DE68928079T2

DE68928079T2 - Plazentale isoferritine zur prognose und diagnose zur immunosuppression

Info

Publication number: DE68928079T2
Application number: DE68928079T
Authority: DE
Inventors: S Leslie Misrock; Chaya Moroz
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1988-03-07
Filing date: 1989-03-06
Publication date: 1997-10-09
Anticipated expiration: 2009-03-07
Also published as: JPH03504272A; EP0403554A4; EP0403554B1; EP0403554A1; JP2788314B2; DE68928079D1; ATE153765T1; AU3440989A; WO1989008842A1

Description

1 EINFÜHRUNG

Diese Erfindung betrifft Verfahren für die Prognose und Stadieneinteilung einer erworbenenen Immuninsuffizienz in Verbindung mit einer HIV-Infektion. Das Verfahren dieser Erfindung impliziert den Nachweis von plazentarem Ferritin (PLF) in Patientenproben wie z.B. Serum oder an Lymphozyten des peripheren Bluts. Erhöhte PLF-Spiegel lassen sich bei Patienten im Frühstadium der Immunsuppression nachweisen. Je nach Art der Krankheit, die mit dem Zustand der Immunsuppression bei den Patienten einhergeht, können die erhöhten PLF-Spiegel im weiteren Verlauf der Krankheit zurückgehen. Der Nachweis und die Bestimmung von PLF kann anhand von in dieser Unterlage beschriebenen monoklonalen Antikörpern vorgenommen werden.
Diese Erfindung wird anhand von Beispielen veranschaulicht, in denen ein erhöhter PLF-Spiegel in Seren von Patienten nachgewiesen wurde, die mit dem "Human Immunodeficiency Virus" (HIV) infiziert waren. Patienten in frühen Krankheitsstadien zeigten die höchsten PLF-Spiegel, welche mit weiterem Fortschreiten der Krankheit zurückgingen.

2 STAND DER TECHNIK

Ferritin ist ein eisenspeicherndes Protein, das Eisen in einer verfügbaren nichttoxischen Form bewahrt. Es sind eine Vielzahl von Ferritin-Isoformen aus unterschiedlichen Geweben isoliert worden. Die Verschiedenartigkeit der Ferritin-Eigenschaften scheint vor allem auf die Gegenwart von verschiedenen Arten von Untereinheiten in der multimeren Proteinschale zurückzuführen sein (Drysdale, 1977, Ciba Found. Symp. 51: S. 41; Arosio et al., 1978, J. Biol. Chem. 253: S. 4451; Watanabe et al., 1981, Biochem. Biophys. Res. Comm. 103; S. 207). Tatsächlich sind drei Ferritin-Untereinheiten beschrieben worden. Die L-Untereinheit (19 kD), vorwiegend in stark eisenhaltigen Geweben, die H- Unterheiten (21 kD), überwiegend in eisenarmen und bösartigen Zellen (Drysdale, 1977, a.a.O.; Arosio, 1978 a.a.O.) und die aus Serum isolierte glycosilierte G-Untereinheit (24 kD) (Cragg et al., 1981, Biochem. J. 199: S. 565). Verschiedene Isoferritine enthalten unterschiedliche Anteile an L- und H-Unterheitstypen. Erst vor kurzem enthüllten erste Untersuchungen von cDNA- Klonen, daß die Untereinheiten H und L von recht komplexen Genfamilien kodiert werden (Brown et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73: S. 857; Costanzo et al., 1984, EMBO J. 3: S. 23), was vermuten läßt, daß die Heterogenität von Ferritinmolekülen sogar noch größer als derzeit ermittelt sein kann.
Verschiedene Ferritin-Isoformen sind aus normalen und bösartigen Geweben isoliert worden, die säurehaltigsten vorwiegend aus Tumorgewebe und fetalem Gewebe (Drysdale, 1976, Ciba Found. Symp. 51: S. 41; Arosio et al., 1978, J. Biol. Chem. 253: S. 4451). Man hält es für möglich, daß die Analyse von säurehaltigem Isoferritin im Serum im Rahmen der Diagnose von Malignität wertvoll ist (Hazard et al., 1977, Nature 265: S. 755). Erhöhte Konzentrationen von Serum-Ferritin fanden sich bei Patienten, die unter einer Vielzahl von bösartigen Krankheiten litten, so u.a. an akuter lymphozytärer Leukämie (ALL) (Matzner et al., 1980, Am. J. Hematol. 9:S. 13), an einem Hepatom (Giannoulis, 1984, Digestion 30: S.236), an Brustkrebs (Jacobs et al., 1976, Br. J. Cancer 34: S. 286) und, wie man seit kurzem weiß, an der Hodgkin- Krankheit (Bezwoda et al., 1985, Scand. J. Haematol. 35: S. 505). Hazard and Drysdale stellten anhand von Untersuchungen, die an den Seren von Patienten mit verschiedenen Tumoren durchgeführt wurden, bei Einsatz von gegen HeLa- Zellferritin gerichteten Antikörpern höhere Serumferritin-Konzentrationen fest als bei Einsatz von Antikörpern, die gegen normales Leber-Ferritin gerichtet waren (Hazard et al., a.a.O.). Anderen ist es versagt geblieben, ein einheitliches Muster von Isoferritinen in Tumorgeweben (Cragg et al., 1977, br. J. Cancer 35: S. 635; Halliday et al., 1976, Cancer Res. 36: S. 4486) oder in Seren, die von Patienten mit Tumoren stammten (Jones et al., 1978, Clin. Chim. Acta. 85: S. 81; Jones et al., 1980, Clin. Chim. Acta. 106: S. 203) aufzuzeigen. Es gibt daher sich widersprechende Ansichten, was die Herkunft und Spezifität des erhöhten Serum-Ferritinspiegels bei bösartigen Krankheiten anbelangt.
Moroz et al. (Exp. Hematology, 1987 15 S. 258-262) beschreiben erhöhte PLF-Spiegel bei einer Vielzahl von hämatologischen Malignitäten. Moroz et al. (Cancer, 1084, 54, S. 84-89 beschreiben erhöhte PLF-Spiegel bei Frauen mit unterschiedlichen Empfänglichkeiten für Brustkrebs.

