorpo monoclonal pode ser utilizado nos processo e sistemas de diagnóstico aqui descritos onde for desejada a formação de um produto de imunorreação contendo Apo AI.

Um hibridoma útil na produção de um anticorpo monoclonal objecto, i.e., MAB AI-4 e MAB AI-11 são os hibridomas 611AV63C2.111 e H10308.1011, tendo sido os referidos hibridomas

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-26depositados de acordo com os Requisitos do Tratado de Budapeste na American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD 20852 U.S.A. em 5 de Março de 1985 e em 16 de Setembro de 1986, respectivamente, e dadas as designações do ATCC HB8744 e HB9201, respectivamente. Deve-se observar que pode ser utilizado o hibridoma ATCC 1580, como é bem conhecido na arte, para produzir outras linhas de células imortais que produzam um anticorpo monoclonal objecto e assim a produção de um anticorpo monoclonal objecto não está por si dependente dos hibridomas de cultura do ATCC HB8744 e HB9201.

São também bem conhecidos outros processos de produção de um anticorpo monoclonal, de uma célula de hibridoma ou de uma cultura de células de hibridoma. Ver, por exemplo, o processo de isolamento de anticorpos monoclonais a partir de um reportório imunológico como descrito por Sastry, et al.. Proc. Natl. Acad. sei., 86:5728-5732 (1989); e Huse et al., Science, 246:1275-1281 (1981).

Também contempladas por este invento são a célula de hibridoma e as culturas contendo uma célula de hibridoma que produzem um anticorpo monoclonal deste invento.

D. Sistemas de Diagnóstico presente invento descreve também um sistema de diagnóstico, preferivelmente na forma de conjunto, para ensaiar quanto à presença de Apo AI ou de um polipéptido de Apo AI uma amostra de fluído. Um sistema de diagnóstico inclui, numa quantidade suficiente para, pelo menos, um ensaio, um polipéptido de Apo AI objecto e/ou um anticorpo ou anticorpo monoclonal objecto, como um reagente imunoguímico embalado separadamente. As instruções para a utilização do reagente embalado estão também tipicamente incluídas.

Como aqui utilizado, o termo embalagem refere-se a uma matriz ou material sólido tal como vidro, plástico, papel, folha e semelhantes, capaz de manter dentro de limites fixos um

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-27,_W:,.

polipéptido, anticorpo policlonal ou um anticorpo monoclonal do presente invento. Assim, por exemplo, uma embalagem pode ser um frasco de vidro utilizado para conter quantidades da ordem dos miligramas de um polipéptido contemplado ou pode ser um alvéolo de placa de microtitulação à qual foram operativamente fixadas quantidades da ordem dos microgramas de um polipéptido contemplado, i.e., ligado de forma a ser capaz de ser imunologicamente ligado por um anticorpo.

As instruções para utilização incluem tipicamente uma expressão tangível que descreve a concentração de reagente ou, pelo menos, um parâmetro do processo de ensaio tal como as quantidades relativas de reagente e amostra a serem misturados, períodos de tempo de manutenção para as misturas de reagente/amostra, temperatura, condições de tampão e semelhantes.

Numa concretização, um sistema de diagnóstico para ensaiar quanto à presença de, ou para quantificar, a Apo AI numa amostra, tal como sangue, plasma ou soro, compreende uma embalagem contendo, pelo menos, um polipéptido de Apo AI deste invento. Numa outra concretização, um sistema de diagnóstico do presente invento para ensaiar quanto à presença, ou a quantidade, de Apo AI ou de um polipéptido de Apo AI numa amostra inclui adicionalmente uma composição de anticorpo anti-Apo AI deste invento. Um exemplo de sistema de diagnóstico é descrito no Exemplo 9.

Em concretizações preferidas, um sistema de diagnóstico do presente invento inclui adicionalmente um marcador ou um meio de indicação capaz de assinalar a formação de um imunocomplexo contendo um polipéptido ou molécula de anticorpo do presente invento.

A palavra complexo como aqui utilizada refere-se ao produto de uma reacção de ligação específica tal como uma reacção de anticorpo-antigénio ou receptor-ligando. Os complexos exemplares são os produtos de imunorreacção.

^{72 730} /7

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-28Como aqui utilizados, os termos marcador e meio de indicação nas suas várias formas gramaticais referem-se a átomos e moléculas simples que estão directamente ou indirectamente envolvidos na produção de um sinal detectável para indicar a presença de um complexo. Qualquer marcador ou meio de indicação pode ser ligado ou incorporado numa proteína, polipéptido ou molécula de anticorpo expressa que faça parte de uma composição de anticorpo ou de anticorpo monoclonal do presente invento ou utilizado separadamente, e aqueles átomos ou moléculas podem ser utilizados sozinhos ou em conjunção com reagentes adicionais. Tais marcadores são eles próprios bem conhecidos na química do diagnóstico clínico e constituem uma parte deste invento apenas no sentido de terem sido utilizados com processos e/ou sistemas de proteínas de outro modo novos.

Os meios de marcação podem ser um agente de marcação flurescente que se liga quimicamente a anticorpos ou antigénios sem os desnaturar para formar um fluorocromo (corante) que é um elemento imunofluorescente detectável útil. Os agentes de marcação fluorescentes adequados são fluorocromos tais como isocianato de fluoresceína (FIC), isotiocianato de fluoresceína (FITC), cloreto de 5-dimetilamina-l-naftaleno-sulfonilo (DANSC), isotiocianato de tetrametilrodamina (TRITC), lissamina, sulfonilo de rodamina 8200 cloreto (RB 200 SC) e semelhantes. Encontra-se uma descrição das técnicas de análise por imunofluorescência em Deluca, Immunofluorescence Analysis, Antibody As a Tool, Marchalonis, et al., eds., John Wiley & Sons Ltd., pgs. 189-231 (1982), que são aqui incorporados por referência.

Em concretizações preferidas o grupo de indicação é uma enzima, tal como peroxidase de rábano silvestre (HRP), glucose-oxidase ou semelhantes. Em tais casos onde o principal grupo de indicação é uma enzima tal como HRP ou glucose-oxidase, são requeridos reagentes adicionais para visualisar o facto de se ter formado um complexo receptor-ligando (imunorreagente). Tais reagentes adicionais para o HRP incluem peróxido de hidrogénio e um precursor de corante de oxidação tal como diaminobenzidina. Um reagente adicional útil com glucose-oxidase é o ácido

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-29“29— ‘tíkf*

2,2'-azino-di-(3-etil-benzotiazolina)-G-sulfónico (ABTS).

Os elementos radioactivos são também agentes de marcação úteis e são aqui utilizados como ilustração. Um exemplo de agente radiomarcador é um elemento radioactivo que produz emissões de raios gama. Os elementos que emitem eles próprios raios gama, tais como ¹²⁴I, -*-²⁸l, ¹³²i e ⁵¹Cr representam uma classe de grupos de indicação de elementos radioactivos que produzem emissão de raios gama. Particularmente preferido é o Um outro grupo de meios de marcação úteis são aqueles elementos tais como ¹³-C, ¹⁸F, ¹⁵O e ¹³N que emitem, eles próprios positrões. Os positrões assim emitidos produzem raios gama após encontro com electrões presentes no corpo do animal. É também útil um emissor beta, tal como índio de ³H.

A ligação dos marcadores i.e., a marcação de polipéptidos e proteínas é bem conhecida na arte. Por exemplo as moléculas de anticorpo produzidas por um hibridoma podem ser marcadas por incorporação metabólica de aminoácidos contendo radioisótopos fornecidos como um componente do meio de cultura. Ver, por exemplo, Galfre et al.. Meth. Enzvmol.. 73:3-46 (1981). São particularmente aplicáveis as técnicas de conjugação ou acoplamento de proteínas através de grupos funcionais activados. Ver, por exemplo, Aurameas, et al.. Scand. J. Immunol., Vol. 8 Supl. 7:7-23 (1978), Rodwell et al.. Biotech.. 3:889-894 (1984), e Patente U.S. No. 4 493 795.

Os sistemas de diagnóstico podem também incluir, preferivelmente como uma embalagem separada, um agente de ligação específico. Um agente de ligação específico é uma entidade molecular capaz de ligar selectivamente uma espécie reagente do presente invento ou um complexo contendo essa espécie, mas não é ele mesmo um polipéptido ou composição de molécula de anticorpo do presente invento. Os exemplos de agentes de ligação específicos são as segundas moléculas de anticorpo, proteínas do complemento ou seus fragmentos, proteína A de S.aureus e semelhantes. Preferivelmente, o agente de ligação específico liga-se à espécie reagente quando aquela espécie está presente '-«ei '

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-30como parte de um complexo.

Nas concretizações preferidas o agente de ligação específico está marcado. Contudo, quando o sistema de diagnóstico inclui um agente de ligação específico que não está marcado, o agente é utilizado tipicamente como um meio ou reagente de amplificação. Nestas concretizações, o agente de ligação específico marcado é capaz de se ligar especificamente a meios de amplificação quando o meio de amplificação está ligado a um complexo contendo uma espécie reagente.

Os conjuntos de diagnóstico do presente invento podem ser utilizados num formato ELISA para detectar a quantidade de Apo AI numa amostra de fluido vascular tal como sangue, soro ou plasma. ELISA refere-se a um ensaio de imunossorção de enzima ligada que emprega um anticorpo ou antigénio ligado a uma fase sólida e um conjugado enzima-antigénio ou enzima-anticorpo para detectar e quantificar a quantidade de um antigénio presente numa amostra. Uma descrição da técnica de ELISA é encontrada no Capítulo 22 da 4^a Edição do Basic and Clinicai Immunolocrv por D.P. Sites et al., publicado por Lange Medicai Publications of Los Altos, CA em 1982 e nas Patentes U.S. N². 3 654 090; N². 3 850 752; e N². 4 016 043 que são todos aqui incorporados para referência.

Assim, nas concretizações preferidas, um polipéptido de Apo AI ou um anticorpo monoclonal do presente invento podem ser fixados a uma matriz sólida para formar um suporte sólido que compreende uma embalagem nos sistemas de diagnóstico objecto.

Um reagente é tipicamente fixado a uma matriz sólida por adsorção a partir de um meio aquoso embora possam ser utilizados outros modos de fixação aplicáveis a proteínas e polipéptidos bem conhecidos daqueles peritos na arte.

São também bem conhecidas na arte as matrizes sólidas úteis.

Tais materiais são insolúveis em água e incluem dextrano reticulado disponível sob a marca registada SEPHADEX na Pharmacia

Fine Chemicals (Piscataway, NJ); agarose; pérolas de poliestireno

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-31de cerca de 1 micra a cerca de 5 milimetros de diâmetro* disponíveis em Abbott Laboratories of North Chicago, IL; poli(cloreto de vinilo), poliestireno, poliacrilamida reticulada, telas à base de nitrocelulose ou nilão tais como folhas, tiras ou pás; ou tubos, placas ou os alvéolos de uma placa de microtitulação tais como aquelas feitas de poliestireno ou de poli(cloreto de vinilo).

A espécie reagente, o agente de ligação específico marcado ou o reagente de amplificação de um qualquer sistema de diagnóstico aqui descrito podem ser fornecidos em solução, como uma dispersão líquida ou como um pó substancialmente seco, por exemplo, na forma liofilizada. Quando o meio de indicação é uma enzima, o substrato da enzima pode também ser fornecido numa embalagem separada de um sistema. Um suporte sólido tal como a placa de microtitulação anteriormente descrita e um ou mais tampões podem também ser incluídos como elementos embalados separadamente neste sistema de ensaio de diagnóstico.

Os materiais de embalagem aqui discutidos relativamente aos sistemas de diagnóstico são aqueles normalmente utilizados em sistemas de diagnóstico.

termo embalagem refere-se a uma matriz ou material sólido tal como vidro, plástico (por exemplo, polietileno, polipropileno e policarbonato), papel, folha e semelhantes capazes de manter dentro de limites fixos um reagente de diagnóstico tal como um polipéptido, anticorpo ou anticorpo monoclonal do presente invento. Assim, por exemplo, uma embalagem pode ser uma garrafa, frasco, invólucro de plástico laminado ou um recipiente semelhante utilizado para conter um reagente de diagnóstico contemplado ou pode ser um alvéolo de placa de microtitulação ao qual foram fixadas operativamente quantidades da ordem dos microgramas de um reagente de diagnóstico contemplado i.e., ligado de modo a ser capaz de ser imunologicamente ligado por um anticorpo ou polipéptido a ser detectado.

