JPH03133395A - ヒト免疫不全ウイルスに対するモノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の原因と
考えられているヒト免疫不全ウィルス（以下、ＨＩＶと
略記する。）のｅｎｖｉ白質の保存領域における特定の
アミノ酸配列部分に対応する合成ペプチド（以下、「合
成ペプチドｊと略記することもある。）からなる免疫原
（以下、「合成ペプチド免疫原１と略記することもある
。

）をＨＩＶの代わりにマウスに免疫して得たハイブリド
ーマ株が産生する、ＨＩＶ惑染の診断に有効なＩｇＧ型
モノクローナル抗体に関するものである。

［従来の技術〕 ヒトがＨＩＶに感染しているか否かの診断は、一般に、
不活化ＨＩＶ　（完全に不活化されていれば、安全性の
面で不安はないが。）を抗原に用いたＥＬｒＳＡや粒子
凝集法（Ｐａｒｔｉｃｌｅ　ａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏ
ｎ法）などで、その不活化ＨＩＶに対する抗体量を検討
することによって行われている。

しかし、これらの方法では、ＨＩＶの感染時期によって
は診断できない場合があり〔例えば、感染初期（ＨＩＶ
が感染していても、ＨＩＶに対する抗体が産生されてい
ない時期）の診断は不可能である。）、ＨＩＶ抗体陰性
輸液の輸血を行ったにもかかわらず、抗体陽転化した患
者が見出された例がある。また、診断できる時期であっ
ても偽陽性、偽陰性などの誤った診断結果を得る場合が
ある（Ｎａｔｕｒｅ、　３１２　、５８３（１９８４）
　）。

そのような例としては、例えば、診断に用いる不活化Ｈ
ＩＶを得るとき、には、どうしてもＨＩＶに特異的な抗
原以外の不純物も含まれるので（ヒト由来の培養細胞を
用いて製造するために、組織適合性抗原などの他の細胞
にも共通して存在して除去できない抗原を含有する。）
、その不純物含有ＨｒＶと自己免疫疾患患者の抗体とが
反応したり、あるいは被検血清を適度に希釈せずに用い
た場合には抗体が非特異的に吸着したりして、偽陽性と
なる。

従って、安全性と診断結果の信頼性の上がらも、不活化
ＨＩＶに代わる抗原の使用が望まれている。

そこで、ＨＩＶ感染初期でもその感染をより正確に診断
するためには、ＨＩＶの構造の保存性が非常に高い領域
に対して特異性が高い抗体を用いてＨＴＶ感染患者にお
けるＨＩＶの量を検討できる方法でなければならない。

これまでに、ＨＩＶのｅｎｖ蛋白質の、、４１とｇｐ１
６０とに反応性を有するモノクローナル抗体（Ｖｉｒｏ
ｌｏｇｙ、皿、２０９〜２１５（１９８８）　）が知ら
れているが、このモノクローナル抗体はマウス製１ｇＭ
抗体であるので、診断に用いる抗体としては、さらに安
定性がよく、精製が容易であり、かつ標識抗体の作製が
容易なＩｇＧ型抗体の利用が望まれていた。

〔発明が解決すべき問題点〕

本発明の目的は、不活化ＨｒＶに代わる優れた抗原とし
てＨＩＶのｅｎｖ蛋白質の保存領域における特定のアミ
ノ酸配列部分に対応する合成ペプチド（ｒ合成ペプチド
Ｊ）からなる免疫原（ｒ合成ペプチド免疫原」）を不活
化ＨＩＶＯ代わりにマウスに免疫して得られたハイブリ
ドーマ株を用いて、ＨｒＶに対して特異的反応性を有し
、安定性がよく、精製が容易であり、かつ標識抗体の作
製が容易なＩｇＧ型モノクローナル抗体を提供すること
である。

Ｃ問題点を解決するための手段〕 本発明者らは、前記の問題点を解決するために鋭意研究
した結果、ｒ合成ペプチド免疫原Ｊを不活化ＨＩＶＯ代
わりにマウスに免疫して得たマウスリンパ球とマウスミ
エローマ細胞との細胞融合によって得られたハイブリド
ーマ株が、ＨＩＶに対して特異的反応性を有し、安定性
がよく、精製が容易であり、かつ標識抗体の作製が容易
なＩｇＧ型モノクローナル抗体を生産できることを見出
し、本発明を完成するに至った。

即ち、本発明は、 （１）次式： ％式％ （式中、ＸはＨ，ＣｙｓまたはＣｙｓ−Ｇｌｙを（式中
、ＸはＨ，ＣｙｓまたはＧｌｙ−Ｃｙｓを表す。） で示されるｒ合成ペプチドｊからなる免疫原をマウスに
免疫して得たマウスリンパ球とマウスミエローマ細胞と
の細胞融合によって得られたハイフリドーマ株が産生し
た、１合成ペプチドＪ、Ｈ１■のｅｎｖ蛋白質のｇｐ４
１およびＨｒＶのｅｎＶ蛋白質のｇｐ１６０のいずれと
も特異的反応性を有するＩｇＧ型モノクローナル抗体 （２）前記のハイブリドーマ株 に関するものである。