3 ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die hier beschriebene Erfindung betrifft ein Verfahren für die Prognose und Stadieneinteilung von erworbener Immuninsuffizienz in Verbindung mit einer HIV-Infektion und impliziert den Nachweis von bestimmten Isoformen von Ferritin, plazentarem Ferritin (PLF) in Patientenproben wie Seren oder an Lymphozyten des peripheren Bluts. Das Verfahren dieser Erfindung basiert zum Teil auf der überraschenden Entdeckung, daß PLF (und nicht andere Isoferritine) in erhöhten Konzentrationen bei immunsupprimierten Patienten in frühen Stadien der Erkrankung vorkommen. Die PLF-Spiegel sinken mit Fortschreiten der Krankheit. Im Gegensatz zu PLF sind die Erwachsenen- Isoferritin-Spiegel in späten Stadien der Immuninsuffizienz erhöht. Diese Entdeckung wurde zum Teil durch die Entwicklung monoklonaler Antikörper wie zum Beispiel dem hier (und in zugehörigen Hauptanmeldungen) beschriebenen monoklonalen Antikörper CM-H9 möglich, der ausschließlich an PLF und nicht an andere Ferritine wie z.B. die Leber- und Milz-Isoformen ankoppelt. Diese monoklonalen Antikörper ermöglichten den alleinigen Nachweis von PLF- Spiegeln bei Patienten im Verlaufe einer Krankheit. Entsprechend dieser Erfindung können monoklonale Antikörper, die diese Art von Spezifität aufweisen, in Immuntests zur Überwachung von PLF-Spiegeln in Patientenproben eingesetzt werden. Solche PLF-Profile können zur Prognose und Stadieneinteilung von erworbener Immuninsuffizienz in Verbindung mit einer HIV-Infektion eingesetzt werden.

4 DEFINITIONEN

AIDS - Acquired Immune Deficiency Syndrome (Erworbenes Immundefekt-Syndrom)
ARC - AIDS related Complex
RSA = Rinderserumalbumin
CD4=T4 = Marker der Helfer/Induktor-T-Lymphozyten
CD8=T8 = Marker der zytotoxischen/Suppressor-T-Lymphozyten
CD2=T11 = Marker der gesamten T-Zellen-Population, Schaferythrozyten rosetten- Rezeptor
ELISA - Enzymgebundener Immunosorbenstest
HIV - Human Immunodeficiency Virus (Humanes Immunschwäche-Virus); HTLV-3; LAV
mAK oder McAb - monoklonale(r) Antikörper
PLF - Plazentares Isoferritin (auch oncofetales Ferritin genannt)
SA - Standardabweichung

5 BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN

ABBILDUNG 1. Die an HIV-infizierten Patienten und an gesunden Blutspendern gleichzeitig gemessenen mittleren Serum-Spiegel von PLF (A) und von normalem Ferritin (B). n = Anzahl der untersuchten Patienten. Die Balken stehen für Mittelwert +1 SA (Standardabweichung). (*) steht für Werte, die noch erheblich höher sind als bei Blutspendern gemäß T-Test p< 0,01; xx, p< 0,001.
ABBILDUNG 2. Das Verhältnis zwischen Serum-PLF pro CD4&spplus;- Lymphozyte von HIV-infizierten Patienten. Die Balken stehen für Mittelwert +1 SA.
ABBILDUNG 3. Streuungsdiagramm des Prozentsatzes an mit dem monoklonalen Antikörper CM-H9 auf PLF hin positiv gefärbten zirkulierenden Lymphozyten bei HIV-infizierten Patienten der Stadien A - E. Jeder Punkt steht für den Nachweis bei einem einzigen Patienten.
ABBILDUNG 4. Die Wirkung einer Levamisole-Behandlung von Lymphozyten von HIV-infizierten Patienten auf die nachweisbare Anzahl von T4&spplus;-. T8&spplus;- und PLF&spplus;-Zellen. Die Lymphozyten wurden vor der Inkubation mit den konjugierten monoklonalen Antikörpern in vitro mit Levamisole (40 µg/ml) oder mit Medium (in unbehandelten Zellen) 30 Minuten lang bei 37ºC inkubiert.
ABBILDUNG 5. Streuungsdiagramm, das den Gesamt-Serumferritin- Spiegel bei Patienten mit hämatologischen Malignitäten (die ersten sieben Spalten) und bei gesunden Personen (rechte Spalte) aufzeigt. Das Gesamiferritin wurde anhand eines McELISA Typ A unter Einsatz von Leber- Ferritin als Standard gemessen.
ABBILDUNG 6. Streuungsdiagramm, das die Serum-PLF-Spiegel bei Patienten mit hämatologischen Malignitäten (die ersten sieben Spalten) und bei gesunden Personen (rechte Spalte) aufzeigt. PLF wurde anhand eines McELISA Typ B unter Einsatz von plazentarem Ferritin als Standard gemessen.
ABBILDUNG 7A. Elutionsprofil von PLF. Plazentare Ferritine wurden wie später beschrieben hergestellt, und PLF wurde aus einer DEAE-Cellulose- Säule unter Einsatz eines Tris-HCl-(pH 7,5-)Gradienten von 0,02 M bis 0,05 M eluiert.
ABBILDUNG 7B. Der PLF-Gehalt einer jeden Fraktion gemäß ELISA- Test. Die folgenden Einfang-Inachweis-Antikörper wurden in ELISA-Sandwich- Tests eingesetzt: CM-H9 Einfang-Ak/CM-H9 Nachweis-AK; CM-G8 Einfang- AK/CM-G8 Nachweis-AK; CM-G8 Einfang-Ak/CM-H9 Nachweis-AK.
ABBILDUNG 8. Streuungsdiagramm von PLF-Spiegeln, die bei Patienten mit Autoimmunkrankheiten nachgewiesen wurden. Die PLF-Spiegel sind erhöht bei solchen Krankheiten, die durch eine Immunsuppression gekennzeichnet sind.

