JPH06508344A

JPH06508344A - Ａｐｏ　ＡＩポリペプチド、抗体及びイムノアッセイ

Info

Publication number: JPH06508344A
Application number: JP3511924A
Authority: JP
Inventors: カーティス　リンダ　ケイ; バンカ　キャロル　エル; ボネット　ディヴィッド　ジェイ; スミス　リチャード　エス
Original assignee: ザスクリップスリサーチインスティテュート
Priority date: 1990-04-07
Filing date: 1991-06-07
Publication date: 1994-09-22
Also published as: IE911922A1; EP0500826A1; WO1991018619A1; CA2084677C; PT97914B; CA2084677A1; PT97914A; EP0500826A4

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】Ａｐｏ　Ａ［ポリペプチド、抗体及びイムノアッセイ本発明は、診断方法及び血液試料中のＡｐｏ　Ａｌ量を免疫学的に定量するのに有効なポリペプチドに関する。更にこれらのポリペプチドは、ヒト患者においてＬＣＡＴ仲介コレチロールエステル化及びコレステロールエステルの生成を増加するための治療方法及び組成物に有効である。

背景リポタンパク質は、血漿コレステロールの主要なキャリヤである。これらはコレステロール含有コアを取り囲む極性脂質と会合した１種以上のタンパク質からなる表面膜を有する脂質−タンパク質ミセル複合体（粒子）である。リポタンパク質は、はじめに超遠心法によって測定された浮遊密度に基づいて分類された。

従って、主な４種の密度か確認されている二キロミクロン、超低密度リポタンパク！（ＶＬＤＬＩ、低密度リポタンパク質ＬＤ［、及び高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）。

そこで多くの研究により、血漿ＨＤＬコレステロールレベルと冠状動脈疾患（ＣＡＤ）の危険率との逆相関が確かめられた。即ち、ＨＤＬ粒子に見られる血漿コレステロールレベルの４二昇はＣＡＤの危険率低下と関係する。例えば、Ｇｏｌｄｂｏｕｒｔ等、Ｉｎｔ。

Ｊ、　Ｅｐ　ｉｄｅｍｉｏ　１．　Ｉ　５　：５ｌ−５５（＋９８６　）参照。

同様に、そこで多くの研究により、ＨＤＬのタンパク質主成分であるアポリポタンパク質ＡＩ（Ａｐｏ　Ａｔ　）の血漿１ノへルもＣＡＤの危険率に逆に関係することが示された。

更に、Ｗｅｉｓｗｅｉｌｅｒ等、Ｃ１１ｎ、Ｃｈｅｍ、、２７：３４８（１９８１）は、Ａｐｏ　Ａ［レベルの情報がＨＤＬコレステロールの予測値に加えられることを報告している。

ＣＡＤと逆相関があるために、脂質代謝におけるＡｐｏ　Ａｌの構造と機能に広範囲にわたる研究がなされた。そこでＡｐｏ　Ａｌは、機能的には組織からのコレステロール除去を仲介すると思われる。

構造的には、精製ＡｐｏＡ！は高割合（５５％）のα−ヘリックスを含むと記載されており、ＨＤＬ粒子のようにリン脂質と会合すると７０％に増加する。Ａｐｏ　Ａｌの脂質結合特性は、一般にα−へリックス及び両染性のプロリン残基によって中断される２２個のアミノ酸残基の一連の縦列に繰り返されるセグメントの機能であると思われる。

そのままのＡｐｏ　Ａｌの臭化シアノジエン−及びトリプシン−断片のｔｋ１ｍａｎ分解によってめられるＡｐｏ　Ａｌのアミノ酸残基配列は、Ｂｒｅｗｅｒ等、Ｂｉｏｃｈｅａ　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ。

Ｃｏｎｕ　、　８０：６２３−６３０（１９７８）に記載されている。Ｂｒｅｗｅｒ等によれば、Ａｐｏ　Ａｌの臭化シアノジエン（ＣＮＢｒ）切断により、アミノ末端からカルボキシ末端までＡｐｏ　Ａｌ配列に沿って存在する順にＣＮＢｒ１　、　ＣＮＢｒ２　、ＣＮＢｒ３及びＣＮＢｒ４と称される４種の主な′　断片を作った。ＣＮＢｒ２及びＣＮＢ１３を作るＡｐｏ　ＡＴ領領域アミノ酸残基配列が本発明に特に関係があるので、図１に具体的に示される。

末変１１ｐｏ　Ａｌ、即ちＨＤＬ粒子に見られるＡｐｏ　Ａｌの免疫化学的確認は、抗原的に不均一で不安定であるので、問題があった。Ａｐｏ　Ａｌの抗原不均一性は、そのままのＨＤＬ中の脂質によって隠されているいくつかのエピトープ又は脂質あるいは他のＨＤＬ会合タンパク質によって影響されるＡｐｏ　Ａｌ配座に依存するいくつかのエピトープの抗体−結合能の結果であると思われる。

限定された抗血清を用いて時間について変化する免疫反応性によって現れるＡｐｏ　Ａｌの抗原不安定性は、自己会合及び脱アミノ化のような現象のためであると思われ、その両方が試験管内で生じることが証明されている。Ｃｕｒｔｉｓｓ等、リポタンパク質不均−性に関する研究会の議事録、Ｌ　ｒ　ｐｐｅ　ｒによる編集、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅｓ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ　Ｎ潤B ８７−２６４６　、Ｐ、３６３−３７７（１９８７）参照。Ｍｉｌｔｈｏｒｐ等、Ａｒｔｅｒｉｏ、、６：２８５−２９６（１９８６）によれば、未変傷ｐｏ　Ａｔ免疫反応性について貯蔵及ηａＯＨ処理の影響は似ているが、同じではなく、貯蔵中の免疫反応性のロスが大部分脱アミノ化によること力便に含まれることを示している。

Ａｐｏ　Ａｌの抗原不均一性及び不安定性のため、患者の血液試料中のＡｐｏ　Ａｌを定量化するためのアッセイシステムを作ることは困難であった。これは、特にそのようなシステムにはシステムの主要な抗−Ａｐｏ　Ａｌ抗体の免疫反応性が患者の試料中のＡｐｏ　Ａｌと非常に少しでも一致する、好ましくは等価である比較物質（標準）を必要とするためである。

最近、Ａｐｏ　Ａｌの抗原均一性及び不安定性と関係がある問題点を克服する努力は、その発現が特異的単離及び貯蔵条件下で一致あるいは“保存”されている未変性Ａｐｏ　Ａｌのエピトープを同定するモノクローナル抗体（ＭＡＲ）を用いることに集中してきた。そのようなエピトープを、本明細書では“保存未変性エピトープ”と呼ぶ。

エピトープＡと称する具体的な保存米麦ｆｆＪｐｏ　Ａｌは、ＭｊｌｔｈＯｒｐｅ等、Ａｒｔｅｒｉｏ、、６：２８５−２９６（１９８６）によって、ＭＡＢ　４Ｈ１ど免疫反応するＡｐｏ　ＡＩ　ＣＮＢｒ１の部分であると定義された。これはｃ、ｃ’及びＣＩ＋と称されるエピトープと対照的であり、全てＡｐｏ　ＡｌのＣＮＢｒ領域に位置し、それらの全てが“非保存”エピトープであることが見出された。

モノクローナル抗体Ａｌ−４及びＡｌ−１１及びＡｌ−１８は、抗−Ａｐｏ　Ａｌ　ｐａｎ抗体、即ち血漿中のＡｐｏ　Ａｌ含有リポタンパク質粒子の全であるいはほとんどの種類を結合する抗体として同定された。ｌｏｇｌｅ等、Ｊ、　Ｌｉｐｉｄ、　Ｒｅｓ、、２９：１２２１−１２２９（１９８８）及びＣｕｒｔｉｓｓ等、”Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｄｙ５ｌｉｐＯｐｒＯｔｅｉｎｅｌｌｌｉａＳ：Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ａｐｐｌｉモ≠狽奄盾獅■ ｉｎ　Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ　ａｎｄ　Ｃｎｔｒｏ１″、Ｌｅｎｆａｎｔ等、ｅｄｓ＋ｐｐ、２１７−２２６　、　Ｒａｖｅｎ　Ｐｒｅｓｓ（mｅｗＹｏｒｋ）、１９８９参照。しかしながら、抗体Ａｌ−４及びＡｌ−１１が免疫反応するＡｐｏ　Ａｌの特異的エピトープは同定されていない。

またＡｐｏ　Ａｌは、レシチン、コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）−仲介コレスチロールエステル化を調節することが知られている。Ｐｏｗｎａｌｌ等、Ｂｉｏｃｈｅａ　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ、７９３：１４９ −１５６（１９８４）による研究は、Ａｐｏ　ＡｌとＨＤＬの相互作用がコレステロールエステル化を生じるＬＣＡＴ活性化に必要であることを示している。更に、ＬＣＡＴを活性化するＡｐｏ　Ａｌの特異的領域が同定された。これらの領域に対応するポリペプチド断片が合成され、ＬＣＡＴ活性化電位について試験された。

Ｓｐａｒｒｏｗ等、Ａｎｎ、Ｎ、Ｙ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　、３４８：１８７− ２０８（１９８０）によれば、Ａｐｏ　Ａｌ断片残基１４８−１８５は、ＬＣＡＴと脂質結合の両方の活性化に関係した。ＦｕｋｕｓｈｉｎｋＬ等、Ｊ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｕ　２５５：１０６５１−１０６５７（１９８０）による類似の研究では、Ａｐｏ　Ａｌ残基１２１−１６４に対応する合成ポリペプチドがコレステロールエステル化の活性化における未変出ｐｏ　Ａｌの３０％はど有効であることを示している。

未変性Ａｐｏ　ＡＴの物理特性によく似ている合成モデルポリペプチドによる更に最近の研究は、ポリペプチドがＦＩＤＬと会合する場合にＬＣＡＴの活性化が生じることを示している。Ｐｏｎ５ｉｎ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、２３：５３３７ −５３４２（１９８４）。

発明の簡単な要約そこでＬＣＡＴ−仲介コレスチロールエステル化を調節するのに有効なポリペプチドを定義するＡｐｏ　Ａｌの３種のエピトープを発見した。更にこれらのエピトープは、血液試料中のＡｐｏ　Ａｌを検出するための診断方法に有効なポリペプチドを定義する保存未変性エピトープを示す。

従って本発明は、約６０個以下のアミノ酸残基からなり、式：にＶＱＰＹＬＤＤＦＱＫＫＷＱＥＢによって示されるアミノ酸残基配列を含むＡｐｏ　Ａｌポリペプチドを提供する。

また約６０個以下のアミノ酸残基からなり、式：　ＰＹＬＤＤＸＱＫＫＷＱＥＢＭＢＬ、ここでＸはＥ又はＦである、によって示され、好ましくは：　ＰＹＬＤＤＸＱ制曙諷ＬＹＲＱＫＶＥＰによって示されるアミノ酸残基配列を含むポリペプチドを提供する。

更に本発明は、少なくとも１つのアッセイを行うのに十分な量で、固体マトリックスに操作的に結合されている本発明のＡｐｏ　Ａｌポリペプチドを含むキット形態の診断システムを提供する。

関連の実施態様において、診断システムは更にここに開示されるキットのＡｐ。

Ａｌポリペプチドと免疫反応する抗−Ａｐｏ　Ａｌ抗体分子を含んでいる。

また更に（ａ）血液試料を（ｉ）本発明の抗−Ａｐｏ　Ａｌ抗体及び（ｉｉ）抗体が免疫反応するＡｐｏ　Ａｌポリペプチド、該ポリペプチドは免疫反応混合物が液体相及び固体相の両方を有するように固体マトリックスに操作的に結合されている、と混合することによって免疫反応混合物を生成させ、（ｂ）該免疫反応混合物を固相中でＡｐｏ　Ａｌ含有免疫反応生成物を生成させるのに十分な時間維持し、（ｃ）工程（ｂ）で生成した生成物の量をめる工程を含む血液試料中のＡｐｏ　Ａｌ量をアッセイする方法が提供される。

また本発明のＡｐｏ　Ａ［ポリペプチドのエステル化コレステロール増加量を患者に投与する工程を含む患者におけるエステル化コレステロール量を増加させる治療方法が提供される。

図面の簡単な説明本開示の一部をなす図面において：図１は、１文字コードを用いてアミノ酸残基位置８５〜１４８のＢｒｅｗｅｒ等、ＢｉｏｃｈｅｕＢｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍ１．８０　：６２３−６３０（１９７８）によって報告されるＡｐｏ　Ａｌのアミノ酸残基を例示する。

位置８６と１１２に位置するメチオニン（Ｍ）残基での分解によって生成されるＡｐｏ　ＡＩ　ＣＮＢｒ２は、位置８７〜Ｉ１１の配列に対応し、カルボキシ末端メチオニンはホモセリンラクトンに変換される。

位置１１２と１４８に位置するメチオニン（Ｍ）残基での分解によって生成されるＡｐｏ　ＡＩ　ＣＮＢｒ３は、位置１１３〜１４７の配列に対応し、カルボキシ末端メチオニンはホモセリンラクトンに変換される。

Ａｐｏ　Ａｌの保存未変性エピトープは、ＭＡＢＡｌ−４全長ＣＮＢｒ断片２及び３によって定義され、アミノ酸残基配列９９〜１１４を含む。ＭＡＲＡｒ−１１によって定義されるＡｐ。

Ａ１の保存未変性エピトープは、アミノ酸残基配列９６−ＩｌｌがらのＣＮＢｒ２に限定される。ＭＡＲＡｌ−１８によって定義されるＡｐｏ　Ａｌの保存未変性エピトープは、アミノ酸残基配列９５−１０５からのＣＮＢｒ２に限定される。

図２は、ＭＡＲＡｌ−１１がＡｌ９６−１１１と免疫反応することを拮抗的に阻害するＡｐｏ　ＡＩ／ＨＤＬ、新鮮な血漿に存在するＨＤＬ及びポリペプチドＡｌ９６−１１１の能力を例示する。

タンパク質濃度は、Ｍａｒｋｗｅｌｌ等、Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　８７：２０６−２２０（１９７８）の方法に従ってめた。Ｘ−軸の単位は、アッセイに用いられる３種の拮抗剤に関して線状に変化する。Ａｐｏ　Ａｌ／ＨＤＬのデータ点は、開始濃度１■／ｍｌ、次に５連続の２倍希釈度に対応する。新鮮な血漿に存在するＨＤＬのデータ点は、開始希釈度１：１０次に６連続の２倍希釈度に対応する。ポリペプチドＡｌ９６−１１１は、開始濃度１■／ｍｌを有する血漿に対して上記のように希釈される。

図３は、ＭＡＲＡｌ−４がＡｐｏ　Ａｌ／ＨＤＬと免疫反応することを拮抗的に阻害するＡｐｏ　Ａｌ／ＨＤＬ及びポリペプチドＡ１９４−１２５及びＡｌ９９ −１２１の能力を例示する。ポリペプチドＡ１９Ｏ−ＩＩＩ、Ａ１９３−１１１及びＡ１９６−１１１は、拮抗的阻害剤ではない。拮抗剤の濃度は、図２に記載されるようにめたμｇタンパク質／ｍｌで示される。

図４は、図１に記載されるＡｐｏ　Ａｌの一部のアミノ酸残基配列を例示する。

保存未変性エピトープはＭＡＢＡｌ−４によって定義され、このエピトープはポリペプチドＡｌ９９−１２１に免疫学的によく似ており、太線として示される。

また太線のポリペプチドＡ１９４−１２５及びＡｌ９９−１２１もＭＡＲＡｌ− ４と免疫反応し、エピトープがよく似ている。

ＭＡＢ　Ａｌ−４と免疫反応せず、エピトープが似ていないＡｐｏ　Ａｌ由来ポリペプチドは細線として示される。実際のＡｐｏ　Ａｌ配列による細い直線は、Ａｐｏ　Ａｌのアミノ酸残基配列に関して近似しており、細線ポリペプチドからなるアミノ酸残基の実際の長さは、数字で示される。

図５は、ＭＡＢ　ＡＩ−ＩＩがＡＩ）ＯＡｌ／１（ＤＬと免疫反応することを拮抗的に阻害するＡｐ。

Ａｌ／ＨＤＬ及びポリペプチドＡ１９０−１比Ａ１９３−１１１及びＡｌ９６− １１１の能力を例示する。ポリペプチドＡｌ９９−１２１は、拮抗的阻害剤ではない。

図６は、図１に記載される＾ｐｏＡＩの一部のアミノ酸残基配列を例示する。保存未変性エピトープはＭＡＲＡｌ−１１によって定義され、このエピトープはポリペプチドＡｌ９６−１１１に免疫学的によく似ており、太線として示される。

また太線のポリペプチドＡ１８４−１１１、＾１８５−Ｉｌｌ、Ａ１９０（１１、Ａｌ９３−１１１．　Ａ１９４−１１１及びＡｌ９４−１２５もＭＡＲＡＩ− １１と免疫反応し、エピトープがよく似ている。ＭＡＲＡｌ−１１と免疫反応せず、エピトープが似ていないＡｐｏ　Ａｌ由来ポリペプチドは細線として示される。ＭＡＲＡＩ−１１と反応しないポリペプチドの直線は図４に記載される通りである。

図７は、実施例１１に記載されるＬＣＡＴ−仲介コレスチロールエステル化を阻害する本発明の抗−Ａｐｏ　Ａｌモノクローナル抗体の能力を例示する。

図８は、プロテオリポソームに結合する抗体の能力と実施例１１に記載されるＬＣＡＴ−仲介コレスチロールエステル化を阻害する能力との比較を示す。結合データ（白抜き）は、ＬＣＡＴアッセイの条件を２回繰り返した液相イムノアッセイから取った。Ａｐｏ　Ａｔは２２０μｇ／ｍ　ｌの濃度で使用し、抗体は４倍モル過剰量で加えた。

Ｌ［’ＤＰｕびＢ−メルカプトエタノールをＬＣＡＴアッセイのように加えた。

棒線は２回繰り返した２実験の平均十／−Ｓ、　Ｅ、を示す。ＬＣＡＴ−介エステル化（斜線）の阻害データは図７から取り、ここに阻害％として表される。

好ましい。しかしながら所望の機能特性がポリペプチドによって保持される限り、いかなるし−アミノ酸残基も“Ｄ”異性体の残基に置き換えることができる。

ＮＨ，は、ポリペプチドのアミノ末端に存在する遊離アミノ基を意味する。Ｃ０ＯＨは、ポリペプチドのカルボキシ末端に存在する遊離カルボキシ基を意味する。ポリペプチド標準命名法、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　ｃｈｅｗ　２４３：３５５２− ５９（１９６９）を保つために、アミノ酸残基（７）略語を次の対応表で示す。

