DK173174B1 - Monoklonale paratopiske molekyler, hybridomer, der producerer disse molekyler, og deres anvendelse til bestemmelse af apoli - Google Patents

Description

i DK 173174 B1 o

Den foreliggende opfindelse angår apolipoprotein A-I og især hybridomaer og monoklonale paratopiske molekyler, der er anvendelige til bestemmelse af apolipoprotein A-I i en væskeprøve, samt en diagnostisk metode og 5 et diagnostisk system til gennemførelse af en sådan bestemmelse.

A. Atherosclerose og lipoproteiner

Atherosclerose er en sygdom, ved hvilken cholesterol og andre lipider, der akkumuleres på arterievægge, danner 10 kraftige afsætninger, der hindrer strømmen af blod og kan føre til dannelsen af en prop, der kan lukke en arterie og forårsage okklusiv thrombotisk eller embolisk sygdom, såsom et hjerteanfald eller et slagtilfælde. Op til 50% af alle dødsfald i USA forårsages af atherosclerose og is sekundære komplikationer deraf.

Human atherosclerose defineres som akkumuleringen af bestemte lipider, herunder cholesterol, og celler i væggene af arterier og danner med tiden okklusive læsioner. Selv om ætiologien af atherosclerose omfatter flere 20 faktorer, tyder en stor mængde klinisk, patologisk, genetisk og eksperimentelt materiale på, at abnormiteter i lipoprotein-metabolisme kan bidrage til udviklingen af atherosclerose. Disse lipider transporteres i blodstrømmen som lipid-proteinkomplekser betegnet lipoproteiner.

25 Atherosclerose, og især den form, der er kendt som koronararteriesygdom (CAD), er et væsentligt sundhedsproblem. Atherosclerose og karsygdomme, som står I forbindelse dermed, var årsagen til 983.000 dødsfald i USA i 1983, og CAD alene er årsagen til flere dødsfald årligt end 30 alle cancerformer tilsammen. I USA forekommer der hvert år mere end 1 million hjerteanfald, og mere end 500.000 mennesker dør som resultat af denne sygdom. I direkte omkostninger til sundhedsvæsenet koster CAD USA mere end 60 milliarder dollars om året. Dette enorme beløb har med-35 ført, at man har koncentreret opmærksomheden omkring metoder til at identificere særlige befolkningsgrupper, som har risiko for CAD, således at sygdommen kan kontrolleres

O

2 DK 173174 B1 med diæt, adfærdsændring (motion) og specifikke terapeutiske midler.

Da cholesterol i væsentlig grad er impliceret i CAD, er dette molekyle og dets tilknyttede plasmaproteiner ble-5 vet undersøgt i stort omfang. Der er blevet defineret fire hovedklasser af cholesterol-associerede plasma-lipoprotein-partikler, som har deres oprindelse i tarmen eller leveren. Disse partikler er involveret i transport af de neutrale lipider omfattende cholesterol og triglycerider. Alle 10 klasser af plasma-lipoproteiner har apolipoproteiner associeret til lipid-proteinkomplekset, og apolipoproteinerne spiller nødvendige roller for funktionen af disse lipopro-teiner.

Den første klasse er chylomicroner. De er de stør-15 ste af lipoproteinerne og er rige på triglycerider. Oprindelsesstedet for chylomicronerne er tarmen.

Selv om apolipoproteiner udgør en mængdemæssigt lille andel af massen af chylomicroner, er apolipoproteinerne A-I, A-II og A-IV angiveligt i væsentligt omfang 20 knyttet til chylomicroner, og der er blevet konstateret syntese i tarmen af disse A-apolipoproteiner. Chylomicroner indeholder også apolipoprotein B-48. Meget af chylo-micron-komplementet af A-apolipoproteiner går tabt, og der optages C- og E-apolipoproteiner, når chylomicroner 25 udsættes for plasma eller højdensitets-lipoprotein (HDL) in vitro. Produktionen i tarmen af A-apolipoproteiner (apo A) kan reguleres af andre faktorer end fedtabsorption og chylomicron-dannelse.

Den næste klasse af lipoproteiner er lipoproteiner 30 med meget lav densitet (VLDL). VLDL-Partiklerne er involveret i triglycerid-metabolisme og transport af disse lipider fra leveren. Apolipoproteinerne apo-B-100 og apo-E er hovedbestanddelene af VLDL-partiklerne.

Det tredje lipoprotein betegnes lavdensitets-lipo-35 protein (LDL) og er et specifikt produkt af katabolismen af VLDL. Det overvejende apolipoprotein i LDL-partiklerne er apolipoprotein B-100, eller apo-B-100.

O

3 DK 173174 B1

Resultaterne af den nu klassiske Framingham-under-søgelse (1971) har vist en klar sammenhæng mellem risikoen for CAD og serumcholesterolniveauer. Denne undersøgelse har ogs& vist, at forhøjede niveauer af lavdensitets-li-5 poprotein-(LDL)-cholesterol er knyttet til en forøget risiko for CAD. For nylig har en undersøgelse foretaget af Lipid Research Clinics coronary Primary Prevention Trial (1984) vist, at plasmaniveauer af cholesterol og LDL-cholesterol kan nedsættes med en kombination af diæt 10 og lægemidler, og at denne nedsættelse af plasma-cholesterol medfører en nedsættelse af hyppigheden af CAD-dødelighed.

LDL er det væsentlige cholesterol-bærende lipoprotein i plasma. LDL er store sfæriske partikler, hvis oliehol-15 dige kerne er sammensat af ca. 1500 molekyler cholesterol, der hver især er bundet via en esterbinding til en langkædet fedtsyre. Denne kerne af cholesterylestere er indesluttet af et lag af phospholipid, ikke-forestrede chole-sterolmolekyler og et enkelt molekyle apolipoprotein 20 B-100. Phospholipiderne er arrangeret således, at de hy drofile hoveder er på ydersiden, hvilket gør det muligt for LDL at være i en hydratiseret suspension i blodet eller extracellulære væsker.

Cholesterolen afleveres til celler på LDL via en 25 specifik LDL-receptor og frigøres fra LDL-partiklerne i lysosomer, hvor den kan kontrollere cellens cholesterol-metabolisme. En akkumulering af intracellulært cholesterol modulerer tre processer.

For det første nedsætter den cellens evne til at 30 fremstille sin egen cholesterol ved at afbryde syntesen af en enzym, HMG-CoA-reduktase, som katalyserer et trin af biosyntesen af cholesterol. Undertrykkelse af enzymet efterlader cellen afhængig af ydre cholesterol hidrørende fra den receptor-medierede optagelse af LDL.

35 For det andet fremmer det indkommende LDL-afledte cholesterol oplagringen af cholesterol i cellen ved aktivering af et enzym betegnet lipoprotein-acyltransferase.

O

4 DK 173174 B1

Dette enzym forestrer fedtsyrer til overskydende choleste-rolmolekyler, hvorved der fås cholesterylestere, som afsættes i oplagrings-smådråber.

For det tredje, hvilket er det vigtigste, påvirker 5 akkumuleringen af cholesterol i cellen en feedback-mekanisme, som får cellen til at standse syntetisering af nye LDL-receptorer. Cellerne justerer derved deres komplement af eksterne receptorer således, at tilstrækkeligt med cholesterol bringes ind i cellerne til at opfylde cello lernes varierende behov, men ikke så meget, at de overbelastes. For eksempel bibeholder fibroblaster, som deler sig aktivt, således at nyt membråmmateriale er nødvendigt, et maksimalt komplement af LDL-receptorer på ca. 40.000 pr. celle. I celler, som ikke formerer sig, begynder det 15 indkommende cholesterol at akkumulere, feedback-systernet nedsætter receptor-produktionen, og komplementet af receptorer nedsættes så meget som ti gange.

På den anden side er det blevet vist, at et andet cirkulerende lipoprotein, højdensitetslipoprotein-(HDL)-20 partikler, er Impliceret i en tilstand med forhøjet cholesterol, som er knyttet til en lavere risiko for athero-sclerose. Apolipoprotein A-I er et strukturelt protein og ligand af HDL-partiklen. Mængden af HDL udviser en invers korrelation med den forudsagte hyppighed af athe-25 rosclerose.

Højdensitetslipoprotein (HDL) indeholder to væsentlige apolipoproteiner, apolipoprotein A-f (apo A-I) og apolipoprotein A-II (apo A-II). Apo A-I er hoved-protein-komponenten af alt primat-HDL. Alle HDL-partikler indehol-30 der apo A-I, og derfor har immunokvantificering af HDL

sædvanligvis involveret kvantificering af apo A-I. Cirka 80% af HDL-partiklerne indeholder også apo A-II, men HDL-partikler, som kun indeholder apo A-II, er ikke blevet beskrevet.

35 Én funktion af apo A-I er aktivering af plasmaen

zymet lecithin-cholesterol-acyltransferase (LCAT). Dette enzym kræves til forestring af frit cholesterol på HDL

O

5 DK 173174 B1 til transport til leveren. I fraværelse af apo A-I forestres cholesterol i blodet ikke, og cholesterol fjernes således ikke fra blodet. Den specifikke rolle ved HDL-metabolisme, der spilles af apo A-II, er ikke blevet de-5 fineret.

Mange undersøgelser har vist, at forhøjede HDL-niveauer udviser en sammenhæng med en nedsat hyppighed af CAD. Nogle forfattere har antaget, at HDL fjerner cholesterol fra perifere steder, såsom arterievæggen, og har 10 således tilskrevet HDL anti-atherogene egenskaber. Højere koncentrationer af HDL-cholesterol hænger sammen med relativt normal lipidmetabolisme og en lavere hyppighed af og/eller nedsat sværhedsgrad af hjertekarsygdomme, medens forhøjede niveauer af LDL-cholesterol er knyttet til 15 unormal 1ipidmetabo1isme og en forøget risiko for CAD.

For at kunne behandle patienter med hyperlipidæmi (for højt indhold af lipider i blodet) og patienter med særlig risiko for CAD på rette måde er det ønskeligt hyppigt at bestemme niveauerne af LDL- og HDL-cholesterol. Hidtil 20 har bestemmelser af HDL-cholesterol været besværlige og unøjagtige ved bestemmelse af blodniveauerne af HDL.

B. Lipoproteinstruktur og -funktion

Det er vigtigt at forstå, at cholesterol ikke foreligger frit i plasma, men transporteres til vætr i kroppen 25 ved hjælp af lipoproteiner. Cholesterol kan fremkomme ved direkte cellulær syntese eller via kosten. Imidlertid kan cholesterol kun fjernes fra organismen via leveren, hvor det omdannes til galdesyrer og udskilles.

Chylomicroner transporterer cholesterol og triglyce-30 rider til leveren, hvor de metaboliseres, medens LDL fører cholesterol til væv uden for leveren, herunder koronararterierne. Således er lipoproteinet LDL/apo B involveret i afsætning af "dårligt" cholesterol i perifert væv. Modsat fjerner lipoproteinet HDL/apo A "godt" 35 cholesterol fra vævene og returnerer cholesterol til leveren til udskillelse.

Historisk er der udviklet mange systemer til isole-

O

6 DK 173174 B1 ring og karakterisering af lipoproteiner. Disse metoder er sædvanligvis baseret på de fysisk-kemiske egenskaber af lipoproteinpartiklerne. De to mest hyppigt anvendte metoder er ultracentrifugering og elektroforese.

5 Differentialdensitetsgradient-ultracentrifugering udnytter den kendsgerning, at lipoproteinerne er lettere eller mindre tætte end andre plasmaproteiner, og det er relativt let, men tidsrøvende og kompliceret, at adskille chylomicroner (de letteste lipoproteiner), VLDL, LDL og 10 HD1* fra hinanden. Elektroforetiske metoder har været nyttige til klassifikation af patienter med hyperlipidæmier. Imidlertid er disse metoder ikke lette at gennemføre i et sædvanligt klinisk laboratorium.

Man kan også se, at den simple kvantificering af 15 blodcholesterol eller triglycerider ikke giver lægen en information om, hvilke lipoproteiner der bærer disse li-pider og mængden deraf.

C. Plasma-lipoproteiner

Der er defineret fire hovedklasser af plasmalipo-20 proteiner, nemlig chylomicroner, VLDL, LDL og HDL, og der eksisterer utvivlsomt undergrupper af disse. Alle lipoproteiner har deres oprindelse i tarmen eller leveren eller begge steder og synes at have en pseudo-micelle--struktur. Neutrale lipider og især cholesterolestere og 25 triglycerider holdes i kernen af lipoproteinerne i en opløselig og stabil form via vekselvirkninger med de polære overfladebestanddele, apolipoproteiner og phospho-lipider.

Ikke-forestret cholesterol er også til stede i 30 disse komplekser. Dets polaritet ligger mellem polariteten af neutrale lipider (cholesterylestere og triglycerider) og polariteten af de mere polære apolipoproteiner og phospholipider, og det findes både i kernen og på overfladen.

35 En ydre overflade bestående af apolipoproteiner, ikke-forestret cholesterol og phospholipider omgiver en vanduopløselig kerne af cholesterylestere og triglycerider

O

7 DK 173174 B1 og beskytter de ikke-polære lipider mod de vandige omgivelser. Denne generelle strukturopfattelse støttes af undersøgelser af spredning af røntgenstråler under lav vinkel og af andre fysiske metoder, ved hvilke forskel-5 lige sonder er blevet anvendt til udforskning af strukturen af lipoproteiner. En vigtig funktion af plasma-lipo-proteiner er således opløseliggørelse og transport af de neutrale plasmalipider.

D. Apolipoproteiner io Apolipoproteiner er de lipid-frie proteinkomponenter af plasmalipoproteiner, der fås ved at behandle isolerede intakte lipoproteiner med organiske opløsningsmidler, detergenter eller chaotrope midler. Ikke alle proteiner, som er Indesluttet i lipoproteiner, spiller nødvendigvis 15 en rolle ved lipidtransport. Et relevant eksempel i den foreliggende sammenhæng er, at serum-amyloid A-proteiner, akut-fase-reaktanter, transporteres i plasma bundet til HDL. Disse proteiner med lav molekylvægt kan udgøre op til 30% af apo-HDL ved inflammatoriske tilstande, men det 20 er tvivlsomt, om de har nogen specifikke lipidtransport-roller.

Apolipoprotein A-I (apo A-I), som er til stede i HDL-partikler, er det protein, som har interesse ifølge den foreliggende opfindelse. Apo A-I diskuteres nedenfor.

25 Apo A-I er den væsentlige proteinkomponent af alt primat-HDL, er til stede i alle HDL-partikler, og der er flere, f.eks. ca. 7-8, apo A-I-molekyler pr. HDL-partikel.

Det er blevet rapporteret, at det er til stede i relativt små mængder i chylomicroner, VLDL og LDL og udgør ca. ' 30 60-80% af proteinet af HDL.

Apo A-I består af en enkelt kæde af 243-245 rester, indeholder ikke cystin, cystein, leucin eller kulhydrat og eksisterer i flere iso-former. Apo A-I har et a-helix-indhold på ca. 55% i den lipidfrie tilstand, hvilket 35 stiger til ca. 75% ved binding af phospholipid. Gentagne cykler på 11 helix-rester er blevet identificeret i dette apolipoprotein. Det er blevet foreslået, at disse enheder

O

8 DK 173174 B1 repræsenterer en enkelt oprindelig kæde, som ved gen-duplikation har dannet en gentagelsesenhed med 22 rester. Disse enheder har en nær sekvenshomologi og antages at udgøre de lipidbindende områder af proteinet.

5 Som ovenfor anført er apo A-I en kraftigt virksom aktivator af LCAT, et plasmaenzym, som katalyserer omdannelsen af cholesterol og phosphatidylcholin til choleste-rylester og lysophosphatidylcholin. Specifikke lipidbindende områder af apo A-I har vist sig at aktivere LCAT, 10 og denne aktivitet er blevet knyttet til den lipidbindende evne. Som allerede anført syntetiserer leveren og tarmen apo A-I, men deres relative bidrag til det totale plasmaindhold og faktorerne, der modulerer apo A-I-produktion, er ikke godt definerede.

15 Typisk er mere end ca. 90% af plasma-apo A-I knyttet til HDL, mindre end ca. 1% til VLDL og LDL og ca. 10% eller mindre til den lipoproteinfrie plasmafraktion. Mængderne af apo A-I i hver partikeltype varierer fra forfatter til forfatter og synes at afhænge af metoderne, der 20 er anvendt til separation af partiklerne.

Bestemmelse af hovedproteinbestanddelen af HDL, apo A-I, er klinisk betydningsfuld. Resultaterne af et antal undersøgelser har vist, at apo A-I-niveauerne nedsættes hod patienter med CAD. Denne observation understre-25 ger den beskyttende rolle af plasma apo A-I hos denne patientgruppe.

Resultaterne af flere undersøgelser tyder på, at det ved nøjagtig måling af apo A-I-niveauet kan være muligt at forudsige et individs prognose for unormal lipidmeta-30 bolisme, atherosclerose og specifikt CAD. Imidlertid har mængden af apo A-I alene ikke kunnet anvendes som markør for unormal lipidmetabolisme, om ikke andet så på grund af vanskelighederne med at foretage en nøjagtig og præcis måling. Medens relativt høje apo A-I-niveauer synes at 35 hænge sammen med normal lipidmetabolisme, og relativt lave niveauer synes at hænge sammen med unormal lipidmetabolisme og CAD, er der således ikke blevet rapporteret en klar

O

9 DK 173174 B1 skillelinje mellem normale personer og personer med kendt CAD.

Som ovenfor anført har det vist sig at være yderst vanskeligt at foretage en nøjagtig og præcis mængdebestem-5 melse af apo A-I i et klinisk anvendeligt immunobestemmel-sessystem, såsom en radioimmunobestemmelse (RIA), en enzym-bundet immunobestemmelse (ELISA), en elektroimmuno-bestemmelse (EIA), en radialimmunodiffusion (RID) eller en immunonephelornetrisk bestemmelse (INA), se f.eks.

10 tabel 1 i Steinberg et al. (1983) Clin. Chem. 29/3:415- 426 vedrørende variationerne i værdierne, der rapporteres ved anvendelse af forskellige metoder.