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E. Processos de Ensaio presente invento contempla vários processos de imunoensaio para a determinação da quantidade de Apo AI numa amostra de fluído biológico utilizando um polipéptido, anticorpo policlonal ou anticorpo monoclonal deste invento como um reagente imunoquímico para formar um produto de imunorreacção cuja quantidade se relaciona, directa ou indirectamente, com a quantidade de Apo AI na amostra. Aqueles peritos na arte compreenderão que há numerosos procedimentos químicos de diagnóstico clínico bem conhecidos nos quais um reagente imunoquímico deste invento pode ser utilizado para formar um produto de imunorreacção cuja quantidade se relaciona com a quantidade de Apo AI presente numa amostra corporal. Assim, embora sejam aqui descritos exemplos de processos de ensaio, o invento não está tão limitado.

Podem ser empregues vários protocolos heterogénios e homogénios, competitivos ou não competitivos na realização de um processo de ensaio deste invento. Por exemplo o presente invento contempla um processo competitivo para ensaiar quanto à quantidade de Apo AI uma amostra de fluido vascular, caracterizado por compreender os passos de:

(a) Formação de uma mistura de imunorreacção por mistura de uma amostra de fluido vascular com:

(i) um anticorpo do presente invento, preferivelmente um anticorpo monoclonal, e (ii) um polipéptido de Apo AI do presente invento que é capaz de imunorreagir com o anticorpo adicionado no passo (i).

Preferivelmente a amostra de fluido vascular é fornecida como uma quantidade conhecida de sangue, ou de um produto derivado de sangue tal como soro ou plasma. Sem olhar ao tipo de amostra utilizada, é preferivelmente obtida a partir de uma pessoa que foi deixada em jejum, pelo menos, durante cerca de 12 horas, como é conhecido na arte. Uma tal amostra é referida como uma amostra em jejum. Observa-se também que quando for utilizado soro ou plasma como amostra, aquela amostra não necessita de

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ser submetida a tratamento cora um agente de desnaturação ou caotrópico com a finalidade de alterar a expressão do epítopo de Apo AI a ser ensaiado.

Numa concretização, o processo de diagnóstico inclui a formação de uma mistura de imunorreacção por mistura de uma amostra de fluido vascular com:

(i) uma molécula de anticorpo anti-Apo AI que imunorreage com 1) Apo AI/HDL, 2) Apo AI isolada, 3) Apo AI CNBr2-CNBr3 e 4) o polipéptido PYLDDFQKKWQEEMELYRQVEP e está substancialmente isento de moléculas de anticorpo que imunorreage com 1) Apo AI CNBr2 e 2) os polipéptidos:

SKDLEEVKAKVQPYLDDFQKKWQEE, LEEVKAKVQPLYDDFQKKWQEE, e

YRQKVEPLRAEL; e (ii) um polipéptido de Apo AI do presente invento que inclui uma sequência de resíduos de aminoâcido representada pela fórmula: -PYLDDXQKKWQEEMELYRQKVEP- e que inclui preferivelmente uma sequência de resíduos de aminoâcido representada pela fórmula: -PYLDDXQKKWQEEMELYRQKVEP-. Em concretizações partiçularmente preferidas, o anticorpo é o anticorpo monoclonal produzidos pela linha de células de hibridoma tendo a designação ATCC HB 8744 e o polipéptido é seleccionado a partir do grupo de polipéptidos mostrado na Tabela 1 consistindo em AI99-121, AI94-125, AI94-114, AI98-114, AI98-121, e AI99-114.

Numa outra concretização, a mistura de imunorreacção é formada por mistura de uma amostra de fluido vascular com:

(i) uma molécula de anticorpo anti-Apo AI que imunorreage com 1) Apo AI/HDL, 2) Apo AI isolada, 3) Apo AI CNBr2 e 4) o polipéptido KVQPYLDDFQKKWQEE e está substancialmente isenta de moléculas de anticorpo que imunorreagem com 1) Apo AI CNBrl, 2) Apo AI CNBr3 e 3) os polipéptidos:

SKDLEEVKAKVQPYLDDFQKKWQEE, SKDLEEVKAKVQPYLDDFQ, e

QPYLDDFQKKWQEEMELYRQKVEP; e

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SCRF Case 210.0 (POR) (ii) um polipéptido de Apo AI do presente invento que inclui uma sequência de resíduos de aminoácido representada pela fórmula: -KVQPYLDDFQKKWQEE-. Em concretizações particularmente preferidas, o anticorpo é o anticorpo monoclonal produzido pela linha de células de hibridoma tendo a designação ATCC HB9201, e o

-34polipéptido é seleccionado a partir do grupo de polipéptidos mostrados na Tabela 1 consistindo em AI96-111, AI93-111, AI84-111, AI85-111, AI87-111, e AI94-111 AI94-125 e AI90-111.

Preferivelmente, é conhecida a quantidade de anticorpo que é misturada. São adicionalmente preferidas as concretizações onde o anticorpo está marcado i.e., ligado operativamente a um meio de indicação tal como uma enzima, radionuclido e semelhantes.

Preferivelmente, o polipéptido de Apo AI está presente como parte de um suporte sólido, i.e., ligado operativamente a uma matriz sólida, de modo a que a mistura de imunorreacção formada tenha uma fase sólida e uma fase líquida. São adicionalmente preferidas as concretizações nas quais a quantidade de polipéptido presente na mistura de imunorreacção é uma quantidade suficiente para formar um excesso de epítopos relativamente ao número de locais de combinação de anticorpo presentes na mistura de imunorreacção capaz de imunorreagir com aqueles epítopos.

(b) A mistura de imunorreacção é mantida sob certas condições de ensaio biológico durante um período de tempo predeterminado tal como de cerca de 10 minutos a cerca de 16-20 horas a uma temperatura de cerca de 4 graus C a cerca de 45 graus c sendo um tal tempo suficiente para Apo AI presente na amostra imunorreagir com (ligar-se imunologicamente) uma porção dos locais de combinação de anticorpo anti-Apo AI presentes no anticorpo monoclonal para formar um produto de imunorreacção contendo Apo AI (imunocomplexo). Nas concretizações em que o polipéptido está na fase sólida, o imunocomplexo formado está também presente na fase sólida.

As condições de ensaio biológico são aquelas que mantêm a actividade biológica dos reagentes imunoquímicos deste invento e

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«BB»

•''SÍw a Apo AI que se pretende ensaiar. Aquelas condições incluem uma

-35gama de temperaturas de cerca de 4 graus C a cerca de 45 graus c, uma gama de valores de pH de cerca de 5 a cerca de 9 e uma força iónica que varia desde a da água destilada até aproximadamente à do cloreto de sódio um molar. Os processos para optimizar tais condições são bem conhecidas na arte.

(c) É determinada a quantidade de produto de imunorreacção contendo Apo AI que foi formada no passo (b), determinando-se assim a quantidade de Apo AI presente na amostra.

A determinação da quantidade do produto de imunorreacção contendo Apo AI, directa ou indirectamente, pode ser realizada por técnicas de ensaio bem conhecidas na arte, e depende tipicamente do tipo de meio de indicação utilizado.

Nos processos de ensaio competitivo preferidos, a quantidade de produto determinada no passo (c) está relacionada com a quantidade de produto de imunorreacção formada similarmente e determinada utilizando uma amostra de controlo em vez da amostra de fluido vascular, em que a amostra de controlo contém uma quantidade conhecida de um polipéptido objecto, a partir da qual é determinada uma curva padrão.

Um exemplo do ensaio de diagnóstico competitivo contemplado, no qual um polipéptido de Apo AI é operativamente ligado a uma matriz sólida, é o ELISA descrito no Exemplo 9.

Numa outra concretização, o presente invento contempla um anticorpo duplo ou um imunoensaio de tipo sanduíche compreendendo os passos de:

(a) formação de uma primeira mistura de imunorreacção por mistura de uma amostra de fluido vascular com um primeiro anticorpo, preferivelmente um anticorpo monoclonal, em que o anticorpo e a Apo ΑΙ/HDL presentes na amostra são capazes de formar um primeiro produto de imunorreacção que pode imunorreagir com um anticorpo monoclonal objecto. Preferivelmente, o primeiro anticorpo é ligado operativamente a uma matriz sólida.

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-36(b) manutenção da primeira mistura de imunorreacção assim formada sob certas condições de ensaio biológico durante um período de tempo suficiente para formar o primeiro produto de imunorreacção. Preferivelmente, o primeiro produto de imunorreacção é então separado da amostra.

(c) formação de uma segunda mistura de imunorreacção por mistura do primeiro produto de imunorreacção com um segundo anticorpo, preferivelmente um anticorpo monoclonal, em que o segundo anticorpo e a Apo AI/HDL presentes no primeiro produto de imunorreacção são capazes de formar um segundo produto de imunorreacção.

(d) manutenção da segunda mistura de imunorreacção assim formada sob certas condições de ensaio biológico durante um período de tempo para formar o segundo produto de imunorreacção ou o produto de imunorreacção de tipo sanduíche.

(e) determinação da quantidade do segundo produto de imunorreacção que foi formado e, assim, da quantidade de Apo AI na amostra.

Preferivelmente, o anticorpo monoclonal objecto do passo (c) é marcado, preferivelmente com uma enzima e, por consequência, o segundo produto de imunorreacção formado é um produto marcado.

Numa concretização, a detecção de polipéptidos de Apo AI numa amostra corporal é utilizada como um meio para seguir o destino dos polipéptidos de Apo AI administrados terapeuticamente de acordo com os processos terapêuticos aqui descritos.

São também contemplados os ensaios imunológicos capazes de detectar a presença de formação do produto de imunorreacção sem a utilização de um marcador. Tais processos empregam um meio de detecção, que é ele próprio bem conhecido na química de diagnóstico clínico e constitui uma parte deste invento apenas no sentido de ter sido utilizado com polipéptidos, processos e sistemas de outro modo novos, os exemplos de meios de detecção incluem os processos conhecidos como biossensores e incluem processos de biossensibilidade com base na detecção de mudanças na reflectividade de uma superfície, mudanças na absorção de uma

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-37onda evanescente por fibras ópticas ou mudanças na propagação ue ondas acústicas de superfície.

F. Composições Terapêuticas presente invento contempla composições terapêuticas úteis na prática dos processos terapêuticos aqui descritos. As composições terapêuticas do presente invento contêm um transportador fisiologicamente tolerável em conjunto com um polipéptido de Apo AI, como aqui descrito, dissolvido ou disperso nele como um ingrediente activo. Numa concretização preferida, a composição terapêutica não é imunogénica quando administrada a um paciente mamífero ou humano para fins terapêuticos.

Como aqui utilizados, os termos farmaceuticamente aceitável , fisiologicamente tolerável e suas variações gramaticais quando se referem a composições, transportadores, diluentes e reagentes, são utilizados permutavelmente e representam o facto de que os materiais são capazes de administração a ou sobre um mamífero sem a produção de efeitos fisiológicos indesejáveis tais como náuseas, tontura, perturbação gástrica e semelhantes.

A preparação de uma composição farmacológica que contém ingredientes activos nela dispersos ou dissolvidos é bem conhecida na arte. Tipicamente, tais composições são preparadas como injectáveis como soluções ou suspensões líquidas, contudo, podem também ser preparadas formas sólidas adequadas para solução ou suspensões, em líquido antes da utilização. A preparação pode também ser emulsionada.

ingrediente activo pode ser misturado com excipientes que são farmaceuticamente aceitáveis e compatíveis com o ingrediente activo e em quantidades adequadas para utilização nos processos terapêuticos aqui descritos. Os excipientes adequados são, por exemplo, a água, solução salina, dextrose, glicerol, etanol ou semelhantes e suas combinações. Adicionalmente, se desejado, a composição pode conter quantidades menores de substâncias auxiliares tais como agentes molhantes ou emulsionantes, agentes intensificam a eficácia do

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-38tamponantes de pH e semelhantes gue ingrediente activo.

A composição terapêutica do presente invento pode incluir sais farmaceuticamente aceitáveis dos componentes. Os sais farmaceuticamente aceitáveis incluem os sais de adição de ácido (formados com os grupos amino livres do polipéptido) que são formados com ácidos inorgânicos tais como, por exemplo, os ácidos clorídricos ou fosfórico, ou ácidos orgânicos como acético, tartárico, mandélico e semelhantes. Os sais formados com os grupos carboxilo livres podem também ser derivados de bases inorgânicas tais como, por exemplo, os hidróxidos de sódio, potássio, amónio, cálcio ou férricos, e bases orgânicas como isopropilamina, trimetilamina, 2-etilaminoetanol, histidina, procaína e semelhantes.