対応表Ｍ　Ｍｅｔ　メチオニンＨＨｉｓ　ヒスチジンＱ　Ｇｉｎ　グルタミンＥ　Ｇｌｕ　グルタミン酸Ｗ　Ｔｒｐ　トリプトファンＲＡｒｇ　アルギニンＤ　Ａａｐ　アスパラギン酸Ｎ　Ａａロ　アスパラギンＣＣｙｓ　システィン全てのアミノ酸残基配列は、本明細書中左右の向きがアミノ末端からカルボキシ末端の従来の方向にある式によって示されることに留意しなければならない。更にアミノ酸残基配列の始め又は終わりのダッシュは、更に１個以上のアミノ酸残基配列へのペプチド結合又はカルボキシル又はヒドロキシル末端基への共有結合を示すことに留意しなければならない。

τ生成されるポリペプチドの誘導カルボキシ末端メチオニン残基を意味する。ホモセリンラクトンは通常タンパク質に見られず、本発明のポリペプチドに存在しないことが好ましい。

中＃Ａｐｏ　Ａｌ・会合脂質及びＡｐｏ　Ａｌの他にＩＩＤＬに典型的に見られるＡｐｏ　Ａ１１のような池のタンパク質の両方を実質的に含まないＡｐｏ　Ａｌを示す。

ポリペプチド及びベブチド：ポリペプチド及びペプチドは、隣接残基のα−アミノとカルボキシルとのベブチｉ・結合によって１つの残基を他の残基につないだアミノ酸残基の線状系列を示すために、本明細書中で同じ意味に用いられる用語ないた約５０個以Ｉ−のアミノ酸残基の線状系列を示ずｔ：めに本明細書で用いられる用語である、合成ベブ壬１・　天然ダンバク質及びその断片を含まないペプチド結合によって一緒に結合されるアミノ酸残基の化学的に生成された鎖を意味する。

Ｂ、ポリベブ千１・本明細７１て用いられる“Ａｐｏ　Ａｌポリペプチド“は、アミノ酸残基配列かＡｐｏ　Ａｔ分子の一部に灯心、好ましくは同一であるポリペプチドを意味する。

ｌ実施態様において、本発明のＡｐｏ　Ａｔポリベブ千ｌ・は、約６０個以下のアミノ酸残基、好ま（−べは約：３２個以下のアミノ酸残基からなり、式　ＫＶＱＰＹＬＩ′１ＤＦＱＫＫＷＱ開によ−）で示されるアミノ酸残基を３む、：のポリペプチドは、モノクローナル抗体ＭＡＲＡｌｌ＋と免疫反応するポリペプチドの能力によって定義されるＡｐｏ　Ａｌの保存未変性エピトープを定義する（即ちポリペプチドはＭＡＢＡｌ−１１エピトープを定義する）、、好ましい実施態様において、ポリペプチドはＱＥＭＳＫＤＬ［：ＢＶＫＡＫＶＱＰＹＬＤＤＦＱＫＫＷＱＥＥ。

ＥＭＳＫＤＬＥＥＶＫＡＫＶＱＰＹＬＤＤＦＱＫＫＷＱＥＥ。

ＬＥ８ＶＫＡＫＶＱＰＹＬＤＤＦＱＫＫＷＱＥＥ。

ＶＫＡにＶＱＰＹＬＤＤＦＱＫＫＷＱＥＥ。

ＫＡＫＶＱＰＹＬＤＤＦＱにＫＷＱＥＢ。

ＫＡＫＶＱＰＹＬＤＤＦＱＫＫＷＱＥＥＭＢＬＹＲＱＫＶＥＰＬＲＡＥ、及びＫＶＱＰＹＬＤＤＦＱＫＫＷＱＥＥＭ。

からなる群から選択される式によって示されるアミノ酸残基配列を有する。

ＭＡＲＡｌ−１１エピトープを定義する関連Ａｐｏ　Ａｌポリペプチドは、２６〜６０個のアミノ酸残基、好ましくは２７〜３２個ｆ７）アミノ酸残基からなり、式：　ＫＶＱＰＹＬＤＤＦＱＫＫＷＱＥＥによって示されるアミノ酸残基配列を含む。ポリペプチドは、ＱＥＭＳＫＤＬＥＥＶＫＡＫｖＱＰＹＬＤＤＦＱＫＫＷＱＥＥ。

ＥＭＳＫＤＬＥＥＶＫＡＫＶＱＰＹＬＤＤＦＱＫＫＷＱＥＥ、及びＫＡＫＶＱＰＹＬＤＤＦＱＫＫＷＱＥＥＭＥＬＹＲＱＫＶＥＰＬＲＡＥ。

からなる群から選択される式によって示されるアミノ酸残基配列を有することが好ましい。

ＭＡＲＡＩ−１１エピトープを定義するもう１つの関連Ａｐｏ　Ａｌポリペプチドは、約２５個以下のアミノ酸残基、好ましくは２２個以下のアミノ酸残基からなり、式：　ＫＶＱＰＹＬＤＤＦＱＫＫＷＱＥＥによって示されるアミノ酸残基配列を含む。好ましい実施態様において、ポリペプチドはＫＶＱＰＹＬＤＤＦＱＫＫＷＱＥＥ。

もう１つの実施態様において、本発明のＡｐｏ　Ａｌポリペプチドは、約６０個以Ｆのアミノ酸残基からなり、式：　ＰＹＬＤＤＸＱＫＫＷＱＥＥＭＥＬここでＸはＢ又はＦである、によって示されるアミノ酸残基配列を含む。このポリペプチドは、モノクローナル抗体ＭＡＢ　Ａｌ−４と免疫反応するポリペプチドの能力によって定義されるＡｐｏ　Ａｌの保存未変性エピトープを定義する（即ちポリペプチドはＭＡＢ　Ａ１４エピトープを定義する）　、　Ａｐｏ　Ａｌポリペプチドは、式：　ＰＹＬＤＤＸＱＫＫＷＱＥＥＭＥＬＹＲＱＫＶＥＰ　１．ｍ、：、テＸはＢ又はＦである、によって示されるアミノ酸残基配列を含むことが好ましい。。好ましい実施態様において、ポリペプチドはＫＡＫＶＱＰＹＬＤＤＸＱＫＫＷＱＥＥｌｉｌＥＬ。

ＫＡＫＶＱＰＹＬＤＤＸＱＫＫＷＱＥＥＭＢＬＹＲＱＫＶＢＰＬＲＡＥ。

ＱＰＹＬＤＤＸＱＫＫＷＱＥＥＭＥＬ。

ＱＰＹＬＤＤＸＱＫＫＷＱＥＥＭＥＬＹＲＱＫｖＥＰ。

ＰＹＬＤＤＸＱＫＫＷＱＥＥｌｉｌＥＬ、及びＰＹＬＤＤＸＱＫＫＷＱＥＥＭＥＬＹＲＱＫＶＥＰ。

もう１つの実施態様において、本発明のＡｐｏ　Ａｌポリペプチドは、約４０個以下のアミノ酸残基からなり、式・ＡＫＶＱＰＹＬＤＤＦＱによって示されるアミノ酸残基配列を含む。このポリペプチドは、モノクローナル抗体ＭＡＲＡｌ− １８と免疫反応するポリペプチドの能力によって定義されるＡｐｏ　Ａｒの保存未変性エピトープを定義する（即ちポリペプチドはＭＡＲＡｌ−１８エピトープを定義する）。好ましい実施態様において、ポリペプチドはＬＥＥＶＫＡＫＶＱＰＹＬＤＤＦＱ。

ＬＥＥＶＫＡＫＶＱＰＹＬＤＩＩＦＱＫＫＷＱＥＥ。

５ＫＤＬＥＥＶＫＡＫＶＱＰＹＬＤＤＦＱ、及びＡＫＶＱＰＹＬＤＤＦＱ。

本発明のＡｐｏ　Ａｔポリペプチドは、ホモセリンラクトンを含まないことが好ましいう好ましいＡｐｏ　Ａｌポリペプチド、それらの呼称及びそれらのＡｐｏ　Ａｌアミノ酸残基位置は表１に示される。

表１ポリペプチド呼称　アミノ酸残基配列Ａｒ８４−１１１　ＱＥＭＳＫＤＬＥＥｉＶＫＡＫＶＱＰＹＬＤＤＦＱＫＫＷＱＥＥＡＩ８５−１１１　８Ｍ５ＫＤＬＢＥＶＫＡＫＶＱＰＹＬＤＤＦＱＫＫＷＱＢＢＡ　１８７−１１１　５ＫＤＬＢＥｖＫＡＫＶＱＰＹＬＤＤＦＱＫＫＷＱＥＢＡ　１９０−Ｉｌｌ　ＬＢＥｖＫＡＫＶＱＰＹＬＤＤＦＱＫＫＷＱＥＥＡＩ９３−１＋１　ＶＫＡＫＶＱＰＹＬＤＤＦＱＫＫＷＱＥＢＡＩ９４−Ｉｌｌ　ＫＡＫＶＱＰＹＬＤＤＦＱＫＫＷＱＥＢＡＩ９４−１１４１　ＫＡＫＶＱＰＹＬＤＤＸＱＫＫＷＱＥＥＭＥＬＡＩ９４−１２５’　ＫＡＫＶＱＰＹＬＤＤＸＱＫＫＷＱＥＥＭＥＬＹＲＱＫＶＢＰＬＲＡＢＡＩ９６−１１１　ＫＶＱＰＹＬＤＤＦＱＫＫＷＱＥＢＡＩ９８−１１４’　ＱＰＹＬＤＤＸＱＫＫＷＱＢＥＭＥＬＡ　１９８−１２１　’　ＱＰＹＬＤＤＸＱＫＫＷＱＥＥＭＥＬＹＲＱＫＶＥＰＡＩ９９−１１４’　ＰＹＬＤＤＸＱＫＫＷＱＥＥＭＥＬＡ　１９９−１２１　’　ＰＹＬＤＤＸＱＫＫＷＱＥＥＭＥＬＹＲＱＫＶＢＰＡＩ９０−１０５　ＬＥＥＶＫＡＫＶＱＰＹＬＤＤＦＱＡＩ８７−１０５　５ＫＤＬＥＥＶＫＡＫＶＱＰＹＬＤＤＦＱＡＩ９５−１０５　ＡＫＶＱＰＹＬＤＤＦＱ１アミノ酸残基位置１０４の丁は、グルタミン酸のＥ又はフェニルアラニンのＦが残基位置１０４に存在することを示す。

本発明のＡｐｏ　Ａｌポリペプチドは、更に実質的に全てＨＤＬのＡｐｏ　Ａｌによって発現されるエピトープ（抗原決定基）に免疫学的に似ている能力によって確認されることが好ましい。

種々の文法形として本発明で用いられる“免疫学的に似ている”とは、本明細書で定義されるＡｐｏ　Ａｌの保存未変性エピトープを確認する本発明の抗体と免疫反応する本発明のＡｐｏ　Ａｌポリペプチドの能力を意味する。

本ポリペプチドは、必要な配列を含み、本発明の抗体と免疫反応することができる限り、Ａｐｏ　Ａｌのアミノ酸残基配列と同一である必要がないことは理解すべきである。

本ポリペプチドは、ポリペプチドがＡｐｏ　Ａｌ未変性保存エピトープに免疫学的に似ていることができる限り、アミノ酸残基配列が本明細書で示されるポリペプチドのあらゆる類縁体、断片又は化学誘導体を含む。従って本ペプチドは、種々の変更、置換、挿入及び欠除を受けることができ、そのような変化はその用途において特定の利点を与える。

“類縁体”とは、１種以上の残基が機能的に類似した残基で保存的に置換されており、本明細書に記載されるＡｐｏ　Ａｌに似ている能力を示す本明細書で詳細に示される配列と実質的に同一のアミノ酸残基を有するあらゆるポリペプチドを含む。

保存的置換の具体例としては、イソロイシン、バリン、ロイシン又はメチオニンのような１個の非極性（疎水性）残基を別のものに置換すること、アルギニンとりシン、グルタミンとアスパラギン、グリシンとセリンとの１個の極性（親水性）残基を別のものに置換すること、リシン、アルギニン又はヒスチジンのような１個の塩基性残基を別のものに置換すること又はアスパラキン酸又はグルタミン酸のような１個の酸性残基を別のものに置換することを含む。

“保存的置換”とは、そのポリペプチドが必要な結合活性を示すならば、非誘導残基の代わりに化学的誘導残基を使用することも含む。

“化学誘導体”は、側鎖官能基の反応によって化学的に誘導化される１個以上の残基を有する本ポリペプチドを意味する。そのような誘導化分子としては、例えばアミンヒドロクロリド、ｐ−トルエンスルホニル基、カルボベンゾキシ基、ｔ −プチルオキシ力ルポニル基、クロロアセチル基又はホルミル基を生成させるために遊離アミノ基を誘導化した分子がある。遊離カルボキシル基は、塩、メチル及びエチルエステル又はエステルの他の種類又はヒドラジンを生成させるために誘導化される。遊離ヒドロキシル基は、０−アシル又は叶アルキル誘導体を生成させるために誘導化される。ヒスチジンのイミダゾール窒素は、Ｎ−ｉｍ−ペンジルヒスチジンを生成させるために誘導化される。また化学誘導体としては、２０種の標準アミノ酸の１個以上の天然アミノ酸誘導体を含むペプチドが含まれる。例えば４−ヒドロキシプロリンはプロリンに置換され、５化トロキシリジンはりシンに置換され、３−メチルヒスチジンはヒスチジンに置換され、ホモセリンはセリンに置換され、オルニチンはりシンに置換される。本発明のポリペプチドは、また必要な活性が維持される限り、１個以上の付加及び／又は欠除を有するあらゆるポリペプチド又は本明細書中で配列が示されるポリペプチドの配列に相対する残基をも含む。

ポリペプチドは、ホモセリンラクトン又は他のアミノ酸の存在を示すことができる通常のアミノ酸分析にかけた際、ポリペプチドに存在するホモセリンラクトンが検出されない場合ホモセリンラクトンを含まない。ホモセリンラクトンを検出するのに適切なアミノ酸分析法は一般的に当業界でよく知られている。

“断片”とは、本明細書でアミノ酸残基配列が示されるポリペプチドより短いアミノ酸残基配列を有するあらゆる本ポリペプチドを意味する。本発明のポリペプチドは、１個以上の保存的又は非保存的置換が行われるためにＡｐｏ　ＡＴの配列と同一でない配列を有する場合、通常約３０％以下、更に通常は２０％以下、好ましくは１０％以下のアミノ酸残基が置換され、但し“リンカ−”を与えるためにどちらかの末端に追加の残基が付加された位置９９のプロリン残基は、置換又は削除することができず、それによって本発明のポリペプチドは、標識又は固体マトリックス又はキャリヤに便利に付加することができ、リンカ−残基はＡｐｏ　Ｌｌエピトープを作成せず、即ちＡｐｏ　Ａｌに構造が似ていない。本発明のポリペプチドで用いることができる標識、固体マトリックス及びキャリヤは後記される。

アミノ酸残基リンカ−は通常少なくとも１個の残基であり、４０個以上の残基、しばしば１〜ＩＯ個の残基であることができるが、Ａｐｏ　ＡＴｌエピトープ作成しない。

リンキングに用いられる代表的なアミノ酸残基はチロシン、システィン、リシン。

グルタミン酸及びアスパラギン酸等である。更に、本ポリペプチドは、特にことわらない限り、Ａｐｏ　Ａｌの天然配列と異なり、その配列は末端−冊、アシル化、例えばアセチル化又は例えばアンモニア、メチルアミン等による末端−カルボキシルアミノ化によるチオグリコール酸アミノ化によって修飾される。

キャリヤーハプテン複合体として当業界で知られているものを生成するためにキャリヤに結合する場合、本発明のＡｐｏ　Ａｌポリペプチドは、Ａｐｏ　Ａｌ、好ましくはＨＤＬ粒子の一部であるＡｐｏ　Ａｌ（Ａｐｏ　Ａｌ／ＨＤＬ）と免疫反応する抗体を誘発することができる。従って免疫交差−反応性の十分に確立された原理により、本発明は表Ｉに示されるポリペプチドの抗原的に関係のある変異体が予想される。“抗原的に関係のある変顕体゛とは、表１のポリペプチド及びＡｐｏ＾Ｉと免疫反応する抗体分子を誘発することができる本ポリペプチドである。

本発明のいかなるペプチドも薬学的に許容しうる塩として用いられる。本発明のベブ千］・と塩を生成することができる適切な酸としては、塩酸、臭化水素酸、過塩参酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸、リン酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ビルじン酸、シュ１゛ア酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、アントラニル酸、ケイ皮酸、＋フ々！ノンスルホン酸、スルファニル酸等の無機酸が挙げられる６、本発明のベブチＩ・と塩を生成することがＴ゛きる適切な塩基としては、水酸化すトす・”ツム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウム等の無機塩基及びモノ− 、ジー及びトリーアルキル及びアリールアミン（例えばトリエチルアミン、ジイソプロピルアミン、メチルアミン、ジメチルアミン等）及び任意に置換されたエタノールアミン（例えばエタノールアミン、ジェタノールアミン等）の有機塩基が挙げられる３、本明細書で本ポリベブ千ｌ・とも呼ばれる本発明のＡｐｏ　Ａｌポリペプチドは、組換えＤＮＡ技術を含む当業考に知られているいずれの手法によっても合成することができる。１固相メリフイール！・型合成のような合成化学手法は、純度、抗原特異性、望ましくない副生成物を含まない、製造の容易さ等の理由で好ましい。使用できる多くの技術の優れｔ−概要は、固相ペプチド合成の場合、Ｊ、Ｍ、Ｓｔｅｗａｒｄ　、　Ｊ、Ｄ。

Ｙｏｕｎｇ、　５ｏｌｉｄ　Ｐｈａｓｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　５ｙｎｊｔ＋ｅｓｉｓ−１Ｗ、Ｈ，Ｆｒｅｅｍａｎ　Ｃｏ、、　Ｓａｎ　Ｆｒａ獅■奄唐モ潤B １９６９；！＋４．Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ等、”Ｐｅｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ”、　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ　、５ｅｃ盾獅■ Ｅｄｉｔｉｏｎ　、１９７６及び、Ｊ　、　Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ、　Ｈｏｒｍｏｎａｌ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ａｎｄ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ”AＶｏｌ。

２、ｐ４６、Ａｃａｄｃｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ（Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）、１９８３及び古典的な溶液合成の場合、Ｅ。

５ｃｈｒｏｄｅｒ＋に、Ｋｕｂｋｅ　、ゴｈｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ−、Ｖｏｌ、　ｌ　、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ（Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋj、１９６５にμられ、各々をここに引用する。そのような合成に使用できる適切な保護基は、Ｉ゛ＥＥ文献、１．Ｆ、Ｗ、Ｍｃｏｍｉｅ、”Ｐｒｏｊｅｃｔｉｖｅ　Ｇｒｏｕｐｓ　ｉｎ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ−P Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、１９７３にｎ＋Ｊされ、これをここに引用する。