以下、本発明の詳細な説明する。

本発明で使用する「合成ペプチド」としては、ＨＩＶの
ｅｎｖ蛋白質の保存領域における特定のアミノ酸配列部
分に対応した合成ペプチド（例えば、ｇ−ｒ１６０のア
ミノ末端から７３２〜７５０番目のＬ体のアミノ酸配列
に対応した合成ペプチド）、その合成ペプチドのいずれ
か一方の末端〔アミン末端（Ｎ末端）またはカルボキシ
ル末端（Ｃ末端）〕にＣｙｓまたはＣｙｓ−Ｇｌｙをペ
プチド結合によって連結したＬ体のアミノ酸配列からな
る合成ペプチド、即ち、 Ｘ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ
−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−１ｉｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−
Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒ　ｇ−Ａｓ　ｐ−Ａｒ　
ｇ−Ａｓ　ｐ　−Ｙ（式中、ＸはＨ，ＣｙｓまたはＣｙ
ｓ−Ｃ；ｌｙを（式中、ＸはＨ，ＣｙｓまたはＧｌｙ−
Ｃｙｓを表す、、） で示されるＬ体のアミノ酸配列を有する合成ペプチド を挙げることができるが、好ましくは、Ａｒｇ−Ｇｌｙ
−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−ＡｒｇＰｒｏ−ＧＩｕ−Ｇｌｙ−１
１ｅ−ＧｌｕＧｌｕ−Ｇｌｕ−ｃｔｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ
Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｃ；１ｙＣｙｓ　（
Ｃ末端側） がよい。

ｒ合成ペプチドＪの作製は、液相法または固相法などの
通常の方法によって行うことができるが、好ましくは、
固相法によってポリマー性の固相支持体へ、前記ペプチ
ドのＣ末端側からそのアミノ酸残基に対応したＬ体のア
ミノ酸を順次ペプチド結合によって結合して行くのが良
い。

そして、そのようにして得られた「合成ペプチド１は、
トリフルオロメタンスルホン酸（以下、ＴＦＭＳＡと略
記する。）、フッ化水素などを用いてポリマー性の固相
支持体からの切断とアミノ酸側鎖の保護基の除去とを行
い、逆相系などのカラムを用いた高速液体クロマトグラ
フィー（ＨＰＬＣ）を用いた通常の方法で精製すること
ができる。そして、そのｒ合成ペプチド」のアミノ酸配
列は、そのアミノ酸配列の分析によって確認することが
できる。

本発明で使用するマウスに免疫することができるｒ合成
ペプチド免疫原」としては、前記のようにして合成して
得られた「合成ペプチドＪ　（以下、ｒペプチド免疫原
」と略記することもある。）、またはそのｒペプチド免
疫原ｊと高分子担体との結合物（ｒ高分子・ペプチド免
疫原Ｊ）を用いることができる。

ｒ高分子・ペプチド免疫原」の作製における高分子担体
としては、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヤギ血清ア
ルブミン（ＧＳＡ）、卵白アルブミン（ＯＶＡ）、陣笠
具ヘモシアニン（ＫＬＨ）、γ−グロブリンなどの高分
子蛋白質、ポリＬ−リジン（ＰＬＬ）などのようなポリ
アミノ酸、多ｔＵｔなどを挙げることが出来る。そして
、「ペプチド免疫原」と高分子蛋白質との結合は、「合
成ペプチド１と前記のいずれかの高分子蛋白質を１−エ
チル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイ
ミド塩酸塩（以下、ＥＤＰＣｌｉす）、１−シクロへキ
シル−３−（２−モルホリノエチル）カルボジイミドメ
ト−Ｐ−）ルエンスルホン酸塩（以下、ＣＭ　Ｅ　Ｃと
略す）などを用いて結合することによって行うことがで
きるし、あるいは、ｒペプチド免疫原」のいずれか一方
の末端（Ｎ末端またはＣ末端）のＣｙｓ残基のＳＨ基を
利用して、ｍ−マレイミド安息香酸−（Ｎ−ヒドロキシ
コハク酸イミドエステル）（以下、ＭＢＳと略す。）、
Ｎ−コハク酸イミジル−３−（２ピリジルジチオ）プロ
ピオネート（以下、５ＰＤＰと略す。）などの２官能性
架橋試薬を用いて、分子量１万以上の担体（例えば、Ｂ
ＳＡ、ＯＶＡ、ＫＬＨなどのような蛋白質、およびＰＬ
Ｌなとのようなポリアミノ酸が好ましい。）と結合する
ことによって作製することができる。

このようにして得られたｒ高分子・ペプチド免疫原１は
、これをそのまま本発明におけるｒ合成ペプチド免疫原
」として用いることもできるが、ｒ合成ペプチド」　（
ペプチド免疫原）に対して特異性が高いモノクロナル抗
体産生ハイブリドーマを得るためには、５ｅｐｈａｄｅ
ｘ、５ｅｐｈａｃｒｙｌなどを用いたゲル濾過によって
精製されたｒ合成ペプチド免疫原ｊを用いてもよい。

