DE60207409T2

DE60207409T2 - Hiv1-vpr-wechselwirkungen mit dem mitochondrialen apoptosis-induzierenden faktor sowie verfahren zur verwendung davon

Info

Publication number: DE60207409T2
Application number: DE60207409T
Authority: DE
Inventors: B. David WEINER; Karuppiah Muthumani
Original assignee: University of Pennsylvania Penn
Current assignee: University of Pennsylvania Penn
Priority date: 2001-05-25
Filing date: 2002-05-28
Publication date: 2006-07-20
Anticipated expiration: 2022-05-29
Also published as: DE60207409D1; EP1397520B1; US7598041B2; WO2003040415A1; EP1397520A1; AU2002310158B2; DK1397520T3; ATE310104T1; ES2251596T3; CA2448162A1; JP2005508506A; EP1397520A4; US20050026138A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung bezieht sich auf die Entdeckung, dass HIV Vpr an AIF aus Mitochondrien bindet, und auf Assays zur Identifikation von Modulatoren der Wechselwirkung.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Das akzessorische HIV-Protein Vpr wurde als ein Protein identifiziert, das zum Anhalten des Zellzyklus und zur Induktion der Apoptose fähig ist. Diese Beobachtung ist in der WO 01 74163 beschrieben.
Die Wechselwirkung von HIV Vpr mit dem humanen zellulären Protein hVIP wurde in der WO 99 19359 offenbart.
Die WO 94 19456 beschreibt ein Verfahren zur Identifikation von Verbindungen, welche die Bindung zwischen HIV Vpr und gag inhibieren.
Der mitochondriale Apoptose-induzierende Faktor wurde identifiziert.
Es sind Screenings zur Entdeckung von Arzneistoffen und neue Arzneistoffe erforderlich, welche die Apoptose verhindern oder induzieren und bei der Behandlung von entzündlichen Krankheiten und Krebs nützlich sind.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Identifikation von Verbindungen, welche die Vpr-Bindung an AIF inhibieren.
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Identifikation von Verbindungen, welche die Kerntranslokation von Vpr in Anwesenheit von AIF inhibieren.
AUSFÜHRLICHE BEESCHREIBUNG BEVORZUGTER AUSFÜHRUNGSFORMEN
Es wurde entdeckt, dass Vpr an AIF bindet. Es wurde entdeckt, dass der durch das an AIF gebundene Vpr gebildete Komplex, der normalerweise in den Mitochondrien gefunden wird, zum Zellkern wandert.
AIF induziert bekanntlich die Apoptose über einen Caspase 9-unabhängigen Signalweg. Vpr induziert bekanntlich die Apoptose über einen Caspase 9-abhängigen Signalweg.
Die Entdeckung, dass Vpr an AIF bindet, stellt die Mittel bereit, spezifische Inhibitoren zu entwerten und zu entdecken. Gemäß der vorliegenden Erfindung werden Vpr und AIF verwendet, um Verbindungen nach spezifischen Inhibitoren zu durchmustern. Inhibitoren sind als Anti-HIV-Mittel sowie als Mittel zur Behandlung von entzündlichen Krankheiten und Krebs geeignet. Gereinigtes Vpr und AIF können in Arzneistoffscreenings zur Identifikation von Verbindungen verwendet werden, welche die Komplexe dissoziieren und die Bildung von Komplexen inhibieren. Verbindungen können auch durchmustert werden, um diejenigen zu identifizieren, die den Komplex an der Kerntranslokation hindern.
Ein Durchschnittsfachmann kann die Nukleinsäuremoleküle isolieren, die für Vpr und AIF kodieren, und sie unter Verwendung von Standardtechniken und leicht erhältlichen Ausgangsmaterialien in Expressionsvektoren inserieren. Die kodierende Sequenz ist operativ mit den erforderlichen Regulatorsequenzen verknüpft. Expressionsvektoren sind bekannt und leicht erhältlich. Beispiele für Expressionsvektoren umfassen Plasmide, Phagen, virale Vektoren und andere Nukleinsäuremoleküle oder Nukleinsäuremoleküle enthaltende Vehikel, die dazu geeignet sind, Wirtszellen zu transformieren und die Expression von kodierenden Sequenzen zu fördern. Die rekombinanten Expressionsvektoren der Erfindung sind dazu geeignet, Wirte zu transformieren, welche die Proteine exprimieren.