一般にＦ想される固相合成法は、１個以上のアミノ酸残基又は適切に保護されたアミノ酸残基を増大するペプチド鎖に連続付加を−ることからなる。通常、最初のアミノ酸残基のアミノ又はカルボキシル基は、適切な選択的に除去される保護基によって保護される。リジンのような反応性ｆｉ１１鎖基を含むアミノ酸の場合には別の選択的に除去される保護基が使用される。

内相合成を用いる具体例として、保護又は誘導アミノ酸は、保護されないカルボキシル又はアミノ基を介して不活性固体支持体に結合される。次いでアミノ又はカルボキシル基の保護基は選択的に除去され、適切に保護された相補（アミノ又はカルボキシル）基を有する配列の次のアミノ酸を混合し、固体支持体に既に結合した残基とアミド結合を生成させるのに適切な条件下で反応させる。次いでアミノ又はカルボキシル基の保護基をこの新しく付加したアミノ酸残基から除去した後、次のアミノ酸（適切に保護された）等を付加する。全ての所望されるアミノ酸を適当な配列で結合させた後、残りのあらゆる末端及び側鎖保護基（及び固体支持体）を連続的に又は同時に除去して最終ポリペプチドを生成させる。

Ａｐｏ　Ａｌポリペプチドは、特に生体試料に存在するＡｐｏ　Ａｌを検出するために本発明の診断方法及びシステムで使用することができ、あるいはＡｐｏ　ＡＴのエピトープと免疫反応する抗体調製の本明細書で記載される接種物を調製するために使用することができる。

更に、本発明のＡｐｏ　Ａｌポリペプチドは、患者においてコレステロールのエステル化を増加させるために本発明の治療方法で使用することができる。

Ｃ７抗体及びモノクローナル抗体種々の文法形の“抗体”は、集合語として本明細書で用いられ、免疫グロブリン分子及び／又は免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、即ち抗体結合部位又はパラトープを含む分子を意味する。

“抗体結合部位”は、抗体分子の構造部分が抗原を特異的に結合する重及び軽鎖可変及び超呵変領域を含むことである。

本明細書で用いられる種々の文法形の“抗体分子”とは、そのままの免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分の両方を意味する。

本発明の診断方法及びシステムに用いられる具体的な抗体分子は、そのままの免疫グロブリン分子、実質的にそのままの免疫グロブリン分子及びパラトープを含む免疫グロブリン分子の部分であり、Ｆａｂ　、Ｆａｂ’、　Ｆ（ａｂ’）ｙ及びＦ（Ｖ）として当業界で既知の部分を＾む４、抗体のＦａｂ及びＦ（ａｂｌ）を部分（１、よく知られている方法による実質的にそのままの抗体の各ケバパイン及びペプシンのタンパク質分解反応によって調製される。

例えばＴｈｒｏｆ　ｉ　Ｉｏｐｏｌｏｕｓ及びＤｉｘｏｎの米国特許第４．３４２．５６６号参照。Ｆａｂ’抗体部分もまたよく知られており、Ｆ（ａｂＪｔ部分からつくられ、次いでジスルフィド結合を還元してメルカプトエタノールを用いた場合重鎮２部分を結合し、次いで得られたタンパク質メルカプタンをヨードアセタミドのような試薬でアルキル化する。

そのままの抗体分子を含む抗体か好ましく、本明細書で例示として用いられる。

ｌ実施態様におい−Ｃ１本発明の抗体、即ち抗−Ａｐｏ　Ａｌ抗体は、ｌ　）ＨＤＬ粒子に存在するＡｐｏ　Ａｔ（Ａｐｏ　Ａｌ／）ＩＤＬ）　、２）、’４Ｌ離Ａｐｏ　Ａｌ　３）Ａｐｏ　Ａｌ（ＣＮＢｒ２−ＣＮＢｒ３）及び４）| リペプチドＰＹＬＤＤＦＱＫＫＷＱＥＥＭＨＬと免疫反応することができ、１）Ａｐｏ　ＡＩ　ＣＮＢｒ１及び２）ポリペプチド５ＫＤＬＥＥＶＫＡＫＶＱＰＹＬＤＤＦＱＫＫＷＱＥＥ。

ＬＥＥＶＫＡＫＶＱＰＹＬＤＤＦＱＫＫＷＱＩＥＥ、及びＹＲＱＫＶＥＰＬＲＡＥＬ。

と免疫反応する抗体分子−を実質的に含まない場合に確認される。

もう１つの実施態様におい℃、抗−Ａｐｏ　Ａｌ抗体は、１）Ａｐｏ　Ａｌ／）ＩＤＬ、２）単離Ａｐ。

Ａ１．３）Ａｐｏ　ＡＩ　ＣＮＢｒ２及びｉ）ボリベブ千１−ＫＶＱＰＹＩ、ＤＤＦＱＫＫＷＱＥＢと免疫反応することがてき、ＩＭｐｏ　ＡＩ　ＣＮＢｒ１．２）Ａｐｏ　ＡＩ　ＣＮＢｒ：３及び３）ポリペプチド５ＫＤＬＥＩＥＶＫＡＫＶＱＰＹＬＤＤＥＱＫＫＷＱＥＥ。

５ＫＤＬＥＥＶＫＡＫＶＱＰＹＬＤＤＦＱ、及びＰＹＬＤＤＦＱＫＫＷＱＩＥピＭＥＬ’ｉ’ＲＱＫＶＥＰ。

と免疫反ｌ、コ、４−る抗体分子を実質的に含まない場合に確認される。

、〜ｐｏＡＩ２イｆ抗％ｉに、４：ろ抗体Ｆｊ、Ｅｅ：ｔｉ（は、当業界で既知の種々の免疫的アッセイによ−）てｔ１１定４−る、−ヒができる５、抗−Ａｐｏ　Ａｌ抗体とＣＮＢｒ断１１との具体的な免疫反応は′Ｌ′、施例８に記載される１、ＡＩ）［Ｉ　Ａｌ／’Ｈ１）１．、星離＾ｐｏ　Ａｌ（実施例４（こ記載される通り調ｉ〕）及び、’１１３ＯＡｔポリベブ千１・との直接結合は、実施例９に記載さ４−する方法によって少なくとちア・ノ４ごイすることが下、・きる。

本発明の抗体は、代表的にはＡ＠乳ａノ物を本発明のＡｐｏ　Ａｔボリペグチトを含む接種物で免疫化してＡｐｏ　Ａｌポリペプチドに対して免疫特異性を有する抗体分子を哺乳動物に誘発させることにより産生される。次いで抗体分子を哺乳動物から集め、例えばＤＥＡＥ　５ｅｐｈａｄｅｘを用いるよく知られている手法によって所望される程度まで単離してＩｇＧ画分を得る。

抗体の特異性を高めるために、抗体は固相−付着免疫化ポリペプチドを用いるイムノアフィニティークロマトグラフィーによって精製することができる。ポリペプチドが抗体分子と免疫反応するのに十分な時間抗体を固相−付着免疫化ポリペプチドと接触させて同相−（＝１着免疫複合体を生成させる。結合した抗体は標準手法によって複合体から分離される。

このように生成した抗体は、特に生体試料に存在するＡｐｏ　Ａｔを検出するために本発明の診断方法及びシステムで使用することができる。例えば実施例９に記載される方法参照。

種々の文法形の“接種物”は、Ａｐｏ　Ａｌポリペプチドに対する抗体の調製に用いられる有効成分として本発明のＡｐｏ　Ａｌポリペプチドを含む組成物を記載するために本明細書で用いられる。ポリペプチドを抗体を誘発させるために接種物中で用いる場合、ポリペプチドは種々の実施態様で例えば単独で又はキャリヤに結合した複合体として又はポリペプチドポリマーとして使用することができる。しかしながら、表現の容易さ及びポリペプチド接種物の関係において、本発明のポリペプチドの種々の実施態様は、本明細書で集合的に“ポリペプチド及びその種々の文法形として呼ばれる。

約３５個より少ないアミノ酸残基を含むポリペプチドの場合、抗体の産生を誘発さ−けるためにギヤリヤに結合したペプチドを使用することが好ましい。

更に１個以上のアミノ酸残基は、ボリペブ干１・をキャリヤに結合するのを助けるためにポリペプチドのアミ八及びカルボキシー木端に（−＝１加することができる。

ポリペプチドのアミノ−及びカルボキシー末端に付加したシスティン残基は、ジスルフィド結合ににり複合体を生成させるのに特に有効である、ことが見られたうしかしながら、当業界でよく知らオｌている！ｙ合体の他の製造方法も用いることがで去る１、更に具体的なリンヤンク方法としては、用ｃｈａｅｌ　（ｉ加反応生成物、クルクルアルデヒドのようなノアルデヒド、Ｋｌ　１ｐｓｔｅｉｎ等、Ｊ、Ｉｎｆｅｃｔ、Ｄｉｓ、　、！４７：３１８−３２６（＋９８３　）等の使用又はキャリヤに対するアミド結合を生成させるために水溶性カルボジイミドを使用するようなカルボジイミドテクノロジーの使用がある。タンパク質複合又は活性化官能基によるカップリングの再検討の場合、ＡｕｒｕＩｅａｓ等、５ｃａｎｄ、　Ｊ、　Ｉｍｎｕｎ吐、ｌニア−２３（１９７８）参照。

有効なキャリヤは、当業界でよく知られており、一般的にそれ自体タンパク質である。そのようなキャリヤの具体例は、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）　、エデスチン、チログロブリン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）又はヒト血清アルブミン（Ｈ３Ａ’）のようなアルブミン、ヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）のような赤血球細胞、破傷風トキソイド、コレラトキソイド及びポリ（Ｄ−リシン：Ｄ−グルタミン酸）のようなポリアミノ酸等である。

キャリヤの選択は、接種物の最後の用途に依存することが多（、本発明に特に関係しない基準に基づく。例えば接種される個々の動物に都合の悪い反応を生じないキャリヤを選択しなければならない。

本発明の接種物は、代表的にはキャリヤに結合した複合体として本発明のポリペプチドの免疫原有効量を含有する。免疫化ポリペプチドに対する免疫応答を十分誘発させる単位量当たりのポリペプチドの有効量は、特に接種される動物の種類、動物の体重及び当業界でよく知られている接種法の選択による。接種物は、代表的には接種（投与量）当たり約５０ミクログラムから５００ミリグラムのポリペプチド濃度、好ましくは投与量当たり約５０ミクログラムから約５０ミリグラムを含有する。

接種物に関係する“単位投与量”とは、動物に対する単位投薬として適切な物理的に分離している単位を意味し、各単位は、必要な希釈剤、即ちキャリヤ又は賦形剤と関係がある所望の免疫原作用を生じるように計算された所定量の活性物質を含有する。本発明の接種物の新規な単位投与量は、明細書によって指示され、本明細書で詳細に開示されるａ）活性物質のユニークな特性及び達成される個々の免疫作用及びｂ）そのような活性物質を動物における免疫用に配合する技術上固有の制約に直接依存し、これらは本発明の特徴である。接種物は典型的には乾燥固形ポリペプチド−複合体から、ポリペプチド−複合体を水、食塩水又はリン酸塩緩衝食塩水のような生理的に許容しつる（受容しうる）希釈剤に分散させて水性組成物を生成させることにより調製される。

接種物はまた、希釈剤の一部としてアジュバントを含むことができる。完全７０インドアジユバント（ＣＦＡ）　、不完全フロインドアジュバント（ＩＦＡ）及びミョウバンのようなアジュバントは、当業界でよく知られている物質であり、数個所から市販されている。

当業界で現在知られている活性化官能基によるポリペプチド複合又はカップリング手法は特に使用できる。例えば＾ｕｒａｍｅａｓ等、５ｃａｎｄ、　Ｊ、　Ｉｎｎｕｎｏｌ、、Ｖｏｌ、８．５ｕｐｐ１．７：７−２３（１９７８）及び米国特許第４．４９３．７９５号、同第３．７９１．９３２号及び同第３、８３９．１５３号参照。更に部位方向カップリング反応は、カップリング後ポリペプチド配向のためあらゆる活性のロスを最小にするように行うことができる。例えばＲｏｄｗｅｌｌ等、Ｂｉｏｔｅｃｈ、、３：８８９−８９４（１９８５）及び米国特許第４．６７１９５８号参照。

更に１個以上のアミノ酸残基は、ポリペプチドを結合して複合体を生成させるのを助けるためにポリペプチドのアミノ−又はカルボキシ−末端に付加することができる。通常ポリペプチドのカルボキシ−末端に付加されるシスティン残基は、ジスルフィド結合により複合体を生成させるのに特に有効であることが見られたが、当業界でよく知られている他の方法も用いられる。

好ましい抗−Ａｐｏ　Ａｌ抗体はモノクローナル抗体であり、本明細書で抗−Ａｐｏ　Ａｌ抗体の具体例として用いられる。

ることができる抗体結合部位の１種だけを含む抗体分子の集団を意味する。従ってモノクローナル抗体は、代表的には免疫反応するいかなるエピトープに対しても単一の結合親和性を示す。モノクローナル抗体は、従って各々が異種エピトープに免疫特異性である多数の抗体結合部位を有する抗体分子、例えば二特異性モノクローナル抗体を含んでいる。

ｌ実施態様において、モノクローナル抗体は、１）Ａｐｏ　Ａｌ／ＨＤＬ、２）単離Ａｐｏ　Ａｌ、３）Ａｐｏ　ＡＩ　ＣＮＢｒ２−ＣＮＢｒ３及び４）ポリペプチドＰＹＬＤＤＦＱＫＫＷＱＥＥＭＥＬと免疫反応することができ、１）Ａｐｏ　ＡＩ　ＣＮＢｒ１及び２）ポリペプチド：５ＫＤＬＥＢＶＫＡＫＶＱＰＹＬＤＤＦＱＫＫＷＱＥＥ。

ＬＥＢＶＫＡＫＶＱＰＹＬＤＤＦＱＫＫＷＱＥ８．及びＹＲＱＫＶＥＰＬＲＡＥＬ。

と免疫反応する抗体分子を実質的に含まない場合に確認される。ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ８７４４を有するハイブリドーマＡｌ−４によって産生されるモノクローナル抗体が特に好ましい。

もう１つの実施態様において、モノクローナル抗体は、１）Ａｐｏ　Ａｔ／ＨＤＬ、２）単離Ａｐｏ　Ａｔ、　３）Ａｐｏ　ＡＩ　ＣＮＢｒ２及び４）ポリペプチドＫＶＱＰＹＬＤＤＦＱＫＫＷＱＢＢと免疫反応することができ、Ｉ）Ａｐｏ　ＡＩ　ＣＮＢｒ１．２）Ａｐｏ　ＡＩ　ＣＮＢｒ３及び３）ポリペプチド：５ＫＤＬＥＥＶＫＡＫＶＱＰＹＬＤＤＥＱＫＫＷＱＥＢ。

５ＫＤＬＥＥＶＫＡＫＶＱＰＹＬＤＤＦＱ、　及ヒＰＹＬＤＤＦＱＫＫＷＱＥＥＭＥＬＹＲＱＫＶＥＰ。

と免疫反応する抗体分子を実質的に含まない場合に確認される。この実施態様においてＡＴＣＣ受託番号ＨＢ９２０１を有するハイブリドーマＡｌ−１１によって産生されるモノクローナル抗体が特に好ましい。

モノクローナル抗体は、代表的には１種類の抗体分子だけを分泌する（産生ずる）ハイブリドーマと呼ばれる単一細胞のクローンによって産生される抗体からなる。ハイブリトーマ細胞は、抗体産生細胞とミエローマ又は他の自己−永存細胞系を融合させてつ（られる。このような抗体の調製は、最初にＫｏｈｌｅｒ、　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、　Ｎａｔｕｒｅ　２５６：４９５−４９７（＋９７５）によって記載され、この説明を引用する。このように調製されたハイブリドーマは、Ａｐｏ　ＡＴポリペプチドと免疫反応する抗体分子の存在に対して又は本発明のＡｐｏ　ＡｌポリペプチドによるＨＤＬへの結合阻害に対してスクリーンすることができる。

簡単には、モノクローナル抗体組成物を産生ずるハイブリドーマをつくるために、ミエローマ又は他の自己−永存細胞系をＡｐｏ　Ａｌ含有リポタンパク質粒子に存在するようなＡｐｏ　Ａｌ又は本発明のＡｐｏ　Ａｔポリペプチドで高度免疫化した哺乳動物の牌臓から得たリンパ球と融合させる。ポリペプチド−誘発ハイブリドーマテクノロジーはＮｉｍａｎ等、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ｓｃｉ、、Ｕ、　Ｓ、　Ａ、、８０：４９４９−４９５３（１９８３）によって記載されており、この説明をここに引用する。

ハイブリトーマを調製するために用いられるミエローマ細胞系は、リンパ球と同じ種であることが好ましい。代表的には、１２９　ＧＩＸ＋株のマウスが好ましい哺乳動物である。本発明で用いられる適切なマウスミエローマとしては、ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン−感受性（ＨＡＴ）細胞系Ｐ３Ｘ６３− Ａｇ８．６５３及びＳｐ２１０−Ａｇ１４があり、これらは各々受託番号ＣＲＬＩ５８０及びＣＲＬ１５８１によってアメリカ牌細胞は、代表的にはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）１５００を用いてミエローマ細胞と融合される。融合ハイブリッドは、ＨＡＴに対する感受性によって選択される。本発明のモノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマは、各々実施例ＩＯ及び９に記載されるラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）及び酵素結合免疫吸着剤アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いて同定される。

本発明のモノクローナル抗体は、適切なポリペプチド特異性の抗体分子を分泌するハイブリドーマを含有する栄養培地からなるモノクローナルハイブリドーマ培養を開始することによっても生産することができる。培養は、ハイブリドーマが抗体分子を培地に十分分泌する条件及び時間で維持される。次いで抗体含有培地が集められる。次いで抗体分子は、よく知られている手法によって更に単離することができる。

これらの組成物の調製に有効な培地は、共に当業界でよく知られ、市販されており、合成培養基、近文系マウス等がある。具体的な合成培地は、４．５ｇｍ／Ｉグルコース、２０ｍ＋グルタミン及び２０％ウシ胎児血清で補足したダルベツコの最小必須培地（ＤＭＥＭ：Ｄｕｌｂｅｃｃｏ等、Ｖｉｒｏｌ、　８：３９６（１９５９））である。具体的な近文系マウス株はＢａ１ｂ／Ｃである。

本発明のモノクローナル抗体は、本明細書で開示した本発明の抗体と同じ方法で使用することができる。

例えば、モノクローナル抗体は本明細書で開示されるＡｐｏ　Ａｌ含有免疫反応生成物の生成が所望される診断方法及びシステムで使用することができる。

本モノクローナル抗体、即ちＭＡＲＡｌ−４及びＭＡＢ　Ａｔ−ＩＩを産生ずるのに有効なハイブリドーマは、各々１９８５年３月５日及び１９８６年９月１６田こブダペスト条約要件に従ってアメリカンタイプ力ルチュアコレクション、ロックビル、ＭＤ　２０８５２Ｕ、　Ｓ、　Ａ、に寄託されており、各々ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ８７４４及びＨＢ９２０１が与えられている。