ｒ合成ペプチド免疫原Ｊ　　（１’ペプチド免疫原ｊ、
またはｒ高分子・ペプチド免疫原」）を用いたマウスの
免疫方法は、本発明の目的を達成することができる限り
特に限定されないが、例えば、その免疫原を水、生理食
塩水、中性の等張緩樹液（例えば、トリス緩衝生理食塩
水、リン酸緩衝生理食塩水など。）などの溶媒に適当量
溶解したもの（例えば、数μｇ／ｍｆ！〜数ｍ　ｇ　／
　ｍ　ｆで、被免疫動物あたり数μｇ〜数ｍｇ、）を数
週間〜数カ月間隔で数回投与することで行うことができ
る（なお、この方法だけで「合成ペプチド免疫原１に対
して十分量の抗体を得ることができない場合には、ミョ
ウバン、結核死菌体および／または核酸などを含むアジ
ュバントを混合して得られたエマルジョンを用いること
もできる。）。そして、免疫によって生じた抗体量を分
析する分析用抗原としては、前記のようなｒ合成ペプチ
ド免疫原」の調製において用いた担体、２官能性架橋試
薬とは異なるものを用いて調製したものを用いるのが好
ましく、さらに好ましくは前記のようなｒ合成ペプチド
免疫原１の調製において用いた合成ペプチドとは異なる
末端にＣｙｓをペプチド結合によって連結したｒ合成ペ
プチド１を用いるのがよい。

本発明におけるｒ合成ペプチド免疫原ｊを免疫するため
に用いるマウスとしては、細胞融合に用いるミエローマ
細胞と同系のマウスを用いるのが好ましく、さらに好ま
しくはＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスがよい。

本発明のＩｇＧに属するモノクローナル抗体は、ｒ合成
ペプチドＪ、およびヒト免疫不全ウィルスのｅｎｖ蛋白
質のｇｐ４１とｇｐ１６０とに対して特異的反応性を有
するのに対し、ヒト免疫不全ウィルスの構成蛋白質のｐ
ｌＢ、ｐ２４、ｐ３２、ｐ５１、ｐ５５、ｐ６５、ｇｐ
　１２０とは反応性が認められないものである。

そのような特異性を有するモノクローナル抗体は、例え
ば、ｒ合成ペプチド免疫原」を用いてＢＡ　Ｌ　Ｂ　／
　ｃマウスから得たリンパ球とＢＡＬＢ／Ｃマウスのミ
エローマ細胞とを融合して得たハイブリドーマ株の４１
６−１株（微工研条寄第２４９３号）、４１６−４株（
微工研条寄第２４９４号）および４１　Ｓ−２株（微工
研条寄第２４９５号）などを培養することによって得る
ことができる。

このようなハイブリドーマの作製は、従来公知の方法、
例えば、ＭｉｌｓｔｅｉｎとＫｏｈｌｅｒの方法（Ｎａ
ｔｕｒｅ、２５６，４９５　（１９７６））に準じて行
うことができる。そのようなハイブリドーマ株の好まし
い作製方法について、概略を以下順次説明する。

モノクロ−ル　　　　バイブ１　ドーマ　の　制（１）
免疫動物リンパ球の調製 マウスの免疫方法は、生理食塩水またはＰＢＳ〔リン酸
緩衝生理食塩水〕に溶解したｒ合成ペプチド免疫原Ｊ　
（１０〜４００μｇ）をマウスに１回または敗退間隔で
数回投与することで行うことができる。

１回目の免疫は、アジュバント（ミョウバン、結核死菌
体、核酸などを含む免疫促進物質）を投与せずに行うこ
ともできるが、アジュバントを用いて調製したエマルジ
ョンを投与することが好ましい。

リンパ球は、その免疫動物の充分な抗体価を確認後、最
終免疫から数日後の、血液、リンパ節、肺臓などから得
ることができるが、肺臓から得た方が好ましい。

（ｉｉ　）ミエローマ細胞の準備 細胞融合には、マウス由来のＭＰＣ−１１、Ｐ３−Ｘ６
３−Ａｇ８・６５３　（６５３Ｌ　Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ
８−Ｕｌ　　（Ｐ２Ｏ３）、Ｐ３−ＮＳ−１（ＮＳ−１
）、ＳＰ２１０−Ａｇ１４　（ＳＰ２１０）などのミエ
ローマ細胞を用いることができるが、６５３、Ｐ２Ｏ３
，ＮＳ−１，５Ｐ２１０なとの細胞外に抗体を産住分泌
しないＢＡＬＢ　／　ｃマウス由来のミエローマ細胞を
用いた方が好ましい。

（ｉｉｉ　）細胞融合 細胞融合は、前記のようにして免疫されたマウスのリン
パ球とミエローマ細胞との細胞数ヲ（３〜２０）：１の
割合で、細胞融合に支障をきたさない細胞懸濁溶液、例
えば、一般に用いられるすンバ球培養用培地成分（ＭＥ
Ｍ、ＤＭＥＭ、ＭｃＣｏｙ、ＲＰＭ１１６４０などの培
地成分）溶液、等張緩缶液などを用いて良（混合し、遠
心分離した後のベレット（細胞塊）に、ＨＶＪ　（セン
ダイウィルス）またはＰＥＧ（ポリエチレングリコール
）溶液を添加することによって行うことができるが、好
ましくはＰＥＧ？容液を用いるのがよく、さらに好まし
くは平均分子量が１０００〜８０００で３０〜６０重量
％０ＰＥＣ；７Ｖ液を用いるのがよい。この時、細胞融
合を促進するために、コルヒチン、ジメチルスルホキシ
ド、ポリーＬ−アルギニンなどを添加することもできる
。

（ｉｖ　）ハイブリドーマの選択 ハイブリドーマの選択は、細胞融合の操作後の細胞をＨ
ＡＴ培地（ヒボキサンチン、アミノプテリン、チミジン
、ウシ胎児血清を含有した培地。