Os transportadores fisiologicamente toleráveis são bem conhecidos na arte. Exemplos de transportadores líquidos são as soluções aquosas estéreis que não contêm quaisquer materiais para além dos ingredientes activos e da água, ou contêm um tampão tal como fosfato de sódio a um valor de pH fisiológico, solução salina fisiológica ou ambos, tal como solução salina tamponada com fosfato. Ainda adicionalmente, os transportadores aquosos podem conter mais do que um sal tampão, assim como sais como os cloretos de sódio e de potássio, dextrose, polietilenoglicol e outros solutos.

As composições líquidas podem também conter fases líquidas adicionais e com exclusão de água. Os exemplos de tais fases líquidas adicionais são glicerina, óleos vegetais tais como óleo de semente de algodão e emulsões água-óleo.

G. Processos Terapêuticos

Verificou-se que os polipéptidos de Apo AI do presente invento têm a capacidade de modular a actividade enzimática da lecitina:colesterol-aciltransfrase (LCAT) e assim aumentar o nível de colesterol esterificado num paciente humano. A

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-39^íf £

f esterificação do colesterol, quando ocorre pela actividade da LCAT, é referida aqui como esterificação do colesterol mediada por LCAT.

Assim, o presente invento proporciona um processo de aumento do colesterol esterifiçado num paciente, caracterizado por compreender a administração ao paciente de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição fisiologicamente tolerável contendo um polipéptido de Apo AI do presente invento.

Uma quantidade terapeuticamente eficaz é uma quantidade predeterminada calculada para alcançar o efeito desejado, i.e., para aumentar a quantidade de colesterol esterificado num paciente. Uma quantidade terapeuticamente eficaz é tipicamente uma quantidade de um polipéptido de Apo AI do presente invento que quando administrada numa composição fisiologicamente tolerável é suficiente para alcançar uma concentração no plasma de cerca de 0,1 gg/ml a cerca de 100 pg/ml, preferivelmente de cerca de 1,0 pg/ml a cerca de 50 pg/ml, mais preferivelmente pelo menos cerca de 2 pg/ml e normalmente 5 a 10 pg/ml.

O nível de colesterol esterificado presente num paciente, particularmente no plasma e associado a partículas de lipoproteína, pode ser prontamente determinado por análises clínicas de rotina. Os exemplos de ensaios para seguir o nível de colesterol esterificado são descritos no Exemplo 11. Adicionalmente, as mudanças no colesterol esterificado podem ser seguidas durante um regime de tratamento para determinar a eficácia do polipéptido de Apo AI administrado, ao longo do tempo.

Assim, o presente processo terapêutico proporciona um meio para aumentar in vivo o colesterol esterificado num paciente humano que mostre sintomas de elevado colesterol no soro ou está por outro lado em risco médico pela presença de colesterol no soro, em que é benéfico reduzir os níveis do colesterol por esterificação do colesterol.

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-40,,X k

As composições terapêuticas contendo um polipéptido de Apo AI deste invento são convencionalmente administradas por via intravenosa, como, por exemplo, por injecção de uma dose unitária. 0 termo dose unitária quando utilizado em referência a uma composição terapêutica do presente invento refere-se a unidades fisiologicamente descontinuas adequadas como dosagem unitária para o sujeiro, contendo cada unidade uma quantidade predeterminada de um material activo calculado para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o diluente requerido; i.e., transportador ou veículo.

As composições são administradas de uma maneira compatível com a formulação de dosagem e numa quantidade terapeuticamente eficaz. A quantidade a ser administrada depende do sujeito a ser tratado, capacidade do sistema imunitário do sujeito para utilizar o ingrediente activo e grau de efeito terapêutico desejado. As quantidades preciosas de ingrediente activo requeridas para serem administradas dependem da opinião do médico e são características de cada indivíduo. Contudo, são aqui descritas gamas de dosagem adequadas para aplicação sistémica e dependem da via de administração. Os regimes adequados para administração inicial e as injecções de reforço são também variáveis, mas são tipificadas por uma administração inicial seguida por doses repetidas a intervalos de uma ou mais horas por uma injecção subsequente ou por outra administração. Alternativamente, é também contemplada a infusão intravenosa contínua suficiente para manter as concentrações no sangue nas gamas especificadas para as terapias in vivo.

Como um auxiliar para a administração de quantidades eficazes de um polipéptido de Apo AI, é útil um processo de diagnóstico deste invento para a detecção de um polipéptido de Apo AI no sangue do paciente, para caracterizar o destino da composição terapêutica administrada.

Exemplos

Os Exemplos seguintes ilustram, mas não limitam, o presente

-4172 730

SCRF Case 210.0 (POR) invento.

1. Polipéptidos

Os polipéptidos AI84-111, AI85-111, AI87-111, AI90-111, AI93-111, AI94-111, AI94-114, AI94-125, AI96-111, AI98-114, AI98-121, AI99-114 e AI99-121, foram sintetizados utilizando a técnica em fase sólida clássica descrita por Merrifield, Adv. Enzvmol.. 32: 221-96 (1969) como adaptada para utilização com um sintetizador de péptidos automático Modelo 43OA (Applied Biosystems, Foster City, CA). Os polipéptido-resinas foram clivados por fluoreto de hidrogénio, extractadas e analisadas quanto à pureza por cromatografia líquida de alta eficiência utilizando uma coluna de C18 de fase inversa (Waters Associates, Milford, MA).

A sequência de resíduos de aminoácido dos polipéptidos acima referidos é mostrada na Tabela 1.

2. Preparação de Apo AI/HDL

A HDL foi isolada de plasma obtido por plasmaforese do sangue de um doador em jejum, normal, do banco de sangue local (San Diego Plasma Centre, San Diego, CA). Para esse fim o plasma assim obtido foi ajustado para conter uma concretização final de benzamidina de 2 milimolar (mM) ácido etilenodiaminotetraacético (sal dissódico) (EDTA) 14 mM, 20 microgramas por mililitro (Mg/ml) de inibidor de tripsina de soja, 10 000 unidades por ml de aprotinina, 20 Mg/ml de inibidor de tripsina de lima, 25 Μ9/™1 de polibreno e 1 mM de D-fenilalanil-l-prolil-l-arginina-clorometilcetona (PPACK). A HDL foi então isolada a partir deste plasma ajustado por ultracentrifugação sequêncial utilizando brometo de potássio sólido (KBr) para ajuste de densidade.

Primeiro, o plasma ajustado foi centrifugado a 186 000 x g durante 18 a 24 horas, a 4 graus centrifugados (4°C). A camada de topo do sobrenadante resultante contendo Apo-VLDL foi removida e retida. A camada de fundo do sobrenadante foi recuperada e

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-42misturada com a camada de KBr sólido até a densidade ser superior a 1,063 gramas por mililitro (g/ml). A mistura resultante foi então estratificada sob uma solução de EDTA a 0,1% contendo KBr à densidade de 1,063 g/ml e centrifugada a 186 000 x g durante 18 a 24 horas. A camada de fundo foi de novo recuperada e misturada com KBr sólido até a densidade ser ajustada para mais do que 1,21 g/ml. Aquela camada ajustada foi esterifiçada sob uma solução de EDTA a 0,1% contendo KBr a uma densidade de 1,21 g/ml e foi centrifugada a 186 000 x g durante aproximadamente 48 horas a 4°C.

A camada de topo resultante foi então recuperada e misturada com KBr sólido até a densidade ser superior a 1,063 g/ml. Aquela camada de topo ajustada foi estratificada sob uma solução de EDTA a 0,1% contendo KBr a uma densidade de 1,063 g/ml e, ainda, centrifugada adicionalmente a 186 000 x g durante 18 a 24 horas, a 4°C.

A camada média foi recuperada e misturada com KBr sólido até a densidade ser ajustada a mais do que 1,21 g/ml. Aquela camada média ajustada foi estratificada sob uma solução de EDTA a 0,1% contendo KBr a uma densidade de 1,21 g/ml e centrifugada a 300 000 x g durante 18 a 24 horas a 4°C. A camada de topo contendo HDL, resultante, tendo uma densidade igual a 1,063 a 1,21 g/ml foi recuperada. A HDL recuperada foi dialisada contra tampão de lipoproteína (LLB; água contendo NaCl 150 mM, EDTA 0,3 mM, 0,005% de alfa-tocoferol e benzamidina 5 mM) e a Apo ΑΙ/HDL resultante foi armazenada sob condições estéreis durante não mais do que 21 dias. A concentração de proteína da Apo ΑΙ/HDL determinou-se estar entre 15 e 25 mg/ml por uma modificação do processo de Lowry [Lowry et al., J. Biol. Chem.. 193, 265-275 (1951)] quando conduzida na presença de SDS utilizando um padrão de albumina de soro de bovino.

3. Preparação de Apo AI Deslipidada

A Apo AI deslipidada foi preparada por extracção orgânica dos lipidos da Apo ΑΙ/HDL. Uma amostra da Apo ΑΙ/HDL preparada no

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SCRF Case 210.0 (POR) ®»·

-43Exemplo IB foi primeiro dialisada durante a noite (aproximadamente 18 horas) contra EDTA a 0,01 por cento tendo um valor de pH de 7,5, depois dialisada contra EDTA a 0,003 por cento durante aproximadamente 6 horas e, subsequentemente, liofilizada até 10 a 20 miligramas de proteína por tubo. Em cada tubo foram misturados 35 ml de etanol absoluto: éter etílico anidro (1:1) a 4°C. A seguir à mistura, a solução foi mantida durante 20 minutos a -20°C. A solução foi então centrifugada durante 30 minutos a 1 000 x g a 0°C, o sobrenadante foi retirado e foi retida a pelota contendo Apo AI.

Foi realizada uma extracção em etanol-éter duas vezes mais como descrito acima para um total de três extracções. Subsequentemente, foram misturados 35 ml de éter anidro à amostra, a 4°C. A mistura foi mantida durante 30 minutos a -20°C, centrifugada a 1 000 x g durante 30 minutos a -20°C e foi recuperada a pelota contendo Apo AI e seca utilizando azoto gasoso para formar Apo AI deslipidada. Deve-se observar que a Apo AI deslipidado não contêm só Apo AI, mas também outras proteínas associadas à HDL, tais como Apo AII.

4. Preparação da Apo Al Isolada

A Apo AI foi isolada a partir da Apo Al deslipidada por fraccionamento por tamanhos utilizando a cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) seguindo os procedimentos de Kinoshita et al., J. Biochem.. 94:615-617 (1983). Cerca de 300 pg de Apo AI deslipidada preparada no Exemplo 3 foram dissolvidos em 200 microlitros (/xl) de dodecilsulfato de sódio a 0,1% (SDS), fosfato de sódio 0,1 M (pH 7,0) e fraccionados por tamanhos em colunas de HPLC Spherogel - TSK 3 000 SW (Beckman Istruments Inc., Fullerton, CA). As fracçoes contendo a Apo AI isolada foram armazenadas a -20°C.

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5. Preparação de anti-soros Policlonais para Polipêptidos

Sintéticos

A. Preparação do Imunogénio

A LDL é isolada a partir do plasma obtido por plasmaforese de sangue de coelho, reunido, normal (Scripps Clinic and Research Foundation Vivarium, La Jolla, Calif.). 0 plasma assim obtido é tratado como descrito para a purificação da Apo AI/HDL no Exemplo

2. Após a segunda centrifugação, é recuperada a camada de topo contendo LDL e é rejeitada a camada de fundo contendo HDL. A camada de topo é misturada com KBr sólido até a densidade ser ajustada acima de 1,063 g/ml. Aquela camada ajustada é estratificada sob uma solução de EDTA a 0,1% contendo KBr a uma densidade de 1,21 g/ml e é centrifugada a 186 000 x g durante 18 a 24 horas, a 4°C.

A camada de topo é então recuperada e o KBr sólido é misturado até a densidade ser superior a 1,063 g/ml. Aquela camada de topo ajustada é estratificada sob uma solução de EDTA a 0,1% contendo KBr a uma densidade de 1,063 g/ml e, ainda, centrifugada adicionalmente a 250 000 x g durante 18 a 24 horas, a 4°C. A camada de topo contendo LDL concentrada é recuperada e dialisada contra PBS (solução salina tamponada com fosfato, pH 7,2) e armazenada a -70°C.

