DE19727815C1 - Antikörper N6B6 - Google Patents
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Description
Die Erfindung betrifft einen spezifisch gegen CD164 gerichteten
monoklonalen Antikörper.
Derartige Antikörper sind aus der DE 195 30 272 C1 und der DE
195 30 273 C1 bekannt.
CD164 ist ein glykosyliertes Zelloberflächenprotein, das
ursprünglich als Peanut Agglutinin (PNA) -bindendes Glykoprotein
identifiziert wurde.
Maligne Zellen von vielen menschlichen Tumoren besitzen an ihrer
Zelloberfläche Peanut Agglutinin (PNA)-bindende Glykoproteine.
Diese PNA-bindenden Glykoproteine bieten u. a. die Möglichkeit,
Nachweisreagenzien und/oder therapeutisch wirksame Reagenzien
direkt an die betreffenden Zellen heranzuführen und daran zu
binden. Seit einigen Jahren bekannt sind die nach der inzwischen
eingeführten MUC-Nomenklatur benannten Glykoproteine MUC1, MUC2
und MUC3. Ein kürzlich identifiziertes Zelloberflächen-Glyko
protein ist das Protein MGC-24 (Multi-Glycosylated Core protein
of 24kDa), dessen Aminosäuresequenz und dazugehörige Nukleotid
sequenz von Masuzawa, et al., J. BIOCHEM. 112, 609-615, (1992)
vollständig aufgeklärt wurde.
In jüngster Zeit wurde eine Variante oder Isoform des Proteins
MGC-24 gefunden, die MGC-24v genannt wurde. MGC-24 und MGC-24v
weisen fast identische extrazelluläre Domänen auf. MGC-24 ist
jedoch ein vornehmlich sezerniertes Protein, während MGC-24v
ein integrales Membranprotein vom Typ I ist. Mit seinem Moleku
largewicht von 160 kD ist MGC-24v ein Homodimer aus zwei 80
kD-Untereinheiten.
In einer CD-Klassifizierung wurde dem Glykoprotein MGC-24v die
Bezeichnung CD164 zugewiesen, die im folgenden verwendet werden
soll.
Die Funktion von CD164 ist noch völlig ungeklärt. Dieses
Zelloberflächenprotein wird jedoch auf einer Reihe neoplastischer
Gewebe epithelialen Ursprungs exprimiert. Daher eignet es sich
besonders gut als Angriffspunkt für eine gezielte zelluläre
Diagnose und Therapie derartiger Tumoren.
Als Vermittler für ein entsprechendes zellulär zielgerichtetes
Diagnostikum bzw. Therapeutikum kommt insbesondere ein Antikörper
in Betracht, der spezifisch an CD164 bindet.
Ein solcher Antikörper kann sowohl mit einfachen Nachweis
reagenzien wie Fluoreszenzfarbstoffen oder radioaktiven Stoffen
als auch mit speziellen therapeutisch wirksamen Reagenzien
gekoppelt sein.
Aus der DE 195 30 272 C1 ist ein monoklonaler Antikörper bekannt,
der an MGC-24 bindet und die Bezeichnung 103B2 trägt. Ein
weiterer, gegen MGC-24 gerichteter Antikörper ist in der DE
195 30 273 C1 offenbart. Dieser Antikörper trägt die Bezeichnung
105A5. In der Zwischenzeit stellte sich heraus, daß beide
Antikörper auch die Isoform MGC-24v, also CD164, erkennen
(Zannettino et al., "CD164 Workshop Panel Report", in: Leucocyte
Typing VI, Kishimoto, T. et al., Garland Publishing, New York
(im Druck)).
Zum Nachweis und zur gezielten Beeinflussung des Antigens ist
es wünschenswert, daß verschiedene monoklonale Antikörper zur
Verfügung stehen, da so Ergebnisse mit hoher Zuverlässigkeit
experimentell bestätigt werden können.