ハイブリトーマＡＴＣＣ１５８０は、当業界でよ（知られている通り、本モノクローナル抗体を産生ずる他の不滅細胞系を産生ずることができ、従って本モノクローナル抗体の産生は、ＡＴＣＣ）ｌＢ８７４４及ｎＢ９２０１それ自体によるハイブリドーマの培養に依存しない。

モノクローナル抗体、ハイブリドーマ細胞又はハイブリドーマ細胞培養の他の産生方法もよく知られている。例えば、５ａｓｔｒｙ等、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｅａｄ、　Ｓｃｉ、　８６：５７２Ｂ−５７３２（＋９８９）及び１（ｕｓｅ等、５ｃｉｅｎｃｅ、２４６：１２７５−１２８１（１９８１）によって記載されている免疫レパートリ−からのモノクローナル抗体の単離方法参照。

またハイブリドーマ細胞及び本発明のモノクローナル抗体を産生する／Ｘイブリト−マ細胞を含む培養が本発明によって提供される。

Ｄ９診断システム本発明は、液体試料中のＡｐｏ　Ａ［又はＡｐｏ　Ａｔポリペプチドの存在をアッセイするための、好ま（バはキット形態の診断システムを記載する。診断システムは、少なくとも１アツセイに１−分な量で、本Ａｐｏ　Ａｌポリペプチド及び／又は本抗体又はモノクローナル抗体を別々にパッケージした免疫化学試薬として含む。典型的にはパンケーン試薬の使用指示書も含められる。

本明細書で用いられる“パンケージ”とは、本発明のポリペプチド、ポリクローナル抗体又はモノクロ・−光ル抗体を所定の制限内で保持することができるガラス、プラスチック、紙、ホイル等の固体マトリラス又は材料を意味する。従って具体的には、パッケージは予想されるポリペプチドのミクログラム量を含有させるために用いられるカラスバイアルであったり、予想されるポリペプチドのミクロ１グラム歇が操イ１的に＋−１加された、即ち抗体によって免疫学的に結合することができるように結合されたミクロタイターブレートウェルであることができる。

“使用指示書”は、典型的には試薬濃度又は混合される試薬と試料の相対量、試薬、・′試料混合物の維持時間、温度、バッファー条件等の少なくとも１ア・ソセイ法を記載する確実な表現を含む。

ｌ実施態様において、熊液、血漿又は直情のような試料中のＡｐｏＡｌの存在又は定量を７”ツセイする診断システムは、少なくとも１種の本発明のＡｐｏ　Ａｌポリペプチドを＾むパッケージからなる。もう１つの実施態様では、試料中のＡｐｏ　Ａ［又はＡｐｏＡＩポリペブチ１−の存在又は量をアッセイする本発明の診断システムは、更に本発明の抗−Ａｐｏ　Ａｒ抗体岨成物を含む。具体的な診断システムは、実施例９に記載される３、。

好ましい実施態様において、本発明の診断システムは、更に本発明のポリペプチド又は抗体分子を含む免疫複合体の産生をシグナル化することができる標識又は指示手段を含む。

本明細書で用いられる“複合体”とは、抗原−抗体反応又はレセプター−リガント反応のような特異的結合反応の生成物を意味する。具体的な複合体は、免疫反応生成物である。

本明細書で用いられる種々の文法形の“標識”及び“指示手段”とは、複合体の存在を指示するために検出可能なシグナルの生成に直接又は間接に関係するシグナル原子及び分子を意味する。いかなる標識又は指示手段も本発明の抗体又はモノクローナル抗体組成物の一部である発現タンパク質、ポリペプチド又は抗体分子に結合又は組み込まれるかあるいは別々に用いられ、それらの原子又は分子は、単独で又は他の試薬と共に用いられる。そのような標識は、それ自体臨床診断化学においてよく知られており、ほかの新規なタンパク質方法及び／又はシステムで使用される限りにおいてのみ本発明の一部を構成する。

標識手段は、有効な免疫蛍光トレーサーである蛍光色素（色素）を生成するために抗体又は抗原にそれらを変性することなく化学的に結合する蛍光標識物質であることができる。適切な蛍光標識物質は、フルオレセインイソシアネート（ＦＩＣ）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、５−ジメチルアミン− １−ナフタレンスルホニルクロリド（ＤＡＮＳＣ）　、テトラメチルローダミンイソヂオシアネーート（ＴＲＩＴＣ）　、リスサミン、ローダミン８２００スルホニルクロリド（Ｒ［ｌ　２００　ＳＣ）等の蛍光色素である。免疫蛍光分析法の説明は、ＤｅＬｕｃａ、Ｉｍｍｕｎｏｆ　１ｕｏｒｅｓｅｅｎｃｅＡｎａｌｙｓｉｓ”、Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ａｓ　ａ　Ｔｏｏｌ、Ｍａｒｃｈａｌｏｎｉｓ等、ｅｄｓ、、Ｊｈｏｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎ刀@。

Ｌｔｄ、、ｐｐ、　１８９−２３１（１９８２）に見られ、ここに引用する。

好ましい実施態様において、指示基は、西洋ワザビパーオキシダーセ（ＨＲＰ）、グルコースオキシダーゼ等の酵素である。主な指示基がＨＲＰ又はグルコースオキシダーゼのような酵素である場合には、他の試薬はレセプター−リガンド複合体（免疫反応体）か生成した事実を可視化することが必要である。ＨＲＰの場合そのような試薬としては、過酸化水素及びジアミノベンジジンのような酸化色素前駆体が挙げられる。グルコースオキシダーゼに関して有効な試薬は、２．２１−アジノージ−（３〜工千ルーベンズチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）である。

放射性元素もまた有効な標識物質であり、本明細書で具体的に用いられる。具体的な放射能標識物質は、γ線を放出する放射性元素である。それ自体１ｔ４！、１１８１、１！ｌｊ、　ｔｓｔｌ及び５ＩＣｒのようなγ線を放射する元素は、 γ線放出放射性元素指示基の１種を示す。５Ｉが特に好ましい。もう１つの有効な標識手段群は、それ自体ポジトロンを放射するＩＩｃ　、Ｕｐ、０及び１３Ｎのような元素である。そのように放射されボントロンは、動物体内に存在する電子とぶつかる際にγ線を放出する。’ＨのＩｌ＋インジウムのようなβ放射体も有効である。

ポリペプチド及びクンバク質の標識結合、即ち標識化は、当業界でよく知られている。例えば、ハイブリトーマによって産生された抗体分子は、培養基に成分としてすえられた放射性同位元素含有アミノ酸の代謝取り込みによって標識化することができる。例えばＧａ１ｆｒｅ等、Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｉ、　７３：３−４６（１９８１）参照。活性化官能基によるクンバク質複合又はカップリング技術は、特に使用できる。例えばＡｕｒａｍｅａｓ等、５ｃａｎｄ、　Ｊ、　ｂ＋＋ｍｕｎｏ１．、Ｖｏｌ、　８５ｕｌ）ｐｉ、　７：７−２３（１９７ｇ）、Ｒｏｄｗｅｌ兼凵A Ｂｉｏｔｅｃｈ、３．８８９−８９４（１９８４）及び米国特許第４．４９３．７９５号参照。

診断システムは、特異的結合剤を、好ましくは別個のパッケージとして含むこともてきる。”特異的結合剤”は、本発明の試薬物質又はそのような物質を含む複合体を選択的に結合する（ヒができる分子体であるが、それ自体本発明のポリペ −ｒ千］・又はｆＡ二体分子絹成物ではない４．具体的な特異的結合剤は、第２抗体分子、補体々ンバ′７質又はその断片、３．７・”ルウスプロテインＡ等である。特異的結合Ａｌｌは、物質が複合体の一部と（−１て存（ｒする場合、試 −影物質を結合することが好ま（−い、ｆ＋ｉ’ｔｌ−い゛１ｆ施牲様におい−ｊ’Ｊ、特異的結合剤は標識化される。

しかしながら、診１ＩＹＴぺ−１−ムが（ヤ識化されない特冗的結自Ｎ１を含む場合１、−の物質は典型的には増幅［Ｙ′べｉ　ｉ　、ｐ’ｔ　＄と（−７で用いら４Ｉ６、これらの実施態様において、増幅手段かムけ；物′ｉ″ｉ眉１ゆ含体ｉ＝Ｌ！ｉ負−さ１ビ）場ｒマ、特ソ疼的（専識鈷合削は増幅手段夕特異的に結合−４−ることが−Ｃ専る。

本発明の診断キットは、血液、血清又は血漿のような血液試料中のＡｐｏ　Ａｌの量を検出するために“ＥＬＩＳＡ”フォーマットに使用することができる。ＥＬＩＳＡ″は、試料中に存在する抗原の量を検出及び定量するために固相に結合した抗体又は抗原及び酵素−抗原又は酵素−抗体を使用する酵素結合免疫吸着剤アッセイを意味する。ＥＬＩＳＡ法の説明は、１９８２年にＬｏｓ　Ａｌｔｏｓ、ＣＡのＬａｎｇｅ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎによって出版されたり、Ｐ、５ｉｔｅｓ等によるＢａ５ｉｃ　ａｎｄ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｉｏｍｕｎｏｌｏｇｙの４版の第２２章及び米国特許第３．６５４．０９０号、同第３．８５０．７５２号及び同第４．０１６．０４３号に見られ、これらを全てここに引用する。

このように好ましい実施態様において、本発明のＡｐｏ　Ａｌポリペプチド又はモノクローナル抗体は、本診断システム中のパッケージからなる固体支持体を生成するために固体マトリックスに付加することができる。

試薬は、典型的には水性培地から吸着によって固体マトリックスに付加されるが、当業者によく知られているタンパク質及びポリペプチドに応用できる他の付加方式を使用することができる。

有効な固体マトリックスも当業界でよく知られている。そのような材料は、水に不溶であり、Ｐｈａｒｍａｅｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、　ＮＪ）から商標５ＥＰＨＡＤＢＸとして入手できる架橋デキストラン、アガロース；Ｎｏｒｔｈ　Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬのＡｂｂｏｔＬａｂｏｒａ　ｔｏｒ　ｉｅｓから入手できる直径約１ミクロンから約５ミリメートルのポリスチレンビーズのビーズ、ポリビニルクロ１月、ポリスチレン、架橋ポリアクリルアミド、シート、ストリップ又はパドルのようなニトロセルロース−又はナイロンヘースのウェブ；又はポリスチレン又はポリビニルクロ１月・から生成されるようなチューブ、プレート又はウェルが挙げられる。本明細ＩＦＪ−記載されるあらゆる診断システムの試薬物質、特異的標識結合剤又は増幅試薬は、溶液、液状分散液又は実質的な乾燥粉末、例えば凍結乾燥体として与えることができる。指示手段が酵素である場合、酵素の基質はシステムの別個のパッケージとしてＬｊえることもてきるう前記ミク〔］］タイクープ１．−＋のよ・）な固体支持体及び１踵以−１二のバソーアア−も診断アワ＋ｒ（７／ステム中別個にバ・、、）ｒ−ノとしＣ含めることができる。

診断システムに関して本明細書で述べられるバソケ・−・７→・グ材料は、通例診断２・ステムで使用されるものである。

“パッケーグとは、本発明のポリペプチド、抗体又はモノクローナル抗体のような診断試薬を所定の制限内で保持することができるガラス、プラスチック（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン及びポリカーボネート）、紙、ホイル簿の固体マトリックス又は材料を意味する。従って具体的には、パッケージはビン、バイアル、プラスチック及びプラスチック−ホイル積層エンベロープ又は予想した診断試薬を含有させるために用いられる類似の容器であることができ、あるいは予想診断試薬のミクログラム量を操作的に付加した、即ち検出される抗体又はポリペプチドによって免疫学的に結合することができるように結合されたミクロタイタープレートであることができる。

Ｅ、アッセイ法。

本発明は、その量が試料中のＡｐｏ　Ａｌの量に直接又は間接に関係する免疫反応生成物を生成させる免疫化学試薬として本発明のポリペプチド、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を用いる生体液試料中のＡｐｏ　Ａｔ量を定量するための種々のイムノアッセイ法を提供する。多くのよく知られている臨床診断化学方法があり、ここで本発明の免疫化学試料を、その量が生体試料に存在するＡｐｏ　Ａｌ量に関係する免疫反応生成物を生成するために使用することができることを当業者は理解するであろう。

競合的又は非競合的な異種及び同種の種々のプロトコールを本発明のアッセイ法を行うのに使用することができる。例えば本発明は、下記工程からなる血液試料中のＡｐｏ　Ａｔ量をアッセイするための競合的方法を提供する。

（ａ）血液試料を（ｉ）本発明の抗体、好ましくはモノクローナル抗体及び（ｉｉ）工程（ｉ）の抗体と免疫反応することができる本発明のＡｐｏ　Ａｌポリペプチドと混合することによって免疫反応混合物を生成させる。

血液試料は、既知量の血液又は血清又は血漿のような血液由来生成物として与えられることが好ましい。用いられる試料の種類にかかわらず、当業界で知られているように少なくとも約１２時間絶食した人から得ることが好ましい。このような試料を“絶食”試料と呼ぶ。また血清又は血漿を試料として用いる場合、その試料はアッセイされるＡｐｏ　Ａｌエピトープの発現を変えるために変性又はカオトロピック剤による処理にかける必要がないことは留意される。

ｌ実施態様において、診断方法は血液試料を（ｉ）ｌ）　Ａｐｏ　Ａｌ／ＨＤＬ、２）単離Ａｐｏ　Ａｌ、３）Ａｐｏ　ＡＩ　ＣＮＢｒ２−ＣＮＢｒ３及び４）ポリペプチドＰＹＬＤＤＦＱＫＫＷＱＥＥＭＢＬと免疫反応し、１）Ａｐｏ　ＡＩ　ＣＮＢｒ１及び２）ポリペプチド：５ＫＤＬＥＥＶＫＡＫＶＱＰＹＬＤＤＦＱＫＫＷＱＥＥ。

ＬＢＥＶＫＡＫＶＱＰＹＬＤＤＦＱＫＫＷＱＢＥ、及びＹＲＱＫＶＥＰＬＲＡＥＬ　；及びと免疫反応する抗体分子を実質的に含まない抗−Ａｐｏ　Ａｌ抗体分子及び（ｉｉ）式：　ＰＹＬＤＤＸＱＫＫＷＱＥＥＭＢＬテ示されるアミノ酸残基配列を含み、好ましくは式：ＰＹＬＤＤＸＱＫＫＷＱＥＥＭＢＬＹＲＱＫＹＥＰ　テ示されるアミノ酸残基配列を含む本発明（７）ＡｐＯＡｌポリペプチドと混合することによって免疫反応混合物を生成させることを含む。特に好ましい実施態様において、抗体はＡＴＣＣ呼称ＨＢ　８７４４を有するハイブリドーマ細胞系によって産生されるモノクローナル抗体であり、ポリペプチドはＡｌ９９ −１２１．　Ａｌ９４−１２５、Ａ１９４−１１４、Ａｌ９８−１１４、Ａ１９８−１２１及びＡｌ９９−１１４からなる表！で示したポリペプチド群から選択される。もう１つの実施態様において、免疫反応混合物は、血液試料を（ｉ　）ｌ　）　Ａｐｏ　Ａｌ量［（ＤＬ、２）単離Ａｐｏ　Ａ［，３）Ａｐｏ　ＡＩ　ＣＮＢｒ２及び４）ポリペプチドＫＶＱＰＹＬＤＤＦＱＫＫＷＱＥＢと免疫反応し、Ｉ）Ａｐｏ　ＡＩ　ＣＮＢｒ１．２）Ａｐｏ　ＡＩ　ＣＮＢｒ３及び３）ポリペプチドニ５ＫＤＬＥＢＶＫＡＫＶＱＰＹＬＤＤＢＱＫＫＷＱＢＥ。

と免疫反応する抗体分子を実質的に含まない抗−ＡｐＯＡ■抗体分子及び（ｉｉ）式：　ＫＶＱＰＹＬＤＤＦＱＫＫＷＱＢＥｔ−示されるアミノ酸残基配列を含む本発明（７）Ａｐｏ　Ａｌポリペプチドと混合することによって生成される。

特に好ましい実施態様において、抗体はＡＴＣＣ呼称ＨＢ　９２０１を有するハイブリドーマ細胞系によって産生されるモノクローナル抗体であり、ポリペプチドはＡｌ９６−１１１．　Ａｌ９３−１１１．　Ａｌ８４−１１１．　Ａｌ８５ −１１１　、Ａ１８７−１１１、＾１９４−Ｉｌｌ、　Ａ１９４−１２５及びＡｌ９Ｏ−１１１からなる表１で示したポリペプチド群から選択される。

混合される抗体の量は既知であることが好ましい。更に抗体が標識化、即ち酵素、放射性核種等の指示手段に操作的に結合される実施態様が好ましい。

生成された免疫反応混合物が固相及び液相であるので、Ａｐｏ　Ａｌポリペプチドは固体支持体の一部として存在させる、即ち固体マトリックスに操作的に結合させることか好ましい。更に免疫反応混合物に存在させるポリペプチドの量が、エピトープと免疫反応することができる免疫反応混合物に存在する抗体結合部位の数に相対する過剰量のエピトープを生成させるのに十分な量である実施態様が好ましい。

（ｂ）免疫反応混合物は、生物アッセイ条件下約４〜４５℃の温度において約１０分から約１６−２０時間のような所定時間維持され、試料に存在するＡｐｏ　Ａｔがモノクローナル抗体に存在する抗−Ａｐｏ　Ａｌ抗体結合部位と免疫反応（免疫学的に結合）してＡｐｏ　Ａｌ含有免疫反応生成物を生成させるのにそのような時間が十分である。実施態様において、ポリペプチドが固相である場合、生成される免疫複合体もまた固相に存在する。

生物アッセイ条件は、本発明の免疫化学試薬及びアッセイされるために探索されるＡｐｏ　Ａｌの生物活性を維持するものである。これらの条件としては、温度範囲約４〜４５℃、ｐＨ値範囲約５〜９及び蒸留水から約１モルの塩化ナトリウムまで変化するイオン強度がある。そのような条件を最適に使用する方法は、当業界でよく知られている。

（Ｃ）工程（ｂ）で生成したＡｐｏ　Ａｌ含有免疫反応生成物の量は、試料に存在するＡｐ。

Ａｌの量を定量することによってめられる。

Ａｐｏ　Ａｌ含有免疫反応生成物の量を直接又は間接にもとめることにより、当業界でよく知られているアッセイ法を達成することができ、典型的には用いられる指示手段の種類に依存する。好ましい競合的アッセイ法において、工程（Ｃ）で定量した生成物の量は、血液試料の代わりに対照試料を用いて同様に生成及び定量した免疫反応生成物の量に関係があり、ここで対照試料は本ポリペプチドの既知量を含み、標準曲線がめられる。