Os polipêptidos AI84-111, AI85-111, AI90-111, AI93-111, AI94-111, AI94-114, AI94-125, AI96-111, AI98-114, AI98-121, AI AI99-114 e AI99-121, são sintetizados como descrito no Exemplo 1. Cada polipéptido é dissolvido individualmente em acetato de sódio

1.5 M, pH 7,8, até uma concentração final de 6 mg/ml com um volume total de 5 ml. Um polipéptido dissolvido é misturado com

2.5 ml de cada solução de LDL a 2 mg/ml e uma solução de acetato de sódio 3 M, pH 7,8, para uma proporção péptido:LDL de 1000:1. Uma solução de glutaraldeído 500 mM é adicionada à mistura reaccional de polipéptido e LDL, utilizando um excesso molar de 2,7 de glutaraldeído para péptido. A mistura é mantida à temperatura ambiente durante 10 minutos, após o que é adicionada

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uma solução 40 mM de boro-hidreto de sódio para uma concentração final de 0,2 mM. A mistura é em seguida mantida a 37°C durante 5 a 8 horas, a qual é seguida por diálise contra PBS durante 5 dias com duas mudanças de tampão por dia utilizando uma tubagem de diálise tendo um corte” (cut-off) de peso molecular de 12 000 a 14 000. A solução dialisada é centrifugada a 2 500 x g durante 10 minutos e a pelota resultante é ressuspensa em 5 ml de PBS para formar um imunogénio de péptido-LDL. Prepara-se um imunogénio de péptido-LDL para utilização de cada um dos péptidos anteriormente descritos no protocolo de preparação de imunogénio.

B. Imunização e Recolha dos Anti-soros Policlonais imunogénio de péptido-LDL preparado no Exemplo 5A é emulsionado utilizando o sistema adjuvante de Ribi (Ribi Immunochem Research, Inc., Hamilton, Montana) de acordo com as instruções do fabricante e os antigénios de péptido-LDL são incorporados na emulsão a uma concentração de 300 gg/ml. São injectados dois coelhos com 1 ml de uma emulsão preparada após serem recolhidas as amostras de soro pré-imune. É administrado 1 ml da dose de emulsão, como se segue: 0,30 ml intradermicamente (0,05 ml em cada um de 6 locais); 0,40 ml intramuscularmente (0,2 ml em cada perna traseira); 0,10 ml subcutaneamente (região do pescoço); e 0,20 ml intraperitonealmente. Os coelhos são injectados 6 vezes a intervalos de 3 semanas seguindo o protocolo de injecção que foi descrito. Uma semana após a segunda até à sexta injecção, são recolhidas as amostras de sangue para verificar o título de anticorpos contra o péptido específico utilizado como um imunogénio pelo ensaio SPRIA descrito abaixo. As amostras de sangue recolhidas são agitadas numa estufa a 37^eC durante uma hora, após o que as amostras são centrifugadas a 3 000 x g durante 20 minutos. A interface é recolhida e rodada numa microcentrífuga a 12 000 x g durante 5 minutos. 0 sobrenadante contendo anticorpos anti-péptido é recolhido e armazenado a -20°C.

Os títulos dos anticorpos anti-péptido são determinados por radio-imunoensaio em fase sólida (SPRIA) essencialmente como

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-46descrito em Curtiss e Edgington, J. Biol. Chem.. 257:15213-15221 (1982). Resumidamente, 50 μΐ de PBS contendo 5 gg/ml de péptidos sintéticos são misturados nas cavidades das placas de microtitulação. As placas são mantidas durante a noite (cerca de 16 horas) a 4°C para permitir a aderência dos péptidos às paredes das cavidades. Após lavagem das cavidades por quatro vezes com tampão de SPRIA (KC1, 2,68 mM, KH₂PO₄ 1,47 mM, NaCl 137 mM, Na₂HP0₄ 8,03 mM, Tween-20 0,05%, Traysol 0,1 KlU/ml, BSA 0,1%, NaN₃ 0,015%), são misturados 200 μΐ de tampão de SPRIA contendo soro de cabra normal a 3% (NGS) e albumina de soro de bovino a 3% (BSA) a cada alveólo para bloquear o excesso de locais de ligação à proteína. As placas são mantidas durante 30 minutos a 20°C, alveólos são esvaziados por agitação e secos para formar um suporte sólido, i.e., uma matriz sólida à qual foi fixada operativamente a Apo AI/HDL.

A cada alveólo são então misturados 50 μΐ de amostra de soro para formar uma mistura de imunorreacção de fase sólida-líquida. A mistura é mantida durante 2 horas a 37°C para permitir a formação dos produtos de imunorreacção de fase sólida. Após lavagem dos alveólos como previamente descrito, são misturados 50 μΐ de IgG anti-ratinho de cabra marcada com ¹²^ΐ _a o,25 μ<2 de proteína por ml, um cada alveólo, para formar uma mistura reaccional de marcação. Aquela mistura é mantida durante 1 hora a 37°C para permitir a formação de produtos de imunorreacção de fase sólida marcados com ¹²⁵I. Após lavagem dos alveólos como previamente descrito, é determinada a quantidade de produto marcado com ·*·²⁵Ι ligado a cada alveólo, por cintilação gama. Os títulos de anticorpos anti-péptido específicos nas amostras de soro recolhidas a partir de coelhos imunizados são determinados por comparação com amostras de soro de coelho normal préimunizado que são uma medida de fundo não especifico. As amostras de soro são consideradas conter anticorpos policlonais antipéptido se o sinal radioactivo for 5 vezes superior aquele observado com o soro de coelho normal.

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-476. Preparação de Anticorpos Monoclonais

A. Anti-péptido

Os polipéptidos designados por AI84-111, AI85-111, AI90-111, AI93-111, AI94-111, AI94-114, AI94-125, AI96-111, AI98-114, AI98—121, AI99-114 e AI99-121, são preparados individualmente como imunogénios de acordo com o Exemplo 5A. Os ratinhos Balb/c ByJ (Scripps Clinic and Research Foundation Vivarium, La Jolla, CA) são imunizados intraperitonealmente (i.p.) com 50 /xg de imunogénios de péptido-LDL preparados em adjuvante de Freund completo (CFA) seguida por uma segunda e terceira imunização utilizando o mesmo imunogénio de péptido-LDL, cada uma separada por cerca de 3 semanas, em adjuvante de Freund incompleto (IFA). Os ratinhos receberam um reforço, intravenosamente (i.v), de 50 μ<3 de péptidos preparados em solução salina normal 4 dias antes da fusão e um segundo reforço de perfusão similar um dia mais tarde.

Os animais assim tratados são sacrificados e foi recolhido o baço de cada rato. É então preparada uma suspensão de células de baço. As células de baço são então extractadas da suspensão de células de baço por centrifugação durante cerca de 10 minutos a 1 000 r.p.m., a 23 °C. A seguir à remoção do sobrenadante a pelota de células é resuspensa em 5 ml de tampão de lise de NH₄C1 frio e foi incubada durante cerca de 10 minutos.

A suspensão de células lisadas são misturados 10 ml de meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (GIBCO) e tampão HEPES [ácido 4-(2-hidroxietil)-l-piperidinoetano-sulfónico] e aquela mistura é centrifugada durante cerca de 10 minutos a 1 000 r.p.m., a 23°C.

O sobrenadante foi decantado, a pelotas é resuspensa em 15 ml de DMEM e HEPES, e é centrifugada durante cerca de 10 minutos a 1000 r.p.m., a 23°C. É repetido o procedimento acima.

A pelota é depois resuspensa em 5 ml de DMEM e HEPES. É

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então removida, para contagem, uma alíquota da suspensão de células do baço. As fusões são realizadas da maneira seguinte utilizando a linha de células de mieloma de ratinho, não segregantes P3X63Ag8.653.1, um subclone da linha P3X63Ag 8.653 (ATCC 1580). Utilizando uma proporção de células de mieloma para células de baço de cerca de 1 para 10 ou de cerca de 1 para 5, é centrifugada uma quantidade suficiente de células de mieloma numa pelota, lavadas duas vezes em 15 ml de DMEM e HEPES e centrifugadas durante 10 minutos a 1 000 r.p.m., a 23°C.

As células de baço e as células de mieloma são combinadas em tubos de 15 ml de fundo redondo. A mistura de células é centrifugada durante 10 minutos a 1 000 r.p.m., a 23°C e o sobrenadante é removido por aspiração. Em seguida, são misturados 200 μΐ de polietilenoglicol aquoso de peso molecular 4 000 a 50 por cento (peso por volume) (PEG; ATCC Baltimore, MD) a cerca de 37 °C utilizando uma pipeta de 1 ml com agitação vigorosa para romper a pelota e as células são misturadas suavemente durante 15 a 30 segundos. A mistura de células é centrifugada durante 4 minutos a 700 r.p.m..

A cerca de 8 minutos da altura da adição do PEG, são misturados lentamente 5 ml de DMEM mais tampão HEPES à pelota, sem perturbação das células. Após 1 minuto, a mistura resultante é fragmentada com uma pipeta de 1 ml e é incubada durante 4 minutos adicionais. Esta mistura é centrifugada durante 7 minutos a 1 000 r.p.m.. 0 sobrenadante é decantado, são lentamente adicionados 5 ml de meio de HT (hipoxantina/timidina) à pelota e a mistura é mantida sem perturbação durante 5 minutos. A pelota é então fragmentada em grandes pedaços e a suspensão de células final é colocada em frascos T75 (2,5 ml por frasco) nos quais foram previamente colocados 7,5 ml de meio de HT. A suspensão de células resultante é incubada a 37°C para deixar crescer as células fundidas. Após 245 horas são misturados 10 ml de meio de HT aos frascos, seguida 6 horas mais tarde por mistura de 0,3 ml de aminopterina 0,04 mM. Misturam-se aos frascos, 48 horas após fusão, 10 ml de meio de HAT (hipoxantina/aminopterina/timidina).

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-49Colocam-se, 3 dias após fusão, as células viáveis em placas de cultura de tecidos de 96 alveólos a cerca de 2 x 10⁴ de células viáveis por cavidade (768 cavidades totais) em meio tampão de HAT como descrito em Kennett et al.. Curr. Top. Microbiol. Immunol.. 81:77 (1978). As células são alimentadas sete dias após a fusão com meio de HAT e, em seguida, a intervalos de aproxirnadamente 4-5 dias quando necessário com meio de HT. 0 crescimento é seguido microscopicamente e os sobrenadantes de cultura são recolhidos cerca de duas semanas mais tarde e analisados quanto à presença de anticorpo específico de HDL por radio-imunoensaio(RIA) de fase sólida essencialmente como descrita em Curtiss e Edgington J. Biol. Chem.. 257:15213-15221 (1982).

Resumidamente, são misturados 50 μΐ de PBS contendo 5 /zg/ml do imunogénio de péptido-LDL preparado nos alveólos das placas de microtitulação. As placas são mantidas durante a noite (cerca de 16 horas) a 4°C para permitir a aderência do imunogénio de péptido-LDL às paredes dos alveólos. Após lavagem dos alveólos quatro vezes com tampão de SPRIA (KC1 2,68 mM, KH₂PO₄ 1,47 mM, NaCl 137 mM, Na₂HPO₄ 8,o3 mM, Tween-20 0,05% Traysol 0,1 KlU/ml, BSA 0,1%, NaN₃ 0,015%), são misturados 200 μΐ de tampão de SPRIA contendo soro de cabra normal a 3% (NGS) e albumina do soro de bovino a 3% (BSA), em cada alveólo, para bloquear o excesso de locais de ligação à proteína. As placas são mantidas durante 30 minutos a 20°C, as cavidades esvaziadas por agiração e secas para formar um suporte sólido, i.e., uma matriz sólida à qual é fixado operativamente imunogénio de péptido-LDL.

A cada alvéolo são então misturados 50 μΐ de sobrenadante de cultura de tecidos de hibridoma para formar uma mistura de imunorreacção de fase sólida-líquida. A mistura é mantida durante 2 horas a 37°C para permitir a formação dos produtos de imunorreacção de fase sólida. Após lavagem dos alveólos como previamente descrito, são misturados 50 μΐ de IgG anti-ratinho de cabra marcada com ¹²⁵I a 0,25 μ$ de proteína por ml, a cada alveólo, para formar uma mistura reaccional de marcação. Aquela mistura é mantida durante 1 hora a 37°C para permitir a formação

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de produtos de imunorreacção de fase sólida marcados com

Após lavagem dos alveólos como descrito previamente, é determinada a quantidade de produto marcado com ¹²⁵I ligado a cada cavidade por cintilação gama.

Os hibridomas são seleccionados a partir de culturas de hibridomas que segregam anticorpos anti-péptido para seus meios de cultura e são caracterizados adicionalmente como aqui descrito.