En af de påståede årsager til disse analytiske vanskeligheder er, at apolipoprotein A-I-molekylet er til 15 stede i plasma og serum som del af en stor, biokemisk heterogen partikel, hvori nogle af molekylets antigensteder (epitoper) er skjult og maskeret. Som en følge heraf har flere forskere anvendt demaskeringsbehandlinger til deres prøver, således at de normalt skjulte epitoper 20 demaskeres og bliver tilgængelige for immunoreaktion.

Steinberg et al. (1983) Clin. Chem. 29:415-426 diskuterer også demaskering ved behandling af en blodprøve, såsom plasma eller serum, med denatureringsmidler, såsom urinstof, tetramethylurinstof og guanidin, overfladeaktive 25 midler, såsom natriumdodecylsulfat og polyoxyethylen(20)-sorbitanmonolaurat ("Tween 20"), opvarmning til f.eks.

52°C i 3 timer og 37°C i 2 timer, og delipiderende organiske opløsningsmidler, såsom blandinger af ethanol og diethylether, methanol og diethylether, chloroform og ' 30 methanol, og lignende. Andre specifikke demaskeringsbe handlinger er beskrevet i Maciejko et al. (1982) Clin.

Chem. 28:199-204 (overfladeaktivt middel); Koren et al.

(1985) Clin. Chim. Acta 147:85-95 (organisk opløsningsmiddel); og Bury et al. (1985) Clin. Chem. 31:247-251 35 (37°C, 2 timer).

Nogle af de ovennævnte forskere og andre har også anvendt præparater af polyklonalt antistof til at hjælpe DK 173174 B1 10 o til med at undgå den tilsyneladende heterogenitet af apo A-I, således som det foreligger i plasma og serum, jf. Maciejko et al, (1982) Clin. Chem. 28:199-204; Koren et al. (1985) Clin. Chim. Acta 147:85-95; Bury et al, 5 (1985) Clin. Chem. 31:247-251; og Fesmire et al. (1984)

Clin. Chem. 30:712-716. Naturligvis har anvendelsen af polyklonale antistoffer ved en klinisk anvendelig kvantitativ immunobestemmelse den ulempe, at der er forskelle i antistofaktivitet ved anvendelse af sera fra forskellige 10 dyr og også forskelle i immunospecificitet mellem forskellige serum-portioner.

Endvidere har Kottke et al. (1986) Mayo Clin. Proc. 61:313-320 målt niveauerne af apolipoproteinerne A-I, A-II og B, HDL-cholesterol, triglycerider og alder som 15 variable hos mænd og har fundet, at anvendelsen af alle disse seks variable er nødvendig for på nøjagtig måde at skelne CAD-patienter fra asymptomatiske kontroller. Ved disse undersøgelser er der anvendt radioimmunobestemmel-ser til målingerne.

20 Polyklonale antistoffer, en antistof-prøve-holde tid på 16 timer og en demaskerende detergentbehandling blev angiveligt anvendt til RIA-målingen af apo A-I-vær-dier af Kottke et al. Et monoklonalt antistof blev angiveligt anvendt til RIA-måling af apo B. Kottke et al.

25 har rapporteret apo A-I-middelværdier for normale personer og CAD-patienter, der ikke overlapper hinanden inden for én standardafvigelse.

På den anden side, bortset fra de her anvendte monoklonale paratopiske molekyler, har ingen andre for-30 skere beskrevet monoklonale antistoffer, der immunorea-gerer i det væsentlige ligeligt med HDL-partikler og apo A-I samt immunoreagerer med i det væsentligt alt apo A-I, som er til stede i en prøve. Således har Curtiss et al. (1985) J. Biol. Chem. 200:2982-2998, rapporteret et 35 monoklonalt antistof betegnet A-I-7, som immunoreagerer omtrent ligeligt med apo A-I og HDL, men kun er i stand til at immunoudfælde ca. 60% af radiomærket apo A-I eller DK 173174 B1 11 o HDL, som vides at være til stede i de undersøgte prøver.

3. Monoklonale paratoplske molekyler som reagenser for apo A-I

Anvendelsen af monoklonale antistoffer eller delene 5 deraf indeholdende kombinerende steder, dvs. paratopiske molekyler, som reagenser til bestemmelse af tilstedeværelsen af apo A-I i humane blodprøver er tiltrækkende, fordi sådanne reagenser, når de først er tilvejebragt, kan produceres i relativt store mængder med ensartet kvalitet, 10 hvorved problemerne med uoverensstemmelse, der er knyttet til polyklonale antistoffer, undgås. Imidlertid er der et antal faktorer, som taler mod anvendelsen af et bestemt monoklonalt paratopisk molekyle som komponent i sådanne bestemmelsessystemer.

15 Ved anvendelse af et monoklonalt antistof som ek sempel på et monoklonalt paratopisk molekyle anføres det ifølge den kendte teknik, at et monoklonalt antistof kan være for imraunospecifikt til at være anvendeligt på grund af den antigene heterogenitet af dets mål-antigen. For 20 eksempel beror specificiteten af konventionelle antisera indeholdende polyklonalt antistof på en overensstemmelse mellem hundreder eller tusinder af forskellige antistoffer, der bindes til antigene determinanter, der dækker det meste af eller det hele af et antigent protein, således 25 som det har vist sig at være nyttigt ved apo A-I-bestem-melser. Som resultat heraf vil små ændringer i strukturen af antigenet på grund af genetisk polymorfi, glycosyle-rings-heterogenitet eller let denaturering eller anden reaktion sædvanligvis have ringe effekt på bindingen af 30 polyklonalt antistof. På lignende måde vil et større eller mindre undersæt af antistoffer fra polyklonale antisera sædvanligvis binde antigener, som er blevet modificeret eller denatureret.

I modsætning hertil bindes monoklonale antistoffer 35 sædvanligvis til én antigen determinant (epitop) på antigenmolekylet. Hvis denne determinant af en eller anden grund er ændret, er det ikke sikkert, at antistoffet fort-

O

12 DK 173174 B1 sat bindes. Om dette er et problem eller en fordel, afhænger af de individuelle omstændigheder. Hvis det monoklonale antistof, som i det foreliggende tilfælde, skal anvendes til en diagnostisk bestemmelse af et apolipo-5 protein, kan en mindre antigenvariation i dette protein forårsage grove fejl.

For det andet er den heldige anvendelse af mono-klonale antistoffer på grund af deres enestående specificitet ofte afhængig af affiniteten til mål-antigenet.

10 Medens et monoklonalt antistof kan have tilstrækkelig affinitet til at være anvendeligt til binding af antigen i væskefase og fastfase, medens det monoklonale antistof selv er i væskefase, er det f.eks. ikke sikkert, at det. samme antistof er anvendeligt-som~Fastfase-bundet antistof, 15 som er anvendeligt til at binde og tilbageholde antigenet fra en opløsning.

De ovennævnte problemer er generelle for anvendelsen af monoklonale antistoffer. Det er derfor blevet erkendt af fagmænd, at det er væsentligt at afprøve og karakteri-20 sere monoklonale antistoffer i ethvert bestemmelsessystera, hvori de skal anvendes, jf. Goding, James W., Monoclonal Antibodies: "Principles and Practice", Academic Press,

New York (1983), side 40-46.

Den foreliggende opfindelse angår hybridomaer og 25 monoklonale paratopiske molekyler udskilt af disse hybridomaer, der reagerer immunologisk med apolipoprotein A-I, samt metoder til bestemmelse af tilstedeværelsen af apolipoprotein A-I eller HDL i en væskeprøve og et diagnostisk system, typisk i form af et sæt, som er anvendeligt 30 til gennemførelse af bestemmelsesmetoderne, især på en flydende blodprøve.

Således angår et aspekt af opfindelsen et hybridoma, som er valgt hybridomaer med ATCC-deponerlngsnumrene HB 9200, HB 9201, HB 9202, HB 9203 og HB 9204. Opfindelsen 35 angår endvidere de monoklonale paratopiske molekyler, der udskilles af hver af disse hybridomaer og reagerer med apolipoprotein A-I. Disse monoklonale paratopiske mole-

O

13 DK 173174 B1 kyler er fortrinsvis hele monoklonale antistoffer.

Et yderligere aspekt af opfindelsen angår en fremgangsmåde til bestemmelse af apolipoprotein A-X i en væskeprøve. Denne metode omfatter blanding af en væske-5 prøve# der skal undersøges, med en effektiv mængde af et af de ovenfor nævnte fem monoklonale paratopiske molekyler til dannelse af en blanding. Denne blanding holdes under biologiske bestemmelsesbetingelser i et forudbestemt tidsrum, der er tilstrækkeligt til, at de parato-10 piske molekyler immunoreagerer med apolipoprotein A-I, som er til stede i prøven, og danner en immunoreaktant. Tilstedeværelsen af lmmunoreaktanten påvises derefter, hvorved tilstedeværelsen af apolipoprotein A-I i den oprindelige prøve påvises. I denne udførelsesform for op-15 findelsen indeholder de paratopiske molekyler fortrinsvis et operativt bundet radioaktivt element, som indikerende middel, og tilstedeværelsen af apolipoprotein A-I i den oprindelige prøve bestemmes ved at skille lmmunoreaktanten fra resten af blandingen og bestemme den udsendte stråling 20 fra den fraskilte immunoreaktant.

I en anden udførelsesform for bestemmelsesmetoden bindes de førstnævnte monoklonale paratopiske molekyler til en fast matriks til dannelse af en fast bærer før dannelsen af blandingen. De ikke-specifikke proteinbindende 25 steder af det faste underlag blokeres. lmmunoreaktanten, der dannes efter blanding af væskeprøven, bindes til den faste bærer som fastfase-bundet immunoreaktant. Ved denne udførelsesform foretrækkes det, at tilstedeværelsen af en fastfase-bundet Immunoreaktant bestemmes ved anvendelse 30 af andre monoklonale paratopiske molekyler.

Her blandes de andre monoklonale paratopiske molekyler i væskefase med den ovenfor anførte, førstnævnte blanding til dannelse af en anden blanding. Disse andre paratopiske molekyler immunoreagerer med apolipoprotein 35 A-I og er valgt blandt de førnævnte monoklonale paratopiske molekyler, men er ikke de molekyler, der anvendes i den førstnævnte blanding, og immunoreaktionen af disse andre

O

14 DK 173174 B1 monoklonale paratopiske molekyler er heller ikke i det væsentlige blokeret eller inhiberet af immunoreaktionen af de førstnævnte paratopiske molekyler. Disse andre paratopiske molekyler bindes operativt til et indikerende 5 middel, som fortrinsvis er et enzym.

Den således dannede anden blanding holdes under biologiske bestemmelsesbetingelser i et forudbestemt tidsrum, som er tilstrækkeligt til, at de andre paratopiske molekyler, hvortil der er bundet indikerende middel, im-10 munoreagerer med apolipoprotein A-I, som er til stede i blandingen. De faste og flydende faser, der dannes efter blandingen af de to paratopiske molekyler og dannelsen af immunoreaktanter, adskilles, og tilstedeværelsen af apolipoprotein A-I, hvortil der er bundet indikerende 15 middel, i den fraskilte faste fase bestemmes, hvorved tilstedeværelsen af apolipoprotein A-I i prøven bestemmes.

De monoklonale paratopiske molekyler ifølge den foreliggende opfindelse er også anvendelige ved kvantitative bestemmelser af mængden af apolipoprotein A-I i 20 en væskeprøve, især i en flydende blodprøve, såsom serum eller plasma. Når der ønskes kvantitative resultater, gennemføres der trin, som generelt ligner de ovenfor skitserede.

Således blandes en kendt mængde af en væskeprøve, 25 der skal undersøges, med en fast bærer, der i det væsentlige består af en fast matriks, der har fastfase-bundne første monoklonale paratopiske molekyler, der immunorea-gerer med apolipoprotein A-I og udskilles af en af hybridomaerne med ATCC-deponeringsnumrene HB 9200 eller 30 HB 9201, til dannelse af en blanding af fast stof og væskefase. De ikke-specifikke proteinbindingssteder på overfladen af den faste bærer blokeres. Blandingen af fast stof og væskefase holdes under biologiske bestemmelsesbetingelser i et forudbestemt tidsrum, der er til-35 strækkeligt til, at de første paratopiske molekyler immu-noreagerer med i det væsentlige alt apolipoprotein A-I, som er til stede i prøven.

O

15 DK 173174 B1

Apolipoprotein A-I i den ovennævnte væskeprøve blandes yderligere med andre monoklonale paratopiske molekyler i væskefase, der immunoreagerer med apolipoprotein A-I, udskilles af en af hybridomaerne med ATCC-depone-5 ringsnumrene HB 9200 eller HB 9201, men ikke anvendes i den førstnævnte blanding, og bindes operativt til et indikerende middel i form af et enzym til dannelse af en anden blanding. De paratopiske molekyler, der anvendes i dette trin, er således de andre af de to, der er nævnt i 10 det første blandingstrin.

Den således dannede anden blanding holdes under biologiske bestemmelsesbetingelser i et forudbestemt tidsrum, der er tilstrækkeligt til, at de andre paratopiske molekyler, hvortil der er bundet indikerende middel, danner 15 en immunoreaktant med i det væsentlige alt apolipoprotein A-I, som er til stede i denne prøve. De faste og flydende faser, der fremkommer ved de ovennævnte blandinger og holdetrin, adskilles, og mængden af immunoreaktant indeholdende apolipoprotein A-I, hvortil der er bundet indi-20 kerende middel, som er til stede i den fraskilte faste fase, bestemmes og dermed mængden af apolipoprotein A-I i prøven.

Det er særligt foretrukket, at de to blandingstrin af den ovennævnte bestemmelsesmetode gennemføres i det 25 væsentlige samtidigt, og at de to holdetrin gennemføres sammen. Når disse trin ikke gennemføres i det væsentlige samtidigt hhv. sammen, foretrækkes det, at de faste og flydende faser, som er til stede ved slutningen af det første holdetrin, adskilles, før den anden blanding fore-30 tages, i hvilket tilfælde apolipoprotein A-I anvendt i den anden blanding er det, som er til stede i den fast-fase-bundne immunoreaktant, der er dannet i det første holdetrin.

Et diagnostisk system, typisk i form af et sæt, 35 som er egnet til anvendelse ved bestemmelse af tilstedeværelsen af apolipoprotein A-I i en væskeprøve, udgør et andet aspekt af den foreliggende opfindelse. I en udførel-

O

16 DK 173174 B1 sesform omfatter systemet en pakning, som indeholder para-topiske molekyler udskilt af en af de ovennævnte hybri-domaer og til stede i en tilstrækkelig mængde til, at der kan gennemføres mindst én bestemmelse. Mere fore-5 trukket omfatter det diagnostiske system yderligere et indikerende middel, der er direkte operativt bundet til det ovennævnte paratopiske molekyle eller er bundet til et andet molekyle, der er i stand til at indikere immuno-reaktion af de ovennævnte paratopiske molekyler med apo-10 lipoprotein A-I.

Mest foretrukket er det diagnostiske system egnet til anvendelse ved bestemmelse af mængden af apolipopro-tein A-I, som er til stede i en flydende blodprøve. Dette diagnostiske system omfatter en første pakning indehold-15 ende en fast bærer, der i det væsentlige består af en fast matriks med monoklonale paratopiske molekyler, der immunoreagerer med apolipoprotein A-I og udskilles af en af hybridomaerne med ATCOdeponeringsnumrene HB 9200 eller HB 9201, bundet til den faste matriks. De ikke-specifikke 20 proteinbindende steder af denne faste bærer er blokerede.

Dette system omfatter yderligere en anden pakning, der indeholder paratopiske molekyler, der immunoreagerer med apolipoprotein A-I, udskilles af en af hybridomaerne med ATCC-deponeringsnumrene HB 9200 eller HB 9201, men ikke 25 udskilles af hybridomaet fra den første pakning, og er operativt bundet til et indikerende middel i form af et enzym.

Den foreliggende opfindelse har flere fordele.

Én af fordelene er, at der hermed tilvejebringes 30 reagenser, der er i stand til at immunoreagere med i det væsentlige alt apolipoprotein A-I eller alle HDL-partik-ler i en flydende blodprøve, såsom serum eller plasma.

En anden fordel ved den foreliggende opfindelse er, at anvendelsen af disse paratopiske molekyler kan 35 give en kvalitativ bestemmelse af tilstedeværelsen af apolipoprotein A-I eller HDL.

Endnu en fordel ved den foreliggende opfindelse er.

DK 173174 B1 17 o at der ved anvendelse af særligt foretrukne paratopiske molekyler, der udskilles af to af hybridomaerne ifølge opfindelsen, kan gennemføres en særdeles nøjagtig og præcis bestemmelse til kvantitativ bestemmelse af mæng-5 den af apolipoprotein A-I, som er til stede i en blodprøve .

Andre fordele ved den foreliggende opfindelse vil fremgår af den følgende detaljerede beskrivelse af opfindelsen.

10 Figurerne på tegningen viser følgende:

Figur 1 indeholder en graf, der illustrerer evnen af en kendt konstant mængde (0,375 pg/ml) af peberrod-peroxidase (HRPO)-mærkede AI-10-molekyler til at immuno-reagere med fastfase-bundet reagens apolipoprotein A-I 15 i nærværelse af stigende mængder af ikke-mærkede AI-10-molekyler {A ) og AI-11-molekyler (Bl). Ad ordinaten er der afsat den optiske tæthed, medens der ad abscissen er afsat mængden i pg af tilsatte ikke-mærkede konkurrerende monoklonale antistoffer. Detaljer vedrørende denne under-20 søgelse er anført i afsnittet "materialer og metoder".

Grafen viser, at stigende mængder af ikke-mærkede AI-10-molekyler i immunoreaktionsblandingen tilsvarende nedsætter mængden af mærket AI-10 bundet som fastfase-immunoreaktant. Således konkurrerer ikke-mærket AI-10 med 25 mærket AI-10 om apo A-I.