Wirtszellen für die Verwendung in bekannten rekombinanten Expressionssystemen zur Proteinproduktion sind bekannt und leicht erhältlich. Beispiele für Wirtszellen umfassen Bakterienzellen, wie zum Beispiel E. coli, Hefezellen, wie zum Beispiel S. cerevisiae, Insektenzellen, wie zum Beispiel S. frugiperda, nicht-menschliche Säuger-Gewebekulturzellen, wie zum Beispiel Ovarialzellen des chinesischen Hamsters (CHO-Zellen) und menschliche Gewebekulturzellen, wie zum Beispiel HeLa-Zellen.
In einigen Ausführungsformen kann zum Beispiel ein Durchschnittsfachmann unter Verwendung bekannter Techniken DNA-Moleküle in einen kommerziell erhältlichen Expressionsvektor zur Verwendung in bekannten Expressionssystemen inserieren. Zum Beispiel kann das kommerziell erhältliche Plasmid pSE420 (Invitrogen, San Diego, CA) zur Produktion von PAPA1 in E. coli verwendet werden. Das kommerziell erhältliche Plasmid pYES2 (Invitrogen, San Diego, CA) kann zum Beispiel zur Produktion in S. cerevisiae-Hefestämmen verwendet werden. Das kommerziell erhältliche komplette Baculovirus-Expressionssystem MAXBAC^TM (Invitrogen, San Diego, CA) kann zum Beispiel zur Produktion in Insektenzellen verwendet werden. Das kommerziell erhältliche Plasmid pcDNAI oder pcDNA3 (Invitrogen, San Diego, CA) kann zum Beispiel zur Produktion in Säugerzellen, wie zum Beispiel Ovarialzellen des chinesischen Hamsters, verwendet werden. Ein Durchschnittsfachmann kann diese kommerziellen Expressionsvektoren und -systeme oder andere verwenden, um Proteine mittels Routinetechniken und leicht erhältlicher Ausgangsmaterialien herzustellen. (Siehe z.B. Sambrook et al., Molecular Cloning a Laboratory Manual, Zweite Aufl. Cold Spring Harbor Press (1989), durch Verweis Bestandteil der vorliegenden Beschreibung). Die gewünschten Proteine können somit sowohl in prokaryotischen als auch in eukaryotischen Systemen hergestellt werden, was ein Spektrum von prozessierten Formen des Proteins ergibt.
Ein Durchschnittsfachmann kann andere kommerziell erhältliche Expressionsvektoren und -systeme verwenden oder Vektoren unter Verwendung bekannter Methoden und leicht erhältlicher Ausgangsmaterialien herstellen. Expressionssysteme, welche die erforderlichen Kontrollsequenzen, wie zum Beispiel Promotoren und Polyadenylierungssignale und bevorzugt Enhancer, enthalten, sind leicht erhältlich und für eine Vielfalt von Wirten bekannt. (Siehe z.B. Sambrook et al., Molecular Cloning a Laboratory Manual, Zweite Aufl. Cold Spring Harbor Press (1989).
Der Expressionsvektor, der entweder die für Vpr oder für AIF kodierende DNA enthält, wird zur Transformation des kompatiblen Wirts verwendet, welcher dann kultiviert und unter Bedingungen gehalten wird, in denen eine Expression der Fremd-DNA stattfindet. Das auf diese Weise produzierte Protein der vorliegenden Erfindung wird aus der Kultur entweder durch Lyse der Zellen oder aus dem Kulturmedium, wie geeignet, auf eine dem Fachmann bekannte Weise gewonnen. Ein Durchschnittsfachmann kann unter Verwendung bekannter Techniken das Vpr oder AIF isolieren, das unter Verwendung derartiger Expressionssysteme produziert wird. Die Verfahren zur Reinigung von Protein aus natürlichen Quellen unter Verwendung von Antikörpern, die spezifisch an die Proteine binden, können ebenso zur Reinigung von Proteinen angewandt werden, die durch rekombinante DNA-Technik produziert wurden.