この培地成分としては一般に用いられるリンパ球培養用
培地成分を用いることができる）で培養して行うことが
できる。

ハイブリドーマの培養は、培養プレートの各ウェル（培
養ウェル）に抗体産生ウェルの検索に適した細胞個数を
入れて行い、この時、ハイブリドーマの増殖促進物質ま
たはそれを産生ずる細胞（例えば、胸腺、肺臓、リンパ
節由来のリンパ球など）をフィーダー細胞として必要に
応じて使用することができる。

）ＥＡＴ培地で増殖することによって選択されたハイブ
リドーマは、抗体産生ウェルの検索に適した細胞個数に
達・するまで、ＨＴ培地（ヒボキサンチン、チミジン、
ウシ胎児血清を含有した培地、この培地成分としては一
般に用いられるリンパ球培養用培地成分を用いることが
できる）で数日間培養し、さらに、−船釣に用いられる
ウシ胎児血清を含有するリンパ球培養用培地で培養する
。

（ｖ）抗体産生ハイブリドーマの選択 前記（ｉｖ　）で得られたハイブリドーマが、目的とす
る抗体を産生じているか否かの検定は、例えば、ＥＬＩ
ＳＡ法（酵素免疫測定法）、プラーク形成法、凝集反応
法、ＲＩＡ（ラジオアイソトープを用いた方法）、間接
蛍光抗体法（ＩＦＡ）などで行うことができるが、検定
数が非常に多い場合には、ＥＬＩＳＡ法で行うことが好
ましい。

このＥＬＴＳＡ法は、以下のようにして行う。

分析用抗原を固定化したＥＬＩＳＡプレートの各ウェル
（測定ウェル）に、ハイブリドーマ培養上清を加えて一
定時間静置する。そして、これらの洗浄した各測定ウェ
ルに結合したマウス由来の抗体と反応して結合すること
ができる酵素標識抗体（標識に用いる酵素は、例えば、
ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−ガ
ラクトシダーゼなどを挙げることができる。標識される
抗体は測定ウェルに結合した動物由来の抗体だけと反応
して結合することができる限り特に限定されず、例えば
、マウス、ラット、ウサギ、ヤギなどから得られた血清
、またはマウス細胞などを用いて作製されたハイブリド
ーマ株が産生したモノクローナル抗体を挙げることがで
きる。）をこれらの測定ウェルに加えて一定時間静置す
る。次に、これらの測定ウェルを洗浄し、用いた酵素に
対応したＳ質溶液を加えて酵素活性を測定する。そして
、酵素活性が認められれば、その培養上清をとった培養
ウェル中に目的とする抗体を産生ずるハイブリドーマが
存在していたことがわかる。

このようにして、細胞増殖が認められ、かつ抗体を産生
じているハイブリドーマを得ることができる。

（ｖｉ）ハイブリドーマの株化（クローニング）抗体産
生が認められた培養ウェル中のハイブリドーマは、限界
希釈法、シングル・セル・マユブレーション法（倒立顕
微鏡下、１ウエルに１個のハイブリドーマを入れる方法
）、軟寒天を用いてコロニーを拾い上げる方法、ＦＡＣ
３（Ｆ　１　ｕ　。

ｒｅｓｃｅｎｔ　　Ａｃｔｉｖａｔｅｄ　　Ｃｅ１ｌＳ
ｏｒｔｅｒ）を用いた方法などでクローニングすること
ができる。この時、前記のいずれかのクローニング方法
によって（Ｖ）で見出した抗体産生ハイブリドーマを培
養し、その増殖が認められた培養ウェルの上清を用い、
（ｖ）の抗体産生ハイブリドーマの選択で行ったＥＬＩ
ＳＡ法の代わりに、ウェスタン・プロッティング法でｇ
ｐ４１またはｇｐ１６０と反応する抗体産生ウェルを検
索する。

このようにして、ｒ合成ペプチド」のみならず、ＧＰ４
１およびＧＰ１６０に対しても特異性が高く、かつ抗体
価が高いモノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマ
株を選択することができる。

そして、このようにして得られたハイブリドーマ株の産
生抗体のクラスを検討することによって、目的とするＩ
ｇＧモノクローナル抗体産生株を得ることができる。

モノクロ−ル　　の＋ｉ法 「合成ペプチド」に対して特異性が高く、かつ抗体価が
高いモノクローナル抗体の生産は、前記（ｖｉ）で得た
ハイブリドーマ株をフラスコ内で培養したり、または動
物の腹腔内で培養することによって行うことができる。

前記（ｖｉ）で得たハイブリドーマ株のフラスコ内培養
での該モノクローナル抗体の生産は、例えば、０〜２０
％ウシ胎児血清を含む一般的に用いられるリンパ球培養
用培地（例えば、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＭｃＣｏｙ、ＲＰ
Ｍ１１６４０などの培地成分を含む培地）で細胞濃度が
上限に達するまで培養することによって行うことができ
る。この時、該モノクローナル抗体は、遠心操作で得た
培養上清中に含まれている。

一方、前記（ｖｉ）で得たハイブリドーマ株の動物脂腔
内培養での該モノクローナル抗体の生産は２、細胞融合
に用いた細胞が由来する系統のマウスとは異なるものを
用いて行うこともできるが、好ましくは同系のものを用
いて行った方がよい。