Darüber hinaus können sich verschiedene, gegen das gleiche
Antigen gerichtete monoklonale Antikörper in ihren jeweiligen
Sensitivitäten und Kreuzreaktivitäten unterscheiden. Wenn mehrere
monoklonale Antikörper gegen ein gegebenes Antigen zur Verfügung
stehen, so kann in Abhängigkeit von der Verwendung der am besten
geeignete Antikörper ausgewählt werden.
Der in der DE 195 30 272 C1 beschriebene Antikörper 103B2
gehört der Immunglobulinklasse IgG3 an, wohingegen der in der
DE 195 30 273 C1 offenbarte Antikörper 105A5 zur Immunglobulin
klasse IgGM gehört.
Antikörper, also Inmiunglobuline, bestehen aus variablen Regionen,
deren Funktion die spezifische Epitoperkennung ist, sowie aus
konstanten Regionen, die charakteristisch für eine Immun
globulinklasse sind. Auch die konstanten Regionen der Antikörper
beeinflussen ihre Eigenschaften wesentlich. So bilden Antikörper,
die zur Immunglobulinklasse IgM gehören, tetramere Strukturen
aus, während die zur IgG-Klasse gehörenden Antikörper monomer
vorliegen. Außerdem gibt es vier verschiedene Subklassen der
Immunglobulinklasse IgG, die sich hinsichtlich ihrer Disulfid
brückenbindung, ihrer Stabilität und weiteren physikochemischen
Eigenschaften unterscheiden.
Die Verschiedenartigkeit der konstanten Regionen der Immun
globuline nutzt man vor allem bei den heute allgemein Üblichen
indirekten Nachweismethoden, bei denen Antikörper durch sekun
däre, an Nachweisreagenzien gekoppelte Antikörper nachgewiesen
werden. Diese sekundären Antikörper binden spezifisch an die
konstanten Regionen der primären, ihrerseits an die Antigene
bindenden Antikörper. Sekundäre Antikörper erkennen somit meist
nur eine Immunglobulinklasse.
Es ist daher zweckmäßig, zu verschiedenen Immunglobulinklassen
gehörende monoklonale Antikörper zur Verfügung zu haben, um
ein möglichst breites Spektrum an Nachweismöglichkeiten anwenden
zu können.
Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde,
einen weiteren monoklonalen Antikörper bereitzustellen, der
spezifisch an CD164 bindet und der in praktisch unbegrenzter
Menge zur Verfügung steht.
Diese Aufgabe wird durch die Bereitstellung eines monoklonalen
Antikörpers gelöst, der von Hybridomzellen produziert und
freigesetzt wird, die unter der Nummer DSM ACC2307 bei der
Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,
DMSZ, hinterlegt sind. Er ist mit der Bezeichnung N6B6 benannt.
Im Laufe der Analysen zu dem monoklonalen Antikörper N6B6 wurde
nachgewiesen, daß er zur Immunglobulinklasse IgG2a gehört (siehe
dazu auch Beispiel 1). Somit wird mit diesem monoklonalen
Antikörper ein Antikörper mit einem bisher nicht verfügbaren
Subtyp bereitgestellt, der standardisiert reproduzierbar ist,
potentiell unbegrenzt hergestellt werden kann und der spezifisch
an das Zelloberflächenglykoprotein CD164 bindet.
Der erfindungsgemäße Antikörper ermöglicht eine gezielte
Erkennung und Beeinflussung von Zellen, die CD164 exprimieren.
Er stellt damit ein weiteres, vielseitig einsetzbares Mittel
für den Arzt und Forscher dar, um einerseits solche Zellen
nachzuweisen, und zwar sowohl in der Zellkultur als auch im
Patientenorganismus, und um andererseits diese Zellen ggf. zu
manipulieren, entweder durch den Antikörper selbst oder durch
daran oder an geeignete sekundäre Antikörper gekoppelte spezi
fische Reagenzien.
Die Erfindung betrifft ferner Hybridomzellen, die unter der
Nr. DSM ACC2307 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen
und Zellkulturen GmbH, DMSZ, hinterlegt sind und den Antikörper
mit der Bezeichnung N6B6 produzieren.