6 AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Diese Erfindung betrifft Verfahren für die Prognose und die Stadieneinteilung einer Immunsuppression, die in Verbindung mit AIDS (erworbenes Immunschwäche-Syndrom) als Folge einer HIV-Infektion auftritt.
Diese Erfindung basiert zum Teil auf der überraschenden Entdeckung, daß PLF (plazentares Ferritin) - im Gegensatz zu Isoformen von Erwachsenen- Ferritin - bei an Immunsuppression leidenden Patienten in frühen Krankheitsstadien erhöht ist. Je nach Art der Krankheit des immunsupprimierten Patienten können die PLF-Spiegel mit Fortschreiten der Krankheit erhöht bleiben oder zurückgehen. Im Gegensatz zu PLF-Spiegeln ist der Erwachsenen-Ferritin Spiegel in späten Stadien der Immuninsuffizienz erhöht. Diese Entdeckung wurde zum Teil möglich durch die Entwicklung eines monoklonalen Antikörpers, CM-H9 (der in dieser Anmeldung sowie in Hauptanmeldungen beschrieben wird), der für PLF spezifisch ist und der nicht mit Erwachsenen-Ferritin kreuzreagiert.
Entsprechend dieser Erfindung kann die Bestimmung von PLF-Spiegeln in Patientenproben zur frühen Diagnose einer Immunsuppression genutzt werden. Darüber hinaus kann die Überwachung sowohl des PLF-Spiegels als auch des Erwachsenen-Ferritin-Spiegels prognostisch zur Einstufung des Entwicklungsgrades einer Immunsuppression herangezogen werden. Wenngleich auch eine Vielzahl von Geweben auf die Gegenwart von PLF und/oder Erwachsenen- Ferritin hin untersucht werden kann, so sind doch Serum und Lymphozyten des peripheren Bluts (PBL) geeignete Test-Proben. Während Erwachsenen-Ferritin in Serum (und in verschiedenen Körpergeweben) untersucht werden kann, kommt PLF nicht nur im Serum vor, sondern scheint sich auch an die Oberfläche einer bestimmten Untergruppe von zirkulierenden Lymphozyten zu binden. Das heißt, daß wenn PLF anfänglich in sehr frühen Stadien der Erkrankung produziert wird, die Untergruppe der zirkulierenden Lymphozyten das gesamte verfügbare PLF binden kann, so daß die PLF-Serum-Spiegel normal erscheinen können, während ein Test der zirkulierenden Lymphozyten auf PLF hin positiv ausfällt. Mit steigenden PLF-Produktionsmengen während der frühen Stadien der Immunsuppression erreicht die Lymphozyten- Untergruppe, die an PLF andockt, einen Punkt, an dem sie gesättigt ist und an dem erhöhte PLF-Serumspiegel nachweisbar sein müßten.
Je nach Art der Krankheit des immunsupprimierten Patienten können die PLF-Spiegel im weiteren Verlauf der Krankheit erhöht bleiben oder zurückgehen. Bei HIV-infizierten Patienten, beispielsweise, sind die PLF- Spiegel in frühen Erkrankungsstadien erhöht, nehmen jedoch in den späten Stadien der Erkrankung ab. Demgegenüber sind die PLF-Spiegel bei Patienten mit lymphoproliferativen Krankheiten wie Hodgkin-Lymphom, Nicht-Hodgkin- Lymphom des niedrigen und mittleren Malignitätsgrads sowie bei Patienten mit akuter lymphozytärer Leukämie (ALL) in frühen Erkrankungsstadien erhöht und bleiben auch bei Fortschreiten der Krankheit erhöht. Wenngleich die Anmelder auch nicht verpflichtet oder gezwungen sind, die Mechanismen dieser Erfindung zu erklären, kann es so sein, daß die infizierten Lymphozyten im Falle von AIDS bzw. die malignen Lymphozyten im Falle eines Lymphoms und von Leukämie die zellulären Quellen des PLF sind, das in erhöhten Graden pro Zelle während einer Immunsuppression ausgedrückt wird. Ensprechend nehmen im Falle von AIDS-Patienten bei zurückgehender Population von infizierten Lymphozyten die nachgewiesenem PLF-Konzentrationen ab. Demgegenüber bleiben bei einem Lymphom und bei Leukämie mit wuchernder Population von bösartigen Lymphozyten die PLF-Spiegel erhöht.
Der Nachweis von PLF in Patientenproben kann anhand einer Reihe von Verfahren erfolgen. Ein geeigneter Ansatz für den Nachweis von PLF, der weiter unten ausführlicher beschrieben wird, impliziert Immuntests, die monoklonale Antikörper verwenden, die unter Ausschluß der Isoformen von Erwachsenen-Ferritin PLF definieren und binden. Solche monoklonalen Antikörper können in jedem Immuntestformat für den PLF-Nachweis eingesetzt werden, so u.a. in enzymgebundenen Immunosorbenstests (Enzyme-linked immunosorbant assays - ELISAs), Radioimmuntests (Radioimmunoassays - RIAs), Fluoreszenzimmuntests (Fluorescent immunoassays - FIAs), etc., in einem Sandwich-System oder kompetitiven System oder in zytotoxische Test- Systemen. In hier beschriebenen besonderen Ausführungsarten werden zwei Arten von monoklonalen Antikörpern beschrieben, die sich besonders für den Einsatz in einem nach der Sandwich-Methode durchgeführten Immuntest eignen: ein monoklonaler Antikörper kreuzreagiert sowohl mit PLF als auch mit Erwachsenen-Ferritin, während ein zweiter, für PLF spezifischer monoklonaler Antikörper mit Erwachsenen-Ferritin nicht kreuzreagiert. Der kreuzreaktive Antikörper kann in einem Sandwich-Testsystem als ein Einfang-Antikörper eingesetzt werden, um alle in der Probe vorkommenden Isoformen von Ferritin, d.h. sowohl PLF als auch Erwachsenen-Ferritin, einzufangen. Der PLF- spezifische monoklonale Antikörper kann markiert und zum Nachweis von eingefangenem PLF eingesetzt werden, während der kreuzreaktive monoklonale Antikörper markiert und zum Nachweis von allen eingefangenen Isoformen von Ferritin eingesetzt werden kann.
In den nachfolgenden Kapiteln werden die typischen Eigenschaften von PLF, PLF-definierende monoklonale Antikörper sowie die Verwendungsmöglichkeiten von PLF zu Diagnose- und Prognosezwecken bei Autoimmunzuständen beschrieben. Diese Erfindung wird anhand von Beispielen aufgezeigt, in denen Serum-PLF-Spiegel sowie Erwachsenen-Ferritin-Spiegel bei HIV-infizierten Patienten sowie bei Patienten mit Lymphomen oder Leukämie sowie gewissen Autoimmunkrankheiten während des Krankheitsverlaufs unter Einsatz von PLF- spezifischen und Erwachsenen-Ferritin-spezifischen monoklonalen Antikörpern in einem ELISA-Sandwich-Format verfolgt wurden.