このような方法によるｒ合成ペプチド」に対して特異性
が高く、かつ抗体価が高い該モノクローナル抗体の生産
は、マウス、ラット、ハムスターなどの適当な動物の腹
腔内にこの動物の免疫能を低下させる物質、例えば、プ
リスタンなどの鉱物油を投与し、数週間後に１０ｈ〜１
０７個の前記（ｖｉ）で得たハイブリドーマ株細胞を投
与し、その腹腔内にこの株細胞を数週間で高密度に増殖
させることによって行うことができる。この時、該モノ
クローナル抗体は、遠心操作で得た腹水上清中に含まれ
ている。そして、その抗体濃度は、フラスコ内培養で得
た時の培養上清の抗体濃度の１０〜１０００倍である。

ハイブリドーマ株のフラスコ内または動物腹腔内での培
養で得られた該モノクローナル抗体は、蛍白質の一般的
な精製法に適用されている塩析、透析、イオン交換クロ
マトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーな
どを行うことによって精製され、高純度のモノクローナ
ル抗体となる。

前記のようにして得た該モノクローナル抗体は、ｒ合成
ペプチド」、およびヒト免疫不全ウィルスのｅｎｖ蛋白
質のｇｐ４１とｇｐ１６０とに対して特異的反応性を有
するＴｇＧに属するモノクローナル抗体である。

〔実施例〕

以下、本発明の実施例を具体的に説明する。なお、これ
らの実施例は、本発明の範囲を限定するものではない。

参考例１ 〔「合成ペプチドｊの作製〕 ｒ合成ペプチド免疫原Ｊの作製で用いる？合成ペプチド
１は、以下のようにして合成した。

Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル−３−ｐ−メトキシベンジ
ルシスティン樹脂７１０ｍｇ（システィン含ｉｔ；０．
７１ｍｍｏｒ！、７ｇ、スチレン−１％−ジビニルベン
ゼン共重合体）を出発原料とし、ペプチド自動合成装置
（アプライド・バイオシステムズ社製）を用いた固相法
によってｇｐ、４１の中央部分に相当する１８個のアミ
ノ酸残基からなるペプチドのＣ末端側に、ｃｔｙ−Ｃｙ
ｓをペプチド結合で連結した２０個のアミノ酸残基から
なる合成ペプチド Ａｒ　ｇ−Ｇ　１　ｙ−Ｐ　ｒ　ｏ−Ａｓ　ｐ−Ａｒ　
ｇ　−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−１１ｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌ
ｕ−Ｃ；Ｉｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＧｌｕＡｒｇ−Ａｓｐ
−Ａｒｇ−Ａｓｐ−ＧｌｙＣｙｓ（Ｃ端側） を作製した。

まず、前記２０個のアミノ酸配列からなるペプチドを、
常法通り、Ｌ体のアミノ酸を用いて、そのＣ末端側のＣ
ｙｓからアミノ酸を順次１個づつ前記の出発原料と反応
させることによって、１．７８ｇの保護したペプチド結
合樹脂を得た（なお、このとき用いたアミノ酸の側鎖官
能基は、Ａｒｇではメシチレン−２−スルホニル基で、
ＡｓｐまたはＧｌｕではベンジルエステルで保護した。

）。

この保護したペプチド結合樹脂１ｇを、５００μｌのエ
タンジチオールと１ｍｌのチオアニソールからなる混合
液に懸濁して、室温で１０分間攪拌後、水冷下で１０ｍ
２のトリフルオロ酢酸（以下、ＴＦＡと略記する。）を
加え、さらに１０分間攪拌した。

この混合液にＴＦＭＳＡ　（トリフルオロメタンスルホ
ン酸）を１ｍ２滴下し、室温で３０分間攪拌した後、３
０ｍ１の無水エーテルを加えてその生成物を沈澱させて
分離し、その沈澱物を無水エーテルで数回洗浄し夕後、
減圧下で乾燥した。

このようにして得られた粗精製の合成ペプチド１００ｍ
ｇを２ｍｌの蒸留水に溶解した後、濾過して得られた濾
液をＡＱＵＡＰＯＲＥ　　ＲＰ−３００（１０Ｘ１００
ｍｍ）（アプライド・バイオシステムズ社製）にのせ、
（Ａ）０．１％ＴＦＡ含有蒸留水および（Ｂ）０．１％
ＴＦＡを含有した７０％ＣＨ，ＣＮからなる溶媒を用い
て、（Ａ）液が８９％、（Ｂ）液が１１％のイソクラチ
ックモードで溶出した。

３つの大きなピークを示した溶出画分のうちの最初の溶
出画分を分取し、濃縮後凍結乾燥することによって目的
とする前記記載の合成合成ペプチドを２８ｍｇ得た。

この合成ペプチドは、ＨＰＬＣによる分析では９９％以
上の純度であり、そのアミノ酸配列は前記記載の合成ペ
プチドであることを確認できた。

参考例２ 〔ｒ合成ペプチド免疫原」の調製〕 ■免疫用抗原の調製 ０．７ｍの２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，４）に、生
体高分子である１　０ｍｇのＫＬＨを溶解したものに、
０．１　ｍ　ｊ２のジメチルホルムアミドに２ｍｇのＭ
ＢＳを溶解したものを滴下して加え、室温で３０分間攪
拌した後、ＰＤＩＯカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−ＬＫ
Ｂ社製）を用いて低分子化合物を除去した（溶出液とし
ては、２０％のジメチルスルホキシドを含む前記の２０
ｍＭリン酸緩衝液を用いた）。

この溶出液に実施例１で作製したｒ合成ペプチドＪ　８
ｍｇを加え、室温で３時間攪拌した後、リン酸緩衝生理
食塩水（ＰＢＳ）に対して２回透析し、非透析画分の蛍
白質量を定量して、ｒ高分子・ペプチド免疫原」である
「合成ペプチド免疫原ｊを３．５　ｍ　ｌ　（１，７ｍ
　ｇ　／　ｍ　ｌ　）得た。