Neben der Produktion von Proteinen durch rekombinante Techniken können auch automatisierte Peptid-Synthesizer zur Produktion von Vpr und/oder AIF eingesetzt werden. Solche Techniken sind dem Durchschnittsfachmann bekannt und sind im Fall von Derivaten mit Substitutionen nützlich, die in der Produktion DNA-kodierter Proteine nicht vorgesehen sind.
Hybridome, die Antikörper produzieren, welche an AIF oder Vpr binden, und die Antikörper selbst sind bei der Isolierung und Reinigung von AIF oder Vpr und Proteinkomplexen nützlich, die AIF und Vpr einschließen. Zudem sind Antikörper spezifische Inhibitoren von AIF oder Vpr. Antikörper, die spezifisch an das jeweilige Protein binden, können dazu verwendet werden, dieses Protein aus natürlichen Quellen unter Verwendung bekannter Techniken und leicht erhältlicher Ausgangsmaterialien zu reinigen. Derartige Antikörper können auch dazu verwendet werden, das Protein von Material zu reinigen, das bei der Produktion des Proteins durch rekombinante DNA-Technik vorliegt.
Wie hierin verwendet, bezieht sich die Bezeichnung "Antikörper" auf komplette, intakte Antikörper sowie deren Fab-Fragmente und F(ab)₂-Fragmente. Komplette, intakte Antikörper umfassen monoklonale Antikörper, wie zum Beispiel murine monoklonale Antikörper, chimäre Antikörper und humanisierte Antikörper. In einigen Ausführungsformen binden die Antikörper spezifisch an ein Epitop von AIF oder Vpr. Antikörper, die an ein Epitop binden, sind dazu geeignet, dieses Protein aus sowohl natürlichen Quellen als auch rekombinanten Expressionssystemen unter Verwendung bekannter Techniken, wie zum Beispiel der Affinitätschromatographie, zu isolieren und zu reinigen. Derartige Antikörper sind dazu geeignet, die Anwesenheit dieses Proteins in einer Probe nachzuweisen und festzustellen, ob Zellen das Protein exprimieren.
Die Produktion von Antikörpern und die Proteinstruktur von kompletten, intakten Antikörpern, Fab-Fragmenten und F(ab)₂-Fragmenten und der Aufbau der für diese Moleküle kodierenden genetischen Sequenzen sind bekannt und sind zum Beispiel in Harlow, E. und D. Lane (1988) ANTIBODIES: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY beschrieben. Kurz gefasst wird zum Beispiel AIF oder ein immunogenes Fragment desselben Mäusen injiziert. Die Milz der Maus wird entnommen, die Milzzellen werden isoliert und mit immortalisierten Mauszellen fusioniert. Die Hybridzellen oder Hybridome werden kultiviert, und die Zellen, die Antikörper sezernieren, werden selektiert. Die Antikörper werden analysiert, und wenn sich herausstellt, dass sie spezifisch an das Protein binden, wird das Hybridom, das sie produziert, kultiviert, um einen kontinuierlichen Vorrat an Antikörpern zu produzieren. Antikörper gegen AIF sind kommerziell von Chemicon International (Temecula, CA) Katalog Nr. AB16501 erhältlich.