Grafen viser også, at stigende mængder af ikke-mærkede AI-11-molekyler ikke i væsentlig grad nedsætter mængden af mærkede Al-10-molekyler bundet som fastfase-immuno-reaktant. Ikke-mærkede AI-11-molekyler konkurrerer således 30 ikke med mærkede AI-10-molekyler om binding til apolipoprotein A-I.

Figur 2 indeholder en graf, der viser, at der fås lignende resultater som i figur 1 ved anvendelse af HDL som fastfase-bundet antigen med en konstant mængde (0,375 35 pg/ml) HRPO-mærkede AI-1O-molekyler og ikke-mærkede AI-11-molekyler (0) og AI-10-molekyler (AK Al-10-Molekyler og AI-11-molekyler bindes derfor til forskellige epitoper,

O

18 DK 173174 B1 der er tilstrækkeligt adskilt på overfladen af apolipo-protein A-I eller HDL til, at der muliggøres binding af begge monoklonale antistofmolekyler til et enkelt apo A-I-molekyle uden sterisk konkurrence med og inhibering 5 af bindingen af det andet molekyle.

I. Diskussion A. Definitioner

Udtrykket "antistof" refererer til et molekyle, som er medlem af en familie af glycosylerede proteiner 10 betegnet immunoglobuliner, der kan kombinere specifikt med et antigen. Et sådant antistof kombinerer med dets antigen ved en specifik immunologisk bindende vekselvirkning mellem den antigene determinant af antigenet og antistof-kombineringsstedet af antistoffet.

15 Et "antistof-kombineringssted" er den strukturelle del af et antistofmolekyle, som omfatter variable og hypervariable regioner af tung og let kæde, der specifikt binder antigen. Ved anvendelse af nomenklaturen ifølge Jerne, (1974) Ann. Immunol. (Inst. Pasteur), 125C:373-20 389, betegnes et antistof-kombineringssted sædvanligvis en "paratop" i den foreliggende beskrivelse.

Antistof-kombineringssted-holdige (paratop-holdige) polypeptiddele af antistoffer er de dele af antistofmolekyler, der indeholder paratopen og bindes til et antigen 25 og omfatter f.eks. Fab-, Fab'-, F(ab')2~ °9 F(v)-delene af antistofferne. Fab- og F(ab1)2-delene af antistoffer fremstilles ved proteolytisk indvirkning af papain hhv. pepsin på i det væsentlige intakte antistoffer ved velkendte metoder, jf. f.eks. US patentskrift nr. 4.342.566.

30 Fab1-Antistofdele er også velkendte og fremstilles ud fra F(ab*)2_dele efterfulgt af reduktion af disulfidbindingerne, som binder de to tung-kæde-dele sammen, f.eks. med mercaptoethanol, og efterfulgt af alkylering af det fremkomne protein-mercaptan med et reagens, såsom iod-35 acetamid. Intakte antistoffer foretrækkes og anvendes som illustration af de monoklonale ligand-molekyler ifølge opfindelsen.

DK 173174 B1 19 o

Ordet "antigen" er blevet anvendt historisk til at betegne en helhed, som bindes af et antistof, og også til at betegne den helhed, som fremkalder produktion af antistoffet. Den mere gængse anvendelse af ordet begrænser 5 betydningen af "antigen" til den helhed, der bindes af et antistof, medens ordet "immunogen" anvendes om den helhed, der fremkalder antistof-produktion. Når en helhed, som omtales i den foreliggende beskrivelse, både er immunogen og antigen, vil den sædvanligvis blive betegnet io et antigen.

Udtrykket "antigen determinant" refererer til den faktiske strukturelle del af antigenet, der bindes immunologisk af et antistof-kombineringssted. Jerne-Nomenklaturen redefinerer en antigen determinant som en "epitop".

15 Udtrykket "biologisk aktiv" refererer i det mindste

Til evnen af en proteinholdigt molekyle til specifikt at binde antigen eller specifikt antistof-kombineringssted, selv om anden generel eller effektor-evne også kan være til stede i et sådant molekyle. Biologisk aktivitet 20 af et paratopisk molekyle indeholdende et antistof-kom bineringssted viser sig ved den immunologiske reaktion af paratopen (antistof-kombineringsstedet) med dens epitop (antigen determinant) ved blanding af disse i et vandigt medium til dannelse af en immunoreaktant, i det mindste 25 ved fysiologiske pH-værdier og ionstyrker. Den biologiske aktivitet forekommer fortrinsvis under biologiske bestemmelsesbetingelser, dvs. de betingelser, hvorved et mono-klonalt paratopisk molekyle, som er anvendeligt ifølge opfindelsen, bindes til epitopen (antigen determinant) 30 inden for et pH-værdiområde på ca. 5 til ca. 9, ved ionstyrker, såsom ionstyrken af destilleret vand og op til ca. 1 M natriumchloridopløsning, og temperaturer på ca.

4 til ca. 45°C. De monoklonale paratopiske molekyler, som er anvendelige ved den foreliggende opfindelse, er 35 alle biologisk aktive.

"ELISA" refererer til en enzym-bundet imraunosorbens-bestemmelse, hvorved et antigen eller antistof bundet til

O

20 DK 173174 B1 en fast fase og et enzym-antistof eller enzym-antigen-konjugat anvendes til at påvise og bestemme mængden af antigen eller antistof i en prøve. En beskrivelse af ELlSA-metoden findes i kapitel 22 i 4. udgave af "Basic 5 and Clinical Immunology" af D.P. Sites et al., publiceret af Lange Medical Publications, Los Altos, CA i 1982 og i US patentskrift nr. 3.654.090, 3.850.752 og 4.016.043.

"Enzym" refererer til et protein, der er i stand til ved katalytisk indvirkning at fremskynde eller 10 fremkalde en ændring i et substrat, som det ofte er specifikt for.

"Immunoreaktant" som anvendt i den foreliggende beskrivelse refererer til produktet af en immunologisk reaktion, dvs. den helhed, der dannes, når et antigen 15 bindes immunologisk af et antistof eller et molekyle indeholdende en paratop. En immunoreaktant er derfor en specifik type af kompleks, der dannes mellem molekylerne.

Udtrykkene "indikerende middel", "enzym-indikerende middel" eller "mærkning" anvendes ensbetydende i den 20 foreliggende beskrivelse i forskellige grammatiske former til at omfatte enkelte atomer, molekyler og enzymer, som enten direkte eller indirekte er involveret i tilvejebringelsen af et påviseligt signal, der viser deres tilstedeværelse. I det væsentlige ethvert indikerende middel, 25 som kan bindes til eller inkorporeres i et antistof, er anvendeligt ved den foreliggende opfindelse, og sådanne indikerende midler kan anvendes alene eller sammen med yderligere reagenser. Sådanne indikerende grupper eller mærkninger er velkendte i sig selv inden for immunokemien 30 og udgør kun en del af den foreliggende opfindelse i det omfang de anvendes med i øvrigt hidtil ukendte paratopiske molekyler, metoder og/eller systemer. Paratopiske molekyler betegnes, når de er bundet til et enzym-indikerende middel, undertiden i den foreliggende beskrivelse enzym-bundne 35 paratopiske molekyler.

Udtrykket "helt antistof" anvendes i den foreliggende beskrivelse til at skelne et komplet, intakt molekyle, der

O

21 DK 173174 B1 udskilles af en celle, fra andre mindre molekyler, der også indeholder paratopen, som er nødvendig for biologisk aktivitet i en immunoreaktion med en epitop.

De paratopiske molekyler ifølge den foreliggende 5 opfindelse er monoklonale paratopiske molekyler. Et "monoklonalt antistof" (Mab) er et antistof produceret af kloner af et hybridoma, der kun udskiller én art af antistofmolekyler, og et monoklonalt paratopisk molekyle er et monoklonalt antistof eller en paratop-holdig poly-10 peptiddel deraf som diskuteret nedenfor. Hybridoma-cellen dannes ved fusion af en antistof-producerende celle og en myelom-celle eller en anden udødelig cellelinje. Sådanne antistoffer blev først beskrevet af Kohier og Milstein, Nature 256, 495-497 (1975).

15 Udtrykkene "monoklonalt paratopisk molekyle" og "paratopisk molekyle" alene anvendes ensbetydende og i fællesskab i den foreliggende beskrivelse om den gruppe af molekyler, der indeholder et kombineringssted af et monoklonalt antistof og omfatter et helt monoklonalt 20 antistof, et i det væsentlige helt monoklonalt antistof og en antistof-bindingssted-holdig del af et monoklonalt antistof. De hele monoklonale antistoffer betegnet AI-10 og AI-11, AI-12, AI-13 og AI-14 er paratopiske molekyler ifølge opfindelsen ligesom dele af disse hele antistoffer, 25 der indeholder paratopen. Udtrykkene "monoklonalt paratopisk molekyle" eller "paratopisk molekyle" anvendes alene i den foreliggende beskrivelse, når der menes et generisk biologisk aktivt molekyle indeholdende antistofbindingsstedet af de ovennævnte monoklonale antistoffer, 30 medens betegnelserne AI-10, AI-11, AI-12, AI-13 og AI-14 med eller uden ordene "paratopisk molekyle" anvendes, når der menes de specifikke hele antistoffer, der produceres af hybridomaerne HB 9200, HB 9201, HB 9202, HB 9203 eller HB 9204.

35 Ordene "udskille" og "producere" anvendes ofte ensbetydende inden for teknikken til at referere til celler, hvorfra der fås antistofmolekyler. Celler, som

O

22 DK 173174 B1 producerer antistoffer, behøver imidlertid ikke at udskille disse molekyler i deres omgivelser. Hybridoma-cellerne, som er af interesse ifølge opfindelsen, udskiller mono-klonale antistoffer i deres omgivelser. Ikke desto min-5 dre betegnes sådanne celler undertiden i den foreliggen-^ de beskrivelse "antistof-producerende” celler, og deres antistoffer betegnes undertiden som værende "produceret" i overensstemmelse med den måde, hvorpå udtrykket anvendes inden for teknikken. Paratop-holdige polypeptiddele 10 af de ovennævnte antistoffer betegnes på lignende måde i den foreliggende beskrivelse som værende "produceret" eller "udskilt", selv om det vil forstås, at sådanne molekyler fremstilles ud fra antistoffer, som selv er "produceret" eller "udskilt".

15 Udtrykket "ovenstående væske" anvendes i den fore liggende beskrivelse til at referere til det in vitro-væskemedium, hvori celler dyrkes. Monoklonale antistoffer produceret af hybridoma-kulturerne af interesse udskilles i kulturmedium-omgivelserne. Derfor er den ovenstående 20 væske af kulturmedium for disse celler en foretrukken kilde til de monoklonale paratopiske molekyler og kan let fås fri for hybridoma-celler ved velkendte metoder. Eksempler på sådanne metoder er centrifugering med lav hastighed til sedimentering af celler fra det flydende medium.

25 Monoklonale paratopiske molekyler kan alternativt fås fra ascites-tumor-væske (ascitesvæske) af laboratoriedyr, hvori hybridoma-væv er indført. Begge metoder beskrives nedenfor.

Udtrykket "i det væsentlige samtidig" som anvendt 30 i den foreliggende beskrivelse i sammenhæng med blandingen af tre eller flere komponenter af antigen og parato-pisk molekyle til dannelse af en immunoreaktionsblanding betyder, at alle komponenterne er til stede og blandet i en enkelt blanding inden for ca. 15 minutter i forhold 35 til hinanden og fortrinsvis inden for ca. 5 minutter i forhold til en hvilken som helst blanding af to af komponenterne.

O

23 DK 173174 B1

Udtrykket "i det væsentlige alt" som anvendt i den foreliggende beskrivelse i sammenhæng med immunoreaktionen af et paratopisk molekyle og dets antigen-apolipoprotein A-I til dannelse af en immunoreaktant betyder, at det 5 paratopiske molekyle immunoreagerer med ca. 90% af antigenet til stede i opløsningen til dannelse af immunoreak-tanten, når det paratopiske molekyle er til stede i overskud .

B. Hybridomaer og monoklonale paratopiske molekyler 10 Den foreliggende opfindelse omfatter paratopiske molekyler, der udskilles af fem hybridomaer. Disse paratopiske molekyler immunoreagerer med apolipoprotein A-I. Apolipoprotein A-I-molekylet betegnes i den foreliggende beskrivelse også hyppigt apo A-I.

15 Blandt de fem hybridomaer foretrækkes især de, der har laboratoriebetegnelserne H91H4.2H8 og H103D8.1D11 og udskiller paratopiske molekyler betegnet AI-10 hhv.

AI-11. Hvert af de paratopiske molekyler AI-10 og AI-11 immunoreagerer med en bevaret antigen determinant på 20 apolipoprotein A-l og immunoreagerer med mindst ca. 90% 125 af I-HDL-partikler ved en væskefase-RlA. Som det fremgår af figur 1 og 2, bindes begge paratopiske molekyler AI-10 og AI-11 til apo A-l, men interfererer I det væsentlige ikke med hinandens binding.

25 De fem hybridomaer er deponeret hos American Type

Culture Collection (ATCC), Rockville, MD, den 16. september 1986. Laboratoriebetegnelserne, betegnelserne for de paratopiske molekyler og deres klasser samt ATCC-de-poneringsnumrene er anført nedenfor.

30

Laboratorie- Betegnelse for ATCC- hybridoma- paratopisk IgG- deponerings- betegnelse molekyle klasse nummer_ H91H4.2H8 AI-10 2a HB 9200 35 H103D8.1D11 AI-11 1 HB 9201 H105C7.1C10 AI-12 1 HB 9202 H105F4.1B4 AI-13 1 HB 9203 H114D12.2D8 AI-14 2a HB 9204

O

24 DK 173174 B1

Curtiss og Edgington (1985), J. Biol. Chem., 260: 2982-2993, beskriver immunokemisk heterogenitet af humant HDL samt fremstilling af tre hybridomaer, hvis monoklonale paratopiske molekyler immunoreagerer med apo A-I. Disse 5 monoklonale paratopiske molekyler, der betegnes AI-4, AI-7 og AI-9, immunoreagerer hver især med humant apo A-I og humane HDL-partikler ved væskefase-RIA, men udviser forskellige grader af immunoreaktivitet.

Undersøgelserne, som er beskrevet i den nævnte 10 artikel, viser indirekte immunopræcipitations-immuno- 125 reaktiviteter ved væskefase-RIA med I-HDL i overskud af antistof i % af total trichloreddikesyre-udfældelig radiomærkning på ca. 44% for AI-4, ca. 61% for AI-7 og ca. 32% for AI-9. Maksimal immunoreaktion af AI-4, AI-7 125 15 og AI-9 over for isoleret I-apo A-I ved væskefas&-RIA angives til ca. 60% for AI-4 og AI-7 og ca. 30% for AI-9.

Kombinationer af to eller tre af disse monoklonale paratopiske molekyler kan ikke immunopræcipitere 100% 20 af det mærkede HDL. Imidlertid kan kombinationer af to vilkårlige af disse monoklonale paratopiske molekyler med monoklonale paratopiske molekyler over for apolipo-protein A-II immunoreagere med 100% af det udfældelige 125I-HDL.

25 Som diskuteret nedenfor i afsnittet "Resultater” er immunoreaktiviteterne af de i den foreliggende beskrivelse beskrevne hybridomaer med både humant HDL og humant apo A-I betydeligt forbedrede i forhold til immunoreaktiviteterne rapporteret af Curtiss og Edgington (1985) ; 30 j. Biol. Chem., 260:2982-2993. Disse maksimale immunoreak-tiviteter over for HDL ved væskefase-RIA er ca. 30% eller mere større end Immunoreaktiviteterne rapporteret for AI-7, 125 som angiveligt immunoreagerer med ca. 60% af I-HDL. Hybridomaerne ifølge opfindelsen fremstilles ved 35 tre separate fusioner af muse-miltceller med celler af den ikke-sekreterende muse-myelomlinje P3x63Ag8.653.

Frisk naturligt eller frisk glutaraldehyd-tværbundet humant

O

25 DK 173174 B1 HDL anvendes som immunogener.

C. Metoder

Ifølge fremgangsmådeaspektet af den foreliggende opfindelse bestemmes tilstedeværelsen og om ønsket mæng-5 den af apolipoprotein A-I i en væskeprøve. Væskeprøven er vandig og kan være vand alene, en sammensætning af salte, en pufferopløsning eller en legemsvæske, såsom en blodprøve.

En flydende blodprøve anvendes ofte ved en frem-10 gangsmåde ifølge opfindelsen, hvor der ønskes en kvantitativ bestemmelse af apo A-I eller HDL. Prøven kan enten være serum eller plasma, idet resultater opnået ved anvendelse af begge har vist sig ikke at kunne skelnes statistisk fra hinanden. Således er nogle resultater, 15 som er angivet nedenfor, ved anvendelse af fremgangsmåden opnået ved anvendelse af gennemsnitsværdier opnået ved bestemmelser af både serum og plasma. Uafhængigt af, om der anvendes serum eller plasma, tilvejebringes den flydende blodprøve fortrinsvis fra personer, som har fastet i 20 mindst ca. 12 timer, således som det er kendt inden for teknikken. En sådan blodprøve betegnes en "fastende" prøve. Det bemærkes også, at når serum eller plasma anvendes som væskeprøve ved en kvantitativ bestemmelse, behøver prøven ikke at blive underkastet en demaskeringsbe-25 handling, som sædvanligvis gennemføres ved bestemmelse af apo A-I i sådanne prøver.

Det er overraskende, at nøjagtige og præcise resultater kan opnås ved anvendelse af de særligt foretrukne ELISA-metoder, der er beskrevet i den foreliggende be-· 30 skrivelse, under anvendelse af en flydende blodprøve, såsom plasma eller serum, fordi disse prøvematerialer indeholder proteiner, lipider og andre forbindelser, der kunne forventes at interferere med bestemmelsen, jf. f.eks.

Maggio, "Enzyme-Imminoassay", CRC Press, Inc., Boca Raton, 35 FL, 1980, side 65.