7 PLAZENTARES FERRITIN (PLF) UND PLF- SPEZIFISCHE MONOKLONALE ANTIKÖRPER

Zwei monoklonale Antikörper, der ausschließlich mit PLF reagierende CM-H9 und der mit PLF sowie auch mit Erwachsenen-Ferritin kreuzreagierende CM-G8, wurden eingesetzt, um plazentares Ferritin zu charakterisieren. Mit CM-H9 reaktive(s) plazentare(s) Ferritin(e) war(en) äußerst sauer im Vergleich zu Molekülen, die mit CM-G8 reaktiv sind, was auf eine strukturelle Heterogenität in plazentarem Ferritin vom Menschen hinweist. Eine drei Untereinheiten umfassende Struktur wurde durch unsere Analyse aufgedeckt: eine leichte (L-) Untereinheit mit 18 kD und eine schwere (H-) Untereinheit mit 20 kD sowie eine Untereinheit mit 43 kD. Die 18-kD-L-Untereinheit und die 20- kD-H-Untereinheit sind bereits für Milz- und Leber-Ferritine aufgezeigt worden; die dritte Untereinheit mit höherem Molekulargewicht (43 kD) indes scheint einzigartig für plazentares Ferritin vom Menschen zu sein. CM-H9-reaktives plazentares Ferritin bestand nur aus der 43-kD-Untereinheit. Diese 43-kD- Untereinheit konnte unter erschöpfenden Reduktionsbedingungen nicht weiter aufgetrennt werden.
Die so identifizierte 43-kD-Untereinheit von Human-Placenta-Ferritin scheint entweder Teil des Ferritin-Moleküls zu sein oder mit diesem verbunden zu sein. Diese Vorstellung basiert auf den Erkenntnissen, daß diese Untereinheit die CM-G8-reaktiven Antigen-Epitope enthält, die in Milz- und Leber-Ferritin vorkommen. Desweiteren enthielt CM-H9-reaktives Ferritin meßbare Eisenmengen, wie sich durch seine Reaktionsfreudigkeit mit Kaliumferrocyanid zeigte, und kann daher als ein placenta-assoziiertes Isoferritin angesehen werden. Die Verwendung von CM-H9 und CM-G8 zur Analyse von aus einer DEAE-Säule eluierten PLF-Fraktionen offenbarte, daß die 43-kD-Untereinheit als ein Homopolymer oder als ein Dimer mit der L- oder H-Kette vorkommen kann.
Einige strukturelle Ähnlichkeiten wurden zwischen der 20-kD-H- Untereinheit und der 43-kD-Untereinheit festgestellt. Beide Untereinheiten zeigten sich für eine V8-(Endoproteinase Glu-C-)Proteolyse empfänglich und beide verloren ihre antigene Reaktionsfreudigkeit mit CM-G8 nach einer SDS- Behandlung unter Reduktionsbedingungen. Es kann sein, daß die höhermolekulare Untereinheit (43 kD) von Placenta-Ferritin entweder ein stabiler Dimer oder eine Vorstufe der H-Untereinheit (20 kD) ist (siehe auch Parhami-Seren und Moroz, 1986, G.I. Pat. Clin. 1(1): S. 17).
Schließlich wurde die einzigartige, in Placenta-Ferritin vorkommende 43- kD-Untereinheit, die mit CM-H9 reagiert, auch in Ferritin-Molekülen, die von Brustkrebszellen synthetisiert worden waren, und nicht in Ferritin, das durch normale Brustzellen synthetisiert worden war, nachgewiesen. Desweiteren wurde CM-H9-reaktives Ferritin im Blut von an Brustkrebs erkrankten Patienten, nicht jedoch von gesunden Personen nachgewiesen. Wir vermuten daher, daß die CM-H9-reaktive 43-kD-Untereinheit ein charakteristisches Merkmal von karzinofetalem Ferritin ist.