B. AI-4 hibridoma que comporta a designação laboratorial 611 AV63C2.111 e segrega a molécula paratópica designada por AI-4 foi obtido a partir de uma fusão de esplenócitos de ratinhos Balb/c (Scripps Clinic and Reserach Foundation Vivarium, La Jolla, Calif.) imunizados com Apo/VLDL como discutido no Exemplo 2. Foi utilizado o protocolo de fusão padrão como discutido no Exemplo 6. Os hibridomas assim preparados foram seleccionados e ensaiados como discutido anteriormente, com a única excepção de que foi utilizada a Apo AI/HDL como o substrato revestido em vez do imunogénio de péptido-LDL. 0 hibridoma foi depositado em 5 de Março de 1985 na American Type Culture Collection, Rockville, Md. sob o número de acesso do ATCC HB 8744 de acordo com o Tratado de Budapeste sobre o Reconhecimento Internacional do Depósito de Microorganismos para os Fins de Procedimento de Patente.

C. AI-11 hibridoma que tem a designação laboratorial H103D8.1D11 e segrega a molécula paratópica designada por AI-11 foi obtida a partir de uma fusão de esplenócitos de ratinhos Balb/c (Scripps Clinic and Reserach Foundation Vivarium, La Jolla, Calif.) imunizados com Apo AI/HDL como discutido no Exemplo 2. Foi utilizado o protocolo de fusão padrão como discutido no Exemplo 6. Os hibridomas assim preparados foram seleccionados e ensaiados como discutido anteriormente, com a única excepção de que foi utilizada a Apo AI/HDL como o substrato revestido em vez do imunogénio de

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SCRF case 210.0 (POR) péptido-LDL. O hibridoma foi depositado em 16 de Setembro de 1986 na American Type Culture Collection, Rockville, Md. sob o número de acesso do ATCC HB 9201 de acordo com o Tratado de Budapeste sobre o Reconhecimento Internacional do Depósito de Microorganismos para os Fins de Procedimento de Patente.

-51D. Purificação da Preparação de Anticorpos Monoclonais

Os fluidos ascíticos foram obtidos a partir de conjuntos separados de ratinhos Balb/c de 10 semanas de idade que tinham sido sensibilizados com 0,3 ml de óleo mineral e injectados intraperitonealmente com 5 x 10® células de hibridoma com as designações 611 AV63C2.111 e H103D8.1D11. 0 tempo médio para o desenvolvimento das ascites foi de 9 dias. A seguir à clarificação por centrifugação a 15 000 x g durante 15 minutos, a 23°C, os fluidos ascíticos produzidos pelos hibridomas foram reunidos e armazenados no frio a -20°C.

Os anticorpos monoclonais AI-4 d AI-11 purificados a partir dos hibridomas foram preparados por cromatografia líquida de proteína, rápida, (FPLC) utilizando uma coluna de permuta aniónica Pharmacia Mono Q HR5/5 (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ) utilizando um gradiente de NaCl de 0-0,5 molar (M) em Tris 10 mM, pH 8,0, seguindo as instruções fornecidas com a coluna. Os Mab purificados foram concentrados utilizando uma célula de ultrafiltração com agitação Amicon (Danvers, MA? membrana PM 30) até uma concentração de 1 mg/ml, dialisados em PBS (solução salina tamponada com fosfato, pH 7,2) e armazenados a -70°C.

Os hibridomas que segregam anticorpos anti-péptido como descrito no Exemplo 6A são injectados em ratinhos Balb/c com 10 semanas de idade como descrito anteriormente para obter o fluido ascítico. Os anticorpos monoclonais anti-péptido purificados são preparados por FPLC como anteriormente descrito. Os Mab purificados são concentrados numa célula de ultrafiltração agitada, Amicon, e armazenados como anteriormente descrito.

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7. Radio-iodacão

A radio-iodação da HDL, Apo AI e lg anti-ratinho de cabra purificada imunoquimicamente, foi realizada enzimaticamente utilizando o procedimento de iodação com Iodogénio e o Iodogénio foi obtido na Pierce Biochemicals. A iodação com Iodogénio foi utilizada para caracterizar os antigénios e anticorpos para o radio-imunoensaio em fase sólida, como discutido acima.

8. Especificidade do Fragmento de Apo AI-Brometo de Cianogénio

A especificidade do fragmento de CNBr, de Apo AI, foi determinada por análise por transferência Western de acordo com o processo em Curtiss et al.. Proceeding of the Workshop on Lipoprotein Heterogeneity, Ed. por Lippel, NIH Publicação N^a 87-2646 p. 363-377 (1987). Resumidamente a fragmentação por CNBr foi realizada em Apo AI isolada dissolvida em ácido fórmico a 90%. 0 CNBr foi adicionado num excesso molar de 13 000 e a mistura reaccional foi mantida cerca de 15 horas s cerca de 20 graus °C. A seguir à liofilização, os fragmentos de CNBr resultantes foram solubilizados em SDS a 1% Tris 0,01 M, pH 8,2, e submetidos a focagem isoeléctrica em faixas de geles de poliacrilamida a 6% contendo ureia 8 M e anfolina a 2% (pH 4 a pH6) como descrito por Curtiss et al. . J. Biol. Chem. . 260:2982-93 (1985). As proteínas separadas electroforeticamente foram transferidas para nitrocelulose para imunorreacção com MAB AI-4. A produção de produtos de imunorreacção foi detectada por lg anti-ratinho de cabra radio-iodada seguida por auto-radiograf ia.

Os resultados destes estudos indicam que o MAB AI-4 não imunorreage com os fragmentos de CNBr de Apo AI CNBrl, CNBr2, CNBr3 e CNBr4 mas imunorreage com CNBr2-CNBr3. Estes resultados de imunorreacção de CNBr indicam que o MAB AI-4 também imunorreage com a Apo AI isolada.

0s resultados destes estudos indicam que o MAB AI-11 não imunorreage com os fragmentos de CNBr de Apo AI CNBrl, CNBr3 e

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-53CNBr 4 mas imunorreage com CNBr2. Estes resultados de imunorreacção de CNBr indicam que o MAB AI-11 também imunorreage com a Apo AI isolada.

9. ELISA de Polipéptidos em Fase Sólida

OS polipéptidos de Apo AI AI84-111, AI85-111, AI90-111, AI93-111, AI94-111, AI94-125, AI96-111, AI99-111 e AI99-114, foram testados quanto à imunorreactividade com o anticorpo monoclonal AI-11 num ELISA de ligação directa. No ensaio, foram dissolvidos 50 jLtg/ml de cada polipéptido em PBS para formar uma solução de revestimento de péptido, da qual foram misturados 150 μΐ nos alveólos de uma placa de microtitulação de poli(cloreto de vinilo) flexível (Immulon). Os alveólos foram então mantidos cerca de 16 a 20 horas a 4^eC para permitir a absorção (revestimento) do péptido nas paredes dos alveólos. Após remoção da solução de revestimento de péptido por agitação, os alveólos foram lavados uma vez com 3 50 μ1 de tampão de lavagem (PBS contendo 1 g/1 de BSA, 0,5 ml/1 de Tween 20 e 2 μΐ/ΐ de aprotinina). 0 excesso dos locais de ligação à proteína foram bloqueados por mistura de 200 μΐ de tampão de bloqueamento (PBS contendo BSA a 3%) em cada alveólo, manutenção dos alveólos durante 1 hora a 37°C, remoção do tampão de bloqueamento por agitação e depois lavagem dos alveólos por 3 vezes como previamente descrito. A placa foi então seca durante 1 hora a 37°C seguida por adição de 100 μΐ de PBS contendo 0,5 Mg/ml de anticorpo AI-11 conjugado com peroxidase de rábano silvestre para formar uma mistura de imunorreacção de fase sólida-líquida. A mistura de imunorreacção de fase sólida-líquida resultante foi mantida a 20°C durante 1 hora para permitir a formação de um produto de imunorreacção de fase sólida contendo o polipéptido. As cavidades foram então lavadas por 3 vezes com tampão de lavagem para remover o anticorpo não ligado.

A quantidade de produto de imunorreacção presente na fase sólida foi então determinada por mistura de duzentos microlitros de substrato OPD em cada alveólo para formar uma mistura de reacçâo de revelação. A mistura foi mantida durante 30 minutos a

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cerca de 20°C. Subsequentemente, foram misturados 50 μΐ de H₂SO₄ 4N em cada alveólo para parar a reacção de revelação e a solução resultante foi analisada quanto à absorvância a 450 nanómetros utilizando um leitor de placa de microtitulação (Dynatech) para detectar a quantidade de produto de imunorreacção formado.

OS polipéptidos de Apo AI AI85-111, AI94-125 e AI96-111 mostraram ser imunorreactivos especificamente com o anticorpo monoclonal AI-ll no ELISA de ligação directa, anterior. Os polipéptidos de Apo AI AI90-111, AI93-111 e AI99-114 foram também reconhecidos pelo anticorpo mas com especificidade diminuída. 0 polipéptido Apo AI99-111 não foi ligado pelo anticorpo.

Para determinar a eficiência relativa da ligação da AI-ll aos polipéptidos sintéticos de Apo AI, foi realizado um ELISA de competição com AI96-111 como o polipéptido sintético de teste em comparação com soro contendo APo AI e Apo AI/HDL purificada. As placas de microtitulação foram revestidas com AI96-111 tal como anteriormente descrito.

Após o passo de secagem do ensaio anteriormente descrito, foram misturados 50 μΐ de uma amostra de fluido (i.e., uma amostra defluido contendo Apo AI) ou padrão (i.e., um polipéptido de Apo AI), a serem ensaiados no alveólo revestido com o polipéptido de AI96-111 simultaneamente com 50 μΐ do anticorpo AI-ll conjugado com HRPO para formar uma mistura de imunorreacção. No ensaio aqui descrito foram testados 3 competidores quanto à sua capacidade para competir pela ligação do AI-ll ao polipéptido AI96-111 revestido numa gama de diluições. 0 polipéptido AI96-111 foi adicionado a alveólos revestidos separados a uma concentração de partida de 1 mg/ml e diluído para metade 6 vezes, em série, até uma concentração final de 0,0156 mg/ml. As amostras de soro descritas como no Exemplo 2 foram adicionadas a uma diluição de partida de 1:10 e diluídas para metade 6 vezes, em série, até uma diluição final de 1:320. A Apo AI/HDL como descrita no Exemplo 2 foi adicionada a uma concentração de partida de 1 mg/ml e diluída para metade 5 vezes até uma concentração final de 0,031 mg/ml. A placa foi então

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-55incubada durante 30 minutos à temperatura ambiente. A placa foi lavada e o ensaio revelado como anteriormente descrito para determinar a quantidade de produto de imunorreacção formado e, assim, a quantidade de competidor presente na amostra de fluido adicionada.

Os resultados deste ensaio, mostrados na Figura 2, indicam que o MAB AI-11 imunorreage com AI96-111 presente na amostra de fluido mas tem uma maior afinidade para a Apo AI nativa do soro a para a HDL purificada.

10. Imunorreactividade do MAB AI-4 e AI-11

A. MAB AI-4

A imunorreactividade do MAB AI-4 para a Apo AI/HDL nativa e vários polipéptidos sintéticos foi examinada por um RIA competitivo realizado como se segue:

Cem μΐ de PBS (NaCl 0,15 M, NaPO₄ 0,01 M, pH 7,2) contendo ¹⁰ Mg/ml de Apo AI/HDL foram misturados nos alveólos de placas de microtitulação. As placas foram mantidas durante 1 hora a 20°C numa plataforma rotativa para permitir a aderência da Apo AI/HDL às cavidades e formar suportes sólidos. Após aspiração do excesso de líquido dos alveólos, foram misturados 200 μΐ da solução de bloqueamento (BSA a 3%, NGS a 3% em PBS) a cada alvéolo, e os alvéolos foram mantidos durante 30 minutos a 20°C numa plataforma rotativa. Subsequentemente, a solução de bloqueamento foi removida por aspiração e os alveólos foram lavados 3 vezes com tampão SPRIA.

A cada alveólo foram, então, primeiro, misturados 50 μΐ de PBS contendo BSA a 3% e várias concentrações de antigénio competidor, i.e., péptido de Apo ΑΙ/HDL e segundo, 50 μΐ de MAB AI-4 na forma de ascites clarificadas diluídas 1:11,25 x 10$ em PBS contendo BSA a 3% para formar misturas de imunorreacção competitivas. Nos alveólos de controlo, o antigénio de competição ou o anticorpo foram substituídos por PBS contendo BSA a 3%.