Ａｐｏ　Ａｔポリペプチドが固体マトリックスに操作的に結合される提供した競合的診断アッセイの具体例は、実施例９に記載されるＥＬＩＳＡである。

もう１つの実施態様において、本発明は、下記工程からなる二重抗体又は“サンドイッチ”免疫アッセイを提供する。

（ａ）血液試料を第１抗体、好ましくはモノクローナル抗体と混合して第１免疫反応混合物を生成させ、ここで試料に存在する抗体及びＡｐｏ　Ａｌ／ＨＤＬは、本モノクローナル抗体と免疫反応することができる第１免疫反応生成物を生成させることができる。第１抗体は、固体マトリックスに操作的に結合されることが好ましい。

（ｂ）そのように生成した第１免疫反応混合物を生物アッセイ条件下で第１免疫反応生成物を生成させるのに十分な時間維持する。次いで第１免疫反応生成物を試料から分離することが好ましい。

（Ｃ）第１免疫反応生成物を第２抗体、好ましくはモノクローナル抗体と混合して第２免疫反応混合物を生成させ、ここで第１免疫反応生成物に存在する第２抗体及びＡｐｏ　Ａｌ／ＨＤＬは、第２免疫反応生成物を生成させることができる。

（ｄ）そのように生成した第２免疫反応混合物を生物アッセイ条件下で第２又は “サンドイッチ”免疫反応生成物を生成させるのに十分な時間維持する。

（ｅ）第２免疫反応生成物の量を定量して試料中のＡｐｏ　Ａｌ量をめる。

工程（Ｃ）の本モノクローナル抗体は、好ましくは酵素で標識化されることが好ましく、従って生成した第２免疫反応生成物は標識生成物である。

ｌ実施態様において、生体試料中のＡｐｏ　Ａｌポリペプチドの検出は、本明細書で開示される治療方法に従って治療的に投与したＡｐｏ　Ａｌポリペプチドの成り行きをモニターするための手段として利用される。

また標識を使用せずに免疫反応生成物生成の存在を検出することができる免疫的アッセイが提供される。そのような方法は“検出手段”を用い、その手段は、それ自体臨床診断化学においてよく知られており、ほかの新規なポリペプチド、方法及びシステムで使用される限りにおいてのみ本発明の一部を構成する。具体的な検出手段としては、バイオセンサーとして知られる方法があり、表面の反射率の変化、光学繊維による消失波の吸収の変化又は表面音響波の伝播の変化の検出に基づくバイオセンシンク法をふくむ。

Ｆ、治療組成物本発明は、本明細書に記載される治療方法を行うのに有効な治療組成物を提供する。本発明の治療組成物は、有効成分としてその中に溶解又は分散される本明細書に記載されるＡｐｏ　Ａｌポリペプチドと一緒に生理的に許容されるキャリヤを含む。好ましい実施態様において、治療組成物は、治療のために哺乳動物又はヒト患者に投与する場合免疫原ではない。

本明細書で用いられる“薬学的に受容しつる”薬学的に許容しつる”及びその文法上の変化は、それらが組成物、キャリヤ、希釈剤及び試薬を指す場合同じ意味で用いられ、それらの物質が嘔吐、めまい、胃の不調等の生理的に好ましくない作用を起こさずに哺乳動物に投与することができることを示す。

有効成分がその中に溶解又は分散されている医薬組成物の調製は、当業界で十分理解されている。そのような組成物は、代表的には液体溶液又は懸濁液のような注射用剤として調製されるが、使用時には液体の溶液又は懸濁液に適切な固形体も調製することができる。調製は、乳化することもできる。

有効成分は、薬学的に許容し且つ有効成分と適合しうる賦形剤と本明細書に記載される治療方法で用いるのに適切な量で混合することができる。適切な賦形剤は、例えば水、食塩水、デキストロース、グリセリン、エタノール等及びその組み合わせである。更に、所望される場合、組成物は有効成分の有効性を高める湿潤又は乳化剤、ｐＨ緩衝剤等の補助物質を少量含むことができる。

本発明の治療組成物は、その中に成分の薬学的に許容しうる塩を含めることができる。薬学的に許容しうる塩としては、例えば塩酸又はリン酸のような無機酸又は酢酸、酒石酸、マンデル酸のような有機酸等と生成される酸付加塩（ポリペプチドの遊離アミノ基と生成される）が挙げられる。遊離カルボキシル基と生成される塩もまた例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、酸化第二鉄のような無機塩基及びイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミンエタノール、ヒスチジン、プロカイン等の有機塩基から誘導することができる。

生理的に許容しうるキャリヤは、当業界でよく知られている。液状キャリヤの具体例は、有効成分と水の他に物質を含まずあるいは生理的１）Ｈ値のリン酸ナトリウム、生理的食塩水又はリン酸塩緩衝食塩水のようなバッファーを含む滅菌水溶液である。また更に水性キャリヤは、１種以上のバッファー塩及び塩化ナトリウム及びカリウム、デキストロース、ポリエチレングリコール及び他の溶質のような塩を含むことができる。

液状組成物は、水を加えた及び取り除いた液相を含むことができる。そのような他の液相の具体例は、グリセリン、綿実油のような植物油及び水−油エマルジ本発明のＡｐｏ　Ａｌポリペプチドがレシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）の酵素活性を調節する能力を有し、それによってヒト患者におけるエステル化コレステロールのレベルを増加させることを発見した。ＬＣＡＴの活性によって生じるコレステロールのエステル化は、本明細書で“ＬＣＡＴ−仲介コレスチロールエステル化”と呼ばれる。

従って本発明は、本発明のＡｐｏ　Ａｌポリペプチドを含有する生理的に許容しうる組成物の治療的に有効な量を患者に投与することからなる患者におけるエステル化コレステロールの増加方法を提供するものである。

治療的に有効な量は、所望の効果を得るように、即ち患者においてエステル化コレステロールの量を増加させるように計算された所定の量である。治療的に有効な量は、典型的には生理的に許容しつる組成物として投与した場合、血漿濃度約０．１〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは約１．０〜５０μｇ／ｍ　ｌ、更に好ましくは少なくとも約２μｇ／ｍｌ及び通常５〜１０μｇ／ｍｌが十分得られる本発明の＾ｐｏＡＩポリペプチドの量である。

患者、特に血漿に存在し、リポタンパク質粒子と会合するエステル化コレステロールのレベルは、通常の臨床分析によって容易にめることができる。エステル化コレステロールのレベルをモニターする具体的なアッセイは、実施例１１に記載される。更にエステル化コレステロールの変化は、投与したＡｐｏ　Ａｌポリペプチドの有効性を時間について定量する処理法でモニターすることができる。

従って本治療方法は、血清コレステロール上昇の徴候を示すかあるいは血清コレステロールの存在によって医学的に危険であるヒト患者においてエステル化コレステロールを生体内で増加させるための手段を提供するものであり、ここでコレステロールのエステル化によってコレステロールのレベルを低下させることは有益である。

本発明のＡｐｏ　Ａｌポリペプチドを含有する治療組成物は、例えば単位投与量の注射によって通常静脈内に投与される。本発明の治療組成物について用いられる場合“単位投与量”は、単位投薬として患者に適切な物理的に分離している単位を意味し、各単位は、必要な希釈剤、即ち担体又は賦形剤と共に所望の治療効果を生じるように計算された有効物質の所定量を含有する。

組成物は、投薬処方と適合する方法及び治療的に有効な量で投与される。投与量は、治療される患者、有効成分を使用する患者の免疫系の能力及び所望される治療効果の程度に依存する。投与に必要とされる有効成分の正確な量は、医師の判断に依存し、各個人に固有である。全身系用に適切な投薬範囲は、本明細書に開示され、投与経路に依存する。開始投与及びブースター注射に適切な用法も可変的であるが、典型的には、開始投与後、１時間以上の間隔で次の注射又は他の投与によって繰り返し投与される。また、生体内治療に特定される範囲に血中濃度を十分維持する連続静脈内注入が予想される。

Ａｐｏ　Ａｌポリペプチドの有効量の投与を助けるものとして、患者の血液中の＾ｐＯＡｌポリペプチドを検出する本発明の診断方法は、投与された治療用組成物の成り行きを確認するのに有効である。

更に１９８７年１１月２田こ出願され、出願番号第１１６．２４８号を有する米国特許第号で定義したＭＡＲＡｌ−１８エピトープを定義するＡｐｏ　ＡｌポリペプチドもまたＬＣＡＴ活性を調節する能力を有し、それによって本明細書に記載される治療方法によるヒト患者のエステル化コレステロールのレベルを増加することを発見したのであり、この特許の教示をここに引用する。

実施例下記実施例は、本発明を具体的に説明するものであるが、限定するものではない。

１、ポリペプチドポリペプチドへ１８４−１ｌｌ、Ａ１８５−１１１、Ａｌ８７−１１１　Ａｌ９Ｏ−１１１，Ａ１９３−１１１、Ａｌ９４−１１１、Ａｌ９４−１１４、Ａ１９４−１２５、Ａ［９６−１１１，Ａｌ９８−１１４、Ａ１９８−１２１　Ａ１９９−１１４、Ａｌ９９−１２１、Ａ１９Ｏ−１０５、Ａ１８７−１０５及びＡｌ９５−１０５をＭｏｄｅｌ　４３０Ａ自動ペプチドシンセサイザー（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　、　Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ　、　ＣＡ）による使用に修正したＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ａｄｖ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、、３２：２２１−９６（１９６９）によって記載される古典的固相法を用いて合成した。ポリペプチド樹脂は、フッ化水素によって切断し、抽出し、逆相Ｃ１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｅｓ、　Ｍｉｌｆｏｒｄ　、　ＭＡ）を用いる高性能液体クロマトグラフィーによって純度を分析した。

上記で命名したポリペプチドのアミノ酸残基配列は表１に示される。

２、Ａｐｏ　Ａｔ／ＨＤＬの調製地域血液銀行（Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ　Ｐｌａｓｍａ　Ｃｅｎｔｅｒ、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ　、　ＣＡ）の正常な絶食−ドナー血液のプラズマフォレシスによって得られた血漿からＨＤＬを単離した。この目的のために、そのようにして得られた血漿を２ミリモル（−）ベンズアミジン、！４−エチレンジアミン四酢酸（ジナトリウム塩）（ＥＤＴＡ）　、２０ミクログラム／ミリリツトル（μｇ／ｍｌ）ダイズトリプシンインヒビター、ｔｏ、　ｏｏｏ単位／ｍｌアプロチニン、２０μｇ／ｍｌリママメトリプシンインヒビター、２５μｇ／ｍ　Ｉポリブレン及び１μ即−フェニルアラニル−１−プロリル−■−アルギニンクロロメチルケトン（ＰＰＡＣＫ）の最終濃度を含むように調整した。次いでこの調節した血漿から密度調整用の固形臭化カリウム（ＫＢｒ）を用いて連続超遠心分離によってＨＤＬを単離した。

まず調整した血漿を１８６．０００ｘｇ、摂氏４度（４℃）で１８〜２４時間遠ノＣルた。Ａｐｏ−ＶＬＤＬを含有する得られた上清の上層を取り出し、保持した。上清の下層を回収し、密度が１．０６３グラム／ミリリツトル（ｇ／ｍｌ）以上になるまで固形ＫＢｒ層と混合した。

次いで得られた混合液を密度１．０６３　ｇ／ｎ＋ＩのＫＢｒを含有する０、　１％　ＩＩ！ＤＴＡ溶液によって油層し、１８６．０００ｘｇで２４時間遠心した。再び下層を回収し、密度が１．２１　ｇ／ｍ１以上に調整されるまで固形ＫＢｒと混合した。この調整した層を密度１．２１　ｇ／ｍｌのＫＢｒを含有する０、　１％　ＥＤＴＡ溶液によッテ油層し、１８６．０００ｘｇ、　４℃で約４８時間以上遠心した。

次いで得られた上層を回収し、密度が１．０６３　ｇ／ｍ１以上になるまで固形ＫＢｒと混合した。この調整した上層を密度１．Ｃ１６３ｇ／ｍｌのＫＢｒを含有する０、！％ＥＤＴＡ溶液によって油層し、また更に１８６，０００ｘｇ、　４℃で約１８〜２４時間遠心した。

中間層を回収し、密度が１．２１　ｇ／＋ｎ１以上に調整されるまで固形ＫＢｒと混合した。

この調整した中間層を密度１．２１　ｇ／ｍｌのＫＢｒを含有する０、１％ＥＤＴＡ溶液によって油層し、３００．０００ｘｇ、　４℃で約１８〜２４時間遠心した。密度１．０６３〜１．２１　ｇ／ｍｌに等しい得られたＨＤＬ含有上層を回収した。この回収したＨＤＬをリポタンパク質ツク・ソファ−化ＬＢ；１５０ｍＭ　ＮａＣｌ　、０．３ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．００５％α−トコフェロール及び油ベンズアミジンを含む水）に透析し、得られたＡｐｏ　Ａｌ／ＨＤＬを無菌条件下で２１日以上貯蔵した。八ｐｏ　Ａｌ／ＨＤＬのタンパク質濃度は、ウシ血清アルブミン標準を用いてＳＤＳの存在下で行った場合、Ｌｏｗｒｙ法［Ｌｏｗｒｙ等、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　ＣｈｅＩＬ、１９３．２６５−２７５（１９５＋）］の変法により１５〜２５■／ｍｌにあることがめられた。

３、脱脂Ａｐｏ　Ａｌの調製脱脂Ａｐｏ　Ａｌは、脂質をＡｐｏ　Ａｌ／Ｉ（ＤＬから有機的に抽出することによって調製した。

実施例ＩＢ　テ調製し？：Ａｐｏ　Ａｔ／）ＩＤＬ試料をまずｐＨ値７．５７７）０．０１％ＥＤＴＡ　ｊ、ニー晩透析し、次に０．００３％ＥＤＴＡに約６時間透析し、法にタンパク質１０〜ｚθミリグラム／管に凍結乾燥した。各試験管に無水エタノール：無水エチルエーテル（１：１）３５ｉｆを４℃において混合した。混合した後、この溶液を一２０℃で２０分間維持した。次いでこの溶液をＩＯｏｏｘｇ、　０℃で３０分間遠心し、上清を流し、Ａｐｏ　Ａｌ含有沈降物を保持した。

エタノールエーテル抽出を上記のように２回行い全部で３回抽出した。次いで４ ℃において無水エーテル３５ｍ１を試料に混合した。この混合液を一２０℃で３０分間維持し、ｌｏｏｏｘｇ、−２０℃で３０分間遠心し、Ａｐｏ　Ａｌ含有沈降物を回収し、窒素ガスを用いて乾燥して脱脂Ａｐｏ　Ａｌを生成させた。脱脂Ａｐｏ　ＡｔはＡｐｏ　Ａｌだけでなく、ＨＤＬと会合した他のタンパク質も含むことは留意しなければならない。

４、単離Ａｐｏ　Ａｌの調製Ａｐｏ　Ａｌは、Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ等、Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、９４：６１５−６１７（１９Ｂ３）の方法に従い高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いてサイズ分画により脱脂Ａｐｏ　Ａｔから単離した。

実施例３で調製した脱脂Ａｐｏ　Ａｌ約３００μｇを０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）２００　ミクロリットル（μｌ）、０．１Ｍ　リン酸ナトリウム（ｐＨ７，０）に溶解し、Ｓｐｈｅｒｏｇｅｌ−ＴＳＫ　３０００　ＳＷ　ＨＰＬＣカラム（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　Ｉｎｃ、　、Ｆｕｌｌｅｒｔ盾氏A ＣＡ）でサイズ分画した。単離Ａｐｏ　Ａｌを含有する両分を一２０℃で貯蔵した。

プールした正常なウサギ血液（Ｓｃｒｉｐｐｓ　Ｃ１１ｎｉｃ　ａｎｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ　Ｖｉｖａｒｉｕｍ、　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、　Ｃａ１ｉｆ、　）のプラズマフォレシスによって得た血漿からＬＤＬを単離する。そのようにして得た血漿を実施例２のＡｐｏ　Ａｌ／ＨＤＬの精製の記載のように処理する。第２遠心分離後、ＬＤＬを含有する上層を回収し、ＨＤＬを含有する下層を捨てる。上層を密度が１．０６３　ｇ／ｍ１以上に調整されるまで固形ＫＢｒと混合する。

この調整した層を密度１．２１　ｇ／ｍｌのＫＢｒを含有する０、１％ＢＤＴＡ溶液によって油層し、１８６．０００ｘｇ、　４℃で１８〜２４時間遠心する。

次いで上層を回収し、密度が１．０６３　ｇ／ｍ１以上になるまで固形ＫＢｒと混合する。

この調整した上層を密度１．０６３　ｇ／ｍｌのＫＢｒを含有する０、１％ＥＤＴＡ溶液によって油層し、また更に２５０，０００ｘｇ、　４℃で１８〜２４時間遠心する。濃縮ＬＤＬを含有する上層を回収し、ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水、ｐＨ７，２）に透析し、−７０℃で貯蔵する。

ポリペプチドＡｌ８４−１１１．　Ａｌ８５−１１１．　Ａｌ９０−１１１、Ａ１９３−１１１、八１９４−１１１．　Ａｌ９４−１１４、Ａ１９４−１２５、Ａ１９６−１１１、Ａｌ９８−１１４、Ａｌ９８〜１２１　Ａ１９９−１１４、Ａｌ９９−１２１を実施例１で記載したように合成する。各ポリペプチドを１，５■詐酸ナトリウム、ｐＨ７，８に最終濃度６　ｍｇ／ｍｌまで全容量５ｍｌとして個別に溶解する。溶解したポリペプチドをペプチド：ＬＤＬ比１０００：Ｉとして２ｍｇ／ｍｌ　ＬＤＬ溶液及び訓酢酸ナトリウム溶液の各２．５ｍｇ／ｍｌと混合する。このポリペプチドとＬＤＬ反応混合液にペプチドに対して２．７モル過剰量のグルタルアルデヒドを用いる５００ｍＭグルタルアルデヒド溶液を加える。この混合液を室温で１０分間維持した後、最終濃度０．２ｄにナトリウムボロヒドリドの４０蘭溶液を加える。その後、混合液を３７℃で５〜８時間維持し、次に分子量１２．０００〜１４．０００を有する透析管を用いて１日につき２回バッファーを交換して５日間ＰＢＳに透析する。透析溶液を２５００ｘｇで１０分間遠心し、得られた沈降物をＰＢＳ　５ｉｆに浮遊させてペプチドルＤＬ免疫原を生成させる。ペプチド−ＬＤＬは、上記免疫原調製プロトコールにおいて上記ペプチドの各々を用いて調製される。Ｂ、　Ｂ。