8 DIE MOLEKULARE HETEROGENITÄT VON PLAZENTA-FERRITIN

Durch eine DEAE-Cellulose-Chromatographie gewonnenes Plazenta- Ferritin (wie in Abs. 6.1 beschrieben) wurde einer isoelektrischen Fokussierung (IEF) unterzogen und dann entweder mit ¹²&sup5;I-CM-H9-mAK oder ¹²&sup5;I-CM-G8- mAK zur Reaktion gebracht. ¹²&sup5;I-CM-H9-mAK reagierte mit Plazenta-Ferritin in einem pH-Bereich zwischen pH 4,7 und pH 5,2. Auf der anderen Seite reagierte auf Agar isoelektrofokussiertes Milz-Ferritin nicht mit ¹²&sup5;I-CM-H9-mAK. ¹²&sup5;I- CM-G8-mAK reagierte mit in einem pH-Bereich zwischen pH 5,1 und 5,4 fokussiertem Plazenta-Ferritin und mit in einem pH-Wert zwischen 5,4 und 5,5 fokussiertem Milz-Ferritin. Die Ergebnisse der isoelektrischen Fokussierung zeigen, daß plazentares Ferritin heterogen ist. Das sauerste Ferritin (pl 4,7 - 5,0) reagierte mit dem monoklonalen Antikörper GM-H9, wohingegen die weniger sauren Moleküle (pl 5,1 - 5,2) sowohl mit dem mAK CM-H9 als auch mit dem mAK CM-G8 reagierten. Es wurde ebenso festgestellt, daß in einem pH-Bereich von pH 5,4 bis pH 5,5 fokussiertes Milz-Ferritin mit ¹²&sup5;I-CM-G8- mAK reagierte, während keine Reaktionsfreudigkeit mit ¹²&sup5;I-CM-H9-mAK bei einem solchen pH-Wert festgestellt werden konnte.
Die aus einer DEAE-Cellulose-Säule eluierten PLF-Fraktionen (siehe Beschreibung in Abs. 6.1) wurden anhand von ELISA-Tests unter Einsatz der nachgenannten Einfang-/Nachweis-Antikörper weiter analysiert: (a) CM-H9- Einfang-AK/CM-H9-Nachweis-AK; (b) CM-G8-Einfang-AK/CM-G8-Nachweis- AK; und (c) CM-G8-Einfang-AK/CM-H9-Nachweis-AK. Die in den Abbildungen 7A und 7B gezeigten Ergebnisse veranschaulichen die relativen Mengen der verschiedenen PLFs in diesen Fraktionen. Matzner et al., (1984, Brit. J. Haematol. 59: S. 443 - 448) berichteten, daß die Fraktion II die größte biologische Aktivität zeigte (d.h. eine immunsuppressive Wirkung auf die T- Zellen-Funktion in vitro), wohingegen die Fraktion I keine derartige Aktivität zeigte. Interessanterweise offenbaren unsere Ergebnisse, daß die aktivere Fraktion II die größten Mengen an CM-H9-reaktivem PLF enthält.

9 DIE IN UNTEREINHEITEN GEGLIEDERTE STRUKTUR VON MIT DEN MONOKLONALEN ANTIKÖRPERN CM-H9 UND CM-G8 REAKTIVEM PLAZENTA-FERRITIN

Die Trennung von Plazenta-Ferritinen mittels SDS-PAGE unter Reduktionsbedingungen mit anschließender Immunoblot-Analyse unter Einsatz von ¹²&sup5;I-CM-H9 oder ¹²&sup5;I-CM-G8 offenbarte, daß ¹²&sup5;I-CM-H9 mit einer einzigen Untereinheits-Struktur (43 kD) von plazentarem Ferritin reagierte. Es konnte keine Reaktionsbereitschaft von ¹²&sup5;I-CM-H9-mAK mit Milz-Ferritin festgestellt werden. Es konnte keine Reaktionsbereitschaft von ¹²&sup5;I-CM-G8- mAK mit Plazenta- oder Milz-Ferritin festgestellt werden. Diese Ergebnisse lassen vermuten, daß die CM-G8-reaktiven Ferritin-Antigendeterminanten sowohl von der Plazenta als auch von der Milz für eine SDS-Behandlung unter Reduktionsbedingungen empfänglich waren. Weitere Immunoblot-Experimente wurden mit polyklonalem Kaninchen-Anti-Human-Milz-Ferritin und ¹²&sup5;I-Protein A durchgewihrt. Ein einziges 1 8-kD-Band zeigte sich sowohl in Plazenta- als auch in Milz-Ferritin nach einer Behandlung mit SDS-PAGE.
Da CM-G8-reaktive Determinanten von Plazenta-Ferritinen und von Milz- Ferritinen nach einer SDS-Behandlung nicht nachgewiesen werden konnten, wurden Versuche konzipiert, in denen affinitäts-gereinigtes Plazenta-Ferritin radioaktiv markiert und mit den monoklonalen Antikörpern immunochemisch ausgefällt wurde, bevor es einer SDS-PAGE-Behandlung unterzogen wurde. Mit verschiedenen Konzentrationen von CM-H9-mAK immunochemisch ausgefälltes und auf SDS-PAGE elektrophoretiertes ¹²&sup5;I-CM-H9-reaktives Ferritin offenbarte eine Struktur, die nur eine einzige Untereinheit von 43 kD umfaßte. Diese Untereinheits-Struktur wurde nach erschöpfenden Reduktionsbedingungen (10-minütiges Kochen in 2 % SDS und 5 % 13-Mercaptoethanol oder in 6 M Harn) nicht weiter aufgeschlossen. Demgegenüber zeigte mit verschiedenen Konzentrationen von CM-G8-mAK immunochemisch ausgefälltes und einer Behandlung mit SDS-PAGE unter den obengenannten Bedingungen unterzogenes ¹²&sup5;I-CM-G8-reaktives Ferritin drei unterschiedliche Untereinheiten von jeweils 43 kD, 20 kD und 18 kD. Diese Ergebnisse weisen auf die Gegenwart einer für CM-H9- und CM-G8-reaktive Ferritine gemeinsamen 43- kD-Untereinheits-Struktur hin, während nur das CM-G8-reaktive Ferritin neben der 43-kD-Untereinheit die H-Kette und die L-Kette enthielt.

ENZYMATISCHE AUFSCHLIESSUNG VON PLAZENTA-ISOFERRITIN MIT V8-PROTEASE

Weitere Experimente wurden durchgeführt, um die Empfindlichkeit der Ferritin-Untereinheiten gegenüber einer beschränkten Proteolyse durch V8- Protease zu bestimmen. Der Großteil der 43-kD-Untereinheit von CM-H9- reaktivem Ferritin war nach einer 60-minütigen Inkubation mit V8-Protease aufgespalten. Eine vollständige Aufspaltung dieser Untereinheit jedoch wurde selbst nach einer 120minütigen Inkubation nicht erreicht. Bei einer Behandlung von CM-G8-reaktivem Ferritin mit V8-Protease wurde sowohl die 43-kD- als auch die 20-kD-Untereinheit vollständig aufgespalten.