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As misturas de imunorreacção foram mantidas cerca de 16 horas a 4°C numa plataforma rotativa para permitir a formação de produtos de imunorreacção em fase sólida. Após lavagem dos alveólos como previamente descrito, foram misturados 100 μΐ de lg anti-ratinho de cabra marcada com l²⁵i (ig anti-ratinho de cabra-¹²⁵I diluída para 2 x 10⁵ desintegrações precipitáveis por ácido tricloroacético por minuto por 100 μΐ de PBS contendo BSA a 3%) a cada alvéolo. As misturas de imunorreacção marcadas assim formadas foram mantidas durante 4 horas a 4°C numa plataforma rotativa. Subsequentemente, os alvéolos foram lavados com tampão SPRIA como previamente descrito e a quantidade de produto de imunorreacção em fase sólida marcado com i25j formada foi determinada num contador gama.

A capacidade do MAB AI-4 para imunorreagir com Apo AI/HDL foi comparada por utilização da Apo AI/HDL e vários péptidos sintéticos como competidores no RIA acima descrito. Os resultados deste estudo são mostrados na Figura 3. B/Bo representa as CPM corrigidas que são traçados em função das concentrações de competição aumentadas em Mg/ml. Os valores B/Bo são determinados na fórmula seguinte:

(CPM da Amostra de Competidor - CPM de 0%) (CPM de 100% - CPM de 0%) onde CPM de 0% é uma medida de fundo não especifico com base no CPM obtido em RIA onde os alveólos com Apo AI/HDL são feitos reagir com o anticorpo secundário marcado na ausência de anticorpo primário e competidor, e onde CPM de 100% é uma medida da ligação não competitiva máxima do anticorpo primário ao substrato revestido nos alveólos. Quando eficazmente um competidor se ligar ao anticorpo primário mais baixos serão os valores de B/Bo. Os resultados do ensaio na Figura 3 mostram que o péptido AI94-125 é um melhor competidor da ligação do MAB AI-4 aos alveólos revestidos com APO AI/HDL do gue é o péptido AI99-121 ou da própria Apo AI/HDL. Os péptidos AI90-111, AI93-111 e AI96-111 são ineficazes no ensaio de competição e assim não são imunorreactivos com o MAB

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-57imunorreactivos com o MAB AI-4.

Foram avaliados outros péptidos quanto à sua capacidade para imunorreagir com o MAB AI-4 em RIA competitivos aqui descritos. Os péptidos AI94-114 e AI99-114 exibiram uma reactividade parcial. Os péptidos AI79-95, AI68-105, AI74-105, AI87-105, AI87-111, AI90-105, AI93-101, AI95-105, AI96-101, AI100-105, AI101-111, AI105-116 e AI115-126 não reagiram com o MAB AI-4.

Os polipéptidos de Apo AI imunorreactivos com o MAB AI-4 de acordo com o RIA de competição acima estão sumarizados na Figura

4. O epítopo nativo conservado definido pelo MAB AI-4 inclui os resíduos de aminoácido nas posições 99.114, no mínimo, porque o péptido AI99-114 imunorreagiu com o MAB AI-4. Contudo, o péptido AI99-121 imunorreagiu com o MAB AI-4 quase tão bem quanto a Apo AI/HDL, indicando que os resíduos 99-121 definem um epitopo preferido na Apo AI. Um polipéptido particularmente preferido para utilização em ELISA ou RIA de competição de diagnóstico é o péptido AI94-125.

péptido AI99-121 foi preparado tendo um E na posição de resíduo 104 em vez do resíduo F normal e mostrou imunorreagir com MAB AI-4. Assim, os péptidos de Apo AI definidos pelo MAB AI-4 que têm um resíduo E ou um resíduo F na posição 104 irão imunorreagir com o MAB AI-4 e são úteis em processos de diagnóstico quando utilizados em conjunção com o MAB AI-4.

B. MAB AI-11

A imunorreactividade do MAB AI-11 para a Apo AI/HDL nativa e vários polipéptidos sintéticos foi examinada por um RIA competitivo como descrito no Exemplo 10A. Os resultados destes ensaios são mostrados na Figura 5. Os péptidos AI96-111, AI90-111 e AI93-111 são inibidores competitivos da ligação do MAB AI-11 à Apo AI/HDL mas são menos eficazes do que a própria proteína nativa. 0 péptido AI99-121 não se liga ao MAB AI-11. Os outros péptidos foram avaliados quanto à sua capacidade para imunorreagir com o MAB AI-11 em RIA competitivos aqui descritos.

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Os péptidos AI84-111, AI94-111 e AI94-125 foram testados no RIA competitivo acima e inibiram também a imunorreactividade do MAB AI-11 com Apo AI/HDL. Os péptidos AI79-95, AI87-105, AI87-111 (com um resíduo E em vez de um resíduo F na posição 104) AI90-105, AI93-101, AI95-105, AI96-101, AI99-121, AI100-105, AI101-111, AI105-116 e AI115-126 não imunorreagem com o MAB AI-11.

Os polipéptidos de Apo AI imunorreactivos com o MAB AI-11 de acordo com o RIA de competição anterior, estão sumariados na Figura 6. 0 epítopo nativo conservado definido pelo MÁB AI-11 inclui os resíduos de aminoácido nas posições 99-111 porque o péptido AI96-111 imunorreagiu com o MAB AI-11.

11. Inibição da Esterificação do Colesterol Mediada por LCAT por

Anticorpos Específicos de Apo AI

Os proteolipossomas contendo lecitina, 14-C-colesterol e Apo AI foram preparados da maneira seguinte. Secaram-se 7,7 mg de fosfatidilcolina (lecitina de gema de ovo) sob azoto gasoso num tubo de ensaio em vidro 13 x 100. Secaram-se no mesmo tubo 116 pg de colesterol de ums solução a 1 mg/ml em etanol e 78,3 pg de 14-C-colesterol de uma solução a 0,29 mg/ml em benzeno com uma actividade especifica de 0,04 mCi/ml, sem contactarem com a lecitina seca. A este tubo foi adicionado 0,3 ml de uma solução de colato de sódio 725 mM em tampão Tris HC1 (Tris 10 mM, NaCl 140 mM, sal de tetrassódico de EDTA 1 mM, pH 7,2), 2,5 ml de tampão Tris HC1 e 0,8 ml de uma solução a 1 mg/ml de Apo Al purificada em tampão Tris HCl. A mistura foi agitada em vórtex durante 60 segundos e depois misturada numa roda rotativa à temperatura ambiente durante 1 hora. A mistura foi dialisada durante a noite contra 500 ml de tampão de Tris HCl que foi mudado por 5 vezes. Os proteolipossomas foram ajustados a um volume de 4 ml após diálise e armazenados no frigorífico. Os 4 ml de proteolipossomas continham 9,78 x 10“⁶ mole de lecitina, 3,0 x IO⁷ _moi_e d_e colesterol, 2,01 x 10“⁷ mole de 14-C-colesterol e

3,14 x IO⁸ mole de Apo AI. As proporções molares de leciti-na:colesterol:Apo AI eram 250:12,5:0,8.

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SCRF Case 210.0 (POR)

-59O ensaio da esterificação de colesterol mediada por LCAT, e incluindo a inibição da esterificação utilizando anticorpos anti-Apo AI, foi realizado em duplicado. A tubos de vidro em tampa de enroscar foram adicionados 100 μΐ da solução de proteolipossoma preparada, 125 μΐ de uma solução a 2% de albumina de soro humano em tampão Tris HC1, anticorpos monoclonais em quantidades de 15,6 jug a 500 gg/tubo e tampão Tris HCl para um volume final de 455 μΐ. Os tubos foram fechados, agitados em vórtex e mantidos durante 30 minutos num banho de água a 37°C. Aos tubos foram adicionados 25 μΐ de uma solução 100 mM de mercaptoetanol em tampão Tris HC1 e 30 μΐ de plasma isento de lipoproteínas (LPDP) como a fonte de LCAT. Os tubos foram de novo fechados, agitados em vórtex e mantidos durante uma hora num banho de água a 37°c, tempo após o qual foi parada a reacção enzimática por adição de 2 ml de etanol. Os controlos para o ensaio incluiram tubos duplicados sem LPDP e tubos duplicados com LPDP, mas sem anticorpo o gue irá resultar em 100% de esterificação.

colesterol e os ésteres de colesterol foram extractados da reacção por adição a cada tubo de 5 ml de hexano contendo 16 jug/ml de colesterol e 16 gg/ml de linoleato de colesterilo. A mistura foi agitada em vórtex durante 20 segundos e a camada superior foi removida para um tubo de vidro 13 x 100. A mistura reaccional original foram adicionados 3 ml mais da solução de hexano/colesterol/linoleato de colesterilo. Esta mistura foi agitada em vórtex e a camada superior foi removida e adicionada à primeira extracção. Os conteúdos de ambas as extracções foram secos sob azoto gasoso ou evaporados durante a noite.

Os conteúdos secos dos tubos contendo o material extractado foram dissolvidos em 50 μΐ de clorofórmio e aplicados em pequenas manchas em folhas de cromatografia de camada fina (TLC) Empore. O tubo foi lavado com 50 μΐ adicionais e adicionado à primeira mancha. As folhas de TLC foram reveladas num solvente de hexano:éter etílico numa proporção de 60:40. As folhas foram secas ao ar e expostas a iodo para visualizar as origens. As folhas foram então colocadas em auto-radiofrafia Kodak X-OMAT durante uma exposição de uma noite. As áreas nas folhas de TLC correspondentes aos si72 730

SCRF Case 210.0 (POR)

correspondentes aos sinais radioactivos no filme foram cortadas e colocadas em frascos de cintilação com 3 ml de cintilante (PPD-PDPDP em tolueno). A marca radioactiva de 14-C foi detectada num contador beta. As taxas de esterificação fraccionárias (FER) foram determinadas a partir das contagens de cintilação onde a FER é expressa como cpm de éster de colesterilo sobre cpm de colesterol mais éster de colesterilo.

Os resultados dos ensaios de esterificação do colesterol mediada por LCAT nos quais foram testados cinco anticorpos monoclonais, AI-4, AI-9, AI-11, AI-16 e Al-18, quanto à sua capacidade para inibir a esterificação do colesterol são mostrados na Figura 7.

Os MAB AI-4 e AI-11 purificados foram preparados como descrito no Exemplo 6C. Os MAB AI-9, AI-16 e AI-18 purificados foram gerados por fusão de esplenócitos de ratinhos imunizados com Apo ΑΙ/HDL similarmente aos processo descritos no Exemplo 6C. Os MAB AI-9 e AI-16 foram utilizados como MAB de controlo na análise de esterificação do coiestero mediada por LCAT, e sabe-se que imunorreagem com o CNBr4 e a sequência de resíduos de aminoácidos de Apo AI1-15, respectivamente. O MAB AI-18 imunorreagem com a sequência de resíduos de aminoácidos de Apo AI AI95-105. O MAB AI-18 não consegue inibir a esterificação do colesterol enquanto que o MAB AI-11 (AI96-111) inibe a esterificação mais eficazmente. Por consequência os resíduos de aminoácidos de Apo AI 106-111 são uma parte essencial de um polipéptido de Apo AI útil para aumentar a esterificação do colesterol.

Nesta análise, foram avaliados 250 /ig de cada anticorpo. Nesta quantidade os anticorpos e a Apo AI estavam em concentrações molares iguais. Os dados para cada anticorpo monoclonal são expressos como percentagens do controlo onde o controlo é FER na ausência de anticorpo mas na presença de LPDP. Às FER de controlo para os resultados alcançam de 0,0626 a 0,0948 por hora. Cada barra representa os dados de duas experiências e cada experiência é feita em duplicado. O anticorpo monoclonal AI-

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SCRF Case 210.0 (POR)

-6111 foi o inibidor mais eficaz da esterificação do colesterol seguido pelo AI-4. Os anticorpos monoclonais AI-9, AI-16 e AI-18 foram ineficazes no blogueamento da esterificação do colesterol.

Estes dados mostram que os epítopos de Apo AI reconhecidos pelo MAB AI-4, e particularmente pelo MAB AI-11 compreendem uma parte da molécula de Apo AI que está envolvida no processo pelo qual a Apo AI aumenta normalmente a esterificação do colesterol. Assim, os polipêptidos que mimetizam imunologicamente o epítopo definido pelo MAB AI-4 ou pelo MAB AI-11 representam polipêptidos de Apo AI úteis que irão actuar como um análogo da Apo AI na capacidade da Apo AI para aumentar a esterificação do colesterol. Isto é, os polipêptidos da Apo AI deste invento podem ser usados similarmente à própria Apo AI para aumentar a esterificação do colesterol.