Til kvantitative målinger bestemmes mængden af apolipoprotein A-I under anvendelse af en forudbestemt

O

26 DK 173174 B1 mængde væskeprøve. Når væskeprøven er en flydende blodprøve, såsom plasma eller serum, er en demaskeringsbehandling, som er sædvanlig ved måling af apo A-I, ikke nødvendig, og prøven kan anvendes uden sådanne demaske-5 ringsbehandlinger.

Når der ønskes en kvalitativ bestemmelse, er det ikke kritisk, om brugeren kender det anvendte volumen af væskeprøve. Dog bør det anvendte prøvevolumen og apo A-I-koncentrationen naturligvis ikke være urimeligt store 10 i forhold til de anvendte reagenser og bør heller ikke være så små, at der søges tilstedeværelse af en urealistisk lille mængde apo A-I. For eksempel gennemføres nøjagtige og præcise kvantitative bestemmelser rutinemæssigt ved en ELISA-metode under anvendelse af prøver, der inde-15 holder ca. 10 til ca. 200 nanogram apo A-I. Kvalitative bestemmelser kan således udføres med endnu lavere mængder apo A-I.

I store træk omfatter fremgangsmåden blanding af en væskeprøve, der skal undersøges, med en effektiv mæng-20 de af paratopiske molekyler valgt blandt de ovennævnte fem monokTonale pafatopiske molekyler til dannelse af en blanding, Denne blanding holdes under biologiske bestemmelsesbetingelser i et forudbestemt tidsrum, der er tilstrækkeligt til, at de paratopiske molekyler immunoreagerer med apo-25 lipoprotein A-I, som er til stede i prøven, og danner en immunoreaktant. Tilstedeværelsen af en immunoreaktant bestemmes derefter, hvorved tilstedeværelsen af apolipopro-tein A-I i den oprindelige prøve bestemmes.

Det vil forstås, at den ovennævnte bestemmelse kan 30 være en fastfase- eller væskefase-bestemmelse eller enhver anden immunobestemmelse, således som det er velkendt.

Eksempler på væskefase- og fastfase-bestemmelser er illustreret nedenfor. Desuden kan der ved fastfase-bestemmelser enten bindes konkurrerende apo A-I (HDL) eller para-35 topiske molekyler til den faste fase.

Tilstedeværelsen af immunoreaktanten kan bestemmes på forskellige måder, der hver især Typisk udnytter et indikerende

O

27 DK 173174 B1 middel som beskrevet i den foreliggende beskrivelse.

I dette aspekt af opfindelsen indeholder de paratopiske molekyler imidlertid fortrinsvis et operativt bundet radioaktivt element som indikerende middel, og til-5 stedeværelsen af apolipoprotein A-I i den oprindelige prøve bestemmes ved at skille immunoreaktanten fra resten af blandingen og bestemme den udsendte stråling fra den fraskilte immunoreaktant.

I en anden udførelsesform for bestemmelsesmetoden 10 bindes de førstnævnte monoklonale paratopiske molekyler til en fast matriks til dannelse af en fast bærer, før blandingen foretages. De ikke-specifikt proteinbindende steder af den faste bærer blokeres. Immunoreaktanten, der dannes efter blandingen, bindes til den faste bærer 15 som en fastfase-bundet Immunoreaktant. I denne udførelsesform foretrækkes det, at tilstedeværelsen af en fastfase-bundet immunoreaktant bestemmes ved anvendelse af molekyler indeholdende indikerende middel, som er andre monoklonale paratopiske molekyler som diskuteret nedenfor.

20 Her blandes molekyler indeholdende indikerende middel i væskefase med den ovenfor anførte førstnævnte blanding til dannelse af en anden blanding.

Disse molekyler indeholdende indikerende middel immunoreagerer med en anden epitop af apolipoprotein 25 A-I, som Ikke I væsentlig grad er blokeret af immunoreak-tionen af de førstnævnte monoklonale paratopiske molekyler og er valgt blandt de ovennævnte monoklonale paratopiske molekyler, men er ikke de molekyler, der anvendes I den førstnævnte blanding. Et særligt anvendeligt par af mono-30 klonale paratopiske molekyler er de, der udskilles af hybridomaer med ATCC-deponeringsnumrene HB 9200 og HB 9201. De andre paratopiske molekyler bindes operativt til et indikerende middel, som fortrinsvis er et enzym. Det bundne indikerende middel kan være ethvert indikerende 35 middel som diskuteret i den foreliggende beskrivelse.

Den således dannede anden blanding holdes under biologiske bestemmelsesbetingelser i et forudbestemt tidsrum,

O

28 DK 173174 B1 der er tilstrækkeligt til, at de andre paratopiske molekyler bundet til indikerende middel immunoreagerer med apolipoprotein A-I, som er til stede i blandingen. De faste og flydende faser, der dannes efter blandingen af 5 begge paratopiske molekyler og dannelsen af deres immuno-reaktanter, adskilles. Tilstedeværelsen af apolipoprotein A-I bundet til indikerende middel I den fraskilte faste fase bestemmes, hvorved tilstedeværelsen af apolipoprotein A-I i prøven bestemmes. Immunoreaktanten, der dannes mel-10 lem et fastfase-bundet paratopisk molekyle, apo A-I-anti-genet og det andet paratopiske molekyle, hvortil der er bundet mærkning, betegnes undertiden i den foreliggende beskrivelse en sandwich-immunoreaktant.

De monoklonale paratopiske molekyler ifølge den 15 foreliggende opfindelse er også anvendelige til kvantitative bestemmelser af mængden af apolipoprotein A-I i en væskeprøve, især en flydende blodprøve, såsom serum eller plasma, som ovenfor anført. Når der ønskes kvantitative resultater, foretages der generelt trin, der ligner 20 de ovenfor skitserede for fastfase-bestemmelsen.

Ved en kvantitativ analyse af mængden af apolipoprotein A-I dannes der således en første fastfase-væske-fase-blanding ved blanding af en forudbestemt kendt mængde af en væskeprøve, såsom plasma eller serum, der ikke er 25 blevet underkastet en demaskeringsbehandling, med en fast bærer, der i det væsentlige består af en fast matriks, der har fastfase-bundne første monoklonale paratopiske molekyler, som immunoreagerer med apo A-I. Disse fastfase-bundne første monoklonale paratopiske molekyler er til 30 stede i overskud i forhold til den mængde apo A-I, der forventes i prøven, og er udskilt af en af hybridomaerne med ATCC-deponeringsnumrene HB 9200 eller HB 9201. Ikke-specifikke proteinbindende steder på overfladen af den faste bærer blokeres før blandingen.

35 Denne første fastfase-væskefase-blanding holdes under biologiske bestemmelsesbetingelser i et forudbestemt tidsrum, der er tilstrækkeligt til, at de første paratopiske

O

29 DK 173174 B1 molekyler immunoreagerer med apolipoprotein A-I, som er til stede i prøveportionen og danner en fastfase-bundet immunoreaktant, der i det væsentlige indeholder alt apolipoprotein A-I, som er til stede i prøven.

5 Apo A-I i prøven blandes også med andre monoklonale paratopiske molekyler i væskefase, der immunoreagerer med apolipoprotein A-I til dannelse af en anden blanding.

Disse andre monoklonale paratopiske molekyler udskilles af en af hybridomaerne med ATCC-deponeringsnumrene HB 10 9200 eller HB 9201, men anvendes ikke i den førstnævnte blanding. Disse andre paratopiske molekyler er også operativt bundet til et indikerende middel i form af et enzym. De paratopiske molekyler, der anvendes i dette trin, er således de andre af de to paratopiske molekyler, 15 der er nævnt i det ovenfor anførte første blandingstrin.

Den således dannede anden blanding holdes under biologiske bestemmelsesbetingelser i et forudbestemt tidsrum, der et tilstrækkeligt til, at de andre enzym-bundne paratopiske molekyler danner en sandwich-immunoreaktant, 20 som i det væsentlige Indeholder alt apolipoprotein A-I i prøveportionen.

Den faste og den flydende fase, der fremkommer ved blanding af de to paratopiske molekyler og dannelsen af immunoreaktanter mellem de to paratopiske molekyler og 25 apo A-I, adskilles ved f.eks. skylning, og mængden af sandwich-immunoreaktant indeholdende apolipoprotein A-I, hvortil der er bundet indikerende middel, som er til stede i den fraskilte faste fase, bestemmes. Da begge de to monoklonale paratopiske molekyler immunoreagerer med i 30 det væsentlige alt apo A-I, som er til stede i prøveportionen, og da mindst ét af de paratopiske molekyler immunoreagerer med en ikke-krydsreaktiv bevaret epitop på apo A-I, giver bestemmelsen af mængden af enzym-bundet apo A-I i inununoreaktanten en bestemmelse af mængden af 35 apolipoprotein A-I, som er til stede i prøveportionen.

Mængden af apolipoprotein A-I i prøven kan let beregnes med kendskab til volumenet af den oprindeligt anvendte DK 173174 B1 30 o forudbestemte mængde af flydende prøveportion.

Fastfase-bestemmelserne af apolipoprotein A-I, der er diskuteret ovenfor, kan hver især gennemføres med successiv gennemførelse af hvert af blandings- og holde-5 trinene i hver bestemmelse, eller de to blandingstrin i hver bestemmelse kan gennemføres i det væsentlige samtidig, idet de to holdetrin i hver bestemmelse gennemføres sammen som allerede anført.

Når trinene gennemføres successivt, foretrækkes det, 10 at de fastfase-bundne monoklonale paratopiske molekyler blandes, og den dannede blanding holdes før iblandingen af de paratopiske molekyler bundet til indikerende middel af enzym, og den fremkomne blanding holdes. Når de foretrukne successive trin følges, foretrækkes det endvidere, 15 at de dannede faste og flydende faser adskilles, og den faste fase skylles for at sikre adskillelsen, før de paratopiske molekyler bundet til indikerende middel af enzym i væskefase blandes med den fraskilte faste fase, og denne blanding holdes.

20 Det bemærkes også, at de paratopiske molekyler bundet til indikerende middel af enzym først kan blandes med den pågældende prøve. Når fremgangsmåden gennemføres på denne måde, sker der ingen adskillelse af faser før iblandingen af de fastfase-bundne monoklonale paratopiske 25 molekyler.

Mest foretrukket blandes de fastfase-bundne monoklonale paratopiske molekyler, væskeprøven og de paratopiske molekyler bundet til indikerende middel af enzym hver for sig i det væsentlige samtidig, og de fremkomne 30 fastfase-væskefase-blandinger holdes sammen. Således hol des blandingen i et tidsrum, der er tilstrækkeligt til, at de fastfase-bundne monoklonale paratopiske molekyler danner fastfase-bundne immunoreaktanter med i det væsentlige alt apo A-I, og at de paratopiske molekyler bundet 35 til indikerende middel af enzym i væskefase også immuno-reagerer med i det væsentlige alt apo A-I i prøven. Den således dannede immunoreaktant betegnes en fastfase-bundet

O

31 DK 173174 B1 sandwich-immunoreaktant. En væskefase er også til stede.

Lignende resultater opnås ved anvendelse af enhver af de to monoklonale paratopiske molekyler som de fast-fase-bundne paratopiske molekyler ved de respektive be-5 stemmelser. Imidlertid er det meste af arbejdet, som er diskuteret i den foreliggende beskrivelse, gennemført ved anvendelse af molekylerne udskilt af hybridomaet med ATCC-deponeringsnummeret HB 9200 (AI-10) bundet til fastfase-matriksen til bestemmelse af apolipoprotein A-I.

10 Eksempler på faste matrikser, som er anvendelige ved de ovenfor anførte fremgangsmåder, er velkendte inden for teknikken og omfatter en fast matriks, såsom en 96-huls mikrotiterplade forhandlet under betegnelsen "Falcon Microtest III Flexible Assay Plates” (Falcon Plastics, 15 Oxnard, CA) eller en mikrotiterstrimmel indeholdende 12 huller på række, såsom de strimler, der forhandles under betegnelsen "Immulon I og II" (Dynatech, Alexandria, VA) . Mikrotiterstrimmelen eller -pladen er fremstillet af et klart plastmateriale, fortrinsvis polyvinylchlorid eller 20 polystyren. Alternative faste matrikser til anvendelse ved en fremgangsmåde ifølge opfindelsen som ovenfor beskrevet omfatter polystyrenperler med en diameter på ca.

1 pm til ca. 5 mm, der kan fås fra Abbott Laboratories,

North Chicago, IL, polystyrenrør, -stænger eller -plader 25 af enhver bekvem størrelse og polystyrenlatex, hvis polystyrenpartikler har en størrelse på ca. 1 p og ved centrifugering kan skilles fra resten af latexen.

Den faste matriks kan også være fremstillet af forskellige materialer som tværbundet dextran, f.eks. "Se-30 phadex G-25, -50, -100, -200" og lignende, der kan fås fra Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ, agarose og tværbundet agarose, f.eks. "Sepharose 6B, CL6B, 4B, CL46" og lignende, der også kan fås fra Pharmacia Fine Chemicals.

35 Det indikerende middel kan være bundet direkte til et paratopisk molekyle ifølge opfindelsen, til et anvendeligt antigen eller kan omfat te et separat molekyle. Det

O

32 DK 173174 B1 indikerende middel kan være et separat molekyle, såsom antistoffer, der bindes til paratopiske molekyler ifølge opfindelsen, såsom gede- eller kanin-anti-muse-antistof-fer. Staphylococcus aureus protein A, der undertiden 5 i den foreliggende beskrivelse betegnes protein A, kan også anvendes som separat molekyleindikator eller mærkningsmiddel, når hele eller i det væsentlige hele paratopiske molekyler ifølge opfindelsen anvendes, dvs. hvor et molekyle indeholdende den del af Fc-regionerne af parato-10 piske molekyler, der er bundet til protein A, anvendes.

Ved sådanne anvendelser indeholder protein A selv en mærkning, såsom et radioaktivt element eller et fluoro-chrom-farvestof.

Radioaktive elementer udgør en gruppe af mærkninger, 15 der er særlig anvendelig. Eksempler på radiomærkningsmidler, der kan anvendes ved opfindelsen, er et radioaktivt element, der producerer gammastråling. Grundstoffer,som 124 125 128 selv udsender gammastråler, såsom I, I, I, 131 132 51 I, I og Cr, udgør en gruppe af indikerende grup-20 per af radioaktivt element udsendende gammastråling.

En anden gruppe af anvendelige indikerende grupper er sådanne grundstoffer som 11c, 18F, 150 og 13N, som selv udsender positroner. De således udsendte positroner danner gammastråler ved sammenstød med elektroner, som er til 25 stede i blandingen.

Et radioaktivt monoklonalt paratopisk molekyle kan typisk fremstilles ved at isolere det monoklonale paratopiske molekyle og derefter mærke det paratopiske molekyle med et af de ovenfor anførte eller andre egnede 30 radioaktive grundstoffer som beskrevet i US patentskrift nr. 4.381.292. Et eksempel på et indikatormærkningsmiddel er et fluorescerende mærkningsmiddel, der kan være kemisk bundet til antistoffer eller antigener uden at denaturere dem til dannelse af et fluorochrom (farvestof), som er 35 et nyttigt immunofluorescens-sporstof. Egnede fluoresce rende mærkningsmidler er fluorochromer, såsom fluorescein-isocyanat (FIC), fluorescein-isothiocyanat (FITC), di-

O

33 DK 173174 B1 methylamino-naphthalen-S-sulfonylchlorid (DANSC), tetra-methylrhodamin-isothlocyanat (TRITC), lissamin-rhodamin B200-sulfonylchlorid (RB 200 SC) og lignende. Immuno-fluorescens-analysemetoder beskrives i DeLula, "Immuno-5 fluorescence Analysis", i Antibody As A Tool, Marchalonis et al., eds., John Wiley & Sons, Ltd., s. 189-231 (1982).

Et enzym er et særligt foretrukket indikerende middel. Når der anvendes et enzym, bindes det fortrinsvis direkte til et paratopisk molekyle ifølge opfindelsen io til dannelse af et konjugat.

Det skal forstås, at anvendelige enzymmolekyler eller andre indikerende midler bundet til et paratopisk molekyle er operativt bundne. Funktionen af enzymet eller en anden mærkning forringes således ikke væsentligt af 15 bindingen eller af det paratopiske molekyle, og funktionen af det monoklonale paratopiske molekyle, hvortil enzymet eller en anden mærkning er bundet, forringes heller ikke af denne binding eller af tilstedeværelsen af enzymet eller en anden mærkning.

20 Enzym-indikeringsmidlet er et biologisk aktivt enzym, såsom peberrodperoxidase (HRPO) eller glucoseoxi-dase eller lignende. Når det indikerende middel er et enzym, såsom HRPO eller glucoseoxidase, kræves der som det er kendt yderligere reagenser for at gøre det synligt, 25 at der er dannet et antistof-antigen-kompleks. Sådanne yderligere reagenser for HRPO omfatter hydrogenperoxid og et oxidationsfarvestof-forstadium, såsom diaminoben-zidin. Yderligere reagenser, som er anvendelige sammen med glucoseoxidase, omfatter glucose og 2,2'-azino-di-(3-30 -ethylbenzthiazolin-6-sulfonsyre) (ABTS).

Metoder til operativ binding af et enzym til et paratopisk molekyle til dannelse af et konjugat er velkendte. Eksempler på metoder er anført i Maggio, Enzyme-Immunoassay, kapitel 4 af Kabakoff, CRC Press, Boca Raton, 35 fl (1980), side 71-104.

De monoklonale paratopiske molekyler kan anvendes således, som de fås fra hybridoma-ovenstående væske eller

O

34 DK 173174 B1 som ascitesvæske. Det foretrækkes imidlertid at anvende rensede paratopiske molekyler.

Flere metoder til rensning af paratopiske molekyler er velkendte inden for teknikken, og der anvendes typisk 5 chromatografiske metoder. Hurtig protein-væske-chromato-grafi (FPLC) er den foretrukne rensningsmetode ved den foreliggende opfindelse.

De enzym-bundne paratopiske molekyIkonjugater tilvejebringes til blandingerne i den flydende fase. Disse 10 molekyler er typisk opløst i et vandigt præparat. Typiske præparater indeholder puffersalte, således som det er tilfældet med f.eks. de rensede præparater indeholdende monoklonalt antistof, der anvendes ved opfindelsen og indeholder phosphatpufret saltopløsning (PBS) som et 15 fortyndingsmiddel. Fortyndet ascitesvæske er også anvendelig.