■分析用抗原の調製 １００μｆの０．１Ｍ　　ＮａＨＣＯ：ｌに生体高分子
であるＢ５Ａｌ　Ｏｍｇを溶解し、これに５ｍｇのＮ−
エチルマレイミドを１００μｌのジメチルスルホキシド
に溶解したものを滴下して室温で１時間攪拌した後に、
５ｍｇの５ＰＤＰを１００μｌのジメチルスルホキシド
に溶解したものを滴下して室温で３０分間攪拌し、この
反応液をＰＤＩＯカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−ＬＫＢ
社製）を用いて低分子化合物を除去した（溶出液として
は、２０％のジメチルスルホキシドを含むｐ　Ｈ８，０
の５０ｍＭ’Ｊン酸緩衝液を用いた）。

このようにして得られた５ＰＤＰ−ＢＳＡ溶液に参考例
１で得られたｒ合成ペプチド」を５ｍｇ加えて室温で一
晩攪拌した後、ＰＢＳに対して２回透析し、非透析画分
の蛋白質量を定量して、分析用抗原として用いるｒ合成
ペプチド免疫原」を４ｍｆ　（４３０ｕｇ／ｍｌ）得た
。

実施例１ 〔「合成ペプチド免疫原１に対するモノクローナル抗体
産生ハイブリドーマ株の作製〕 （ａ）マウスの免疫及び肺臓リンパ球の調製参考例２で
作製した■の免疫用抗原４００ＩＩｇを溶解した０、　
４　ｍ　ｌのＰＢＳと０．４　ｍ　ｌの７ｏインドの完
全アジュバントとを充分に混合して得られたエマルジョ
ンの０．２　ｍ　ｌをＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウス（
♀、８週齢）の腹部皮下に投与した。

この初回免疫から２周間後に、前記と同様にして調製し
た同免疫用抗原のエマルジョン０．２　ｍ　ｌを前記マ
ウスの腹部皮下に投与した。

さらに、２週間後に、同免疫用抗原４００μｇを熔解し
た１ｍｌのＰＢＳと１ｍｌのフロイントの不完全アジュ
バントとを十分に混合して得られたエマルジョン０．５
　ｍ　ｌを前記マウスの腹腔内に投与した。

さらに、２週間後に、最終免疫として、同免疫用抗原１
００μｇを溶解した０、　２　ｍ　ｌのＰＢＳを前記マ
ウスの尾静脈に投与した。

このようにして免疫されたマウスから、最終免疫から３
日目に摘出した肺臓を、ＭＥＭ　（リンパ球培養用培地
粉末を蒸溜水に溶解したもの。１０ｍＭのＨＥＰＥＳを
含む。）を入れたシャーレ中で洗い、１０ｍ／！のＭＥ
Ｍを入れた別のシャーレに移して、滅菌したスライドグ
ラスのフロスト部分を用いてほぐした。

このようにして得た浮遊リンパ球を、ＭＥＭ（３７°Ｃ
）に懸濁して、遠心分離しく回転数；１４００ｒｐｍ、
時間；６分間）した。洗浄操作をさらに２回繰り返した
後、ＭＥＭ（３７°Ｃ）に再懸濁し、細胞融合に使用す
るマウス肺臓リンパ球とした。

［有］）細胞融合 ４Ｘ１０７個の対数増殖期にある８−アザグアニン耐性
のマウスミエローマＩＨ胞（Ｘ６３−Ａｇ８・６５３　
（６５３）またはＳＰ２１０−Ａｇ１４　（ＳＦ３））
と前記のマウスの肺臓リンパ球２×１０８個とを５０ｍ
ｌｍｌラプラスチック製コニカル遠心管れ、混合し、次
いで、上清を遠心分離した後に（回転数；１４００ｒｐ
ｍ、時間；６分間）、同遠心管を軽くたたいてペレット
をは（した。

同遠心管を回転させつつ、１ｍｆｆの４０％ＰＥ０１５
００溶液（３７°Ｃ）を１分間かけて加え、回転させな
がらさらに１分間反応させた。

次に、同遠心管を回転させつつＭＥＭ（３７’Ｃ）を徐
々に加えて１０ｍ２とし、遠心分離（回転数；８００ｒ
ｐｍ、時間；６分間）して、上清を吸引除去した。

同遠心管を軽くたたいてベレットをほぐし、８０ｍｆの
ＨＡＴ培地（ヒボキサンチン１×１０−４Ｍ、アミノプ
テリン４　Ｘ　１０−’Ｍ、チミジン１゜６　Ｘ　１０
−’Ｍ、　２−メルカプトエタノール５×１０−’Ｍ、
ウシインシュリン０．２Ｕ／ｍｆおよび２０％ウシ胎児
血清を含有するＲＰＭ１１６４０培地。３７’Ｃ，）に
懸濁して、９６ウエルの培養プレート１０枚の各培養ウ
ェルに１００μｌづつ分注して、Ｃ○２インキュベータ
ーを用いて培養した（５％ＣＯ□、９５％空気、３７°
Ｃ１湿度１００％）。