A descrição anterior, incluindo as concretizações e exemplos específicos, destina-se a ser ilustrativa do presente invento e não deve ser tomada como limitante. Podem ser efectuadas numerosas variações e modificações sem afastamento do verdadeiro espirito e âmbito do presente invento.

Claims (26)

1. REIVINDICAÇÕES

   1 - Processo de preparação de um polipéptido de Apo AI compreendendo não mais do que 25 resíduos de aminoácido e incluindo uma sequência de resíduos de aminoácido representada pela fórmula:

   -Lys-Val-Gln-Pro-Tyr-Leu-Asp-Asp-Phe-Gln-Lys-Lys-Trp-Gln-Glu-Glucaracterizado por se efectuar o crescimento da cadeia polipeptídica em fase sólida, sobre uma resina polimérica quimicamente inerte, com ligação de um aminoácido, via terminal carboxilo ou amino, à resina, protecção dos grupos laterais reactivos e do grupo amino ou carboxilo do terminal não ligado do aminoácido, remoção dos grupos protectores e clivagem final do polipéptido obtido da resina polimérica.
2. 2 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido polipéptido ter uma sequência de resíduos de aminoácido representada por uma fórmula seleccionada a partir do grupo consistindo em:

   Gln-Glu-Met-Ser-Lys-Asp-Leu-Glu-Glu-Val-Lys-Ala-Lys-Val-Gln-Pro-Tyr-Leu-Asp-Asp-Phe-Gln-Lys-Lys-Trp-Gln-Glu-Glu,

   Glu-Met-Ser-Lys-Asp-Leu-Glu-Glu-Val-Lys-Ala-Lys-Val-Gln-Pro-Tyr-Leu-Asp-Asp-Phe-Gln-Lys-Lys-Trp-Gln-Glu-Glu,

   Leu-Glu-Glu-Val-Lys-Ala-Lys-Val-Gln-Pro-Tyr-Leu-Asp-Asp-Phe-Gln-Lys-Lys-Trp-Gln-Glu-Glu,

   Val-Lys-Ala-Lys-Val-Gln-Pro-Tyr-Leu-Asp-Asp-Phe-Gln-Lys-Lys-Trp-Gln-Glu-Glu,

   Lys-Ala-Lys-Val-Gln-Pro-Tyr-Leu-Asp-Asp-Phe-Gln-Lys-Lys-Trp-Gln-Glu-Glu,

   Lys-Ala-Lys-Val-Gln-Pro-Tyr-Leu-Asp-Asp-Phe-Gln-Lys-Lys-Trp-Gln-Glu-Glu-Met-Glu-Leu-Tyr-Arg-Gln-Lys-Val-Glu-Pro-Leu-Arg-Ala-Glu,

   Lys-Val-Gln-Pro-Tyr-Leu-Asp-Asp-Phe-Gln-Lys-Lys-Trp-Gln-Glu-Glu.
3. 3 - Processo de preparação de um polipéptido de Apo AI compreendendo não mais do que cerca de 60 resíduos de aminoácido e incluindo uma sequência de resíduos de aminoácido representada pela fórmula:

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   SCRF Case 210.0 (POR)

   -63-Pro-Tyr-Leu-Asp-Asp-XGln-Lys-Lys-Trp-Gln-Glu-Glu-Met-GTu-Leu-, na qual X é Glu ou Phe, caracterizado por se efectuar o crescimento da cadeia polipeptídica em fase sólida , sobre uma resina polimérica quimicamente inerte, com ligação de um aminoácido, via terminal carboxilo ou amino, à resina, protecção dos grupos laterais reactivos e do grupo amino ou carboxilo do terminal não ligado do aminoácido, remoção dos grupos protectores e clivagem final do polipéptido obtido da resina polimérica.
4. 4 - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por o referido polipéptido incluir uma sequência de resíduos de aminoácido representada pela fórmula:

   -Pro-Tyr-Leu-Asp-Asp-XGln-Lys-Lys-Trp-Gln-Glu-Glu-Met-Glu-Leu-Tyr-Arg-Gln-Lys-Val-Glu-Pro-.
5. 5 - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por o referido polipéptido ter uma sequência de resíduos de aminoácido representada por uma fórmula seleccionada a partir do grupo consistindo em:

   Lys-Ala-Lys-Val-Gln-Pro-Tyr-Leu-Asp-Asp-XGln-Lys-Lys-Trp-Gln-Glu-Glu-Met-Glu-Leu,

   Lys-Ala-Lys-Val-Gln-Pro-Tyr-Leu-Asp-Asp-XGln-Lys-Lys-Trp-Gln-Glu-Glu-Met-Glu-Leu-Tyr-Arg-Gln-Lys-Val-Glu-Pro-Leu-Arg-Ala-Glu, Gln-Pro-Tyr-Leu-Asp-Asp-XGln-Lys-Lys-Trp-Gln-Glu-Glu-Met-Glu-Leu, Gln-Pro-Tyr-Leu-Asp-Asp-XGln-Lys-Lys-Trp-Gln-Glu-Glu-Met-Glu-Leu-Tyr-Arg-Gln-Lys-Val-Glu-Pro,

   Pro-Tyr-Leu-Asp-Asp-XGln-Lys-Lys-Trp-Gln-Glu-Glu-Met-Glu-Leu, e Pro-Tyr-Leu-Asp-Asp-XGln-Lys-Lys-Trp-Gln-Glu-Glu-Met-Glu-Leu-Tyr-Arg-Gln-Lys-Val-Glu-Pro.
6. 6 - Processo de preparação de um conjunto de diagnóstico, caracterizado por se embalar uma quantidade, suficiente para se efectuar pelo menos um ensaio, de um polipéptido de Apo AI compreendendo não mais do que 25 resíduos de aminoácido e incluindo uma sequência de resíduos de aminoácido representada pela fórmula: -Lys-Val-Gln-Pro-Tyr-Leu-Asp-Asp-Phe-Gln-Lys-Lys-Trp-Gln-Glu-Glu-, cujo crescimento da cadeia polipeptídica é

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   SCRF Case 210.0 (POR) efectuada em fase sólida, sobre uma resina polimérica quimicamente inerte, com ligação de um aminoácido, via terminal carboxilo ou amino, à resina, protecção dos grupos laterais reactivos e do grupo amino ou carboxilo do terminal não ligado do aminoácido, remoção dos grupos protectores e clivagem final do polipéptido obtido da resina polimérica.
7. 7 - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado o referido polipéptido ter uma sequência de resíduos de aminoácido representada por uma fórmula seleccionada a partir do grupo consistindo em:

   Gln-Glu-Met-Ser-Lys-Asp-Leu-Glu-Glu-Val-Lys-Ala-Lys-Val-Gln-Pro“Tyr-Leu-Asp-Asp-Phe-Gln-Lys-Lys-Trp-Gln-Glu-Glu,

   Glu-Met-Ser-Lys-Asp-Leu-Glu-Glu-Val-Lys-Ala-Lys-Val-Gln-Pro-Tyr-Leu-Asp-Asp-Phe-Gln-Lys-Lys-Trp-Gln-Glu-Glu,

   Leu-Glu-Glu-Val-Lys-Ala-Lys-Val-Gln-Pro-Tyr-Leu-Asp-Asp-Phe-Gln-Lys-Lys-Trp-Gln-Glu-Glu,

   Val-Lys-Ala-Lys-Val-Gln-Pro-Tyr-Leu-Asp-Asp-Phe-Gln-Lys-Lys-Trp-Gln-Glu-Glu,

   Lys-Ala-Lys-Val-Gln-Pro-Tyr-Leu-Asp-Asp-Phe-Gln-Lys-Lys-Trp-Gln-Glu-Glu,

   Lys-Ala-Lys-Val-Gln-Pro-Tyr-Leu-Asp-Asp-Phe-Gln-Lys-Lys-Trp-Gln-Glu-Glu-Met-Glu-Leu-Tyr-Arg-Gln-Lys-Val-Glu-Pro-Leu-Arg-Ala-Glu,

   Lys-Val-Gln-Pro-Tyr-Leu-Asp-Asp-Phe-Gln-Lys-Lys-Trp-Gln-Glu-Glu.
8. 8 - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado o referido polipéptido ser operativamente ligado a uma matriz sólida.
9. 9 - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por se embalar ainda separadamente uma quantidade, suficiente para se efectuar pelo menos um ensaio, de um anticorpo contendo moléculas de anticorpo anti-Apo AI que imunorreage com um ligando reactivo:

   a) Apo AI/HDL,

   b) Apo AI isolada,

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   SCRF Case 210.0 (POR)

   -65c) Apo AI CNBr2 e

   d) o polipéptido Lys-Val-Gln-Pro-Tyr-Leu-Asp-Asp-Phe-Gln-Lys-Lys-Trp-Gln-Glu-Glu, mas que não imunorreage com um ligando não reactivo:

   e) Apo AI CNBrl,

   f) Apo AI CNBr3 e

   g) o polipéptido Ser-Lys-Asp-Leu-Glu-Glu-Val-Lys-Ala-Lys-Val-Gln-Pro-Tyr-Leu-Asp-Asp-Phe-Gln-Lys-Lys-Trp-Gln-Glu-Glu,

   h) o polipéptido Ser-Lys-Asp-Leu-Glu-Glu-Val-Lys-Ala-Lys-Val-Gln-Pro-Tyr-Leu-Asp-Asp-Phe-Gln, e

   i) o polipéptido Gln-Pro-Tyr-Leu-Asp-Asp-Phe-Gln-Lys-Lys-Trp-Gln-Glu-Glu-Met-Glu-Leu-Tyr-Arg-Gln-Lys-Val-Glu-Pro, sendo o anticorpo obtido por

   i) pesquisa dos anticorpos que se ligam ao ligando reactivo, provenientes de um animal que foi previamente imunizado contra o referido ligando reagente e mantido durante tempo suficiente para que se formassem anticorpos para o referido ligando reactivo, relativamente a anticorpos que não se ligam ao ligando não reactivo; e ii) recuperação dos anticorpos que se ligam ao ligando reactivo mas não ao ligando não reactivo.
10. 10 - Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por as referidas moléculas de anticorpo serem ligadas operativamente a um meio indicador enzimático.
11. 11 - Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por as referidas moléculas de anticorpo serem preparadas por:

    a) fusão de células do baço, provenientes de animais que foram imunizados contra o ligando reactivo e mantidos durante tempo suficiente para que se formassem anticorpos para o referido ligando reactivo, com células de mieloma, para formar células de hibridoma;

    b) clonação das referidas células de hibridoma em células monoclonais e cultura das células monoclonais;

    c) pesquisa do meio de crescimento das referidas culturas de células de hibridoma monoclonais relativamente a anticorpos segregados que se ligam ao ligando reactivo mas não ao ligando

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    SCRF Case 210.0 (POR)

    -66não reactivo; e

    d) recuperação dos anticorpos do passo c).
12. 12 - Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por o hibridoma ter a designação do ATCC HB8744.
13. 13 - Processo de preparação de um conjunto de diagnóstico, caracterizado por se embalar uma quantidade, suficiente para se efectuar pelo menos um ensaio, de um polipéptido de Apo AI compreendendo não mais do que 60 resíduos de aminoâcido e incluindo uma sequência de resíduos de aminoâcido representada pela fórmula: -Pro-Tyr-Leu-Asp-Asp-XGln-Lys-Lys-Trp-Gln-Glu-Glu-Met-Glu-Leu-Tyr-Arg-Gln-Lys-Val-Glu-Pro- cujo crescimento da cadeia polipeptídica é efectuado em fase sólida, numa resina polimérica quimicamente inerte, com ligação de um aminoâcido, via terminal carboxilo ou amino, à resina, protecção dos grupos laterais reactivos e do grupo amino ou carboxilo do terminal não ligado do aminoâcido, remoção dos grupos protectores e clivagem final do polipéptido obtido da resina polimérica.
14. 14 - Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado o referido polipéptido ter uma sequência de resíduos de aminoâcido representada por uma fórmula seleccionada a partir do grupo consistindo em:

    Lys-Ala-Lys-Val-Gln-Pro-Tyr-Leu-Asp-Asp-XGln-Lys-Lys-Trp-Gln-Glu-Glu-Met-Glu-Leu,