Som ovenfor anført blokeres ikke-specifikke proteinbindingssteder på overfladen af fastfase-bæreren. De fastfase-bundne paratopiske molekyler bindes således f.eks.

20 ved adsorption eller andre velkendte metoder til binding til den faste matriks. Derefter blandes en vandig opløsning af et protein, der er frit for interferens med bestemmelsen, såsom kvæg-, heste- eller andet serumalbumin, der også er frit for forurening med humant apo A-I, med 25 den faste fase til adsorbering af det blandede protein på overfladen af den faste bærer indeholdende paratopiske molekyler ved proteinbindingssteder på overfladen, der ikke er optaget af de monoklonale paratopiske molekyler.

En typisk vandig proteinopløsning indeholder ca.

30 3 til ca. 10 vægt-% kvægserumalbumin i PBS ved en pH-værdi på 7,1-7,5. Blandingen af vandig proteinopløsning og fast bærer holdes typisk i et tidsrum på mindst 1 time ved 37°C, og den fremkomne faste fase skylles derefter fri for ikke-bundet protein.

35 Den flydende blodprøve kan være plasma eller serum som allerede nævnt. Denne prøve fortyndes fortrinsvis i et forhold på ca. 1:2500 til ca. 1:20.000, især ca.

O

35 DK 173174 B1 1:5000, før anvendelsen, således at der fås lineære resultater ved bestemmelserne, som beskrives nærmere nedenfor. Anvendelsen af en ringere fortynding kan give for meget af apolipoprotein-antigenet i blandingen og for-5 ringe lineariteten af bestemmelsesresultaterne og nedsætte eller eliminere overskuddet af fastfase-bundne paratopiske molekyler i forhold til det iblandede antigen. Anvendelse af fortyndinger på mere end ca. 1:20.000 virker i retning af at nedsætte nøjagtigheden.

10 De anvendte holdetider kan varieres inden for vide grænser med ringe variation i resultaterne, så længé der anvendes en minimumstid på ca. 30 minutter ved omgivelsestemperatur (ca. 20-25°C). Når man ønsker at anvende en minimumsholdetid på 30 minutter, foretrækkes det, at den 15 holdte blanding omrøres i dette tidsrum, således at der sikres en i det væsentlige fuldstændig Immunoreaktion mellem apolipoprotein A-I-antigenet og de monoklonale paratopiske molekyler. Når der anvendes længere holdetider, såsom 1 time eller mere ved stuetemperatur, er 20 omrøring ikke nødvendig. Den Ønskede omrøring kan let foretages ved hjælp af en Mgyro-shaker", der drives ved ca. 100 o/m. Alle bestemmelserne, som gennemføres kvantitativt, kan gennemføres ved anvendelse af holdetider for blandingen af paratopiske molekyler og prøve på ca.

25 30 minutter til ca. 60 minutter ved omgivelsestemperatur.

Mængden af apolipoprotein A-I-antigen, som er til stede i den undersøgte immunoreaktant, bestemmes ved blanding af den fraskilte faste fase indeholdende enzym-bundet apolipoprotein med en forudbestemt mængde synliggørelses-30 reagens eller reagenser. Når HRPO anvendes som enzymindikerende middel, blandes synliggørelsesreagenser, såsom hydrogenperoxid og et oxidationsfarvestof-forstadium, såsom o-phenylendiamin (OPD), som er til stede i et vandigt medium, med den fraskilte fastfase-bundne immuno-35 reaktant. Den således dannede blanding holdes under biologiske bestemmelsesbetingelser i et forudbestemt tidsrum, såsom ca. 30 minutter ved omgivelsestemperatur, til ud-

O

36 DK 173174 B1 vikling af farve. Farveudviklingen stoppes derefter ved iblanding af et stoppereagens, såsom 4N svovlsyre. Den optiske tæthed af blandingen aflæses derefter, sammenlignes med en standardkurveværdi, og mængden af apolipo-5 protein bestemmes, således som det er velkendt.

Når den faste bærer og den flydende blodprøve er fremstillet, kan en kvantitativ bestemmelse således gennemføres ved omgivelsestemperatur på et tidsrum på ca. 1 time, dvs. 30 minutters holdetid under omrøring for blan-10 dingen dannet af paratopiske molekyler og prøven og en apden 30 minutters holdetid til udvikling af farve. Det er faktisk ikke nødvendigt at fremstille den faste bærer umiddelbart før hver anvendelse* Derimod kan sådanne bærere som beskrevet i den foreliggende beskrivelse fremstilles og opbevares i 15 fugtig tilstand og tildækket under sædvanlige kølebetingelser i et tidsrum på mindst 1 måned før anvendelsen.

Ved den kvantitative bestemmelse af apo A-I anvendes en standard, som de optiske tæthedsværdier, der fås ved ELISA-bestemmelserne, sammenlignes med til beregning 20 af koncentrationerne af apolipoprotein. Ved bestemmelsen anvendes en sekundær standard, dvs. i stedet for at anvende et bestemt HDL eller apo A-I som standard anvendes der ved bestemmelsen poolet humant HDL som standard. Den sekundære standard anvendes på grund af den relative 25 ustabilitet af det primære apolipoprotein A-I eller HDL ved oplagring. Kottke et al. bemærkede også nedbrydning af renset apo A-I anvendt som primær standard og anvendte en sekundær standard ved deres RIA-bestemmelser med poly-klonalt serum for apo A-I. Au et al. (1986), Clin. Chert.

30 32:1394-1397.

De sekundære standarder fås som frysetørrede, podede humane "fastende" plasmaer indeholdende HDL (apo A-I) og rekonstitueres før anvendelse. Hver af standarderne er selv standardiseret mod primære HDL- eller apo A-I-35 standarder. Et eksempel på en procedure er illustreret for apolipoprotein A-I i afsnittet "Materialer og metoder".

DK 173174 B1 37 o D. Diagnostiske systemer

Den foreliggende opfindelse angår også et diagnostisk system, typisk i form af et sæt, der kan anvendes til gennemførelse af de ovenfor beskrevne fremgangsmåder.

5 Systemet omfatter en pakning, der indeholder et af de ovenfor beskrevne monoklonale paratopiske molekyler, der Immunoreagerer med apo A-I. Pakningen indeholder en tilstrækkelig mængde af disse paratopiske molekyler til gennemførelse af mindst én bestemmelse af apo A-I.

10 Bestemmelsessystemet indeholder mere foretrukket yderligere et indikerende middel, som operativt er bundet til de ovennævnte paratopiske molekyler eller er bundet til et andet molekyle, der er i stand til at vise immunoreaktion af de ovennævnte paratopiske molekyler 15 med apo A-I.

Mest foretrukket er systemet egnet til anvendelse ved kvantitativ bestemmelse af mængden af apo A-I, som er til stede i en flydende blodprøve. Et sådant system omfatter en første pakning indeholdende en fast bærer, 20 der i det væsentlige består af en fast matriks, der har bundne monoklonale paratopiske molekyler, der immunoreagerer med apo A-I, og hvis ikke-specifikke proteinbindingssteder er blokerede. Systemet omfatter endvidere en anden pakning, der indeholder et enzym-bundet monoklo-25 nalt paratopisk molekylkonjugat, der immunoreagerer med apo A-I. Der anvendes de samme to paratopiske molekyler i dette system som diskuteret ovenfor i sammenhæng med den kvantitative apo A-I-bestemmelse.

Fastfase-matrikserne i det ovennævnte diagnostiske 30 system kan være enhver af fastfase-matrikserne, der er diskuteret ovenfor. Mikrotiterhuller, såsom hullerne af de ovenfor beskrevne 12-huls strimler og 96-huls plader er særligt foretrukne. Ikke-specifikke bindingssteder på de faste bærere er blokeret som ovenfor diskuteret.

35 Den faste matriks kan være en beholder for de fast- fase-bundne monoklonale paratopiske molekyler i denne udførelsesform. Typiske beholdere til de enzym-bundne

O

38 DK 173174 B1 monoklonale paratopiske molekyler er glas eller flasker fremstillet af glas eller et plastmateriale, såsom poly-ethylen eller polypropylen.

Ved anvendelse af en mikrotiterplade som et eksem-5 pel på en fast matriks og hele monoklonale antistoffer AI-10 som de fastfase-bundne monoklonale paratopiske molekyler, serum som den flydende blodprøve og hele monoklonale antistoffer AI-11 bundet til HRPO, omfatter et eksempel på et mere foretrukket diagnostisk system 10 i sæt-form følgende: a) en fast bærer, der i det væsentlige består af en mikrotiterplade, der har monoklonalt antistof AI-10 bundet dertil i en tilstrækkelig mængde til gennemførelse af en bestemmelse af mængden af apolipoprotein A-I, som 15 er til stede i en serumprøve, og hvis ikke-specifikke proteinbindende steder på overfladen er blokeret, og b) en separat pakning, der indeholder en vandig opløsning indeholdende monoklonalt antistof AI-11 operativt bundet til HRPO, der er til stede i en tilstrækkelig 20 mængde til gennemførelse af en bestemmelse af mængden af apo A-I, som er til stede i en serumprøve.

Mest foretrukket omfatter et diagnostisk system de ovennævnte komponenenter og én eller flere af følgende: (i) et forråd af hydrogenperoxid med kendt koncentration, 25 (ii) et oxidationsfarvestof-forstadium, såsom OPD, til synliggørelse, (iii) en opløsning af et stoppemiddel, såsom 4N svovlsyre, til standsning af farvedannelsesreak-tionen, (iv) én eller flere puffere i tør form eller væskeform til anvendelse ved bestemmelsen, (v) materialer 30 til fremstilling af standard-referencekurver, og (vi) vejledning til gennemførelse af bestemmelserne. Hver af de umiddelbart ovenfor nævnte komponenter er til stede i det diagnostiske system i en tilstrækkelig mængde til gennemførelse af mindst én bestemmelse, og disse komponen-35 ter er pakket separat efter behov.

II. Resultater

Som ovenfor anført immunoreagerer de paratopiske

O

39 DK 173174 B1 molekyler udskilt af hver af de deponerede hybridomaer med både HDL og apo A-I. Typiske resultater, som fås ved en væskefase-RIA for immunoreaktionen af hver af disse monoklonale paratopiske molekyler med HDL og 5 apo A-I, er vist i tabel IA og IB nedenfor som procent- 125 dele af det totale trichloreddikesyre-udfældelige I--HDL.

Tabel IA

io Maksimal lmmunopræclpitation med 125I-HDL ved væskefase-RIA (%)

Monoklonale paratopiske FPLC- 1) 25 2 35 4) 15 molekyler Ascites Ascites * Ovenstående væske AI-10 92,6 85,9 27,0 AI-11 100,0 93,0 85,0 AI-12 89,7 94,0 87,0 AI-13 93,1 93,1 81,0 20 AI-14 91,4 91,4 34,0 ^ Paratopiske molekyler i væskefase blandes med 125I-125 -HDL eller I-apo A-I i væskefase.

2) 25 Muse-ascitesvæske anvendes som kilde til de nævnte paratopiske molekyler.

Muse-ascitesvæske renset ved hurtig protein-væske-chromatografi (FPLC) anvendes som kilde til de nævnte 30 paratopiske molekyler.

^ Den ovenstående væske fra hybridoma-cellekultur anvendes som kilde til de nævnte paratopiske molekyler.

35 DK 173174 B1 40 o

Tabel IB

Maksimal immunopræcipitation med ^ I-Apo-I ved væskefase-RIA (%) 5 Monoklonale paratopiske FPLC- molekyler*^ Ascites2^ Ascites2'3^ Ovenstående væske4^ AI-10 64,7 70,2 88,0 AI-11 48,8 60,4 41,0 10 AI-12 43,8 46,1 44,0 AI-13 53,0 48,1 35,0 AI-14 22,0 34,9 30,0 1/2,3,4) ge f0<3n0ter til tabel IA.

15

Som det fremgår af resultaterne i tabel IA ovenfor, imraunoreagerer de paratopiske molekyler ifølge den fore- 125

liggende opfindelse i meget større omfang med I-HDL

end antistofferne, som er beskrevet af Curtiss og Edging- 20 ton (1985), J. Biol. Chem. 260:2982-2993. Resultaterne ovenfor illustrerer også en generelt forøget immunoreak-125 tivitet med I-apo A-I i sammenligning med de immuno-reaktiviteter mod det samme antigen, der er rapporteret af Curtiss og Edgington. Desuden har yderligere forsøg 25 vist, at alderen af standarden kan have stor indflydelse på de opnåede resultater.

Der er også gennemført en undersøgelse under anvendelse af forskellige kombinationer af de tre anti-apo A-I- og anti-apo A-II-monoklonale antistoffer ifølge 30 Curtiss og Edgington i sammenligning med AI-10 og AI-11 ifølge den foreliggende opfindelse ved en ELISA-bestemnjel-se af apo A-I i blodprøver. De fleste af disse sammenligninger giver sammenlignelige resultater. Imidlertid giver flere prøver og især blodprøver fra CAD-patienter 35 afvigende resultater ved sammenligning af bestemmelsen ifølge opfindelsen og bestemmelser gennemført ved andre metoder. Nogle af disse sammenlignelige hhv. afvigende

O

41 DK 173174 B1 resultater er vist i tabel II nedenfor for to kombinationer af de monoklonale antistoffer ifølge Curtiss og Edgington.

5 Tabel II

Sammenligning af apo A-I-niveauer målt ved ELISA1*

Apo A-I- C&E-Mab CaE-Mab AI-10 10 prøve1* Com. I2* Com. 23* AI-II4) 1 (105) 46,0 49,0 84,3 2 (120) 80,0 77,0 131 3 71,6 N.D.5 158 4 73,8 N.D.5 151 15 5 110 89,0 160 6 60,0 122 86,2 7 29,0 49,0 130 8 29,0 50,0 138 9 (159) 151 7 158 20 ** Mængder af apo A-I i mg pr. dl som målt ved ELISA under anvendelse af de generelle sandwich-ELISA-métoder, der er diskuteret i den foreliggende beskrivelse.

25 ' Apo A-I-holdige prøver er tilvejebragt kommercielt 2 [nr. 1 (Calbiochem-Behring), nr. 2 (International Union of Immunological Standards; IUIS), nr. 6 (Isolab-elek-troforese-prøve) og nr. 9 (Omega)} fra normale personer uden symptomer (nr. 3, 4 og 5) eller CAD-patienter (nr.

30 7 og 8). Tallene i parentes er mængden af apo A-I, som 3 er til stede ifølge producenten.

4 3 ) ELISA gennemføres under anvendelse af en blanding af monoklonale antistoffer ifølge Curtiss og Edgington 35 (C4E Mab) AI-4, AI-7 og AII-1 bundet til den faste matriks, 5 og monoklonalt AI-4 bundet til HRPO som det andet monoklonale antistof indeholdende indikerende middel.

4)

O

42 DK 173174 B1 ' ELISA som anført i fodnote 3 under anvendelse af de monoklonale antistoffer AI-7, AI-9 og AII-1 bundet til den faste matriks og HRPO-bundet AI-4 som det andet monoklonale antistof.

5 51 ELISA som i fodnote 3 under anvendelse af monoklonale paratopiske molekyler ifølge opfindelsen. AI-10 er bundet til den faste matriks, medens HRPO-bundet Al-11 anvendes som det andet monoklonale paratopiske 10 molekyler.

N.D. = ikke bestemt.

7) J Den opnåede værdi ligger over bestemmelsens område.

15

Medens de ovenfor anførte resultater viser, at anvendelsen af de her omhandlede paratopiske molekyler giver andre resultater end anvendelsen af antistofferne ifølge Curtiss og Edgington i de afvigende prøver, viser resul-20 taterne ikke, hvilke af resultaterne der er korrekte.

Resultaterne sammenfattet i tabel III nedenfor viser, at resultaterne, der opnås under anvendelse af de paratopiske molekyler ifølge den foreliggende opfindelse, er korrekte for disse afvigende prøver i sammenligning med resultater-25 ne, der opnås ved anvendelse af antistofferne ifølge Curtiss og Edgington.

Resultaterne sammenfattet i tabel III er opnået ved anvendelse af serum og/eller plasma fra 30 normale personer uden symptomer (femten mænd og femten kvinder) og 30 den kvantitative sandwich-bestemmelse, der er beskrevet i beskrivelsen. Bestemmelserne er også gennemført under anvendelse af to kommercielt tilgængelige RIA (RIA-I og RIA-II) og to kommercielt tilgængelige RID (RID-I og RID-II). En prøve fra hver person måles ved hver bestem-35 melse.

O

43 DK 173174 B1

Tabel III

Sammenfatning af sammenlignende apo A-I-værdier opnået ved anvendelse af forskellige metoder^ 5 ELISA2 RIA-I3 RIA-II4 RID-I5 RID-II6

Middel- værdi1 155 114 139 175 186 S.D.2 39,4 28,7 32,6 40,6 17,6 10 ^ Apo A-I-mængder i mg pr. dl.

2) ELISA-Bestemmelse gennemføresscm beskrevet i fodnote 15 5 til tabel II under anvendelse af serum og plasma.

3) RIA-I gennemføres under anvendelse af plasma og gennemføres med materialer fra Isotex Diagnostics,

Friendswood, TX, idet producentens anvisninger følges.

20 4) RIA-II gennemføres under anvendelse af serum og gennemføres med materialer fra Ventrex Laboratories, Inc., Portland, ME, idet producentens anvisninger følges.

25 ^ RID-I gennemføres under anvendelse af plasma og gen nemføres med materialer fra Tago Inc., Burlingame, CA, idet producentens anvisninger følges.

RIA-I gennemføres under anvendelse af serum og gen-30 nemføres med materialer fra Calbiochem-Behring, La Jolla, CA, Idet producentens anvisninger følges.

Middelværdi af apo A-I-værdier for alle tredive undersøgte prøver.

35 2 ' S.D. * standardafvigelse fra middelværdien.