11 NACHWEIS VON PLAZENTAREM FERRITIN

Ein geeignetes Verfahren zum Nachweis von PLF in Patientenproben impliziert Immuntests, bei denen monoklonale Antikörper zum Einsatz kommen, die PLF unter Ausschluß jeglicher Isoformen von Erwachsenen-Ferritinen definieren. Solche Antikörper können in einer Vielzahl von Immuntests konfiguriert werden, so u.a. in ELISA-Tests, Radioimmuntests (RIAs), Fluoreszenzimmuntests (FIAs), usw., in einem Sandwich-, kompetitiven oder zytotoxischen/Ziel-Zellen-Format.
In hier erläuterten besonderen Ausführungsarten werden zwei Arten von monoklonalen Antikörpern beschrieben, die sich für solche Tests besonders eignen: monoklonale Antikörper wie CM-G8, die mit PLF und Erwachsenen- Ferritin kreuzreagieren, und monoklonale Antikörper wie CM-H9, die für PLF spezifisch sind und nicht mit Erwachsenen-Ferritin kreuzreagieren. Diese Antikörper können in einer Reihe von Konfigurationen in einem sandwichartigen Test zur Verfolgung sowohl der PLF-Spiegel als auch der Erwachsenen- Ferritin-Spiegel bei einem Patienten eingesetzt werden. Beispielsweise kann ein PLF-spezifischer Antikörper sowohl als Einfang-Antikörper als auch als Nachweis-Antikörper zur Überwachung von PLF-Spiegeln verwendet werden. Alternativ kann ein kreuzreaktiver Antikörper eingesetzt werden, um alle Isoformen von Ferritin (d.h. sowohl PLF als auch Erwachsenen-Ferritin) in der Probe einzufangen; in diesem Falle kann ein PLF-spezifischer Antikörper zum Nachweis der PLF-Isoformen in der Probe eingesetzt werden und kann ein kreuzreaktiver Antikörper in einer Kontrollprobe zum Nachweis sämtlicher in der Probe vorkommender kreuzreaktiver Ferritine verwendet werden. Die Ergebnisse eines solchen Sandwich-Tests können ein Profil der relativen PLF- und Erwachsenen-Ferritin-Spiegel in einer Patientenprobe liefern.
In einer anderen Ausführungsart dieser Erfindung können der PLF- Antikörper und der kreuzreaktive Antikörper unterschiedlich markiert und zur Bestimmung der relativen Anteile an PLF- und Erwachsenen-Ferritin in der Probe eingesetzt werden. In solchen Anwendungen kann jeder Antikörper mit einem anderen Fluor, Chromophor, Lichtemitter oder Enzym markiert werden, um ein andersartiges fluoreszierendes oder kolorimetrisches Signal zu erzeugen. Die Messung eines jeden Signals könnte eine differentielle Analyse von PLF und Erwachsenen-Ferritin in einer einzigen Probe ermöglichen.
Die Immuntests dieser Erfindung beschränken sich nicht auf die Verwendung der monoklonalen Antikörper CM-H9 und CM-G8. Es können vielmehr andere monoklonale Antikörper, die funktional mit CM-H9 und CM-G8 vergleichbar sind, für einen Einsatz gemäß dieser Erfindung in Erwägung gezogen werden. Zu diesem Zweck können die Antikörper CM-H9 und CM-G8 zur Isolierung der entsprechend dieser Erfindung verwendbaren PLF- bzw. Erwachsenen-Ferritin-Moleküle herangezogen werden. Derartigen monoklonale Antikörper können anhand eines jeden beliebigen Verfahrens hergestellt werden, das für die Produktion von Antikörpermolekülen durch kontinuierliche Zell-Linien in Kultur sorgt. So fallen beispielsweise die ursprünglich von Kohler und Milstein (1980, Sci. Am. 243 (4): S. 66-74) entwickelte Hybridom-Technik sowie andere, erst in jüngster Zeit verfügbare Techniken wie z.B. die Human-B- Zell-Hybridom-Technik (Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4: S. 72) und die EBV-Hybridom-Technik zur Produktion von humanen monoklonalen Antikörpern (Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss. Inc., S. 77 - 96) und dergleichen in den Rahmen dieser Erfindung. So würden anhand von solchen Verfahren produzierte Antikörper, die die CM- H9- und CM-G8-Epitope definieren (z.B. solche, die die Ankopplung von CM-H9 oder CM-G8 an ihre Zielantigene konkurrierend hemmen), für eine Verwendung entsprechend dieser Erfindung ausgewählt werden.

12 PLAZENTARES FERRITIN UND IMMUNSUPPRESSIVE ZUSTÄNDE

Die in den nachfolgenden Beispielen präsentierten Ergebnisse werden im folgenden erläutert. Insbesondere die in Abs. 7 präsentierten Daten zeigen, daß PLF- in HIV-infizierten Patienten gebildet wird und daß das Vorkommen von PLF eine bedeutende Rolle in der Pathogenese einer Immuninsuffizienz bei AIDS spielen könnte. Die in den Absätzen 8 und 9 präsentierten Daten zeigen, daß PLF-Spiegel bei Patienten mit bestimmten Lymphomen und Leukämien und Autoimmunkrankheiten, die durch eine Immunsuppression gekennzeichnet sind, erhöht sind.
Die Verfügbarkeit eines bestimmten monoklonalen Antikörpers, der speziell PLF definiert, erlaubte es uns, einen Test zur Messung von Serum- Spiegeln zu konzipieren, die für PLF spezifisch sind, unabhängig von der Menge an Erwachsenen-Ferritin. Ausgehend von diesen Messungen wurden Isoferritin-Profile abgeleitet, die als Prognose-Indikatoren für das Fortschreiten der Erkrankung von HIV-seropositiven Patienten zu ARC und AIDS herangezogen werden können.