Bei einem Verfahren zur Herstellung von Hybridomzellen, die
einen Antikörper gegen das Zelloberflächenglykoprotein CD164
synthetisieren und freisetzen, werden die im Stand der Technik
grundsätzlich geläufigen Schritte durchgeführt, wie sie bspw.
von Bühring et al. in Hybridoma 1991, Band 10, Nr. 1, S. 77-78
beschrieben wurden:
- 1. Immunisierung oder Sensibilisierung eines Tieres, vorzugs weise einer Maus vom Balb/c-Stamm, mit dem Antigen bzw. Immunogen;
- 2. Gewinnung der antikörperproduzierenden Zellen, vorzugsweise der Milzlymphozyten dieses Tieres;
- 3. Fusionierung dieser antikörperproduzierenden Zellen mit einer stabilen, immortalisierten Zellinie, vorzugsweise einer Myelomzellinie, zu Hybridomzellen; und
- 4. Vereinzelung und Vermehrung (Klonierung) solcher Hybridom zellen, die einen Antikörper sezernieren, der an das Antigen bindet.
Dieses Verfahren zeichnet sich dadurch aus, daß das Tier mit
Zellen der Prä-B-Zellinie Nalm-1 immunisiert wird.
Dabei erwies sich als Vorteil, daß diese Zellinie eine starke
Expression von CD164 zeigt, wie sich während der zu dem Anti
körper N6B6 führenden Versuche zeigte.
Wenn Hybridomzellen gesucht werden, die gegen CD164 gerichtete
Antikörper produzieren, so ist es bei der Vereinzelung der
Hybridomzellen vorteilhaft, wenn solche Hybridomzellen ausgewählt
werden, die Antikörper mit einer Spezifität für eine Zellinie
produzieren, die zuvor mit der cDNA für CD164 transfiziert wurde.
Die Herstellung einer solchen Zellinie ist in Ausführungsbeispiel
2 beschrieben.
Diese transfizierte Zellinie ist zur Selektion der Hybridomzellen
besonders vorteilhaft, da sie CD164 in großen Mengen auf ihrer
Zelloberfläche exprimiert.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung des erfindungsgemäßen
Antikörpers zur diagnostischen und/oder therapeutischen Behand
lung von Tumoren, insbesondere von Magen-, Colon- und Brust
karzinomen.
Tumorzellen, insbesondere Zellen von Magen-, Colon- und Brust
karzinomen, zeichnen sich durch einen vergleichsweise hohen
Gehalt an Zelloberflächenglykoprotein CD164 aus. Ein erfin
dungsgemäßer Antikörper, der mit einem Nachweismittel, bei
spielsweise einem radioaktiven Marker, gekoppelt ist, bindet
dieses Nachweismittel indirekt an diese Zellen und ermöglicht
damit den direkten Nachweis dieser Zellen, beispielsweise mit
röntgendiagnostischen /szintigraphischen Methoden. Damit ist
eine sehr frühe Tumordiagnose unter Umständen sogar in vivo
möglich.
In entsprechender Art und weise kann der Antikörper mit einem
therapeutisch wirksamen Mittel gekoppelt sein und dadurch eine
direkte und gezielte Beeinflussung oder gar Eliminierung von
CD164 tragenden Zellen, insbesondere Tumorzellen, ermöglichen.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Antikörper, der
von den unter der Nummer DSM ACC2307 bei der Deutschen Sammlung
von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, DSMZ, hinterlegten
Hybridomzellen produziert und freigesetzt wird, zu einer solchen
diagnostischen und/oder therapeutischen Behandlung verwendet.
Um die therapeutische und/oder diagnostische Applikation des
erfindungsgemäßen Antikörpers zu erleichtern, kann der Anti
körper mit entsprechend geeigneten Hilfssubstanzen in einer
pharmazeutischen Zubereitung vermischt sein.