O

44 DK 173174 B1

Som det fremgår af den ovenfor anførte sammenfatning, ligger middelværdien, der fås under anvendelse af den her omhandlede ELISA, ca. midtvejs mellem middelværdierne opnået med de to RIA (på den lave side) og de to 5 RID (på den høje side). Det fremgår således af den generelle gyldighed af resultaterne opnået under anvendelse af den her omhandlede ELISA, at resultaterne i tabel II opnået under anvendelse af AI-10 og AI-11 faktisk er korrekte.

10 Ved bestemmelserne ifølge den foreliggende opfin delse anvendes der ligesom ved alle andre bestemmelser en standard. Ved ELISA-bestemmelserne kan der anvendes en primær apo A-I eller HDL-standard, men der anvendes fortrinsvis en sekundær HDL-standard, fordi dette er 15 bekvemt og giver nøjagtige resultater.

Den anvendte sekundære standard fås ud fra poolet "fastende" plasma fra flere personer. Her anvendes typisk en pool af plasma fra tyve personer. Den sekundære standard er selv standardiseret mod en primær standard.

20 En primær apo A-I-standard anvendes sædvanligvis ikke, fordi sådanne standarder ikke har været stabile ved oplagring. Det antages, at det rensede protein eller glutamin- eller asparaginrester af proteinet kan deamine-res. Det samme antages at ske med renset HDL, når det 25 anvendes som primær standard.

Til yderligere validering af resultaterne, der fås under anvendelse af den sekundære standard ved kvantitative ELISA-bestemmelser ifølge opfindelsen, gennemføres en række af ELISA-bestemmelser under anvendelse af fast-30 fase-bundet AI-10 og HRPO-bundet AI-11 med forskellige kommercielt tilgængelige apo A-I-standarder. Disse resultater er anført i tabel IV nedenfor.

35

O

45 DK 173174 B1

Tabel IV

Kvantitative ELISA-bestemmelser under anvendelse af forskellige apo A-I-standarder1^ 5 Sekundær Primær Primær Primær

Prøve2) apo-A-I3^ std.-I4) std.-II5) std.-HI6) 1 122 104 128 105 2 . 127 108 132 122 3 71,0 66,0 80,0 78,0 10 4 169 137 168 172 5 77,0 70,5 86,0 85,5 6 94,0 83,5 102 96,5 7 150 123 152 163 8 129 109 134 162 15 9 166 135 166 164 10 176 142 174 172 11 101 - - 102 12 172 - - 171 13 167 - - 166 20 14 176 - - 174 15 177 - - 176 16 141 - - 141 17 192 - - 190 25

Apo A-I-mængder i mg pr. dl.

2)

Prøver fra laboratoriepræparater, som gaver eller fra kommercielle kilder (nr. 1-11) eller fra normale personer 30 uden symptomer (nr. 12-17). Det bemærkes, at prøve 12 er fra den samme person som prøve 3 i tabel II, ligesom prøve 15 er fra den samme person som prøve 5 i den nævnte tabel.

35 Sekundær HDL-standard som beskrevet i den foreliggende beskrivelse.

DK 173174 B1 46 o

Primær standard j, fra Meloy Laboratories, Springfield, VA.

5)

Primær standard II, fra Scripps Laboratories, La Jolla, 5 CA.

^ Primær standard III, fra Chemicon International, Inc.,

El Segundo, CA.

10 Som det fremgår af en vandret sammenligning af re sultaterne i tabel IV, opnås der lignende resultater med alle standarderne. Det fremgår også, at værdierne opnået under anvendelse af Meloy-standarden generelt er noget lavere end værdierne opnået under anvendelse af de andre 15 standarder. Det bemærkes endvidere, at værdien, der er oplyst af producenten af Meloy-standarden, er ca. det halve af den værdi, der findes ved en uafhængig analyse.

En serie af bestemmelser gennemføres over en periode på ca. 3 måneder under anvendelse af de ovenfor anførte 20 standarder til undersøgelse af reproducerbarheden (variationskoefficienten) af den kvantitative bestemmelse ifølge den foreliggende opfindelse. Variationskoefficienten viser sig at være ca. 11-13%.

Ved gennemførelsen af bestemmelserne ifølge den 25 foreliggende opfindelse anvendes der paratopiske molekyler bundet til Indikerende middel, der immunoreagerer med apo A-I, til at vise immunoreaktionen af apo A-I med andre monoklonale paratopiske molekyler. Da der er mere end et apo A-I-molekyle til stede pr. HDL-partikel, er 30 det uklart, om det er nødvendigt, at de fastfase-bundne paratopiske molekyler og de paratopiske molekyler bundet til indikerende middel immunoreagerer med forskellige epitoper på apo A-I til opnåelse af et nøjagtigt og præcist kvantitativt bestemmelsesresultat. Det foretrækkes 35 imidlertid, så længe begge paratopiske molekyler er i stand til at immunoreagere med i det væsentlige alt apo A-I eller HDL i en prøve, at hver af de to typer af mono-

O

47 DK 173174 B1 klonale paratopiske molekyler er frie for at inhibere immunoreaktionen af de andre monoklonale paratopiske molekyler.

Som det fremgår af de kompetitive immunoenzymome- 5 triske resultater i figur 1 og 2, immunoreagerer HRPO- mærket AI-10 med apo A-I og HDL. Resultaterne i figur 1

viser, at immunoreaktionen af mærket AI-10 med apo A-I

inhiberes af tilstedeværelsen af umærket AI-10, men ikke af tilstedeværelsen af umærket AI-11. Figur 2 viser et 10 lignende resultat ved anvendelse af HDL som fastfase-anti- gen. Sammenlignelige resultater fås også ved anvendelse af HRPO-mærket AI-11 sammen med umærket AI-10 og AI-11 sammen med apo A-I og HDL som antigen.

Yderligere undersøgelser af binding i flydende fase 125 125 15 under anvendelse af I-HDL og JI-apo A-I gennemføres under anvendelse af RIA-metoder som beskrevet generelt af Tsao et al. (1982), J. Biol. Chem. 257:15222-15228. Resultaterne af disse undersøgelser er anført i tabel V nedenfor som procentdele af total trichloreddikesyre-ud-20 fældelig radioaktivitet

Tabel V Væskefase- -immunoreaktivlteter af AI-10 og AI-11 25 Maksimal binding af antigen (%)

Paratopiske molekyler1^_125I-HDL2)_125I-Apo A-I2) AI-10 som:

Ovenstående væske 29,2 90,3 30 _ _

Ascites 92,6 FPLC-Ascites 86,0 70,2 AI-11 som:

Ovenstående væske 88,6 42,0 35 Ascites 100,0 49,0 FPLC-Ascites 93,0 60,4 ^ Paratopiske molekyler i væskefase fås fra ovenstående DK 173174 B1 48 o væske fra hybridomacelledyrkning (ovenstående væske), muse-ascitesvæske (ascites) og ascitesvæske renset ved hurtig protein-væskechromatografi (FPLC-ascites).

5 ^ Procent af trTchloréddikesyre-udfældelig radioaktivitet.

Resultaterne i tabel V viser den relativt høje binding af helt AI-10 og AI-11 til radiomærket HDL ved den anvendte væskefase-bestemmelse. Resultaterne viser også 10 den relative ustabilitet af og resulterende lave binding til apo A-I selv. Denne relative ustabilitet af apolipo-protein A-I har nødvendiggjort anvendelsen af en frysetørret plasmapool som sekundær standard ved apo A-I-bestemmelsen som ovenfor diskuteret. De ovennævnte resul-15 tater viser også en relativt lavere binding af AI-11 til apo A-I end til HDL-partikler. Ikke desto mindre viser en sammenligning af resultater opnået under anvendelse af ELISA-metoden for apo A-I med resultater opnået med de mere arbejdskrævende metoder som i tabel IV, at ELISA-20 metoden kvantitativt påviser i det væsentlige alt apo A-I (HDL), som er til stede i de undersøgte prøver.

Yderligere resultater, som er opnået under anvendelse af bestemmelsesmetoden, der er beskrevet ovenfor og beskrives mere detaljeret nedenfor i afsnittet "materialer 25 og metoder", diskuteres nedenfor. Hullerne af 96-huls mikrotiterplader af polystyren anvendes som fast matriks.

Hele monoklonale antistoffer AI-10 anvendes som de fast-fase-bundne første monoklonale paratopiske molekyler. Ikke-specifikke proteinbindende steder på overfladen af 30 den faste bærer blokeres med BSA. HRPO-Bundne hele monoklonale antistoffer AI-11 anvendes som monoklonale para-topiske molekyler nr. 2 og 4, idet OPD anvendes som oxidationsfarvestof-forstadium til synliggørelse.

Bestemmelserne af apo A-I gennemføres for 37 personer 35 uden symptomer og uden CAD-forhistorie. Disse personer betegnes "normale".

Apo A-I-værdierne fås under anvendelse af fortyndet

O

49 DK 173174 B1 plasma og serum som flydende blodprøver. Der findes ingen statistisk signifikante forskelle mellem værdierne for de to prøvekilder, og der anvendes et samlet gennemsnit af disse.

5 En sammenfatning af resultaterne for "normale" personer er anført i tabel VI nedenfor, både særskilt for de 23 mænd og 14 kvinder og som "kombinerede" værdier.

En lignende sammenfatning af apo A-I-værdier bestemt på serum og plasma fra 4 2 mænd, som er diagnosticeret klinisk 10 som havende CAD, er også anført i tabel VI.

Tabel VI

Normale apolipoprotein A-I-niveauer

Mand1^ Kvinder^- ^ Kombineret^ ^ 15 n = 23 n = 14 n B 37 middel = 143 middel = 152 middel - 147 S.D. = 26,5 S.D. » 10,7 S.D. » 22,0 S.D.-anråde = 116-170 S.D.-anråde = 141-163 S.D.-emråde = 125-169 CAD-patienter 20 n = 42 middel = 110 S.D, = 28,8 S.D.-anråde = 81,2-139 25 ^ n Betyder antallet af personer i hver undersøgelse.

Middel er apo A-I-middelværdien udtrykt i milligram pr. deciliter. S.D. er standardafvigelsen fra middelværdien.

S.D.-Området er bredden af én standardafvigelse på hver side af middelværdien. Bestemmelserne gennemføres som be-30 skrevet i afsnittet "Materialer og metoder".

Det fremgår af en gennemgang af de ovenfor anførte resultater og en sammenligning af disse resultater med resultaterne anført af Kottke et al. (1986), Mayo Clin.

Proc., 61:313-320, at middelværdierne af apo A-I for norma-35 le personer og CAD-patienter ved den ovenfor anførte be stemmelse ligner resultaterne anført af Kottke et al. Der fås lignende standardafvigelser for de to bestemmelsestyper. Denne lighed mellem resultaterne er overraskende af

O

50 DK 173174 B1 flere grunde. For det første anvendes der ifølge Kottke et al. en demaskeringsbehandling under anvendelse af et detergent ("Tween 20") til bestemmelserne, medens de her omhandlede flydende blodprøver er frie for sådanne be-5 handlinger. For det andet anvendes der ifølge Kottke et al. en radioimmunobestemmelse, som generelt anses for at være mere nøjagtig og præcis end en ELISA-bestemmelse som anvendt ved den foreliggende opfindelse, ~jf. Voller et al.

(1976), Bull. World Health Organ., 53:55-65. For det tred-10 je anvendes der ifølge Kottke et al. polyklonale antistoffer, som normalt anses for at være i stand til at give en forbedret immunoreaktion med det relativt heterogene apo A-I, medens der ved den foreliggende opfindelse anvendes monoklonale antistoffer. For det fjerde anvendes der iføl-15 ge Kottke et al. en holdetid på 16 timer ved stuetemperatur til immunoreaktionen af de polyklonale antistoffer med apo A-I, medens der ved den foreliggende opfindelse anvendes en periode på 30 minutter ved stuetemperatur.

III. Materialer o<t metoder 20 A. Lipoproteiner

Ved disse undersøgelser isoleres lipoproteiner fra plasma fremkommet ved plasmaforese af normalt "fastende" donorblod fra den lokale blodbank (San Diego Plasma Center, San Diego, CA). Til dette formål indstilles det så-25 ledes fremkomne plasma til at indeholde en slutkoncentra-tion på 5 mM benzamidin, 1 mM diisopropylfluorphosphat, 10 mM ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA), 10 mg/ml sojabønnetrypsininhibitor og 10.000 enheder/ml aprotinin. Lipoproteinerne isoleres derefter fra dette indstillede 30 plasma ved successiv ultracentrifugering under anvendelse af fast kaliumbromid (KBr) til vægtfyldeindstilling.

Det indstillede plasma centrifugeres først ved ca.

200.000 g i 18-24 timer. Der sættes fast KBr til bund- . laget, indtil vægtfylden er større end 1,063 g/ml. Den 35 fremkomne blanding lejres derefter under en 0,1% EDTA-opløsning indeholdende kaliumbromid med en vægtfylde på 1,063 g/ml og centrifugeres yderligere ved 200.000 g i mere

O

51 DK 173174 B1 end 48 timer.

Bundlaget fraskilles igen, og der tilsættes fast kaliumbromid, indtil vægtfylden er større end 1,21 g/ml.

Dette indstillede lag lejres under en 0,1%'s EDTA-opløs-5 ning indeholdende KBr med en vægtfylde på 1,21 g/ml og centrifugeres yderligere ved 200.000 g i mere end 48 timer.

Derefter fraskilles det øvre lag, og der tilsættes fast KBr, indtil vægtfylden er større end 1,063 g/ml.

10 Det indstillede øvre lag lejres under en 0,1%'s EDTA-op-løsning indeholdende KBr med en vægtfylde på 1,063 g/ml og centrifugeres yderligere ved 200.000 g i mere end 48 timer.

Mellemlaget fraskilles, og der tilsættes fast KBr, 15 indtil vægtfylden er større end 1,21 g/ml. Dette indstillede mellemlag lejres under en 0,1%’s EDTA-opløsning indeholdende KBr med en vægtfylde på 1,21 g/ml og centrifugeres ved 300.000 g i mere end 48 timer.

Det øvre lag, som betegnes højdensltets-lipoprotei-20 ner (HDL), fraskilles med en vægtfylde på 1,063 til 1,21 g/ml. Det fraskilte HDL dialyseres mod lipoprotein-puffer (LLB) indeholdende 150 mM NaCl, lmM EDTA, 0,005% a-toco-pherol og 5 mM benzamidin og opbevares under sterile betingelser i ikke mere end 21 dage.

25 B. Isolering af apoprotein A-X

Apoprotein A-l (apo A-I) oprenses fra delipideret HDL (diskuteret nedenfor) ved størrelsesfraktionering under anvendelse af højtryksvæskechromatografi (HPLC) ved proceduren ifølge Kinoshita et al. (1983), J. Bio-30 chem. 94:615-617. Ca. 300 mg ether/ethanol-delipideret HDL opløses i 200 ul 0,1%'s natriumdodecylsulfat (SDS), 0,1 M natriumphosphat (pH-værdi 7,0) og størrelsesfraktioneres på "Spherogel - TSK 3000 SWn-HPLC-søjler (Beckman Instruments Inc., Fullerton, CA). Fraktionerne inde-35 holdende det rensede apo A-I opbevares ved -20°C.

O

52 DK 173174 B1 C. Dannelse af monoklonale paratopiske molekyler

De fem monoklonale paratopiske molekyler fås ud fra tre separate fusioner af miltceller fra immuniserede Balb/c ByJ-mus (Scripps Clinic and Research Foundation 5 vivarium, La Jolla, CA), idet der anvendes standardprocedurer, som er omtalt i den foreliggende beskrivelse. Ovenstående væske fra dyrkning opsamles og screenes først ved fastfase-radioimmunobestemmelse og bliver derefter, hvis denne er positiv, screenet igen ved væskefase-radio-10 immunobestemmeIse som beskrevet nedenfor. Alle hybrido- maer klones mindst to gange ved grænsefortynding og opbevares i frosset tilstand i flydende nitrogen.

Kort fortalt immuniseres Balb/c ByJ-mus intraperi-tonealt (i.p.) med humant HDL som immunogen i komplet 15 Freund's adjuvans (CFA) efterfulgt af en anden og tredje immunisering, hver især med et interval på ca. 3 uger, i ukomplet Freund's adjuvans (IFA). Kun for hybridomaen AI-10 {ATCC HB 9200) tværbindes HDL først med glutaralde-hyd og injiceres derefter først med 500 enheder γ-inter-20 feron (γ-IFN) i CFA og uden γ-IFN ved den efterfølgende IFA-immunisering. Det glutaraldehyd-tværbundne HDL fremstilles ved at omsætte frisk HDL i phosphatpufret saltopløsning med glutaraldehyd ved en slutkoncentration på 0,04% ved 20°C i et tidsrum på 18 timer. For hybridomaerne 25 AI-11, AI-12, AI-13 og AI-14 (ATCC HB 9201, HB 9202, HB

9203 og HB 9204) gennemføres immuniseringerne med nativt HDL. Ca. 3 måneder efter den sidste immunisering under anvendelse af adjuvans modtager musene i alle tilfælde en præfusions-boosterinjektion intravenøst (i.v.) af 30 nativt HDL i normalt saltvand og en anden lignende præfusions-boosterinjektion 1 dag senere.

De således behandlede dyr aflives ca. 3 dage efter den sidste boosterinjektion, og milten udtages fra hver mus. Der fremstilles derefter en miltcellesuspension. os Miltcellerne udvindes derefter fra miltcellesuspensionen ved centrifugering i ca. 10 minutter ved 1000 o/m og 23°C. Efter fjernelse af den ovenstående væske resuspen-

O

53 DK 173174 B1 deres den fremkomne cellepellet i 5 ml kold ammoniumchlo-rid-lysepuffer og inkuberes i ca. 10 minutter.

Til den lyserede cellesuspension sættes 10 ml Dul-becco's Modified Eagle Medium (DMEM) (Gibco) og HEPES-5 -puffer [4-(2-hydroxyethyl)-1-piperidin-ethansulfonsyre]--puffer, og denne blanding centrifugeres i ca. 10 minutter ved 1000 o/m ved 23°C.