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Identifikation von Anti-HIV-Verbindungen und Verbindungen, die sich für die Behandlung von Krebs und Autoimmunkrankheiten eignen. In dieser Hinsicht wird Vpr oder ein Fragment von Vpr, von dem bekannt ist, dass es mit AIF wechselwirkt, mit AIF oder einem Fragment von AIF, welches mit Vpr wechselwirkt, in Anwesenheit einer Testverbindung in Kontakt gebracht. Die Affinität von Vpr oder einem Fragment von Vpr zu AIF oder einem Fragment von AIF wird gemessen und mit der Affinität von Vpr oder einem Fragment von Vpr zu AIF oder einem Fragment von AIF in Abwesenheit einer Testverbindung verglichen. Verbindungen, welche die Bindung von AIF an Vpr trennen können, können sich als Anti-HIV-Verbindungen oder Verbindungen eignen, die sich für die Behandlung von Krebs und Autoimmunkrankheiten eignen. Ein Beispiel für eine Positivkontrolle in diesem Arzneistoffscreening-Assay wären Anti-Vpr-Antikörper, welche bezüglich AIF kompetitiv an Vpr binden. Ein weiteres Beispiel für eine Positivkontrolle in diesem Arzneistoffscreening-Assay wären Anti-AIF-Antikörper, welche bezüglich Vpr kompetitiv an AIF binden. Diese Antikörper eignen sich als bekannte Verbindungen, welche die Vpr/AIF-Wechselwirkung trennen. Bekannte Mengen von Vpr und AIF können unter Bedingungen, die für die Bindung geeignet sind, vereinigt werden. In einigen Ausführungsformen der Erfindung liegt die bevorzugte Konzentration der Testverbindung zwischen 1 μM und 500 μM. Eine bevorzugte Konzentration liegt zwischen 10 μM und 100 μM. In einigen bevorzugten Ausführungsformen ist es wünschenswert, eine Verdünnungsreihe von Testverbindungen zu verwenden. In einigen Aspekten wird ein Kit zur Durchführung dieses Verfahrens bereitgestellt. Der Kit umfasst einen ersten Behälter, der HIV Vpr oder ein Fragment von Vpr umfasst, von dem bekannt ist, dass es mit AIF wechselwirkt; und einen zweiten Behälter, der AIF oder ein Fragment von AIF enthält, das mit Vpr wechselwirkt. Weiter kann der Kit gegebenenfalls Instruktionen für die Durchführung des Testassays und/oder einen vierten Behälter mit einer Positivkontrolle umfassen, wie zum Beispiel Anti-Vpr- Antikörper, welche bezüglich AIF kompetitiv an Vpr binden, und/oder Anti-AIF-Antikörper, welche bezüglich Vpr kompetitiv an AIF binden.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft Verfahren zur Identifikation von Verbindungen, die Vpr/AIF-Komplexe an der Translokation zum Zellkern hindern. Zellen, die bekanntlich Vpr produzieren oder Vpr ausgesetzt werden, werden mit Testverbindungen in Kontakt gebracht. Der Gehalt an Vpr und/oder AIF in dem Kern und/oder der Gehalt an Vpr und/oder AIF im Zytoplasma wird gemessen und mit dem entsprechenden Gehalt von Zellen verglichen, die nicht mit der Testverbindung in Kontakt gebracht wurden. In einigen Ausführungsformen der Erfindung liegt die bevorzugte Konzentration der Testverbindung zwischen 1 μM und 500 μM. Eine bevorzugte Konzentration liegt zwischen 10 μM und 100 μM. In einigen bevorzugten Ausführungsformen ist es wünschenswert, eine Verdünnungsreihe von Testverbindungen zu verwenden.
BEISPIEL
Die folgenden durch Hinterlegungsnummer und Referenzen gekennzeichneten Sequenzen sind durch Verweis Bestandteil der vorliegenden Beschreibung.

Claims

Verfahren zur Identifikation von Verbindungen, welche die HIV Vpr-Bindung an AIF inhibieren, umfassend einen Testassay, welcher die Schritte umfasst: i) In-Kontakt-Bringen von a) HIV Vpr oder einem Fragment von Vpr, von dem bekannt ist, dass es mit AIF wechselwirkt, und von b) AIF oder einem Fragment von AIF, welches mit Vpr wechselwirkt, in Anwesenheit von c) einer Testverbindung und ii) Vergleichen des Grades der HIV Vpr-Bindung an AIF mit dem Grad der HIV Vpr-Bindung an AIF in Abwesenheit der Testverbindung.
Verfahren nach Anspruch 1, in dem a) HIV Vpr und b) AIF oder ein Fragment von AIF, das mit Vpr wechselwirkt, in Anwesenheit c) einer Testverbindung in Kontakt gebracht werden.