Mit dem erfindungsgemäßen Antikörper können CD164 tragende Zellen
aus einer Suspension verschiedenartiger Zellen mit den im Stand
der Technik bekannten Testverfahren, wie z. B. dem Enzyme linked
immunosorbent assay, kurz ELISA, oder dem Radioimmunoassay,
kurz RIA, nachgewiesen werden. Die vorliegende Erfindung betrifft
deshalb auch einen Kit zum Nachweis des Zelloberflächen
glykoproteins CD164, der den Antikörper N6B6 umfaßt.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde überraschenderweise
gefunden, daß der monoklonale Antikörper mit der Bezeichnung
N6B6, der von den unter der Nummer DSM ACC2307 bei der Deutschen
Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, DSMZ,
hinterlegten Hybridomzellen erzeugt wird, an eine Subpopulation
mononukleärer Knochenmarkszellen bindet.
Die Erfindung betrifft deshalb auch die Verwendung des Anti
körpers N6B6 zum Nachweis von hämatopoetischen Zellen, sowie
einen Kit zum Nachweis von hämatopoetischen Zellen, der den
Antikörper N6B6 enthält. Dadurch ist es möglich, undifferenzierte
CD34+-Subpopulationen für funktionelle Analysen aus dem Knochen
mark zu selektieren und aufzureinigen.
Weitere Vorteile ergeben sich aus der nachstehenden Beschreibung.
Es versteht sich, daß die vorstehend genannten und die nach
stehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils
angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen
oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der
vorliegenden Erfindung zu verlassen.
Die Erfindung wird im folgenden anhand von Anwendungs- und
Ausführungsbeispielen näher erläutert.
Als Antigen werden Zellen der Prä-B-Zellinie Nalm-1 verwendet,
die bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zell
kulturen, DSMZ, kommerziell erhältlich sind.
Acht Wochen alte Balb/c-Mäuse werden zweimal in Intervallen
von 10 Tagen intraperitoneal mit 107 Zellen der Zellinie Nalm-1
immunisiert. Vier Tage vor der Fusion werden 5 × 105 Zellen direkt
in die Milz appliziert, um die Immunantwort zu verstärken.
Die Antikörper-Bildung im Mausorganismus wird dadurch Überprüft,
daß das Blutserum des betreffenden Tieres in dem dem Fachmann
geläufigen ELISA-Test auf Bindungseigenschaften mit dem Antigen
untersucht wird.
Nach ca. 3 Wochen werden die Lymphozyten des erfolgreich
immunisierten Tieres gewonnen, indem die Milz herausoperiert
und zu einer Zellsuspension zerkleinert wird.
Die suspendierten Milzzellen werden in Anwesenheit von Poly
ethylenglykol mit Myelomzellen des bekannten Stammes SP2/0 fusio
niert. Die Fusionskultur wird in Hypoxanthin-, Aminopterin-
und Thymidin-(HAT-)haltigem Medium, hier in HAT-RPMI-1640,
kultiviert, in dem sich nur Hybridzellen vermehren können, da
diese sowohl die Eigenschaft der Myelomzellen zur unbegrenzten
Teilungsfähigkeit als auch die Eigenschaft der Antikörper
produzierenden Lymphozyten zum Wachstum in HAT-haltigem Medium
haben.
Nach der Fusion werden die Zellen in Napfplatten ausplattiert
und bei 37°C, 5% Co2 inkubiert.
Die Kulturüberstände werden nach 10-14 Tagen auf der Zellinie
Nalm-1 im Durchflußzytometer gescreent. In einem zweiten Schritt
werden die Überstände auf Reaktivität mit einer Zellinie gete
stet, die zuvor mit der cDNA für CD164 transfiziert worden war.
Die Herstellung dieser transfizierten Zellinie ist in Beispiel
2 beschrieben. Hybridome, die Antikörper mit Spezifität für
diese Zellinie produzieren, werden ausgewählt und nach dem
bekannten Grenzverdünnungsverfahren vereinzelt und kultiviert,
d. h. kloniert.