13 PLAZENTARES ISOFERRITIN BEI HIV-INFEKTION

PLF wurde bei Patienten gemessen, die in den folgenden Stadien eingestuft waren: Stadium A, HIV-seropositiv, jedoch keine klinischen Erscheinungen oder körperlichen Befunde; Stadium B, Lymphknotenerkrankung (Lymphadenopathie) und/oder Milzvergrößerung (Splenomegahe); Stadium C, mit ARC zusammenhängende klinische Symptome oder Befunde; Stadium D, Kaposi-Sarkom, Lymphom oder ZNS-(Zentralnervensystem-)Erkrankung ohne systemische opportunistische Infektionen; und Stadium E, opportunistische Infektionen, die von dem CDC ursprünglich als Hinweise für die Diagnose von AIDS definiert worden waren. Die Ergebnisse offenbaren, daß die Mehrzahl der HIV-infizierten Patienten mit frühen klinischen Erscheinungen (Stadium B) erhebliche Steigerungen der PLF-Serum-Konzentrationen aufweisen. Diese Steigerungen bleiben bei den meisten Patienten in Stufe C (ARC) bestehen. Demgegenüber wird eine Fortentwicklung der Krankheit hin zu AIDS von einem erheblichen Anstieg des Gesamt-Serumferritin-Spiegels bei gleichzeitigem Rückgang der PLF-Konzentration begleitet. Dieser Anstieg der normalen Ferritinspiegel bei AIDS-Patienten wurde bereits früher von anderen Forschern vermeidet (Blumberg, B., et al., 1984, Lancet 1: S.347; Gupta, S., et al., 1986, J. Clin. Lab. Immunol. 20:S. 11 - 13).
Wenn auch die Anmelder nicht verpflichtet sind, diese Erfindung zu erklären, sind wir überzeugt, daß bei HIV-infizierten Personen der Anstieg des Serum-PLF eng zusammengehört mit der Entwicklung einer Lymphadenopathie und späteren klinischen Erscheinungen des AIDS-verbundenen Komplexes (ARC). Anstiege des normalen Ferritinspiegels scheinen vor allem mit der Weiterentwicklung der Krankheit von ARC zu AIDS zusammenzuhängen. Personen mit klinisch latenter HIV-Infektion (Stadium A) zeigen keine Anstiege der Serum-Isoferritine.
Der zelluläre Ursprung des Serum-PLF bei HIV-infizierten Patienten ist indes noch nicht bekannt. Gleichwohl läßt die Feststellung, daß mit der Weiterentwicklung der Krankheit Rückgänge des Serum-PLF-Spiegels positiv mit Rückgängen in der Gesamtzahl von CD4&spplus;-Lymphozyten korreliert, vermuten, daß PLF seinen Ursprung in diesen CD4&spplus;-Zellen haben kann. Tatsächlich gehen sowohl die Serum-PLF-Spiegel als auch die Gesamtzahl der CD4-Lymphozyten mit Fortschreiten der Krankheit zurück. Jedoch steigt der Anteil der HIV-infizierten CD4&spplus;-Lymphozyten innerhalb der schwindenden Population dieser Zellen während dieser Zeit wahrscheinlich an. Dieser Anstieg des Anteils von HIV-infizierten CD4&spplus;-Lymphozyten könnte eine Erklärung für den beobachteten Anstieg im Verhältnis der Serum-PLF-Konzentration pro einzelner CD4&spplus;-Lymphozyte im Stadium E sein (ABB. 2). Diese Ergebnisse lassen vermuten, daß Serum-PLF seinen Ursprung in den HIV-infizierten CD4&spplus;- Zellen hat und daß daher das Verhältnis der Serum-PLF-Spiegel pro CD4&spplus;- Lymphozyte als ein Diagnose-Indikator für den lnfektionsgrad herangezogen werden kann. Kurzum, während die höchsten absoluten Konzentrationen von Serum-PLF mit einer HIV-Infektion im Frühstadium einhergehen kann das Verhältnis der PLF-Konzentration pro zirkulierender CD4&spplus;-Lymphozyte ein brauchbarer Hinweis auf den Grad der Zellinfektion sein.
Die Ergebnisse zeigten auch, daß bei HIV-infizierten Personen eine Untermenge von CD8&spplus;-Zellen (15,2 +/- 6,4 %) vorkommt, an die PLF gebunden ist, wodurch das CD8-Antigen maskiert wird. Es ist unklar, ob der Rezeptor für PLF das CD8-Antigen oder ein Ort in der Nähe von diesem ist, so daß CD8 von PLF durch sterische Behinderung maskiert wird. Da die Mehrzahl der CD8+- Lymphozyten weder PLF-positiv noch in ihrer Reaktion mit mAK-T8 blockiert war, scheint die erste Möglichkeit sehr unwahrscheinlich. Die Maskierung eines T-Zelloberflächen-Rezeptors durch von Tumoren stammendes Isoferritin ist bei krebspatienten beobachtet worden (Hann, H.-W.L., et al., 1984, Nature (London) 265: S. 755 - 756; Moroz, C., et al., 1977, Clin. Exp. Immunol. 29: S. 30 - 35; Moroz, C., et al., 1977, N. Engl. I. Med. 296: S. 1175; Moroz, C., et al., 1977, Cancer Immunol. Immunother. 3: S. 101 - 104; Moroz., C., et al., 1984, Cancer 54: S. 84 - 89). Bei diesen Patienten blockierte Isoferritin die E- Rosetten-Bildung durch die maskierten T-Zeiien. Bei AIDS-Patienten war bei einem Test mit Anti-T11-mAK der E-Rezeptor (T11-Antigen) nicht maskiert. Diese Diskrepanz zwischen den obigen Beobachtungen kann an den zur Identifizierung des E-Rezeptors verwendeten Liganden liegen.
Es ist vielleicht von Bedeutung, daß das Oberflächen-PLF durch eine Behandlung von HIV-infizierten Lymphozyten mit Levamisole, nicht jedoch durch gleichzeitige Inkubation in Komplettgewebe-Kulturmedium entfernt wurde. Die Inkubation mit Levamisole führte zur Demaskierung des normalen CD8- Oberflächen-Markers. Diese Beobachtung ist vereinbar mit früheren Erkenntnissen über die enthemmende Wirkung von Levamisole auf Lymphozyten von Patienten mit Hodgkin-Krankheit und Brustkrebs (Moroz, C., et al., 1977. Cancer Immunol. Immunother. 3: S.101 - 104; Ramot, B., et al., 1976, N. Engl. J. Med. 294: S. 809). Levamisole agiert nachgewiesenermaßen als ein immunpotenzierendes Arzneimittel (Levo, Y., et al., 1975, Biomedicine 23: S. 198 - 200; Nekam, K. et al., 1981, Immunopharm. 3: S. 31 - 40), jedoch ist seine Wirkungsweise noch nicht ganz klar.
Das Muster der Isoferritin-Expression quer durch das klinische Spektrum der HIV-Infektion läßt vermuten, daß PLF eine Rolle in der Pathogenese von progressiver Immuninsuffizienz spielen kann, wie es in der Pathogenese der Hodgkin-Krankheit zu spielen scheint. Ein kleiner Anteil der Lymphozyten des peripheren Bluts normaler Personen (bis zu 6 - 7 %) sowohl in dieser Untersuchung als auch in früheren Analysen (Moroz, C., et al., 1984, Cancer 54: S. 84 - 89), sehr wahrscheinlich in dem CD8-Pool, bindet PLF. Diese Population scheint bei HIV-infizierten Patienten vergrößert zu sein. Hinzu kommt, daß Serum-PLF bei einer HIV-Infektion in einem relativ frühen Stadium dramatisch ansteigt, entsprechend dem Zeitraum der maximalen lymphoiden Aktivierung in den klinischen Stadien B und C. Erste Daten von Walker et al. (1986, Science 234: S. 1563 - 1566) deuten darauf hin, daß bestimmte CD8- Lymphozyten die HIV-Proliferation in vitro hemmen kann. PLF könnte, so eine Hypothese, die Immunkompetenz dieser CD8-Zeilen hemmen und dadurch zu der fortschreitenden HIV-Expression beitragen, die für die Krankheit im Spätstadium kennzeichnend ist (id.).
Eine Erklärung für den PLF-Anstieg im Frühstadium der HIV-Infektion gefolgt von einem Rückgang in einem späteren Stadium der Erkrankung gibt es bislang noch nicht. Eine Möglichkeit, die von unseren ersten Daten getragen wird, ist die, daß Produkte des trans-aktivierenden viralen Gens (tat III) die PLF- MRNA-Expression in virus-infizierten CD4-Zeilen steigern. Der Schwund in der Gesamtzahl dieser Zellen im Spätstadium von AIDS könnte eine Erklärung sein für die beobachteten Rückgänge der Serum-PLF-Konzentration und der zur gleichen Zeit eintretenden Zunahme der Gesamt-Ferritine als Reaktion auf nichtspezifische Stimuli (z.B. Sekundärinfektion) als Reaktanten der akuten Phase.
Die Erkenntnis, daß Levamisole, ein bekanntes immunpotenzierendes Arzneimittel, die Elution von PLF aus einer CD8&spplus;-Untergruppe fördert, könnte ein Hinweis auf eine mögliche Rolle dieses Arzneimittels im Rahmen der Therapie von HIV-Infektionen sein, insbesondere wenn in frühen Stadien dieser Krankheit eingesetzt.