Den ovenstående væske dekanteres, og pelleten re-suspenderes i 15 ml DMEM og HEPES og centrifugeres i ca.

10 10 minutter ved 1000 o/m og 23°C. Den ovennævnte procedure gentages.

Pelleten resuspenderes derefter i 5 ml DMEM og HEPES.

En portion af miltcellesuspensionen fjernes derefter til tælling.

15 Fusionerne gennemføres på følgende måde under anven delse af den ikke-udskillende musemyelom-cellelinie P3x6 3Ag8.653,3, en subklon af linien P3x63Ag 8.653 (ATCC 1580). Ved anvendelse af et forhold mellem myelomceller og miltceller på ca. 1:10 eller ca. 1:5 centrifugeres en 20 tilstrækkelig mængde myelomceller til en pellet, vaskes to gange i 15 ml DMEM og HEPES og centrifugeres i 10 minutter ved 1000 o/m og 23°C.

Miltceller og myelomceller forenes i rundbundede 15 ml's rør (Falcon). Celleblandingen centrifugeres i 25 10 minutter ved 1000 o/m og 23°C, og den ovenstående væske fjernes ved opsugning. Derefter tilsættes 200 JiT 30%'s (vægt pr. volumen) vandig polyethylenglycol med en molekylvægt på 4000 (PEG, ATCC Baltimore, MD) ved ca. 37°C under anvendelse af en 1 ml’s pipette under kraftig omrøring til 30 brydning af pelleten, og cellerne blandes forsigtigt mellem 15 og 30 sekunder. Celleblandingen centrifugeres i 4 minutter ved 700 o/m.

Ca. 8 minutter efter tilsætningen af PEG sættes der langsomt 5 ml DMEM plus HEPES-puffer til pelleten 35 uden forstyrrelse af cellerne. Efter 1 minut opbrydes den fremkomne blanding med en 1 ml's pipette og inkuberes i yderligere 4 minutter. Denne blanding centrifugeres i 7

O

54 DK 173174 B1 minutter ved 1000 o/m. Den ovenstående væske dekanteres, der sættes langsomt 5 ml HT (hypoxanthin/thymidin)-medium til pelleten, og blandingen henstilles uforstyrret i 5 minutter. Pelleten opbrydes derefter i store stykker, og 5 den færdige cellesuspension anbringes i T75-kolber (2,5 ml pr. kolbe), hvori der i forvejen er anbragt 7,5 ml HT-medium. Den fremkomne cellesuspension inkuberes ved 37°C til dyrkning af de fusionerede celler. Efter 24 timer sættes 10 ml HT-medium til kolberne, og 6 timer senere 10 iblandes 0,3 ml 0,04 mM aminopterin. 48 Timer efter fusionen sættes der 10 ml HAT (hypoxanthin/aminopterin/thymi-din)-medium til kolberne.

3 Dage efter fusionen udplades levedygtige celler 4 i 96-huls vævskulturplader med ca. 2 x 10 levedygtige 15 celler pr. hul (i alt 768 huller) i HAT-puffermedium som beskrevet af Kennett et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol., 81:77 (1978). Cellerne fødes 7 dage efter fusionen med HAT-medium og med ca. 4-5 dages intervaller med HT--medium efter hehov. Væksten følges mikroskopisk, og den 20 ovenstående væske fra kulturen, som indeholder antistoffer, opsamles på dag nr. 14 til bestemmelse af produktionen af HDL-specifikt antistof ved fastfase-radioimmuno-bestemmelse (RIA) som beskrevet af Curtiss og Edgington (1982), J. Biol. Chem. 257:15213-15221.

25 De således fremstillede hybridomaer, der producerer anti-HDL-antistoffer, screenes og undersøges, og deres levedygtighed bestemmes. De her omhandlede hybridomaer er udvalgt fra ca. 30 hybridomakulturer, der udskiller anti-HDL-antistoffer i deres kulturmedier.

30 D. Fremstilling og rensning af paratopiske molekyler

Ascitesvæske fås fra 10 uger gamle Balb/c-mus, som er blevet forbehandlet med 0,3 ml mineralolie og har modtaget en intraperitoneal injektion af 3-50x105 hybridoma-celler. Det gennemsnitlige tidsrum for udvikling af asci-35 tes er 9 dage. Efter klaring ved centrifugering ved 15.000 g i 15 minutter ved 23°C pooles ascitesvæskerne fremstilet ved hjælp af hvert hybridoma og opbevares i frosset til-

O

55 DK 173174 B1 stand ved -20°C,

Rensede monoklonale paratopiske molekyler fra hver af de fem hybridomaer fås ved hurtig protein-væskechroma-tografi (FPLC), idet der anvendes en "Pharmacia Mono Q 5 HR5/5"-anionbyttersøjle (Pharmacia Fine Chemicals, Pisca- taway, NJ) og anvendes en 0-0,5 M natriumchlorid-gradient i 10 mM tris, pH-værdi 8,0, idet brugsanvisningen, som følger med søjlen, følges. De rensede monoklonale antistoffer koncentreres ved anvendelse af en omrørt Amicon-10 -ultrafiltreringscelle (Danvers, MA; PM 30-membran) til en koncentration på 1 mg/ml, dialyseres i PBS (phosphat-pufret saltopløsning, pH-værdi 7,2) og opbevares ved -70°C.

De monoklonale antistoffer AI-4, AI-7, AI-9 og AII-I fremstilles som beskrevet af Curtiss og Edgington (1985), 15 J. Biol. Chem. 260:2982-2993.

E. Radlolodering

Radioioderingen af HDL, apo A-I og immunokemisk renset gede-anti-muse-lg gennemføres enzymatisk ved anvendelse af "Enzymobead"-ioderingsproceduren og "Enzymo-20 beads" fra Biorad (Burlingame, CA). "Enzymobead"-ioderingen anvendes til at karakterisere antigenerne og antistofferne til fastfase-radioimmunobestemmelsen som diskuteret nedenfor.

G. Opløsningsmiddel-delipldering af lipoprotelner 25 Når det er nødvendigt, delipideres lipoprotelner ved organisk ekstraktion og betegnes delipiderede lipo-proteiner. Til dette formål dialyseres lipoproteinet, der skal analyseres, mod 0,01%’s EDTA med en pH-værdi på 7,5 natten over (ca. 18 timer).

30 Den fremkomne prøve dialyseres mod 0,003%’s H7EA i ca.

12 timer og frysetørres derefter til 10-20 mg protein pr. rør. Til hvert rør sættes 35 ml af en blanding af absolut ethanol og vandfri ether i forholdet 1:1 ved 4°C, og den fremkomne opløsning blandes.

35 Efter blandingen inkuberes opløsningen i 20 minutter ved -20°C. Opløsningerne centrifugeres derefter i 30 minutter ved 1000 g og 0°C, og den ovenstående væske dekanteres.

O

56 DK 173174 B1

Ethanol/ether-ekstraktionen som ovenfor beskrevet gennemføres yderligere to gange, således at der i alt gennemføres tre ekstraktioner. Derefter sættes 35 ml vandfri ether ved 4°C til prøven, og den holdes ved 5 -20°C i 30 minutter. Den kolde prøve centrifugeres ved 1000 g i 30 minutter og -20°C, og den ovenstående væske dekanteres og bortkastes. De fremkomne pellets tørres under anvendelse af nitrogengas.

H. Kvantitativ apo A-I (HDL)-sandwich-ELISA-bestem-10 melse 1. Primære standarder af apo A-I:

Kvantificering af HDL og Isoleret apolipo-protein A-I

HDL-Fraktionen (1,063-1,21 g/ml) fås fra poolet 15 humant plasma ved standard-ultracentrifugeringsmetoder og dialyseres i PBS. Den sterilfiltreres derefter gennem en 0,45 yrn. "Acrodisc"-filterenhed og opbevares ved 4°C. Proteinindholdet af HDL-fraktionen bestemmes ved en modificeret Lowry-proteinbestemmelse med BSA som standard.

20 Der gennemføres dobbeltbestemmelser af tre fortyndinger af HDL-fraktionen for at sikre aflæsninger inden for en lineær del af standardkurven. Der foretages f.eks. bestemmelser af HDL-fraktionen ved fortyndinger på 1:5, 1:10 og 1:20. Proteinkoncentrationen er sædvanligvis mellem 5 25 og 10 mg/ml. Til langvarig opbevaring fortyndes HDL-fraktionen med PBS til en proteinkoncentration på 1-2 mg/ml.

Efter fortynding bekræftes proteinkoncentrationen igen ved Lowry-bestemmelse ved fortyndinger på 1:2, 1:5 og 1:10. Den fortyndede HDL-fraktion opdeles derefter i por-30 tioner og opbevares ved 4°C.

Isoleret apolipoprotein A-I kan fås fra et antal kommercielle kilder. Selv om producenten typisk inkluderer en angivelse af proteinindhold og renhed, bekræftes proteinkoncentrationen altid ved Lowry-bestemmelse og juste-35 res 0m fornødent på basis af disse resultater. Fortyndinger af apo A-I-præparatet underkastes bestemmelser som beskrevet i det forudgående afsnit. Præparatet deles i

O

57 DK 173174 B1 portioner og oplagres som foreslået af producenten.

HDL- og/eller apo A-I-præparaterne undersøges derefter som ukendte prøver (fortyndet 1:5000) ved en apo A-I-ELISA-bestemmelse (beskrevet nedenfor). Der udføres 5 mindst to bestemmelsesplader pr. dag, indeholdende et komplet sæt af standarder, kvalitetskontroller og fortyndinger af HDL- og/eller apo A-I-præparaterne, over en fem dages periode. ELISA-Værdierne, der fås for HDL og/eller apo A-I afviger mindre end 20% fra Lowry-pro-10 teinbestemmelsesværdien. Hvis værdierne ligger uden for de etablerede grænser, gentages Lowry-bestemmelsen til bekræftelse af den angivne proteinkoncentration. Hvis værdierne stadig ikke stemmer overens, er der sædvanligvis tale om ældning eller forurening af præparatet, og 15 det anses ikke for egnet til anvendelse som primær standard.

Renheden af den primære standard bestemmes også ved analytisk natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgel-elektro-forese (SDS-PAGE).

20 2. Sekundære standarder af apo A-I, fremstilling

og værdibestemmelse ved ELISA

a. Fremstilling af frysetørret poolet standardplasma

Frisk plasma eller serum fås fra mindst 10 normo-25 lipidæmiske personer, som har fastet natten over. Phle-botomi gennemføres under anvendelse af sterile rør indeholdende dinatrium-EDTA ved ikke-traumatisk venepunktur. Prøverne centrifugeres ved 1500 g I 30 minutter ved 4°C, og plasmaet overføres til rene, tæt lukkede rør og opbe-30 vares i højst 24 timer ved 4°C. Lige store mængder af prøverne forenes, og portioner på 0,5 ml anbringes i syrerensede 5 ml's Wheaton-serumglas og frysetørres natten over (ca. 16-18 timer). Glassene forsegles og opbevares ved 4°C.

35 b. Rekonstituering af frysetørret poolet plasmastandard

Glassene får lov at antage stuetemperatur før rekon-

O

58 DK 173174 B1 stitueringen. Aluminiumringen og proppen fjernes således, at trykket i glasset langsomt får lov at stige til atmosfæretryk. Ved anvendelse af en præcisionspipette rekonstitueres de tørrede poolede standarder med 0,5 ml dob-5 belt-destilleret vand, idet vandet langsomt tilsættes ved en side af glassene. Propperne anbringes igen, og glassene omhvirvles hurtigt 3-4 gange og holdes ved stuetemperatur i mindst 30 minutter. Standarden omhvirvles eller omrystes ikke kraftigt, men omhvirvles blidt for 10 at sikre fuldstændig opløsning.

c. Bestemmelse af værdien af den sekundære standard af apo A-I

Apo A-I-værdien af den frysetørrede sekundære standard bestemmes ved apo A-I-ELISA under anvendelse af den 15 primære standard (enten HDL eller apo Α-Ϊ) som kalibreringsmiddel. ELISA-bestemmelsesproceduren er beskrevet i den foreliggende beskrivelse.

Den frysetørrede sekundære standard bestemmes tre gange som ukendt prøve på mindst to besteramelsesplader 20 pr. dag i mindst 10 dage, hvorved der fås mindst 20 værdier (middelværdier af tre forsøg). Gennemsnittet af alle de opnåede værdier for den sekundære standard beregnes, hvorved apo A-I-værdien i mg/dl fås.

Efter bestemmelse af værdien anvendes den sekundære 25 standard til at konstruere en standardkurve, der bestemmes på den samme ELISA-plade med en primær standardkurve med et komplet sæt af kontroller. Primære og sekundære standardkurver bestemmes på mindst 2 96-huls bestemmelsesplader pr. dag over en periode på 5 dage.

30 Når værdien af den sekundære standard er accepteret, konstrueres og bestemmes standardkurver på den samme ELISA-plade med den på det pågældende tidspunkt accepterede portion af frysetørret standard over en periode på 5 dage (2 bestemmelsesplader pr. dag).

35 3. Bestemmelse, generelt

Isolerede AI-10-molekyler bindes til væggene af poly-styren-mikrotiterpladehuller (Nunc-Immuno Plate 1; Irving

O

59 DK 173174 B1

Scientific, Santa Ana, CA) ved blanding af 0,15 ml af en natriumhydrogencarbonatpuffer med én’pH-værdi på 9,0 indeholdende 5 pg/ml AI-10 i hvert hul. Pladerne holdes i 18 timer ved 4°C og vaskes derefter 3 gange med PBS inde-5 holdende 0,1% BSA og 0,05% polyoxyethylen(20)sorbitan-monolaurat ("Tween 20"). Tilbageværende ikke-specifikt bindende steder blokeres derefter ved at blande 0,2 ml PBS indeholdende 10% BSA i hvert hul, holde blandingen i 1 time ved 37°C og derefter skylle. De således præparerede 10 huller kan anvendes i op til ca. 1 måned efter præpareringen, hvis de opbevares i et fugtigt kammer.

Humant HDL fortyndes i PBS til koncentrationer på 1,0 til 0,031 pg/ml til anvendelse som standard-kontrol-opløsninger. Som ovenfor anført anvendes der humant HDL 15 snarere end humant apo A-I som standard ved disse bestemmelser, fordi apo A-I har vist sig at være relativt ustabilt ved opbevaring, medens HDL synes at være relativt mere oplagringsstabilt. Prøver af plasma (eller serum) fortyndes til 1:5000 i PBS.

20 50 pi Standard eller prøve blandes hver gang i tre huller. Inden for 5 minutter derefter blandes 50 pi PBS indeholdende HRPO-mærkede paratopiske molekyler AI-11 i hvert hul. Immunoreaktionsblandingerne holdes i 30 minutter ved 25°C. Ikke-bundet materiale fraskilles der-25 efter fra hullerne ved vaskning som ovenfor beskrevet.

Mængden af fastfase-bundet sandwich-immunoreaktant indeholdende HRPO-mærkning bestemmes derefter ved iblanding af 0,1 ml frisk fremstillet substratopløsning (destilleret vand indeholdende 3% hydrogenperoxid og 0,67 30 mg/ml o-phenylendiamin) .

4. Trinvis apo A-I-HDL-sandwlch-ELISA De følgende trin gennemføres ved udførelse af apo-lipoprotein A-I-sandwich-ELISA-bestemmelsen. Kommercielle kontroller rekonstitueres med deioniseret vand ifølge 35 producentens anvisninger. Kontrollerne omhvirvles forsigtigt og holdes 20-30 minutter ved stuetemperatur for at sikre fuldstændig opløsning.

0 DK 173174 B1 60 a. Prøver og kontroller

Prøver og kontroller fortyndes 1:5000 i PBS. En seriefortynding kan foretages på følgende måde: 20 pi prøve + 1,98 ml PBS (1:100), 5 40 pi af den ovenfor anførte fortynding + 1,96 ml PBS (1:5000).

b. Standard-fortynding

Isoleret apo A-I-(HDL-)standard fortyndes til 4 pg/ml i PBS. Derefter foretages der 2-ganges serielt) fortyndinger til 0,031 pg/ml. Dette kan f.eks. ske på følgende måde, når der anvendes et præparat af HDL betegnet 860527, der indeholder 868 pg/ml: 4 pg/ml = 46 pi + 9,954 ml PBS (1:217), 2 pg/ml = 1 ml af den ovenfor anførte opløsning + 15 1 ml PBS, og fortsættelse med 2-ganges fortyndinger til 0,031 pg/ml.

c. HRPO-Mærket AI-11-fortynding

Der anvendes en 1:5000-fortynding af AI-11 HRPO-20 -konjugat-antistof i PBS. Der kan udføres følgende for tyndinger : 20 μΐ + 1,98 ml PBS (1:100), og

240 pi af ovennævnte opløsning + 11,76 ml PBS

(1:5000).

25 Der dækkes med folie til beskyttelse mod lys. Denne mængde er tilstrækkelig til 2 plader.

d. 3% Hydrogenperoxld 30%'s Hydrogenperoxld fortyndes 1:10 i destilleret vand.

30 e. o-Phenylendiamin-substrat 1 Tablet af o-phenylendiamin (OPD)(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) opløses i 15 ml destilleret vand.

Der tilsættes 62,5 pi 3%’s hydrogenperoxld. Der dækkes med folie til beskyttelse mod lys. Substratet fremstil-35 les frisk hver gang umiddelbart før anvendelsen.

O

61 DK 173174 B1 5. Bestemmelsesprocedure a. Den antistof-bundne ELISA-plade bringes i ligevægt ved stuetemperatur (20-22°C) i mindst 20 minutter.

Pladen fjernes fra posen og vendes om til fjernelse af 5 tilbageværende puffer i hullerne. Hullerne fyldes med 300 pi skyllepuffer (PBS) indeholdende 0,1% BSA og 0,15% "Tween 20", pH-værdi 7,2), hvorefter der henstilles i 10 minutter. Pladen vendes om til fjernelse af puffer, og pladen suges tør ved hjælp af papirservietter. Hul-10 lerne rt)å ikke være tomme mere end 10 minutter under bestemmelsen.

b. Der tilsættes hver gang 50 pi standard eller prøve til 3 huller.