ポリクローナル抗血清の免疫化及び収集実施例５Ａで調製したペプチド−ＬＤＬ免疫原をＲｉｂｉ　Ａｄｊｕｖａｎｔ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｉｂｉ　ＩａｎｕｎｏＣｈｅｍ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　、　Ｉｎｃｌ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、　Ｍｏｎｔａｎａ）を用いて製造業者の指示書に従い乳化し、ペプチド−ＬＤＬ抗原を濃度３００μｇ／ｍｌのエマルジョンに混合する。前免疫血清試料を集めた後、２匹のウサギに調製したエマルジョン１ｍｌを注射する。１ｍｌエマルジョン投与量を次の通り投与する：皮肉０．３０ｍ１（６部位各々に０．０５ｍ１）；筋肉内０．４０ｍ１（各後脚に０．２ｍ１）；皮下０．　ｌ０ｍ１（頚領域）及び腹腔内０．２０ｍ１０詳細な注射プロトコールに従って、ウサギに３週間隔で６回注射する。６回の注射中２回目の１週間後に、下記５ＰＲＩＡアツセイによる免疫原として用いられる特異的ペプチドに対する抗体タイターをチェックするために血液試料を集める。集めた血液試料を３７℃オーブン中で１時間攪拌した後、その試料を３０００ｘｇで２０分間遠心する。界面を集め、ミクロフユージ中１２゜０００ｘｇで５分間攪拌する。抗−ペプチド抗体を含有する上清を集め、−２０ ℃に貯蔵する。

ペプチド抗体タイターは、実質的にＣｕｒｔｉｓｓ　、　Ｅｄｇｉｎｇｔｏｎ、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｕ、２５７・１５２＋３−１５２２１（＋９８２）に記載される固相ラジオイムノアッセイ（ＳＰＲＩＡ）によってめる。簡単には、合成ペプチド５μｇ／ｍｌを含有するＰＢＳ　５０μｍをミクロタイタープレートのウェルに混合する。このプレートを４℃で一晩（約１６時間）維持してペプチドをウェル壁に付着させる。ウェルを５ＰＲＩＡバツフｙ　（２，６８ｍ！ｉｌ　ＫＣＬ、１．４７ｍＭ　Ｋ）ｌｔＰｏイ１３７ｍＭ　ＮａＣ１，８，０３ｍＭ　Ｎａｔ）ＩＰＯ，，０，０５℃１ｗｅｅｎ−２０，０，＋１１υ／ｍP Ｔｒａｙｓｏｌ　、０．　Ｉ％ＢＳＡ、０．０１５％ＮａＮ５）で４回洗浄した後、３％の正常なりギ血清（ＮＧＳ）及び３ｘウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する５ＰＲＩＡバツフア一２００μｍを各プレートに混合して過剰のタンパク質結合部位を遮断する。このプレートを２０℃で３０分間維持し、ウェルを振盪して移し、トライプロットして固体−支持体、即ちＡｐ。

Ａ＋／）ＩＤＬを操作的に付加した固体マトリックスを生成させる。

次いで各ウェルに血清試料５０μｌを混合して固−液相免疫反応混合液を生成させる。この混合液を３７℃で２時間維持して固相免疫反応生成物を生成させる。

上記のようにウェルを洗浄した後、タンパク質０．２５μｇ／ｍｌのＩｔ６Ｉ− 標識ヤギ抗−マウスＩｇ０５０μｍを各ウェルに混合して標識反応混合液を生成させる。この混合液を３７°Ｃで１時間維持して１１５１−標識固相免疫反応生成物を生成させる。ウェルを１記のように洗浄した後各ウェルに結合した１２５１−標識生成物の量をγシンチレーションでめる。非特異的ハックグラウンドの測定値である前免疫化した正常なウサギ血清試料と比較して免疫化したウサギから集めた血清試料の特異的抗−ベプ千ト抗体タイターをめる。血清試料は、放射性シグナルが正常なウサギ血清の５倍以−Ｅである場合に抗−ペブチトボリクローナル抗体を含むとみなされるっ６、モノクローナル抗体の調製Ａ１８４−１１１、Ａｌ８５−１１１．　Ａｌ９Ｏ−１１１，Ａ１９３−１１１．　Ａ１９４−１１１ＳＡ１９４−１１４、Ａｌ９４−１２T、Ａｌ９６−１比Ａ１９８−１１４、Ａ１９８−１２１、Ａ１９９−１１４及びＡｌ９９−１２１を示すポリペプチドを実施例５Ａに従って免疫原として調製する。Ｂａ１ｂ／ｃ　ＢｙＪマウス（Ｓｃｒｉｐｐｓ　Ｃ１１ｎｉｃ　ａｎｄＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ　ｖｉｖａｒｉｕｍ、　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、　ＣＡ）に完全フロインドアジュバント（ＣＦＡ）中調製ペプチドーＬＤＬ免疫原５０μｇを腹腔内（ｉ、　ｐ、　）に免疫化し、第２及び第３免疫化は、各々約３週間離して不完全フロインドアジュバント（ＩＦＡ）中同じペプチド−ＬＤＬ免疫原を用いる。融合４日前に標準食塩水中静脈内（ｉ、ｖ、）調製ペプチド５０μｇの追加をマウスに注射し、■８後第２の同じ追加を潅流免疫する。

そのように処理した動物を犠牲にし、各マウスの牌臓を回収する。次いで牌細胞浮遊液を調製する。次いでｌ０００ｒ、　ｐ、　ｍ、　、　２３℃で約１０分間遠心分離して牌細胞浮遊液から牌細胞を抽出する。上清を除去した後、細胞沈降物を５ｉｆの冷却ＮＨ，ＣＩ溶解バッファーに再浮遊させ、約１０分間インキュベートした。

溶解細胞浮遊液に１０ｍ１のダルベツコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭＸＧＩＢＣＯ）とＨＥＰＥＳ［４−（２−ヒドロキシエチル−）−１−ピペリジンエタンスルホン酸］バッファーを混合し、この混合液を１００Ｏｒ、　ｐ、　ｒｎ、　、　２３℃で約１０分間遠心する。

上滑を傾瀉し、沈降物をＤＭＥＭと）ＩＥＰＥｓの１５ｍ１に再浮遊させ、１０００ｒ、　ｐ、ｍ、　、　２３℃で約１０分間遠心する。上記方法を繰り返す。

次いで沈降物をＤＭＥＭとＨＥＰＥＳの５ｉｆに再浮遊させる。次いで牌細胞浮遊液の一部を計数用に取り出す。融合は、非分泌マウスミエローマ細胞系Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３．　Ｉ、サブクローン系Ｐ３Ｘ６３Ａｇ　８．６５３（ＡＴＣＣＩ５８０）を用いて次の方法で達成される。牌細胞に対するミエローマ比約１１０又は１．５を用いると、十分量のミエローマ細胞が沈降物に遠心され、１５＋ｎｌのＤＭＥＭと）ＩＥＰＥｓで２回洗浄し、］０００ｒ、　ｐ、　ｍ、　、　２３℃で約１０分間遠心する。

牌細胞とミエローマ細胞を１５ｍ１の丸底管で混合する。細胞混合液をｌ０００ｒ、　ｐ、　ｌ　。

２３℃で約１０分間遠心し、上清を吸引により取り除く。その後、約３７℃において５０Ｘ（重量／容量）の水性ポリエチレングリコール４０００分子ＪｉＬ（ＰＥＧ；ＡＴＣＣＢａｌｔｉｍｏｒｅ　。

ＭＤ３２００μｍを１ｉｆのピペットを用いて沈降物を破壊するために激しく攪拌しながら混合し、細胞を１５〜３０秒穏やかに混合する。細胞混合液を７０Ｏｒ、　ｐ、ｔｎ、で４分遠心する。

ＰＥＧを加える約８分間にＤＭＥＭとＨＥＰＢＳバッファー５ｍｌを細胞を妨害せずにゆっ（りと沈降物に混合する。１分後、得られた混合液を１ｍｌのピペットで分け、更に４分間インキュベートする。この混合液を１００Ｏｒ、　ｐ、　ｕで約７分間遠心する。上清を傾瀉し、ＨＴ（ヒボキサンチン／チミジン）培地５ｍｌを沈降物にゆっ（りと混合し、混合液を５分間静かに維持する。次いで沈降物を大きなかたまりにくずし、最終細胞浮遊液を予め７．５ｍｌのＨＴ培地を入れたＴ７５フラスコ（２，５ｍｌ／フラスコ）に入れる。得られた細胞浮遊液を３７℃でインキュベートして融合細胞を培養する。

２４５時間後にＨＴ培地１０ｍ１をフラスコに混合し、６時間後に０．０４−アミノプテリン０、３ｍｌを混合する。融合４８時間後にＨＡＴ（ヒポキサンチン／アミノプテリン／チミジン）　ｌ０ｍ１をフラスコに混合する。

融合３日後に生存細胞をＫｅｎｎｅｔｔ等、Ｃｕｒｒ、Ｔｏｐ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｉｎ＋ｕｎｏ１．．８１ニア７（＋９７８）に記載される）ｔＡＴバッファー培地中約２ＸｌＯ’生存細胞／ウェル（全７６８ウエル）で９６−ウェル組織培養プレートにのせる。融合７日後及び肝培地で必要とされたようにその後約４−５日間隔で細胞にＨＡＴ培地を加える。培養は、顕微鏡的に行われ、約２週間後に培養上清を集め、実質的にＣｕｒｔｉｓｓ　、　Ｅｄｇｉｎｇｔｏｎ　、　Ｊ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、２５７：１５２１３−１５２２１（１９８２）に記載される固相ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によってＨＤＬ−特異的抗体の存在をアッセイする。

簡単には、調製ペプチドルＤＬ免疫原５μｇ／ｍｌを含有するＰＢＳ　５０μｌをミクロタイタープレートのウェルに混合する。このプレートを４℃で一晩（約１６時間）維持してペプチドルＤＬ免疫原をウェル壁に付着させる。ウェルを５ＰＲＩＡバツフアー（２，６８＋ｎＭ　ＫＣＬ　、　１．４７ｍＭ　Ｋｌ（！ＰＯ４，１３７ｍＭ　ＮａＣｌ、８．　Ｏａ＋ｎＭ　ＮａｔＨＰＯａ、０．０５％ sｗｅｅｎ−２０，０、ＩＫＩＵ／ｍｌ　Ｔｒａｙｓｏｌ　、０．　Ｉ％ＢＳＡ、０．０１５％ＮａＮ５）で４回洗浄した後、３ｘの正常なりギ血清（ＮＧＳ）及び３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する５ＰＲＩＡバツフア　−２００μｌを各プレートに混合して過剰のタンパク質結合部位を遮断する。このプレートを２０℃で３０分間維持し、ウェルを振盪して移し、ドライブロットして固体−支持体、即ちペプチド−ＬＤＬ免疫原を操作的に付加した固体マトリックスを生成させる。

次いで各ウェルにハイプリドーマ組織培養上清５０ｕｌを混合して固−液相免疫反応混合液を生成させる。この混合液を３７℃で２時間維持して固相免疫反応生成物を生成させる。上記のようにウェルを洗浄した後、タンパク質０．２５μｇ／ｍｌのＨ８Ｈ−標識ヤギ抗−マウスＩｇＧ　５０μｍを各ウェルに混合して標識反応混合液を生成させる。この混合液を３７℃で１時間維持して１１１１１− 標識固相免疫反応生成物を生成させる。ウェルを上記のように洗浄した後各つヱルに結合した…Ｉ−標識生成物の量をγシンチレーションでめる。

ハイブリドーマは、抗−ペプチド抗体をそれらの培養基に分泌するハイブリドーマ培養から選択され、更にここに記載されるように確認される。

Ｂ−典研究室呼称６１１ＡＶ６３Ｃ２，Ｉｌｌをもち、Ａｌ−４を示すパラトビツク分子を分泌するハイブリドーマを実施例２で記載したＡｐｏ／ＶＬＤＬで免疫化したＢａ１ｂ／ｃｖウス（ＳｃｒｉｐｐｓＣｌｉｎｉｃ　ａｎｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ　Ｖｉｖａｒｉｕｍ、　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、　Ｃａ１ｉｆ、　）の牌細胞■Z 合から得た。実施例６で記載した標準融合プロトコールを用いた。そのように調製したハイブリドーマを選別し、ペプチド−ＬＤＬ免疫原の代わりにＡｐｏ　Ａｌ／ＨＤＬを被覆基質として使用した以外は前記のようにアッセイした。このハイブリドーマを特許手続き上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約に従って１９８５年３月５田こＡＴＣＣ受入れ番号ＨＢ８７４４としてアメリカンタイプ力ルチュアコレクション、ロックビル、扁、に寄託した。

Ｃ，Ａｌユし研究室呼称Ｈ１０３Ｄ８．１０＋　１をもち、Ａｌ−１１を示すパラトビツク分子を分泌するハイブリドーマを実施例２で記載したＡｐｏ／ＨＤＬで免疫化したＢａ１ｂ／ｃマウス（ＳｃｒｉｐｐｓＣｌｉｎｉｃ　ａｎｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ　Ｖｉｖａｒｉｕｍ、　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、　Ｃａ１ｉｆ、　）の牌細胞■Z 合から得た。実施例６で記載した標準融合プロトコールを用いた。そのように調製したハイブリドーマを選別し、ペプチド−ＬＤＬ免疫原の代わりにＡｐｏ　ＡＩ／ＨＤＬを被覆基質として使用した以外は前記のようにアッセイした。このハイブリドーマを特許手続き上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約に従って１９８６年９月Ｉ６日にＡＴＣＣ受託番号ＨＢ９２０１としてアメリカンタイプ力ルチュアコレクション、ロックビル、顯、に寄託した。

Ｄ、Ａｌ−１８＾ｒ−１８を示すパラトビツク分子を分泌するハイブリドーマを１９８７年１１月２日こ出願され、出願番号第１１６．２４８号を有する米国特許第　号に記載されるようにして得、この特許をここに引用する。このハイブリドーマを特許手続き上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約に従って１９８７年ｌＯ月１４日にＡＴＣＣ受託番号ＨＢ９５７０としてアメリカンタイプカルチュアコレクション、ロックビル、嗣、に寄託した。

Ｅ、モノクローナル抗体の調製及び精製鉱油０．３ｍｌで開始し、呼称６１１　ＡＶ６３Ｃ２，Ｉｌｌ　、Ｈ１０３Ｄ８．　＋０１１及びＨＢ９５７０をもっ５ｘｌＯ’ハイブリドーマ細胞を腹腔内に注射した別々の組の生後１０週のＢａ１ｂ／ｃマウスから腹水を得た。腹水発生の平均時間は９日であった。１５．０００ｘｇ、　２３℃で１５分間遠心して清澄化した後、ハイブリドーマによって生じた腹水をプールし、−２０℃で凍結貯蔵した。

ハイブリドーマからの精製Ａｌ−４、Ａｌ−１１及びＡｌ−１８モノクローナル抗体をＰｈａｒｍｃｉａ　Ｍｏｎｏ　Ｑ　ＨＲ５１５アニオン交換カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ　、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、　ＮＪ）を用いる高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）により１０ｄＴｒｉｓ、　ｐＨ８，０中０−０．５モル（Ｍ）Ｎａｃｌ勾配を用い、カラムに備えられた説明書に従って調製した。精製したＭａｂをＡｍ１ｃｏｎ撹拌限外ろ過細胞（Ｄａｎｖｅｒｓ、　ＭＡ；ＰＭ　３０膜）を用いて濃度１ｍｇ／ｍｌまで濃縮し、ＰＢＳ（リン酸塩緩衝食塩水、ｐＨ７，２）に透析し、−７０℃で貯蔵した。

実施例６Ａに記載される抗−ペプチド抗体を分泌するハイブリドーマを上記生？＆ｌＯ週のＢａ１ｂ／ｃマウスに注射して腹水を得る。精製抗−ペブチトモツクローナル抗体を上記ＦＰＬＣによって調製する。精製晩すをＡｍ１ｃｏｎ攪拌限外ろ過細胞で濃縮し、上記のように貯蔵する。

７、放射性ヨウ素標識）ＩＤＬ　、　Ａｐｏ　Ａｌ及び免疫化学的に精製したヤギ抗−マウスＩｇの放射性ヨウ素標識をｌｏｄｏｇｅｎヨウ素標識方法及びＰｉｅｒｃｅ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓから入手したＩｏｄｏｇｅｎを用いて行った。ｌｏｄｏｇｅｎヨウ素標識を用いて下記で述べられる固相ラジオイムノアッセイ用の抗原及び抗体を確認した。

８、Ａｐｏ　Ａｌ−臭化シアノジエン断片持異性ＭＡＲＡｌ−４、ＭＡＢ　Ａｌ −１１及び１ｉｌＡＢ　Ａｌ−１８のＡｐｏ　ＡＩ　ＣＮＢｒ断片持異性をＣｕｒｔｉｓｓ等、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｗｏｒｋｓｈｏｐ　ｏｎ　Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ　Ｉ（ｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ　ＳＥｄ、Ｌｉ垂垂 ■戟@。

ＮＩＨＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ　Ｎｏ、　８７−２６４６１）、　３６３−３７７（１９８７）の方法によるウェスタンプロットついて行った。ＣＮＢｒを１３．０００モル過剰量で加え、反応混合液を約２０℃で１５時間維持シタ。凍結乾燥１．り後、得うｆＬりＣＮＢｒ断片ヲＬ％ＳＤＳ　、　０．０１Ｍ　Ｔｒｉｓ、　ｐＨ８，２１：可溶化し、ＣＬＩｒｔｉＳＳ等、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、２６０：２９８２−９３（１９８５）によって記載されるように８ｍ素及び２ｘアンフオリン（ｐＨ４〜ｐＨ６）を含む６ｘポリアクリルアミドスラブゲル中等電点電気泳動にがけた。電気泳動的に分離したタンパク質を別のモノクローナル抗体との免疫反応のためにニトロセルロースに移した。免疫反応生成物の生成を放射性ヨウ素標識ヤギ抗−マウスＩｇ次いでオートラジオグラフィーにより検出した。

これらの研究の結果は、ＭＡＲＡｌ−４がＡｐｏ　ＡＩ　ＣＮＢｒ断片ＣＮＢｒ１．　ＣＮＢｒ２　、ＣＮＢｒ３及びＣＮＢｒ４と免疫反応しないがＣＮＢｒ２ −ＣＮＢｒ３と免疫反応することを示す。これらのＣＮＢｒ免疫反応物の結果は、ＭＡＢ　Ａｌ−４も単１１１ｉＡｐｏ　Ａｌと免疫反応することを示す。