細胞融合から４日目と６日目に上記ＨＡＴ培地を５０μ
ｌづつ加え、それ以後は２日おきに５０μｌのＨＴ培地
（ＩＸＩＯ−’Ｍヒポキサンチン。

１．６Ｘ１０−ＳＭチミジン及び２０％ウシ胎児血清を
含有するＲＰＭ１１６４０培地、３７°Ｃに保／！りと
同量交換した。

（Ｃ）ハイブリドーマの選択 前述（ｂ）の培養開始から２〜４週間かけて、細胞増殖
が認められた培養プレートの各ウェルの培養上清中に、
分析用抗原に対する抗体が含まれているか否かを、次に
示すＥＬＩＳＡ法で検討した。

まず、９６ウエル平底ＥＬＩＳＡプレートの各分析ウェ
ルに、実施例２の■で調製した分析用抗原（２ｕｇ／ｍ
１．ｐＨ９，８の５０ｍＭ炭酸緩衝液使用。）を５０μ
２づつ分注し、４°Ｃで一晩静置して分析用抗原を各分
析ウェルに吸着させた。

次いで、ＥＬＩＳＡプレートの各分析ウェルを洗浄液（
０，０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）で２回洗浄
した後、０．１％のＯＶＡ　（卯白アルブミン）溶液（
ＰＢＳに溶解）を各分析ウェルに１００μ２づつ分注し
て室温で３０分間静置し、洗浄液で２回洗浄し、前記培
養プレートの各培養ウェルの培養上清をこれらの各分析
ウェルに５０μβづつ分注し、室温で２時間静置した。

（陰性対照には、ＨＡＴ培地を用いた。一方、陽性対照
には、本発明での細胞融合に用いたマウスの血清を洗浄
液で１００倍に希釈したものを用いた。）。

次に、ＥＬＩＳＡプレートの各分析ウェルを洗浄液で洗
浄し、アルカリフォスファターゼ標識抗マウス免疫グロ
ブリン抗体溶液を５０μＰづつ、各分析ウェルに分注し
、室温で１時間静置した。

そして、ＥＬＩＳＡプレートの各分析ウェルを洗浄液で
洗浄後、ｐ−ニトロフェニルリン酸ナトリウム−６Ｈ２
０溶液（１ｍｇ／ｍｆ）を１００μβづつ各分析ウェル
に分注し、室温で３０分反応後、マイクロプレート用の
吸光度測定装置を用いて各ウェルの４０５ｎｍにおける
吸光度を測定した。

このような検討の結果、分析用抗原に対する抗体産生が
認められた培養ウェル数は、６５３のミエローマ細胞を
用いた５３９個の培養ウェルでは４３個であり、ＳＦ３
のミエローマ細胞を用いた５０７個の培養ウェルでは１
８個であった。

これらの抗体産生が認められた６１個の培養ウェルの上
滑中に含まれる抗体が、前記のＥＬＩＳＡ方法において
、５０μｌの培養上清の代わりに、２５μりの培養上清
と２５μｌの参考例１の合成ペプチド（４００μｇ／洗
浄液１ｍｆ）とを同時に添加反応させて、参考例１の「
合成ペプチド」と反応するか否を検討した（参考例１の
「合成ペプチド」が培養上清中の抗体と分析用抗原との
反応を阻害すれば、培養上清中の抗体は参考例１の１合
成ペプチド」に対して特異的に反応する抗体であるとい
うことをｒｉ１１認できる。）その結果、参考例１のｒ
合成ペプチド」で阻害される抗体を含有していた培養ウ
ェル数は、６５３のミエローマ細胞を用いた４３個の培
養ウェルでは７個であり、ＳＦ３のミエローマ細胞を用
いた１８個の培養ウェルでは２個であった。

従って、真の参考例１の合成ペプチドに対する抗体産生
が認められた培養ウェル数は、合計９個であった。

（ｄ）これら９個について、産生抗体のクラス・サブク
ラスを後述の測定試験■に記載したオフタロニー法で検
討した結果、いずれもＩｇＧであった。

（ｅ）ハイブリドーマの株化（クローニング）２０％ウ
シ胎児血清を含むＲＰＭ１１６４０培地を用いて、前述
の（Ｃ）工程において示した抗体産生が確認された９個
の培養ウェルについて限界希釈法でハイブリドーマをク
ローニングした。

培養には、９６ウエル培養プレートを用い、支持細胞と
してＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスの胸腺細胞懸濁液（
１０７個／ｍりを使用して、（ハイブリドーマ５〜１０
個）／（胸腺細胞懸濁液１００μり／ウェルで培養した
。

前記の培養において、１０〜１４日目頃に単一コロニー
として観察される培養ウェルの上清を採取して、分析用
抗原を用いたＥＬＩＳＡ法（前述の（Ｃ）工程と同様の
方法）で抗体産生ウェルのスクリーニングを行ない、ハ
イブリドーマを３株得、これらを再クローニングした。

このようにして、６５３のミエローマ細胞を用いて得ら
れたハイブリドーマ株を４１６−１株（微工研条寄第２
４９３号）、４１６−４株（微工研条寄第２４９４号）
と称し、ＳＦ３のミエローマ細胞を用いて得られたハイ
ブリドーマ株を４１３−２株（微工研条寄第２４９５号
）と称し、これらの株が産生じたモノクローナル抗体を
、それぞれ４１６−１．４１６−４および４１Ｓ−２と
称す。

これらの３株の培養上清中に含まれるモノクローナル抗
体のクラス・サブクラス、Ｌ　ｔｊｆの型を次の測定試
験Ｉで決定し、各種ＨＩＶ構成蛋白質とモノクローナル
抗体との反応性を測定試験■で検討した。