0 pg/ml-standarden er 50 pi PBS.

15 50 pi fortyndede HDL-standarder sættes til stan dardhullerne (0,031, 0,062, 0,125, 0,25, 0,50, 1,0 pg/-ml).

50 pi af fortyndede kontroller og patient-prøver sættes til de respektive huller.

20 c. 50 pl/hul af HRPO-bundet antistof sættes til alle huller.

d. Pladen indpakkes i aluminiumfolie og anbringes på en "gyro-shaker" (ca. 100 o/m) i 30 minutter ved stuetemperatur (ca. 20-25°C).

25 e. Pladen vaskes ved at fylde hullerne med 300 ^il/- hul af skyllepufferen og derefter vende pladen om til fjernelse af pufferen. Dette gentages to yderligere gange, således at der foretages i alt 3 vaskninger. Pladen suges tør ved hjælp af papirservietter efter den tredje vask-30 ning. Pladen må ikke få lov at tørre ud.

f. 100 pl/hul af frisk fremstillet OPD-substrat tilsættes. Farven får lov at udvikle sig ved stuetemperatur i 30 minutter.

g. Reaktionen stoppes ved tilsætning af 50 pi 4N 35 svovlsyre til alle huller. Den optiske tæthed aflæses ved 492 nm.

DK 173174 B1 62 o I. Plasmaprøver og lipoprotein-kvantificering

Plasmaprøver fås fra 20 patienter med coronararte-riesygdom fra Cardiac Catheterization Laboratory, San Diego VA Hospital. Desuden fås plasma fra 37 normale per-5 soner.

Blod opsamles i rør indeholdende 1,5 mg/ml ethylen-diamintetraacetat (EDTA), og plasmaet separeres omgående ved centrifugering ved 4°C.

Det totale indhold af plasmacholesterol og trigly-10 cerider måles på friske plasmaprøver i et standardiseret klinisk laboratorium under anvendelse af en Abbott ABA-200 bichromatisk analysator, Boehringer-Mannheim "high performance"-cholesterol-reagens 236691 og Abbott Laboratories triglyceride-reagens. LDL- og HDL-cholesterol 15 måles ved anvendelse af metoder beskrevet i Lipid Research Clinic Procedures, HEW Pub. No. 75-628 (NIH), 2. ed., Washington, D.C., Gov. Print. Off., (1974).

Kvantitative apolipoprotein A-I-bestemmelser gennemføres også under anvendelse af kommercielt tilgængelige 20 bestemmelses-sæt leveret af Isotex Diagnostics, Friends wood, TX; Ventrex Laboratories, Inc., Portland, ME; Tago,

Inc., Burlingame, CA; og Calbiochem-Behring, La Jolla, CA. Vejledningerne, der leveres med hvert sæt, følges ved gennemførelsen af bestemmelserne.

25 Kvantitative ELISA-bestemmelser af apo A-I gennem føres som beskrevet i den foreliggende beskrivelse på serum- eller plasmaprøver fra donorer som allerede beskrevet eller på prøver hidrørende fra laboratoriepræparater, gaver eller kommercielle leverandører. Disse kommercielle 30 prøver er tilvejebragt fra Meloy Laboratories, Spring-field, VA; Scripps Laboratories, La Jolla, CA; Omega/-Cooper Biomedical Inc., Malvern, PA; Isolab Lab, Akron, OH; Calbiochem-Behring, La Jolla, CA; International Union of Immunological Standards ClUIS) via Center for-Disease ' 35 Control, Atlanta, GA; og Chemicon International, Inc., El Segundo, CA. Gaveprøver blev leveret af Ortho Diagnostic Systems, Inc., Raritan, NJ. Apo A-I-standarder blev tilvejebragt fra Meloy Laboratories, Scripps Laboratories

O

63 DK 173174 B1 og Chemicon International.

125 J. RIA-Bestemmelse af_I-mærket antigen i vaske fase 125

Til bestemmelse af andelen af I-HLD-partikler 5 og apo A-I bundet af AI-10, AI-11, AI-12, AI-13 og AI-14 anvendes der en væskefase-RIA (Curtiss og Edgington (1985), J. Biol. Chem. 260;2982-2993). Herved sættes der til 0,1 ml radioioderet antigen (HDL eller apolipoprotein A-I) 0,1 ml phosphat-pufret saltopløsning, pH-værdi 7,2, og 10 0,1 ml af forskellige fortyndinger af musehybridom-kultur- væske eller ascitesvæske fortyndet 1:50 i normalt museserum. Alle puffere indeholder også 5% dextran (molekylvægt 40.000). Efter 18 timer ved 4°C tilsættes 0,1 ml udfældende andet antistof (gede-anti-muse-IgG-serum).

15 Efter 4 timers inkubering ved 4°C tilsættes 2 ml koldt PBS, og rørene centrifugeres ved 2000 g i 30 minutter ved 4°C. Den ovenstående væske dekanteres, og I-aktivite-ten af de fremkomne pellets bestemmes i en gamma-tæller.

Den maksimale udfældelige radioaktivitet bestemmes 20 ved at erstatte det andet antistof med 100% TCA. Den minimale udfældelige radioaktivitet eller ikke-specifikke binding (NSB) bestemmes ved at erstatte de specifikke hy-bridoma-antistoffer med et irrelevant hybridoma-antistof af den samme tung-kæde-klasse.

25 Resultaterne beregnes på følgende måde: 125 procent bundet I-antigen = MIDDEL-NSB x 100

TCA-NSB

30 hvori "MIDDEL” er den gennemsnitlige radioaktivitet udfældet i nærværelse af en given mængde af specifikt antistof, "NSB" er mængden af ikke-specifikt bundet radioaktivitet, som er udfældet ved erstatning af de specifikke paratopiske molekyler ifølge opfindelsen med et irrelevant 35 hybridoma-antistof af den samme tung-kæde-klasse, og "TCA" er den maksimale TCA-udfældelige radioaktivitet.

« 64 DK 173174 B1

O

K. Kompetitiv immunoenzymometrlsk bestemmelse af AI-10 og AI-11

Fleksible polyvinylchlorid-mikrotiterplader overtrækkes i ca. 18 timer (natten over) ved 4°C med 0,2 ml phos-5 phat-pufret saltopløsning (PBS) indeholdende 5 pg/ml af enten HDL eller renset apo A-I. Hullerne vaskes tre gange med 0,3 ml PBS indeholdende 1,0 g BSA og 0,5 ml "Tween 20" pr. liter. Resterende bindende steder af hullerne blokeres ved inkubering med 0,2 ml PBS indeholdende 30 10 BSA pr. liter i hullerne i 1 time ved omgivelsestemperatur (20-25°C). Hullerne vaskes derefter tre gange med skylle-puffer. Pladerne anvendes omgående.

PBS (0,05 ml) indeholdende 0,375 pg/ml AI-10 konjugeret med peberrodsperoxldase inkuberes i de for-over-15 trukne huller med 0,05 ml PBS indeholdende fra 0 til 8,0 pg/ml ukonjugeret AI-10 eller ukonjugeret AI-11 raonoklonalt antistof. Inkuberingstiden er 3 timer ved omgiveIsestemperatur. Hullerne vaskes derefter tre gange med skylle-puffer, og der sættes 0,1 ml PBS indeholdende o-phenylen-20 diamin-substrat til alle hullerne og inkuberes i 30 minutter ved omgivelsestemperatur (20-25°C), Farvereaktionen stoppes ved tilsætning af 0,05 ml 4N svovlsyre til alle hullerne, og den optiske tæthed (O.D.) af hvert hul bestemmes ved 490 nanometer (nm) under anvendelse af en 25 Dynatech 96-huls pladeaflæser.

Resultaterne af dén apo A-I-overtrukne plade er vist i figur 1, og resultaterne af den HDL-overtrukne plade er vist i figur 2. En forøgelse på 21 gange af umærkede AI-II-molekyler konkurrerer ikke væsentligt med peroxi-30 dase-mærkede AI-10-molekyler om binding til HDL eller apo A-I. Undersøgelsen er gentaget under anvendelse af peroxidase-mærket AI-11 med umærket AI-10 og AI-11 i de samme koncentrationer med i det væsentlige de samme resultater.

35

Claims (15)

1. Monoklonalt paratopisk molekyle, som reagerer Immunologisk med apolipoprotein A-I og udskilles af et hybridoma valgt blandt hybridomaer med ATCC-deponerings- 5 numrene HB 9200, HB 9201, HB 9202, HB 9203 og HB 9204.

2. Monoklonalt paratopisk molekyle ifølge krav 1, som er et helt antistof.

3. Fremgangsmåde til bestemmelse af tilstedeværelsen af apolipoprotein A-I I en væskeprøve, omfattende følgen- 10 de trin: (a) blanding af en væskeprøve, der skal undersøges, med en effektiv mængde af monoklonale paratopiske molekyler, der immunoreagerer med apolipoprotein A-I og udskilles af et hybridoma valgt blandt hybridomaer med

15 ATCC-deponeringsnumrene HB 9200, HB 9201, HB 9202, HB 9203 og HB 9204 til dannelse af en blanding, (b) bibeholdelse af den nævnte blanding under biologiske bestemmelsesbetingelser i et forudbestemt tidsrum, der er tilstrækkeligt til, at de nævnte paratopiske mole- 20 kyler immunoreagerer med apolipoprotein A-I, som er til stede i prøven, og danner en immunoreaktant, og (c) bestemmelse af tilstedeværelsen af en immunoreaktant.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 3,kendeteg- 25 net ved, at de paratopiske molekyler Indeholder et operativt bundet radioaktivt element, og at tilstedeværelsen af det nævnte apolipoprotein A-I bestemmes ved at skille immunoreaktanten fra resten af blandingen og bestemme den udsendte stråling fra den fraskilte immunoreaktant.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendeteg ne t ved, at de førstnævnte monoklonale paratopiske molekyler er bundet til en fast matriks til dannelse af en fast bærer før dannelsen af den nævnte blanding, at de ikke-specifikke protein-bindende steder af den nævnte 35 faste bærer er blokerede, og at den nævnte dannede immunoreaktant bindes til den faste bærer som fastfase-bundet immunoreaktant. O DK 173174 B1

6. Fremgangsmåde ifølge krav 5, kendetegne t ved, at tilstedeværelsen af den fastfase-bundne immunoreaktant bestemmes ved: (i) blanding af andre monoklonale paratopiske mole-5 kyler i væskefase med den førstnævnte blanding til dannelse af en anden blanding, hvor de andre paratopiske molekyler immunoreagerer med apolipoprotein A-I og udskilles af et hybridoma valgt blandt hybridomaer med ATCC-deponeringsnumrene HB 9200, HB 9201, HB 9202, HB 10 9203 og HB 9204, men ikke anvendes i den førstnævnte blan ding, og de andre paratopiske molekyler er operativt bundet til et indikerende middel i form af enzym, (ii) bibeholdelse af den nævnte anderi blanding under biologiske bestemmelsesbetingelser i et forudbestemt tids- 15 rum, der er tilstrækkeligt til, at de andre paratopiske molekyler bundet til indikerende middel immunoreagerer med apolipoprotein A-I, som er til stede i den nævnte blanding, og danner en sandwich-immunoreaktant og en væskefase, 20 (iii) adskillelse af den faste og den flydende fase, og (iv) bestemmelse af tilstedeværelsen af apolipoprotein A-I bundet til indikerende middel i den fraskilte fastfase-sandwich-immunoreaktant og derved tilstedeværel-25 Sen af apolipoprotein A-I i prøven.

7. Fremgangsmåde til bestemmelse af mængden af apolipoprotein A-I, som er til stede i en væskeprøve, kendetegnet ved, at den omfatter følgende trin: (a) blanding af en forudbestemt mængde væskeprøve 30 med en fast bærer, der i det væsentlige består af en fast matriks, der har fastfase-bundne første monoklonale paratopiske molekyler, som immunoreagerer med apolipoprotein A-Γ og udskilles af et af hybridomaerne med ATCC-deponeringsnumrene HB 9200 eller HB 9201 til dannelse af en 35 blanding af fastfase og væskefase, hvor overfladen af den nævnte bærer har blokerede ikke-specifikke proteinbinden-dende steder, O DK 173174 B1 (b) bibeholdelse af den nævnte blanding af fastfase og væskefase under biologiske bestenunelsesbetingelser i et forudbestemt tidsrum, som er tilstrækkeligt til, at de nævnte første paratopiske molekyler immunoreagerer med 5 apolipoprotein A-I, som er til stede i prøven, og danner en fastfase-bundet immunoreaktant, der i det væsentlige indeholderalt apolipoprotein A-I, som er til stede i prøven, (c) blanding af apolipoprotein A-I i den nævnte 10 væskeprøve med andre monoklonale paratopiske molekyler. i væskefase, der immunoreagerer med apolipoprotein A-I, udskilles af et af hybridomaerne med ATCC-deponerlngsnum-rene HB 9200 eller HB 9201, med ikke anvendes i den førstnævnte blanding, og er operativt bundet til et indi-15 kerende middel i form af enzym, til dannelse af en anden blanding, (d) bibeholdelse af den anden blanding under biologiske bestemmelsesbetingelser i et forudbestemt tidsrum, der er tilstrækkeligt til, at de nævnte andre para- 20 topiske molekyler bundet til indikerende middel danner en immunoreaktant, der i det væsentlige indeholder alt apolipoprotein B-100 i prøven, (e) adskillelse af den faste fase og væskefasen, der hidrører fra de ovenfor anførte trin (a) til (d), 25 og (f) bestemmelse af mængden af immunoreaktant indeholdende apolipoprotein A-I bundet til indikerende middel, der er til stede i den fraskilte faste fase, og dermed mængden af apolipoprotein A-I i den nævnte prøve.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 7, kendeteg ne t ved, at blandingstrinene (a) og (c) i det væsentlige gennemføres samtidig, og at holdetrinene (b) og (d) gennemføres sammen.

9. Fremgangsmåde til bestemmelse af mængden af apo-35 lipoprotein A-I i en flydende blodprøve, kendetegnet ved, at den omfatter følgende trin: (a) dannelse af en blanding af fast fase og flydende O DK 173174 B1 fase ved i det væsentlige samtidig blanding af en flydende blodprøve med en fast bærer, der i det væsentlige består af en fast matriks, der har fastfase-bundne første mono-klonale paratopiske molekyler, der immunoreagerer med apo-5 lipoprotein A-I og udskilles af et af hybridomaerne med ATCC-deponeringsnumrene HB 9200 eller HB 9201, og andre monoklonale paratopiske molekyler i væskefase, der er operativt bundet til et indikerende middel i form af enzym, og som udskilles af et af hybridomaerne med ATCC-de-10 poneringsnumrene HB 9200 eller HB 9201 og ikke er de første paratopiske molekyler bundet til den faste matriks, hvor overfladen af den nævnte bærer har blokerede ikke-specifikke proteinbindende steder, (b) bibeholdelse af den nævnte blanding af fast fase 15 og flydende fase under biologiske bestemmelsesbetingelser i et forudbestemt tidsrum, der er tilstrækkeligt til, at de første paratopiske molekyler og de andre paratopiske molekyler bundet til indikerende middel immunoreagerer med i det væsentlige alt apolipoprotein A-I, som er til 20 stede i prøven, til dannelse af en fastfase-bundet sand-wich-immunoreaktant og en flydende fase, (c) adskillelse af den faste og den flydende fase og (d) bestemmelse af mængden af sandwich-immunoreaktant 25 indeholdende apolipoprotein A-I bundet til indikerende middel, der er til stede i den fraskilte faste fase, og dermed mængden af apolipoprotein A-I i den nævnte prøve.

10. Fremgangsmåde ifølge krav 9, kendetegnet ved, at de første paratopiske molekyler udskilles af 30 hybridomaet med ATCC-deponeringsnummeret HB 9200.

11. Diagnostisk system, som er egnet til anvendelse ved bestemmelse af apolipoprotein A-I I en væskeprøve, kendetegnet ved, at det omfatter: a) en pakning med paratopiske molekyler, der immuno-35 reagerer med apolipoprotein A-I og udskilles af et af hybridomaerne valgt blandt hybridomaer med ATCC-deponerings-numrene HB 9200, HB 9201, HB 9202, HB 9203 og HB 9204, O DK 173174 B1 hvor de nævnte paratopiske molekyler er til stede i en mængde, der tilstrækkelig til gennemførelse af én bestemmelse af tilstedeværelsen af apolipoprotein A-I.

12. Diagnostisk system ifølge krav 11, k e n d e -5 tegnet ved, at det endvidere omfatter et indikerende middel.

13. Diagnostisk system, som er egnet til anvendelse ved bestemmelse af mængden af apolipoprotein A-I, som er til stede i en flydende blodprøve, kendeteg- 10 net ved, at det omfatter: (a) en første pakning indeholdende en fast bærer, der i det væsentlige består af en fast matriks, der har monoklonale paratopiske molekyler, som immunoreagerer med apolipoprotein A-I og udskilles af et af hybridoma- 15 erne med ATCC-deponeringsnumrene HB 9200 eller HB 9201, bundet til matriksen, idet de ikke-specifikke proteinbindende steder af den nævnte bærer er blokeret, og (b) en anden pakning indeholdende paratopiske molekyler, der immunoreagerer med apolipoprotein A-I, 20 udskilles af et af hybridomaerne med ATCC-deponeringsnumrene HB 9200 eller HB 9201, med ikke er de paratopiske molekyler i den første pakning, og er operativt bundet til et indikerende middel, idet de nævnte paratopiske molekyler er til stede i en 25 mængde, der er tilstrækkelig til gennemførelse af én bestemmelse af tilstedeværelsen af apolipoprotein A-I.

14. Diagnostisk system ifølge krav 13, kendetegnet ved, at monoklonale paratopiske molekyler, der udskilles af hybridomaet med ATCC-deponeringsnummeret

30 HB 9200, er bundet til den faste matriks i den første pakning.

15. Hybridoma med et ATCC-deponeringsnummer valgt blandt HB 9200, HB 9201, HB 9202, HB 9203 og HB 9204. 35