Bei dieser Screening-Strategie wird Nutzen aus der Tatsache
gezogen, daß die transfizierte Zellinie CD164 in großen Mengen
auf ihrer Zelloberfläche exprimiert.
Positiv reagierende Hybridomzellkulturen werden weiter kulti
viert, die Antikörper angereichert, gereinigt und charakte
risiert.
Nach der obigen Screening-Strategie wurde der monoklonale Anti
körper N6B6 erhalten. Der Isotyp wurde über PE-konjugierte Anti-
Isotyp-spezifische Antiseren durch direkte Immunfluoreszenz
zu IgG2a bestimmt.
Die Produktion, Reinigung und Charakterisierung der Antikörper
erfolgte mit den in Fachkeisen allgemein bekannten Methoden.
Der Antikörper N6B6, der von den unter der Nummer DSM ACC2307
bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen
GmbH, DSMZ, hinterlegten Hybridomzellen erzeugt wird, weist
die folgenden charakteristischen Merkmale auf:
Immunglobulinklasse: IgG2a
spezifische Bindung an: CD164
Immunglobulinklasse: IgG2a
spezifische Bindung an: CD164
Während der Untersuchungen, die zur Identifizierung des Antigens
des monoklonalen Antikörpers 103B2 (DE 195 30 272 C1) führten,
wurde eine CD164 exprimierende Zellinie etabliert. Diese
Untersuchungen zielten darauf ab, das entsprechende Gen zu finden
und zu analysieren.
Um das Gen zu isolieren, das für das Antigen codiert, das von
dem monoklonalen Antikörper 103B2 erkannt wird, wurde eine retro
virale Expressionsbibliothek nach dem Verfahren erstellt, das
von Rayner und Gonda in Mol. Cell. Biol. 1994, Band 14, Seite
880 beschrieben wurde. Bei dem hier verwendeten Verfahren wurde
mRNA aus kultivierten Stromazellen des menschlichen Knochenmarks
verwendet.
cDNA-Transkripte wurden direkt in den retroviralen Plasmid-Vektor
pRUF. Neo kloniert. DNA aus der Bibliothek wurde verwendet, um
eine amphotrope Wirtszellinie (PA317) zu transfizieren. Über
gangsweise erzeugte retrovirale Partikel wurden geerntet und
dazu verwendet, eine ecotrope Wirtszellinie stabil zu infizieren.
Von diesen Zellen produzierte Viren wurden daraufhin verwendet,
um die faktorabhängige hämatopoetische murine Zellinie FDC-P1
zu infizieren.
Infizierte FDC-P1-Zellen wurden bezüglich der G418-Resistenz
ausgewählt, woraufhin Zellen isoliert und angereichert wurden,
die das von dem Antikörper 103B2 erkannte Antigen exprimieren.
Die Anreicherung von Zellen, die von dem Antikörper erkannt
wurden, erfolgte dabei durch Einsatz mehrerer Durchläufe einer
immuno-magnetischen Zellsortierung (Dynabeads). Nach dieser
FACS-Sortierung wurden klonale Populationen der transfizierten
Zellen etabliert.
Daraufhin wurden die proviralen cDNA-Inserts von genomischer
DNA der infizierten Zellen zurückgewonnen. Zu diesem Zweck wurde
eine PCR-Amplifikation durchgeführt, wobei spezifische retro
virale Primer verwendet wurden, die die Klonierungsstelle in
dem Plasmidvektor flankieren. Auf diese Weise war es möglich,
ein cDNA-Insert von ungefähr 3 kBp zu isolieren.
Eine Sequenzanalyse ergab, daß dieses Insert eine Isoform eines
zuvor klonierten Gens identifizierte. Das zuvor klonierte Gen
gehört zu der mucin-Familie und codiert für MGC-24. Dieses Gen
wurde von Masuzawa et al., J. Biochem. 112, 609-615 (1992),
vollständig aufgeklärt.