Verfahren nach Anspruch 1, in dem a) HIV Vpr oder ein Fragment von Vpr, von dem bekannt ist, dass es mit AIF wechselwirkt, und b) AIF in Anwesenheit von c) einer Testverbindung in Kontakt gebracht werden.
Verfahren nach Anspruch 1, in dem a) HIV Vpr und b) AIF in Anwesenheit von c) einer Testverbindung in Kontakt gebracht werden.
Verfahren nach Anspruch 1, weiter umfassend einen positiven Kontrollassay, welcher die Schritte umfasst: i) In-Kontakt-Bringen von a) HIV Vpr oder einem Fragment von Vpr, von dem bekannt ist, dass es mit AIF wechselwirkt, und b) AIF oder einem Fragment von AIF, das mit Vpr wechselwirkt, in Anwesenheit von c) Anti-Vpr-Antikörpern, welche bezüglich AIF kompetitiv an Vpr binden, und/oder Anti-AIF-Antikörpern, welche bezüglich Vpr kompetitiv an AIF binden.
Verfahren nach Anspruch 1, in dem die Konzentration der Testverbindung zwischen 1 μM und 500 μM liegt.
Verfahren nach Anspruch 1, in dem die Konzentration der Testverbindung zwischen 10 μM bis 100 μM liegt.
Verfahren nach Anspruch 1, in dem eine Reihe von Testassays unter Verwendung einer Verdünnungsreihe von Testverbindungen durchgeführt wird.
Kit zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, umfassend: a) einen ersten Behälter, der HIV Vpr oder ein Fragment von Vpr umfasst, von dem bekannt ist, dass es mit AIF wechselwirkt; und b) einen zweiten Behälter, der AIF oder ein Fragment von AIF umfasst, welches mit Vpr wechselwirkt, und gegebenenfalls c) Instruktionen für die Durchführung des Testassays.
Kit nach Anspruch 9, weiter umfassend einen vierten Behälter, der Anti-Vpr-Antikörper, die bezüglich AIF kompetitiv an Vpr binden, und/oder Anti-AIF-Antikörper umfasst, die bezüglich Vpr kompetitiv an AIF binden.
In-vitro-Verfahren zur Identifikation von Verbindungen, die die Kerntranslokation von HIV Vpr/AIF-Komplexen inhibieren, umfassend einen Testassay, der die Schritte umfasst: i) In-Kontakt-Bringen in Anwesenheit einer Testverbindung von Zellen, die HIV Vpr oder ein Fragment von Vpr, von dem bekannt ist, dass es mit AIF wechselwirkt, und AIF oder ein Fragment von AIF umfassen, das mit Vpr wechselwirkt, in der Anwesenheit und von AIF; und ii) Vergleichen des Gehalts an Vpr/AIF in dem Kern mit dem Gehalt an Vpr/AIF in dem Kern in Abwesenheit der Testverbindung und/oder Vergleichen des Gehalts an Vpr/AIF in dem Zytoplasma mit dem Gehalt von Vpr/AIF in dem Zytoplasma in Abwesenheit der Testverbindung.
Verfahren nach Anspruch 11, in dem die Zellen a) HIV Vpr und b) AIF oder ein Fragment von AIF umfassen, das mit Vpr wechselwirkt.
Verfahren nach Anspruch 11, in dem die Zellen a) HIV Vpr oder ein Fragment von Vpr, von dem bekannt ist, dass es mit AIF wechselwirkt, und b) AIF umfassen.
Verfahren nach Anspruch 11, in dem die Zellen a) HIV Vpr und b) AIF umfassen.
Verfahren nach Anspruch 11, in dem die Konzentration der Testverbindung zwischen 1 μM und 500 μM liegt.
Verfahren nach Anspruch 11, in dem die Konzentration der Testverbindung zwischen 10 μM bis 100 μM liegt.
Verfahren nach Anspruch 11, in dem unter Verwendung von Verdünnungsreihen von Testverbindungen eine Reihe von Testassays durchgeführt wird.