    Lys-Ala-Lys-Val-Gln-Pro-Tyr-Leu-Asp-Asp-XGln-Lys-Lys-Trp-Gln-Glu-Glu-Met-Glu-Leu-Tyr-Arg-Gln-Lys-Val-Glu-Pro-Leu-Arg-Ala-Glu, Gln-Pro-Tyr-Leu-Asp-Asp-XGln-Lys-Lys-Trp-Gln-Glu-Glu-Met-Glu-Leu, Gln-Pro-Tyr-Leu-Asp-Asp-XGln-Lys-Lys-Trp-Gln-Glu-Glu-Met-Glu-Leu-Tyr-Arg-Gln-Lys-Val-Glu-Pro,

    Pro-Tyr-Leu-Asp-Asp-XGln-Lys-Lys-Trp-Gln-Glu-Glu-Met-Glu-Leu, e

    Pro-Tyr-Leu-Asp-Asp-XGln-Lys-Lys-Trp-Gln-Glu-Glu-Met-Glu-Leu-Tyr-Arg-Gln-Lys-Val-Glu-Pro
15. 15 - Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado o referido polipéptido ser operativamente ligado a uma matriz

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    SCRF Case 210.0 (POR) sólida.
16. 16 - Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por se embalar ainda separadamente uma quantidade, suficiente para se efectuar pelo menos um ensaio, um anticorpo contendo moléculas de anticorpo anti-Apo AI que imunorreage com um ligando reactivo:

    a) Apo AI/HDL,

    b) Apo AI isolada,

    c) Apo AI CNBr2-CNBr3 e

    d) o polipéptido Pro-Tyr-Leu-Asp-Asp-Phe-Gln-Lys-Lys-Trp-Gln-Glu-Glu-Met-Glu-Leu-Tyr-Arg-Gln-Lys-Val-Glu-Pro, mas que não imunorreage com um ligando não reactivo:

    e) Apo AI CNBrl,

    f) Apo AI CNBr3 e

    g) o polipéptido Ser-Lys-Asp-Leu-Glu-Glu-Val-Lys-Ala-Lys-Val-Gln-Pro-Tyr-Leu-Asp-Asp-Phe-Gln-Lys-Lys-Trp-Gln-Glu-Glu,

    h) o polipéptido Ser-Lys-Asp-Leu-Glu-Glu-Val-Lys-Ala-Lys-Val-Gln-Pro-Tyr-Leu-Asp-Asp-Phe-Gln, e

    i) o polipéptido Gln-Pro-Tyr-Leu-Asp-Asp-Phe-Gln-Lys-Lys-Trp-Gln-Glu-Glu-Met-Glu-Leu-Tyr-Arg-Gln-Lys-Val-Glu-Pro, sendo o anticorpo obtido por

    i) pesquisa dos anticorpos que se ligam ao ligando reactivo, provenientes de um animal que foi previamente imunizado contra o referido ligando reagente e mantido durante tempo suficiente para que se formassem anticorpos para o referido ligando reactivo, relativamente a anticorpos que não se ligam ao ligando não reactivo; e ii) recuperação dos anticorpos que se ligam ao ligando reactivo mas não ao ligando não reactivo.
17. 17 - Processo de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por as referidas moléculas de anticorpo serem ligadas operativamente a um meio indicador enzimático.
18. 18 - Processo de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por as referidas moléculas de anticorpo serem preparadas por:

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    SCRF Case 210.0 (POR)

    a) fusão de células do baço, provenientes de animais que foram imunizados contra o ligando reactivo e mantidos durante tempo suficiente para que se formassem anticorpos para o referido ligando reactivo, com células de mieloma, para formar células de hibridoma;

    b) clonação das referidas células de hibridoma até à monoclonicidade e cultivar as células monoclonais;

    c) pesquisa do meio de crescimento das referidas culturas de células de hibridoma monoclonais relativamente a anticorpos segregados qu que se ligam ao ligando reactivo mas não aos ligandos não reactivos; e

    d) recuperar os anticorpos do passo c).
19. 19 - Processo de acordo com a reivindicação 18, do por o hibridoma ter a designação do ATCC HB9201.

    caracteriza
20. 20 - Processo para análise da quantidade de Apo AI numa amostra de fluido vascular, caracterizado por compreender os passos de:

    (a) formar uma mistura de imunorreacção, por mistura de uma amostra de fluido vascular com:

    (i) um anticorpo anti-Apo AI contendo moléculas de anticorpo que imunorreagem com:

    (1) Apo AI/HDL, (2) Apo AI isolado, (3) Apo AI CNBr2, e (4) o polipéptido Lys-Val-Gln-Pro-Tyr-Leu-Asp-Asp-Phe-Gln-Lys-Lys-Trp-Gln-Glu-Glu mas não imunorreagem com:

    (5) Apo AI CNBrl, (6) Apo AI CNBr3, (7) o polipéptido Ser-Lys-Asp-Leu-Glu-Glu-Val-Lys-Ala-Lys-Val-Gln-Pro-Tyr-Leu-Asp-Asp-Phe-Gln-Lys-Lys-Trp-Gln-Glu-Glu, (8) o polipéptido Ser-Lys-Asp-Leu-Glu-Glu-Val-Lys-Ala-Lys-Val-Gln-Pro-Tyr-Leu-Asp-Asp-Phe-Gln, e (9) o polipéptido Gln-Pro-Tyr-Leu-Asp-Asp-Phe-Gln-Lys-Lys-Trp-Gln-Glu-Glu-Met-Glu-Leu-Tyr-Arg-Gln-Lys-Val-Glu-Pro;

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    SCRF Case 210.0 (POR) (ii) um polipéptido de Apo AI não compreendendo mais do que 25 resíduos de aminoácido e incluindo uma sequência de resíduos de aminoácido representada pela fórmula:

    -Lys-Val-Gln-Pro-Tyr-Leu-Asp-Asp-Phe-Gln-Lys-Lys-Trp-Gln-Glu-Glusendo o referido polipéptido ligado operativamente a uma matriz sólida, de tal modo que a mistura de imunorreacção tenha uma fase líquida e uma fase sólida;

    (b) manter a referida mistura de imunorreacção durante um período de tempo suficiente para formar um produto de imunorreacção contendo Apo AI na fase sólida, e (c) determinar a quantidade de produto formado no passo (b).
21. 21 - Processo de acordo com a reivindicação 20, caracterizado por o referido polipéptido de Apo AI ter uma sequência de resíduos de aminoácido representada por uma fórmula seleccionada de entre o grupo consistindo em:

    Gln-Glu-Met-Ser-Lys-Asp-Leu-Glu-Glu-Val-Lys-Ala-Lys-Val-Gln-Pro-Tyr-Leu-Asp-Asp-Phe-Gln-Lys-Lys-Trp-Gln-Glu-Glu, Glu-Met-Ser-Lys-Asp-Leu-Glu-Glu-Val-Lys-Ala-Lys-Val-Gln-Pro-Tyr-Leu-Asp-Asp-Phe-Gln-Lys-Lys-Trp-Gln-Glu-Glu,

    Leu-Glu-Glu-Val-Lys-Ala-Lys-Val-Gln-Pro-Tyr-Leu-Asp-Asp-Phe-Gln-Lys-Lys-Trp-Gln-Glu-Glu,

    Val-Lys-Ala-Lys-Val-Gln-Pro-Tyr-Leu-Asp-Asp-Phe-Gln-Lys-Lys-Trp-Gln-Glu-Glu,

    Lys-Ala-Lys-Val-Gln-Pro-Tyr-Leu-Asp-Asp-Phe-Gln-Lys-Lys-Trp-Gln-Glu-Glu,

    Lys-Ala-Lys-Val-Gln-Pro-Tyr-Leu-Asp-Asp-Phe-Gln-Lys-Lys-Trp-Gln-Glu-Glu-Met-Glu-Leu-Tyr-Arg-Gln-Lys-Val-Glu-Pro-Leu-Arg-Ala-Glu, e

    Lys-Ala-Lys-Val-Gln-Pro-Tyr-Leu-Asp-Asp-Phe-Gln-Lys-Lys-Trp-Gln-Glu-Glu.
22. 22 - Processo de acordo com a reivindicação 20, caracterizado por o referido anticorpo ser ligado operativamente a um marcador de enzima, e por o referido produto formado no passo (b) ser um produto de imunorreacção marcado.

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    SCRF Case 210.0 (POR)
23. 23 - Processo de acordo com a reivindicação 20, caracterizado por as referidas moléculas de anticorpo serem as produzidas pelo hibridoma possuindo a designação HB9201 do ATCC.
24. 24 - Processo para análise da quantidade de Apo AI numa amostra de fluido vascular, caracterizado por compreender os passos de:

    (a) formar uma mistura de imunorreacção, por mistura de uma amostra de fluido vascular com:

    (i) um anticorpo anti-Apo AI contendo moléculas de anticorpo que imunorreagem com:

    (1) Apo AI/HDL, (2) Apo AI isolado, (3) Apo AI CNBr2-CNBr3, e (4) o polipéptido Pro-Tyr-Leu-Asp-Asp-Phe-Gln-Lys-Lys-Trp-Gln-Glu-Glu-Met-Glu-Leu-Tyr-Arg-Gln-Lys-Val-Glu-Pro mas não imunorreagem com;

    (5) Apo AI CNBrl, (6) o polipéptido Ser-Lys-Asp-Leu-Glu-Glu-Val-Lys-Ala-Lys-Val-Gln-Pro-Tyr-Leu-Asp-Asp-Phe-Gln-Lys-Lys-Trp-Gln-Glu-Glu, (7) o polipéptido Leu-Glu-Glu-Val-Lys-Ala-Lys-Val-Gln-Pro-Leu-Tyr-Asp-Asp-Phe-Gln-Lys-Lys-Trp-Gln-Glu-Glu, e (8) o polipéptido Tyr-Arg-Gln-Lys-Val-Glu-Pro-Leu-Arg-Ala-Glu-Leu;

    (ii) um polipéptido de Apo AI não compreendendo mais do que cerca 60 resíduos de aminoácido e incluindo uma sequência de resíduos de aminoácido representada pela fórmula:

    Pro-Tyr-Leu-Asp-Asp-XGln-Lys-Lys-Trp-Gln-Glu-Glu-Met-Glu-Leu-Tyr-Arg-Gln-Lys-Val-Glu-Pro-, na qual X é Glu ou Phe sendo o referido polipéptido ligado operativamente a um suporte sólido, de tal modo que a mistura de imunorreacção tenha uma fase líquida e uma fase sólida;

    (b) manter a referida mistura de imunorreacção durante um período de tempo suficiente para formar um produto de imunorreacção contendo Apo AI na fase sólida, e (c) determinar a quantidade de produto no passo (b).

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    SCRF Case 210.0 (POR)

    -7125 - Processo de acordo com a reivindicação 24, caracterizado por o referido polipéptido de Apo AI ter uma sequência de resíduos de aminoácido representada por uma fórmula seleccionada de entre o grupo consistindo em:

    Lys-Ala-Lys-Val-Gln-Pro-Tyr-Leu-Asp-Asp-XGln-Lys-Lys-Trp-Gln-Glu-Glu-Met-Glu-Leu,

    Lys-Ala-Lys-Val-Gln-Pro-Tyr-Leu-Asp-Asp-XGln-Lys-Lys-Trp-Gln-Glu-Glu-Met-Glu-Leu-Tyr-Arg-Gln-Lys-Val-Glu-Pro-Leu-Arg-Ala-Glu, Gln-Pro-Tyr-Leu-Asp-Asp-XGln-Lys-Lys-Trp-Gln-Glu-Glu-Met-Glu-Leu, Gln-Pro-Tyr-Leu-Asp-Asp-XGln-Lys-Lys-Trp-Gln-Glu-Glu-Met-Glu-Leu-Tyr-Arg-Gln-Lys-Val-Glu-Pro,

    Pro-Tyr-Leu-Asp-Asp-XGln-Lys-Lys-Trp-Gln-Glu-Glu-Met-Glu-Leu, e Pro-Tyr-Leu-Asp-Asp-XGln-Lys-Lys-Trp-Gln-Glu-Glu-Met-Glu-Leu-Tyr-Arg-Gln-Lys-Val-Glu-Pro.
25. 26 - Processo de acordo com a reivindicação 24, caracterizado por o referido anticorpo ser ligado operativamente a um marcador de enzima, e por o referido produto formado no passo (b) ser um produto de imunorreacção marcado.
26. 27 - Processo de acordo com a reivindicação 24, caracterizado por as referidas moléculas de anticorpo serem as produzidas pelo hibridoma possuindo a designação HB8744 do ATCC.