Die nun identifizierte Isoform wurde MGC-24v genannt und als
CD164 klassifiziert (Zannettino et al., "CD164 Workshop Panel
Report", in: Leucocyte Typing VI, Kishimoto, T. et al., Garland
Publishing, New York (im Druck)).
Eine mit der CD164-spezifischen cDNA stabil transfizierte
Zellinie wurde in das Screeningverfahren eingesetzt, das bei
der Herstellung der Hybridomzellen, die den Antikörper N6B6
produzieren, verwendet wurde.
Drei verschiedene monoklonale, CD164-spezifische Antikörper
wurden in ein Kreuzblockierungsexperiment eingesetzt, um zu
analysieren, ob diese Antikörper ähnliche oder verschiedene
Epitope auf dem CD164 Glykoprotein erkennen.
Die Antikörper waren der Antikörper 103B2, der Gegenstand der
DE 195 30 272 C1 ist, der Antikörper 105A5, der Gegenstand der
DE 195 30 273 C1 ist sowie der erfindungsgemäße Antikörper N6B6.
Als Antigen wurde die MOLM-1-Zelle eingesetzt (Matsuo Y., et
al., "Establishment and Characterization of Novel Megakaryo
blastoid Cell Line, MOLM-1, from a Patient with Chronic Myelo
genous Leukemia" (1991), Human Cell, 4 : 261-264). Diese Zellinie
zeichnet sich durch eine hohe Expression von CD164 Glykoprotein
auf seiner Zelloberfläche aus.
Die Antikörper 103B2, 105A5 und N6B6 sowie negative Kontroll
antikörper mit jeweils gleichem Isotyp wurden getrennt vonein
ander für dreißig Minuten auf Eis mit MOLM-1-Zellen inkubiert.
Dann wurden die Zellen gewaschen und entweder zur Positiv
kontrolle mit dem gleichen monoklonalen Antikörper oder mit
einem der weiteren CD164 Antikörper inkubiert, um die Blockierung
oder Nichtblockierung festzustellen. Danach wurden die Zellen mit
einem PE-konjugierten, isotyp-spezifischen Sekundärantikörper mit
Spezifität für den jeweils zweiten Antikörper inkubiert. Danach
wurden die Ansätze auf einem FACSCalibur Durchflußzytometer
gemessen.
Tabelle 1 zeigt das Ergebnis dieses Tests, wobei die Blockierung
in % ausgedrückt wird. Der Prozentsatz an Blockierung wurde
nach folgender Formel berechnet:
100 - [(mittlere Fluoreszenz der mit dem getesteten Antikörper
gefärbten Zellen nach Inkubation mit blockierendem Antikörper) -
(mittlere Fluoreszenz der mit einem negativen Kontrollantikörper
des jeweils passenden Isotyps gefärbten Zellen)] / [(mittlere
Fluoreszenz der mit dem Testantikörper gefärbten Zellen nach
Inkubation mit dem negativen Kontrollantikörper) - (mittlere
Fluoreszenz der mit einem negativen Kontrollantikörper des
jeweils passenden Isotyps gefärbten Zellen)].100.
TABELLE 1
KREUZBLOCKIERUNG CD164-SPEZIFISCHER MONOKLONALER
ANTIKÖRPER
Aus Tabelle 1 ist ersichtlich, daß nach Inkubation von MOLM-1-
Zellen mit dem Antikörper 103B2 weder die Bindung des Antikörpers
105A5 noch die Bindung des Antikörpers N6B6 in signifikantem
Ausmaß blockiert wird. Dies bedeutet, daß der Antikörper 103B2
ein Epitop erkennt, das sowohl von dem durch 105A5 als auch
durch N6B6 erkannten Epitop verschieden ist.
Wären die Epitope nicht verschieden, so könnten 105A5 und N6B6
nicht mehr an die MOLM-1 Zellen binden.
Nach Inkubation der MOLM-1-Zellen mit dem Antikörper 105A5 war
zwar eine partielle Blockierung der Bindung von 103B2 von
ungefähr 60% nachweisbar, für den Antikörper N6B6 ließ sich
hingegen keine Blockierung nachweisen.