これらの研究の結果は、ＭＡＲＡｌ−１１がＡｐｏ　ＡＩ　ＣＮＢｒ断片ＣＮＢｒ１．　、　ＣＮＢｒ３及びＣＮＢｒ４と免疫反応しないがＣＮＢｒ２と免疫反応することを示す。これらのＣＮＢｒ免疫反応物の結果は、ＭＡＲＡｆ−１１も単離Ａｐｏ　Ａｌと免疫反応することを示す。

これらの研究の結果は、ＭＡＲＡｌ−１８がＡｐｏ　ＡＩ　ＣＮＢｒ断片ＣＮＢｒ１．　、　ＣＮＢｒ３及びＣＮＢｒ４と免疫反応しないがＣＮＢｒ２と免疫反応することを示す。これらのＣＮＢｒ免疫反応物の結果は、ＭＡＲＡｌ−１８もｊｌｌｔＡｐｏ　Ａｌと免疫反応することを示す。

９、固相ポリペプチドＥＩＪＳＡＡｐｏ　ＡｌポリペプチドＡ１８４−１比Ａｌ８５−１１１．　Ａ１９Ｏ−１１１，Ａ１９３−１１１、Ａ［９４−１比Ａ１９４−１２５、Ａ［９６−１１１，Ａｌ９９−１１１及びＡｌ９９−１．１４を直接結合ＥＬＩＳＡ　Ｇ、：おいてモノクローナル抗体ＡＩ−Ｉｆとの免疫反応性について試験した。アッセイにおいて、各ポリペプチド５０μｇ／ｍｌをＰＢＳに溶解してペプチドコーティング溶液を生成させ、その１５０μｍを可撓性塩化ポリヒニルミクロタイタープレート（Ｉａ＋ｕｌｏｎ）のウェルに混合した。次いでウェルを４℃で約１６〜２０時間維持してペプチドをウェルの壁に（コ−ト）吸収させた。ペプチドコーティング溶液を振盪して除去した後、ウェルを洗浄バッフｙ　−（Ｉｇ／ｌ　ＢＳＡ　、　０．５ｍｌ／Ｉ　Ｔｗｅｅｎ２０及び２μｌ／ｌアプロチニンを含むＰＢＳ）３５０　μｌ　７１回洗浄した。阻止バッフｙ　−（３％ＢＳＡを含むＰＢＳ）２００　μｌを各ウェルに混合し、ウェルを３７℃で１時間維持し、振盪して阻止バッファーを除去し、次いで上記のようにウェルを３回洗浄することによって過剰のタンパク質結合部位を遮断した。次いでプレートを３７℃で１時間乾燥した後、０．５μｇ／ｍｌのワサビパーオキシダーセ複合Ａｌ−１１抗体を含むＰＢＳ　１００μｍを加えて固−液相免疫反応混合液を生成させた。得られた固−液相免疫反応混合液を２０℃で１時間維持して固相ポリペプチド含有免疫反応生成物を生成させた。次いでウェルを洗浄バッファーで３回洗浄して非結合抗体を除去した。

次いでＯＰＤ基質２００μｍを各ウェルに混合して発現反応混合液を生成させることによって固相に存在する免疫反応生成物の量をめた。この混合液を約２０℃ で３０分間維持した。次いで、４Ｎ　Ｈ，３０，５０μｌを各ウェルに混合して発現反応を停止させ、生成した免疫反応生成物の量を検出するためにミクロタイタープレートリーダー（Ｄｙｎａｔｅｃｈ）を用いて４５０ナノメートルの吸光度について得られた溶液をアッセイした。

Ａｐｏ　ＡｌポリペプチドＡｌ８５−１１１、Ａ１９４−１２５及びＡｌ９６− １１１は、上記直接結合ＥＬＩＳＡにおいてモノクローナル抗体Ａｌ−１１と特異的に免疫反応することが見られた。Ａｐ。

Ａ＋ポリペプチドＡｌ９Ｏ−１１１，Ａｌ９３−１１１及びＡｌ９４−１１１も抗体によって確認されたが特異性は低下した。Ａｐｏ　ＡｌポリペプチドＡｌ９９−１１１は、抗体によって結合されなかった。

Ａｐｏ　Ａ１合成ポリペプチドに結合するＡｌ−１１の相対的有効性を定量するために、試験合成ポリペプチドとしてＡｌ９６−１１１を用い、Ａｐｏ　Ａｌ含有血清及び精製Ａｐｏ　ＡＩＩＨＤＬと比較して競合ＥＩＪＳＡを行った。ミクロタイタープレートを上記のようにＡｌ９６−Ｉｌｌで被覆した。上記アッセイの乾燥工程後、アッセイされる液体試料（即ちＡｐ。

Ａ１含有液体試料）又は標準（即ちＡｐｏ　Ａｌポリペプチド）５０μｍをポリペプチドＡ１９６−ＩＩＩ被覆ウェルにＨＲＰＯ複合Ａｌ−１１抗体５０μＩと同時に混合して免疫反応混合液を生成させた。ここに記載したアッセイにおいて、Ａｌ−１１が被覆したＡｌ９６−１１１ポリペプチドに結合するのに拮抗する能力について希釈範囲にわたって３拮抗剤を試験した。別々の被覆ウェルにおいて開始濃度１■／ｍｌでポリペプチド＾１９６−Ｉｌｌを加え、最終濃度０．０１５６■／ｍｌまで２重の連続６回希釈した。実施例２で記載した血清試料を開始希釈度１：１０で加え、最終希釈度１：３２０まで２重の連続６回希釈した。

実施例２で記載したＡｐｏ　Ａｌ／ＦＩＤＬを開始濃度１■／ｍｌで加え、最終濃度０．０３１■／ｍｌまで２重の５回希釈した。次いでプレートを室温で３０分間インキュベールた。

プレートを洗浄し、アッセイを上記のように展開して生成した免疫反応生成物の量及びそれによって添加した液体試料に存在する拮抗剤の量をめた。

図２に示されるこのアッセイの結果は、ＭＡＲＡｌ−１１が液体試料に存在するＡｌ９６−１１１と免疫反応するが、血清及び精製ＨＤＬ中の未変ｔｆＪｐｏ　Ａｌに対する親和性の方が高いことを示す。

米麦ｔ４＝Ａｐｏ　Ａｌ／ＨＤＬのＭＡＲＡｌ−４及び種々の合成ポリペプチドの免疫反応性を次の通り行われる競合ＲＩＡによって試験した：Ａｐｏ　Ａｌ／ＨＤＬ　１０　μｇ／ｍｌを含有するＰＢＳ（０，１５Ｍ　ＮａＣ１，０，ＯＩＭ　ＮａＰＯ＊　、ｐＨ７，２）１００μｌをミクロタイタープレートのウェルに混合した。プレートを回転台に２０℃で１時間維持してＡｐｏ　Ａｌ／ＨＤＬをウェルに付着させ、固体支持体を生成させた。ウェルの過剰液体を吸引した後、阻止溶液（ＰＢＳ中３％ＢＳＡ、　３％ＮＧＳ）２００ｔｔ１を各ウェルに混合し、ウェルを回転台に２０℃で３０分間維持した。次に、阻止溶液を吸引によって除去し、ウェルを５ＰＲＩＡバツフアーで３回洗浄した。

次いで各ウェルに最初に３％ＢＳＡを含むＰＢＳ　５０μｍと種々の濃度の拮抗剤抗原、即ちＡｐｏ　Ａｌ／ＨＤＬペプチドを混合し、次ニ３！％　ＢＳＡを含むＰＢＳ中１：１１．２５ｘｌＯ’　ニ希釈した清澄化腹水としてのＭＡＲＡｌ −４５０μｍを混合して競合免疫反応混合液を生成させた。対照ウェルにおいては、相対する抗原又は抗体を３％　ＢＳＡを含むＰＢＳに置き換えた。

免疫反応混合液を回転台に４℃で約１６時間維持して固相免疫反応生成物を生成させた。上記のように洗浄した後、１２５■−標識ヤギ抗−マウスＩｇ（３重％ＢＳＡを含むＰＢＳ中１００μｍ当たり１分間に２ｘｌＯ’のトリクロル酢酸で沈澱し得られる崩壊まで希釈された４５１−標識ヤギ抗−マウスＩｇ）１００μ ｍを各ウェルに混合した。そのように生成させた標識化免疫反応混合液を回転台に４℃で４時間維持した。次いでウェルを上記のように５ＰＲＩＡバツフアーで洗浄し、生成した＋２ｆｉｌ−標識固相免疫反応生成物の量をγカウンターでめた。

！１ｔＡＢ　Ａ１４がＡｐｏ　Ａｌ／ＨＤＬと免疫反応する能力をＡｐｏ　Ａｌ／ＨＤＬと拮抗剤として種々の合成ペプチドを用いることにより上記ＲＩＡにおいて比較した。この研究の結果を図３に示す。Ｂ／Ｂｏは、増加濃度の競合に対してプロツルた修正ＣＰＭをμｇ／ｍｌとして示す。Ｂ／Ｂｏ値は、次式でめられる：（拮抗剤試料ＣＰＭ　−０％　ＣＰＭ）（１００％ＣＰＭ　−０％ＣＰＭ）式中０％ＣＰＭは、ＲＩＡで得られたＣＰＭに基づ（非特異的バックグラウンドの測定値であり、ここでＡｐｏ　Ａｌ／ＨＤＬで被覆したウェルは、第１抗体と拮抗剤を存在させずに標識化第２抗体と反応させる、また１００％ＣＰＭは、ウェルに被覆した基質に対する第１抗体の最大非競合結合の測定値である。拮抗剤が第１抗体に結合する効率が高くなるにつれてＢ／Ｂｏ値は低くなる。図３におけるアッセイ結果は、Ａｐｏ　Ａｌ／ＨＤＬ−被覆ウェルに結合するＡｌ−４ＭＡＲの方がＡｌ９９−１２１又はＡｐｏ　Ａｌ／ＨＤＬ自体より良好な拮抗剤テアルコトヲ示す。ペプチドＡｌ９Ｏ−１１１，Ａ１９３−１１１及びＡｌ９６− １１１は、競合アッセイにおいて無効であり、従ってＡｌ−４ＭＡＢと免疫反応しない。

ここに記載される競合ＲＩＡにおいてＡｌ−４１ｉ！ＡＢと免疫反応する能力について他のベブチ］・を評価した。ペプチドＡ１９４−１１４及びＡｌ９９−１１４は、一部反応性を示した。

ペプｆ　ｌ’Ａｌ７９−９５　、Ａ１６８−１０５、Ａ［７４−１０５、Ａｌ８７−１０５、Ａｌ８７−１１１．　Ａｌ９Ｏ−１０５、ＡｌX３ −１０１、Ａ１９５−１０５、Ａ１９６−１０１、Ａ１０Ｏ−１０５、Ａｌ０Ｉ −１１１，Ａ１１０５−１１６及びＡｌ１１５−１２６は、Ａｌ−４ＭＡＲと反応しなかった。

を記競合ＲＩＡに従ってＭＡＲＡｌ−４と免疫反応するＡｐｏ　Ａｌポリペプチドは、図４にまとめられる。ＭＡＢ　Ａｌ−４によって定義される保存未変性エピトープは、ペプチドＡｌ９９−１１．１がＭＡＲＡｌ−４と免疫反応したので最小限位置９９−１１４のアミノ酸残基を含む。

しかしながら、Ａｐｏ　Ａｌ／ＨＤＬとほぼ同様にＭＡＲＡｌ−４と免疫反応したＡｌ９９−１２１は、ＡｐｏＡＩの好ましいエピトープを定義することを示す。診［ｒＥＬＩＳＡ又はＲＩＡに有用な特に好ましいポリペプチドは、ペプチドＡｌ９４−１２５である。

残基位置１０４の通常の残基Ｆの代わりにＥを有するペプチドＡｌ９９−１２１を調製し、ＭＡＲＡｌ−４と免疫反応することを示した。従って、位置＋０４にＥ又はＦを有す６ＭＡＲＡｌ−４によって定義されるＡｐｏ　Ａｌペプチドは、ＭＡＲＡｌ−４と免疫反応し、ＭＡＲＡｌ−４と共に用いた場合診断方法に有効である。

Ｂ、ＭＡＲＡｌ−１１米麦ｔ［Ｊｐｏ　Ａｌ／ＨＤＬのＩＭＡＢ　Ａｌ−１１及び種々の合成ポリペプチドの免疫反応性を実施例＋ＯＡで記載した競合ＲＩＡによって試験した。これらのアッセイの結果を図５に示す。ペプチドＡｌ９６−１１１、Ａｌ９Ｏ−１１１及びＡｌ９３−１１１は、Ａｐｏ　Ａｌ／ＨＤＬに結合するＡＩ−ＩＩ　ＭＡＲの競合阻害剤であるが未変性タンパク質自体より有効ではない。ペプチド刀９９−１２１は、Ａｌ−１１ＭＡＲに結合しない。競合ＲＩＡにおいてＡｌ−１１ＭＡＲ免疫反応する能力について他のペプチドを評価した。ペプチドＡｌ８４− １１１．　Ａｌ９４−Ｉｌｌ及びＡｔ９４−１２５を上記競合ＲＩＡで試験し、これらもまたＭＡＲＡｌ−１１とＡｐｏ　Ａｌ／ＨＤＬとの免疫反応性を阻害した。ペプチドＡｌ７９−９５　、Ａｒ８７−１０５、Ａ１８７−皿位置１０４１７）Ｆ残基の代わりにＥを有する）　、Ａ１９Ｏ−１０５、Ａｌ９３−１０１．　Ａ１９５−１０５、Ａｌ９６−１０１．　Ａｌ９９−１２１、Ａｌ１０Ｏ−１０５、Ａｌｌ０Ｉ−１１１、Ａｌ１０５−１１．６　及ヒＡ１１１５−１２６は、Ａｌ−１１ＭＡＲと免疫反応しない。

上記競合ＲＩＡに従ってＭＡＲＡｌ−１１と免疫反応するＡｐｏ　Ａｌポリペプチドは、図６にまとめられる。ＭＡＲＡＩ−１１によって定義される保存未変性エピトープは、ペプチドＡｌ９６−１１１が！ｉ！ＡＢ　Ａｌ−１１と免疫反応したので、位置９６−ＩＩＩのアミノ酸残基を含む。

免疫反応性を実施例１０Ａのように行われる競合ＲＩＡによって試験した。結果は、ＭＡＲＡＩ−１８がペプチドＡ１９Ｏ−１０５、Ａｌ９Ｏ−１１１，Ａｌ８７（０５及びＡｌ９５−１０５）免疫反応性と同等であることを示す。更に、！ｉ！ＡＢＡ＋−１８のＡｌ９５−１０５、Ａｌ９５−１０５（〜Ｐ）及ヒＡｌ９５−１０５（Ｇ／Ｐ）に対する比較がら、位置９９のプロＩルの存在がＭＡＲＡＩ−１８によって確認される保存Ａｐｏ　Ａｒ−エピトープのペプチドによる発現に必要であることを示す。

Ｉｌ、　Ａｐｏ＾Ｉ特異抗体によるＬＣＡＴ−仲介コレスチロールエステル化の阻害レシチン、ｌ４−Ｃ−コレステロール及びＡｐｏ　Ａｌを含むプロテオリポソームを下記の方法で調製した。ホスファチジルコリン（卵黄レシチン）７．７ ■を１３ｘｌＯＱのガラス試験管で窒素ガスの下で乾燥した。エタノール中１■ ／ｍｌ溶液のコレステロール１１６μｇと比活性０．０４ｍＣ１／ｍｌを有するベンゼン中０．２９■／ｍｌのｌ４−Ｃ−コレステロール７８．３μｇを同じ試験管で乾燥レシチンと接触しないように乾燥した。この試験管にＴｒｉｓ　ＨＣＩバッファー（１０ｍｌＪ　Ｔｒｉｓ、　１４０酬ＮａＣ１，ｌＩ［＃１ｌＥＤＴＡ−四ナトリウム塩、ｐＨ７，２）中胆汁酸ナトリウムの７２５酬溶液９．３ｍｌ　、Ｔｒｉｓ　ＨＣＩバッファ　−２，５ｍｌ及びＴｒｉｓ　ＨＣＩバッファー中精製Ａｐｏ　Ａｌの１■／ｍｌ溶液０．８ｍｌを加えた。この混合液を６０秒攪拌した後、室温で１時間回転ホイールで混合した。この混合液を５回交換したＴｒｉｓ　ＨＣＩバッファー５００ｎ＋ｌに一晩透析した。透析後、プロテオリポソームを容量４ｍｌに調整し、冷蔵庫で貯蔵した。プロテオリポソーム４ｍｌは、９．７８ＸＩＯ−’モルレシチン、３．０ｘｌＯ−’モルコレステロール、２．０１ｘｌＯ−’モルｌ４−Ｃ−：］コレステロールび３．１４ＸＩＯ− ’モルＡｐｏ　Ａｌを含有した。レシチン：コレステロール：　Ａｐｏ　Ａｌのモル比は２５０・１２．５・０．８であった。

抗−Ａｐｏ　へｌ抗体を用いるエステル化を含むＬＣＡＴ−仲介コレスチロールエステル化アッセイは、２回ずつ行った。ねじ蓋付きガラス管にプロテオリポソーム調製溶液１００７ｄ　、Ｔｒｉｓ　ＨＣＩバッファー中ヒト血清アルブミンの２％溶液１２５μｌ　、　１５．６〜５００μｇ／管量のモノクローナル抗体及びＴｒｉｓ　ＨＣＩバッファーを最終容量４５５μｍまで加えた。管の蓋を閉め、攪拌し、３７℃水浴中で３０分間維持した。ＬＣＡＴ源としてＴｒｉｓ　ＨＣＩバッファー中メルカプトエタノール１００ｍ溶液２５μｍとリポタンパク質除去血漿（ＬＰＤＰ１３０μｍを管に加えた。再び管の蓋を閉め、撹拌し、３７ ℃水浴中で３０分間維持した後、１タノ一ル２ｍｌを加えて酵素反応を停止させた。アッセイ用対照には、ＬＰＤＰを含む２本ずつの管とＬＰＤＰを含むが抗体を含まない２本ずつの管を含め、これは１００％エステル化を生じるであろう。

コレステロール１６μｇ／ｍｌ及びリノール酸コレステリル１６μｇ／ｍ　ｌを含むヘキサン５ｍｌを各々の管に加えてコレステロールとコレステロールエステルを反応物から抽出した。混合液を２０秒間攪拌し、上層を１３Ｘ１００のガラス管に取り出した。元の反応混合液にヘキサン／コレステロール／リノール酸コレステリル３ｍｌを更に加えた。この混合液を攪拌し、上層を取り出し、最初の抽出液に加えた。両方の抽出液の内容物を窒素ガスの下で乾燥するか又は−晩蒸発させた。