透定基発上 〔モノクローナル抗体のクラス・サブクラスの決定〕 ４１６−１株、４１６−４株および４１３−２株が産生
した免疫グロブリンのクラス・サブクラスの決定は、マ
ウス抗体の各クラス・サブクラスに特異的な抗血′清（
ＩｇＧ＋　、ＴｇＧｚａ、ＩｇＧｚ　ｂ　、　　ｒ　ｇ
　Ｇｘ　、Ｉ　ｇＭ、　　Ｉ　ｇＡ、に型り鎖およびλ
型り鎖などに対する抗血清）を用いたオフタロニー法お
よび各クラス・サブクラスに特異的なペルオキシダーゼ
標識抗体（ＩｇＧ、　、ＩｇＧ２ａ、Ｉｇ（、ｂ、、Ｉ
ｇ（、、ＩｇＭ、ＩｇＡ。

に型り鎖およびλ型り鎖などに対するペルオキシダーゼ
で標識された抗体）を用いた前述の（ｃ）工程と同様の
ＥＬ　Ｉ　ＳＡ法によって行った。

その結果、４１６−１株および４１６−４株が産生じた
モノクローナル抗体（４１６−１および４１６−４）は
、ともにに型のし鎖を有するＩｇＧ１に属する抗体であ
り、４１３−２株が産生じたモノクローナル抗体（４１
３−２）は、に型のし鎖を有するＩｇＧ２ｂに属する抗
体であることがわかった。

皿足拭駄ユ （ＨＩＶ構成蛋白質とモノクローナル抗体との反応性の
検討） 前記の３種のモノクローナル抗体（４１６−１，４１６
−４または４１５−２）とＨＩＶ構成蛋白質（ｐ　１８
、ｐ２４、ｐ３２、ｐ５１、ｐ５５、ｐ６５、ｇｐ１２
０、ｇｐ４１、ｇｐ１６０）との反応性を、Ｉｍｍｕｎ
ｏｂｌｏｔ　Ａｓ５ｅｙ　ｆｏｒ　ＤｅＬｅｃｔｘｏｎ
　。

ｆ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｔｏ　ＨＩＶ　　（Ｂ［０−Ｒ
ＡＤ社製）を用いて、ウェスタン・プロティング法によ
って検討した。

その結果を第１表に示す。

第１表 （＋；反応性有り、−；反応性認められず）実施例３ 〔フラスコ培養でのモノクローナル抗体の生産］１５％
ウシ胎児血清（Ｆｅ２）を含むＲＰＭ１１６４０培地で
培養して得た４１Ｓ−２株の培養細胞を１０ｍｆｆ１の
ＲＰＭ１１６４０液（Ｆｅ２を含まない）に移しかえて
、死滅する直前まで培養した。

ｒ合成ペプチドｊに対するモノクローナル抗体（４１Ｓ
−２）は、培養液を遠心分離（回転数；３０００ｒｐｍ
、時間；５分間）して得られた上清中に５ｅｙｇ／ｍｊ
２（−次元平板免疫拡散法により測定）含有されていた
。

実施例４ 〔マウス腹腔内でのモノクローナル抗体の生産〕ｒ合成
ペプチドｊに対する大量のモノクローナル抗体を得るた
めに、マウス腹腔内で４１１２株の細胞を培養した。

Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウス（♀、８周齢、２週間前
にプリスタンを０．５　ｍ　ｌ　Ｂ腔内に投与しておく
）の腹腔内に、ＲＰＭ１１６４０で浮遊させた４１Ｓ−
２株の細胞（ＩＸＩＯ’個／　０．５　ｍ　ｌ　）を投
与した。

このマウスの体重は、５日目頃から顕著な増加を示し、
６日目、８日目および１００日目３回にわたる１９Ｇの
注射針を用いた腹水の採取によって、その採取の総量は
６ｍｆとなった。この腹水を遠心分離（回転数；３００
０ｒｐｍ、時間；５分間）して、腹水上清を得た。

「合成ペプチドｊに対するモノクローナル抗体（４１Ｓ
−２）は、この腹水上清中に１０ｍｇ／ｍｊ２（−次元
平板免疫拡散法により測定）含有されていた。

〔発明の効果］ 本発明のハイブリドーマ株は、Ｆ（ＩＶの構成蛋白質の
研究やＨＩＶの検査で使用するためには、安定性がよく
、精製が容易であり、かつ標識抗体の作製が容易なＩｇ
Ｇに属する抗体を産生ずる。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）次式： Ｘ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ
   −Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−
   Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ａ
   ｓｐ−Ｙ （式中、ＸはＨ、ＣｙｓまたはＣｙｓ−Ｇｌｙを表し；
   ＹはＯＨ、ＣｙｓまたはＧｌｙ−Ｃｙｓを表す。） で示されるＬ体のアミノ酸配列を有する合成ペプチドか
   らなる免疫原をマウスに免疫して得たマウスリンパ球と
   マウスミエローマ細胞との細胞融合によって得られたハ
   イブリドーマ株が産生した、前記の合成ペプチド、ヒト
   免疫不全ウィルスのｅｎｖ蛋白質のｇｐ４１およびヒト
   免疫不全ウィルスのｅｎｖ蛋白質のｇｐ１６０のいずれ
   とも特異的反応性を有するＩｇＧ型モノクローナル抗体
   。
2. （２）請求項１のハイブリドーマ株。