Wurden die MOLM-1-Zellen zuerst mit dem Antikörper N6B6 und
danach jeweils mit dem Antikörper 103B2 oder 105A5 inkubiert,
ließ sich für den Antikörper 105A5 keine Blockierung der Bindung
messen. Dagegen war eine partielle Blockierung der Bindung des
Antikörpers 103B2 um ca. 20% nachweisbar.
Der Antikörper 103B2 blockiert also die Bindung der Antikörper
105A5 und N6B6 an das CD164 Glykoprotein nicht.
Der Antikörper 105A5 blockiert die Bindung des Antikörpers 103B2
teilweise, die Bindung des Antikörpers N6B6 hingegen nicht.
Der Antikörper N6B6 blockiert die Bindung des Antikörpers 103B2
teilweise, die des Antikörpers 105A2 an CD164 nicht.
Insgesamt ergibt sich, daß die drei verschiedenen CD164-spezifi
schen monoklonalen Antikörper unterschiedliche Epitope des CD164
Glykoproteins erkennen.
Claims (6)
1. Monoklonaler Antikörper, der spezifisch gegen CD164
gerichtet ist, dadurch gekennzeichnet, daß er von Hybridom
zellen produziert und freigesetzt wird, die unter der Nummer
DSM ACC2307 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen
und Zellkulturen GmbH, DSMZ, hinterlegt sind und die
Bezeichnung "N6B6" tragen.
2. Hybridomzellen, dadurch gekennzeichnet, daß sie unter der
Nummer DSM ACC2307 bei der Deutschen Sammlung von Mikro
organismen und Zellkulturen GmbH, DSMZ, hinterlegt sind.
3. Verwendung eines Antikörpers nach Anspruch 1 zur diagno
stischen Behandlung von Tumoren, insbesondere von Magen-,
Colon- und Brustkarzinomen.
4. Verwendung eines Antikörpers nach Anspruch 1 zur therapeu
tischen Behandlung von Tumoren, insbesondere von Magen-,
Colon- und Brustkarzinomen.
5. Kit, dadurch gekennzeichnet, daß
er einen Antikörper nach Anspruch 1 enthält.
6. Verwendung eines Antikörpers nach Anspruch 1 zum Nachweis
von hämatopoetischen Zellen, oder von CD164.
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---|---|---|---|
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DE1997127815 DE19727815C1 (de) | 1997-06-30 | 1997-06-30 | Antikörper N6B6 |
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DE1997127815 Expired - Fee Related DE19727815C1 (de) | 1997-06-30 | 1997-06-30 | Antikörper N6B6 |
Country Status (1)
Country | Link |
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DE (1) | DE19727815C1 (de) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2023133595A2 (en) | 2022-01-10 | 2023-07-13 | Sana Biotechnology, Inc. | Methods of ex vivo dosing and administration of lipid particles or viral vectors and related systems and uses |
WO2024081820A1 (en) | 2022-10-13 | 2024-04-18 | Sana Biotechnology, Inc. | Viral particles targeting hematopoietic stem cells |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE19530273C1 (de) * | 1995-08-17 | 1996-12-12 | Univ Eberhard Karls | Antikörper 105A5 |
-
1997
- 1997-06-30 DE DE1997127815 patent/DE19727815C1/de not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE19530273C1 (de) * | 1995-08-17 | 1996-12-12 | Univ Eberhard Karls | Antikörper 105A5 |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2023133595A2 (en) | 2022-01-10 | 2023-07-13 | Sana Biotechnology, Inc. | Methods of ex vivo dosing and administration of lipid particles or viral vectors and related systems and uses |
WO2024081820A1 (en) | 2022-10-13 | 2024-04-18 | Sana Biotechnology, Inc. | Viral particles targeting hematopoietic stem cells |
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8100 | Publication of the examined application without publication of unexamined application | ||
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