抽出物質を含む管の内容物をクロロホルム５０μｍに溶解し、Ｂ＋ｎｐｏｒｅ博層クロマトグラフィーシート（ＴＬＣ）にスポットした。管を更に５０μｌですすぎ、最初のスポットに加えた。ＴＬＣシートをヘキサン：エチルエーテル比６０：４０の溶媒で展開させた。シートを風乾し、ヨウ素と反応させてスポットを可視化させた。次いでシートをＫｏｄａｋ　Ｘ−（ｍＴネオ−ラジオグラフィーに一晩入れた。フィルムの放射性シグナルに対応するＴＬＣシートの領域を切断し、シンチラント（トルエン中ＰＰＤ−ＰＤＰＤＰ）３ｍｌを含むシンチレーションバイアルにいれた。１４−Ｃ放射性標識をβカウンターで検出した。分数のエステル化割合（ＦＢＲ）をシンチレーションカウントからめ、ここでＦＥＲはコレステロールとコレステリルエステルｃｐｍに関するコレステリルＣｐＨ１として表される。

５種のモノクローナル抗体、Ａｌ−４、Ａｌ−９、Ａｌ−１１、Ａｌ−１６及びＡｌ−１８をコレステロールエステル化を阻害する能力について試験したＬＣＡＴ−仲介コレスチロールエステル化アッセイの結果を図７に示す。

精製ＭＡＲＡｌ−４及びＡｌ−１１を実施例６Ｃに記載されるように調製した。

精製ＭＡＲＡＩ−９、Ａｌ−１６及びＡｌ−１８は、実施例６Ｃに記載される方法と同様にＡｐｏ　Ａｔ／ＨＤＬで免疫化したマウスの牌細胞の融合から生成した。１．ｃＡＴ−仲介コレスチロールエステル化アッセイにおける対照ＭＡＲとしてＭＡＲＡｌ−９及びＡｌ−１６を使用し、これらは、各々ＣＮＢｒ４及びＡｐｏ　Ａｌアミノ酸残基配列Ａｌ１−５と免疫反応することが既知である。

ＭＡＲＡｌ−１８は、Ａｐｏ　Ａｌアミノ酸残基配列Ａｌ９５−１０５と免疫反応する。

このアッセイにおいて、各抗体２５０μｇを評価した。この量において、抗体とＡｐｏ　Ａｌは等モル濃度とした。各モノクローナル抗体のデータは、対照の％として表され、ここで対照は、抗体を存在させないがＬＰＤＰを存在させるＦＥＲである。結果として対照ＦＩＥＲの範囲は、０．０６２６〜０．０９４８／時間である。各々の棒線は、２実験からのデータを示し、各実験は、２回ずつ行われる。モノクローナル抗体Ａｌ−１１は、コレステロールエステル化の最も効果的な阻害剤であり、次がＡｌ−４であった。

モノクローナル抗体Ａｌ−１６０及びＡｌ−１８は、同量でエステル化を阻害した。モノクローナルＡｌ−９は、コレステロールエステル化を阻止するのに無効であった。

ＬＣＡＴ仲介コレステロールエステル化の抗体阻害の度合いが各抗体がプロテオリポソームのＡｐｏ　Ａｔに結合することができる度合いの反映であるかどうかを決定するために、我々は抗体結合の程度を試験した。これは、ＬＣＡＴ活性化活性ノアイ（実施例比Ａ）で用いたものと同じ組成を有する放射能標識プロテオリポソームを用いて二重抗体液相ラジオイムノアッセイにおいて測定した。

液相イムノアッセイは、ＬＣＡＴアッセイの抗体／抗原相互作用の条件を再現するように計画した。Ａｐｏ　Ａｌ４８μｇ７ｍｌ及び約３００．０ＯＱＣ９１１１／管を含むプロテオリポソームを４倍モル過剰量の各抗体及びＩ！％ＩＳＡと３７℃で３０分間インキュベートした。メルカプトエタノールとＬＰＤＰを加えて更に３７℃で１時間インキュベートした。抗体結合の程度は、更にＴａｃｈｉｓｏｒｂ　Ｍ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、　ＣＡ）２ｍｌと振盪台上で室温において６０分間インキュベートシて沈澱させることにより評価した。次いで管を１５００ｘｇで２０分間遠心した。上清を吸引し、沈降物を冷ＰＢＳ　１ａ＋１と洗浄し、再遠心した。沈降物の放射能をｌ５ｏ−Ｄａｔａ　２０／２０シリーズγカウンターで計数した。非特異的結合をＴａｃｈｉｓｏｒｂ　Ｍにのみ反応させた試料で評価し、全ての場合に１０％以下であった。データはＢ／Ｂｏ比として表され、ここでＢＯは非特異的結合が少ないＴＡＣ沈澱可能ｃｐｍ（全Ｃｐｆｆｌの９０−１００％）であり、Ｂは非特異的結合が少ない抗体の存在下で結合したＣｐＨ１である。データを図８に示す。

図８ではＬＣＡＴアッセイに正確に似せた条件下で４倍モル過剰量の抗体によるプロテオリポソームの結合の程度（Ｂ／Ｂｏとして示される）を４倍モル過剰量の抗体によるＬＣＡＴ活性化の阻害の程度（阻害にとして示される）と比較される。結合度とＬＣＡＴ阻害度との直接の関係は、抗体Ａｌ−１１、Ａｌ−４及びＡｌ−１８で明らかである。

しかしながら、この関係は抗体Ａｌ−１６、Ａｌ−９及びＡｌ−１０では見られず、ここでプロテオリポソームに対する抗体結合は、ＬＣＡＴ−仲介コレスチロールエステル化の阻害より著しく増加した。これらの結果は、ＬＣＡＴのＡｐｏ　ＡＩ活性化の抗体阻害が全ての抗体ではないがいくつかの、即ちＡｌ−４、Ａｌ−１１及びＡｌ−１８に特異的であることを示した。おもしろいことに、抗体Ａｌ−４、Ａｌ−１１及びＡｌ−１８の場合、ＬＣＡＴはプロテオリポソームに対する結合より著しく増加した。

まとめると、これらのデータから、ＭＡＲ＾Ｉ−４及び鵬Ｂ　Ａｌ−１８特にＭＡＢ＾ｌ−１１によって確認されるＡｐｏ　Ａｌエピトープは、Ａｐｏ　Ａ１分子の一部がらなり、Ａｐｏ　ＡＴが通常コレステロールのエステル化を増加する方法にこれが関係することを示す。従ってＭＡＲＡｌ−４、ＭＡＢ　Ａ１１８又はＭＡＢ　Ａｌ−１１によって定義されるエピトープに免疫学的によく似ているポリペプチドは、コレステロールのエステル化を増加させる能力においてＡｐｏ　Ａｌの類縁体として機能する有効なＡｐｏ　Ａｌポリペプチドを示す。

即ち、本発明のＡｐｏ　Ａｌポリペプチドは、コレステロールエステル化を増加させるＡｐｏ　Ａｌ自体と同様に使用することができる。

特定の実施態様及び実施例を含む上記明細書は、本発明を具体的に説明するものであり、限定するものではない。本発明の真の精神及び範囲を逸脱することなく他の多くの変更や修正を行うことができる。

サ光学濃度　４９００、：５　１．０　３．０　１０　３０　１００　３００ｔｒｄｌ　（ｌＬｑ／ｍ１）ＦＩＧ、　５ ■Ｉ−コレステロールエステル化国際調査報告ＰＣＴ／ｕｓ９１／の４のコ８＾ｔｔａｃｈｍｅｎｔ　＾　＋ｃｏｎｔｘｎｕｍｔｚａｎ　Ｏｆ　Ｐａｒｔ　ＶＩ＋ＶＬ　０ＢＳＥＲＶＡＴＩＯＮＳ　ＷＨＥＲＥ　ＵＮＩＴＹ　ＯＦ　ＩＮＶＥＮＴＩＯＮ　Ｉｓ　ＬＡＣＫＩＮＧｌ、＋ｃａｎｔｉｎｕｅｄ＋フロントページの続き（５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号／／　Ｃ０７Ｋ　９９：００（７２）発明者　バンカ　キャロル　エルアメリカ合衆国　カリフォルニア州９２１３１　サン　ディエゴ　ピノ　ノワールサークル　１０８８１Ｉ（７２）発明者　ポネット　ディヴイッド　ジェイアメリカ合衆国　カリフォルニア州９２０６４　ボーウェイ　ウッドハロー　レーン１４１７７（７２）発明者　スミス　リチャード　ニスアメリカ合衆国　カリフォルニア州９２０１４　デル　マー　ヴイア　ドナーダ

Claims

【特許請求の範囲】１．６０個以下のアミノ酸残基からなり、式：ＫＶＱＰＹＬＤＤＦＱＫＫＷＱＥＥ、ここで該ポリペプチドはホモセリンラクトンを含まない、によって示されるアミノ酸残基配列を含むＡｐｏ　ＡＩポリペプチド。２．該ポリペプチドが【配列があります】及び【配列があります】からなる群から選択される式によって示されるアミノ酸残基配列を有する請求項１記載のポリペプチド。３．約６０個以下のアミノ酸残基からなり、式：ＰＹＬＤＤＸＱＫＫＷＱＥＥＭＥＬ、ここでＸはＥ又はＦである、によって示されるアミノ酸残基配列を含むＡｐｏ　ＡＩポリペプチド。４．該ポリペプチドが式：ＰＹＬＤＤＸＱＫＫＷＱＥＥＭＥＬＹＲＱＫＶＥＰによって示されるアミノ酸残基配列を含む請求項３記載のＡｐｏ　ＡＩポリペプチド。５．該ポリペプチドが【配列があります】及び【配列があります】からなる群から選択される式によって示されるアミノ酸残基配列を有する請求項３記載のポリペプチド。６．少なくとも１つのアッセイを行うのに十分な量のＡｐｏ　ＡＩポリペプチドを含むキット形態の診断システムにおいて、該ポリペプチドが、６０個以下のアミノ酸残基からなり、式：ＫＶＱＰＹＬＤＤＦＱＫＫＷＱＥＥ、ここで該ポリペプチドはホモセリンラクトンを含まない、によって示されるアミノ酸残基配列を含む診断システム。７．該ポリペプチドが【配列があります】及び【配列があります】からなる群から選択される式によって示されるアミノ酸残基配列を有する請求項６記載の診断システム。８．該ポリペプチドが固体マトリックスに操作的に結合されている請求項６記載の診断システム。９．更に少なくとも１つのアッセイを行うのに十分な量の抗体を含み、該抗体が、（ａ）Ａｐｏ　ＡＩ／ＨＤＬ、（ｂ）単離Ａｐｏ　ＡＩ、（ｃ）Ａｐｏ　ＡＩ　ＣＮＢｒ２及び（ｄ）ポリペプチドＫＶＱＰＹＬＤＤＦＱＫＫＱＥＥと免疫反応するが、（ｅ）Ａｐｏ　ＡＩ　ＣＮＢｒ１、（ｆ）Ａｐｏ　ＡＩ　ＣＮＢｒ３及び（ｇ）ポリペプチドＳＫＤＬＥＥＶＫＡＫＶＱＰＹＬＤＤＥＱＫＫＷＱＥＥ、（ｈ）ポリペプチドＳＫＤＬＥＥＶＫＡＫＶＱＰＹＬＤＤＦＱ及び（ｉ）ポリペプチドＰＹＬＤＤＦＱＫＫＷＱＥＥＭＥＬＹＲＱＫＶＥＰと免疫反応しない抗−Ａｐｏ　ＡＩ抗体分子を含む請求項６記載の診断システム。１０．該抗体分子がＡＴＣＣＨＢ９２０１を有するハイブリドーマによって産生されたものである請求項９記載の診断システム。１１．少なくとも１つのアッセイを行うのに十分な量のＡｐｏ　ＡＩポリペプチドを含み、該ポリペプチドが、約６０個以下のアミノ酸残基からなり、式：ＰＹＬＤＤＸＱＫＫＷＱＥＥＭＥＬ、ここでＸはＥ又はＦである、によって示されるアミノ酸残基配列を含む、キット形態の診断システム。１２．該ポリペプチドが【配列があります】及び【配列があります】からなる群から選択される式によって示されるアミノ酸残基配列を有する請求項１１記載の診断システム。１３．該ポリペプチドが固体マトリックスに操作的に結合されている請求項６記載の診断システム。１４．更に少なくとも１つのアッセイを行うのに十分な量の抗体を含み、該抗体が、（ａ）Ａｐｏ　ＡＩ／ＨＤＬ、（ｂ）単離Ａｐｏ　ＡＩ、（ｃ）Ａｐｏ　ＡＩ　ＣＮＢｒ２−ＣＮＢｒ３及び（ｄ）ポリペプチドＰＹＬＤＤＦＱＫＫＷＱＥＥＭＥＬと免疫反応するが、（ｅ）Ａｐｏ　ＡＩ　ＣＮＢｒ１、（ｆ）ポリペプチドＳＫＤＬＥＥＶＫＡＫＶＱＰＹＬＤＤＦＱＫＫＷＱＥＥ、（ｇ）ポリペプチドＬＥＥＶＫＡＫＶＱＰＹＬＤＤＦＱＫＫＷＱＥＥ及び（ｈ）ポリペプチドＹＲＱＫＶＥＰＬＲＡＥＬと免疫反応しない抗−Ａｐｏ　ＡＩ抗体分子を含む請求項１１記載の診断システム。１５．該抗体分子がＡＴＣＣＨＢ８７４４を有するハイブリドーマによって産生されたものである請求項９記載の診断システム。１６．（ａ）血液試料を（ｉ）（１）Ａｐｏ　ＡＩ／ＨＤＬ、（２）単離Ａｐｏ　ＡＩ、（３）Ａｐｏ　ＡＩ　ＣＮＢｒ２及び（４）ペプチドＫＶＱＰＹＬＤＤＦＱＫＫＷＱＥＥと免疫反応するが、（５）Ａｐｏ　ＡＩ　ＣＮＢｒ１、（６）Ａｐｏ　ＡＩ　ＣＮＢｒ３、（７）ポリペプチドＳＫＤＬＥＥＶＫＡＫＶＱＰＹＬＤＤＥＱＫＫＷＱＥＥ、（８）ポリペプチドＳＫＤＬＥＥＶＫＡＫＶＱＰＹＬＤＤＦＱ及び（９）ポリペプチドＰＹＬＤＤＦＱＫＫＷＱＥＥＭＥＬＹＲＱＫＶＥＰと免疫反応しない抗体分子を含む抗−Ａｐｏ　ＡＩ抗体及び（ｉｉ）６０個以下のアミノ酸残基からなり、式：ＫＶＱＰＹＬＤＤＦＱＫＫＷＱＥＥによって示されるアミノ酸残基配列を含み、免疫反応混合物が液相及び固相の両方を有するように該ポリペプチドが固体マトリックスに操作的に結合されるＡｐｏ　ＡＩポリペプチドと混合することによって免疫反応混合物を生成させ、（ｂ）固相中にＡｐｏ　ＡＩ含有免疫反応生成物を生成させるのに十分な時間該免疫反応混合物を維持し、（ｃ）工程（ｂ）で生成した生成物の量を求める工程からなる血液試料中のＡｐｏ　ＡＩ量をアッセイする方法。１７．該Ａｐｏ　ＡＩポリペプチドが【配列があります】及び【配列があります】からなる群から選択される式によって示されるアミノ酸残基配列を有する請求項１６記載の方法。１８．該抗体分子がＡＴＣＣ呼称ＨＢ９２０１を有するハイブリドーマによって産生される請求項１６記載の方法。１９．（ａ）血液試料を（ｉ）（１）Ａｐｏ　ＡＩ／ＨＤＬ、（２）単離Ａｐｏ　ＡＩ、（３）Ａｐｏ　ＡＩ　ＣＮＢｒ２−ＣＮＢｒ３及び（４）ペプチドＰＹＬＤＤＦＱＫＫＷＱＥＥＭＥＬと免疫反応するが、（５）Ａｐｏ　ＡＩ　ＣＮＢｒ１、（６）ポリペプチドＳＫＤＬＥＥＶＫＡＫＶＱＰＹＬＤＤＦＱＫＫＷＱＥＥ、（７）ポリペプチドＬＥＥＶＫＡＫＶＱＰＹＬＤＤＦＱＫＫＷＱＥＥ及び（８）ポリペプチドＹＲＱＫＶＥＰＬＲＡＥＬと免疫反応しない抗体分子を含む抗−Ａｐｏ　ＡＩ抗体及び（ｉｉ）６０個以下のアミノ酸残基からなり、式：ＰＹＬＤＤＸＱＫＫＷＱＥＥＭＥＬによって示されるアミノ酸残基配列を含み、免疫反応混合物が液相及び固相の両方を有するように該ポリペプチドが固体マトリックスに操作的に結合されているＡｐｏ　ＡＩポリペプチドと混合することによって免疫反応混合物を生成させ、（ｂ）固相中にＡｐｏ　ＡＩ含有免疫反応生成物を先成させるのに十分な時間該免疫反応混合物を維持し、（ｃ）工程（ｂ）で生成した生成物の量を求める工程からなる血液試料中のＡｐｏ　ＡＩ量をアッセイする方法。２０．該Ａｐｏ　ＡＩポリペプチドが【配列があります】及び【配列があります】からなる群から選択される式によって示されるアミノ酸残基配列を有する請求項１９記載の方法。２１．該抗体分子がＡＴＣＣＨＢ８７４４のハイブリドーマによって産生されたものである請求項１９記載の方法。２２．患者におけるエステル化コレステロールの増加方法であって６０個以下のアミノ酸残基からなり、式：ＫＶＱＰＹＬＤＤＦＱＫＫＷＱＥＥによって示されるアミノ酸残基配列を含むＡｐｏ　ＡＩポリペプチドのエステル化コレステロール増加量を該患者に投与することからなる方法。２３．該Ａｐｏ　ＡＩポリペプチドが【配列があります】及び【配列があります】からなる群から選択される式によって示されるアミノ酸残基配列を有する請求項２２記載の方法。２４．患者におけるエステル化コレステロールの増加方法であって、６０個以下のアミノ酸残基からなり、式：ＰＹＬＤＤＸＱＫＫＷＱＥＥＭＥＬ、ここでＸはＥ又はＦである、によって示されるアミノ酸残基配列を含むＡｐｏ　ＡＩポリペプチドのエステル化コレステロール増加量を該患者に投与することからなる方法。２５．該ポリペプチドが【配列があります】及び【配列があります】からなる群から選択される式によって示されるアミノ酸残基配列を有する請求項２４記載の方法。２６．患者におけるエステル化コレステロールの増加方法であって、４０個以下のアミノ酸残基からなり、式：ＡＫＶＱＰＹＬＤＤＦＱによって示されるアミノ酸残基配列を含むＡｐｏ　ＡＩポリペプチドのエステル化コレステロール増加量を該患者に投与することからなる方法。２７．該ポリペプチドが【配列があります】及び【配列があります】からなる群から選択される式によって示されるアミノ酸残基配列を有する請求項２６記載の方法。