14 HERSTELLUNG VON MONOKLONALEN ANTIKÖRPERN, DIE FÜR PLAZENTARES FERRITIN SPEZIFISCH SIND

In den nachfolgenden Abschnitten wird die Herstellung von plazentarem Ferritin und monoklonalen Antikörpern (z.B. dem mAK CM-H9) beschrieben, die ein einziges Epitop von plazentarem Ferritin (PLF) definieren. Diese Antikörper kreuzreagieren nicht mit Milz- oder Leber-Ferritin.

15 HERSTELLUNG VON PLAZENTAREM FERRITIN

Plazentares Ferritin wurde aus Human-Plazenta durch eine Abänderung des von Beamish et al. (1971, J. Clin. Path. 24: S. 581) angewandten Verfahrens hergestellt. Plazentares Gewebe (500 g) wurde in Scheiben geschnitten, dann wurde Wasser bis zu einer Gesamtmenge von 2.000 ml hinzugegeben. Nach einer Homogenisierung wurde die Gewebesuspension 20 Minuten auf 75CC erhitzt. Der Überstand wurde nach Kühlung und 1 5-minütiger Zentrifugation mit 10.000 min&supmin;¹ mit Essigsäure behandelt, um den pH-Wert auf pH 4,6 zu bringen. Das ausgefällte Protein wurde durch 15-minütige Zentrifugation mit 10.000 min&supmin;¹ entfernt, und ein klarer Überstand wurde mit verdünnter NaOH auf einen neutralen pH-Wert eingestellt. Während einer 240- minütigen Ultrazentrifugation des klaren braunen Überstandes mit 100.000 x g sammelte sich das suspendierte Ferritin in einem kleinen Knopf am Röhrchenboden. Das Präzipitat wurde in 0,9 % Kochsalzlösung erneut gelöst und durch einen Durchgang durch eine Sephadex-G200-Säule weiter gereinigt. Die Ferritin-Fraktion aus dieser Säule wurde durch ein DEAE-Cellulose- Anionenaustauschharz geschickt unter Einsatz eines Tris-HCl-Puffers mit pH 7,5 und einem Gradienten von 0,02 - 0,5 M. Es wurden drei Protein- Spitzenwerte erreicht, der sauerste Spitzenwert, pl = 4,8, wurde aufgefangen und zur Analyse herangezogen. Seine Reinheit wurde durch isoelektrische Fokussierung und Immunelektrophorese gegen Anti-Ferritin-Serum und Anti- Human-Vollserum aufgezeigt. Dieses Protein wurde zur Immunisierung von Mäusen wie im folgenden beschrieben verwendet.

16 HERSTELLUNG VON MONOKLONALEN ANTIKÖRPERN, DIE AN PLAZENTARES FERRITIN ANKOPPELN

Bei der Herstellung von monoklonalen Antikörper, die an PLF ankoppeln, die jedoch auch mit anderen Isoferritinen kreuzreagieren können, wurde nach dem folgenden Protokoll verfahren. Das Protokoll und die hergestellten monoklonalen Antikörper werden in dem israelischen Patent IL-A-62879, eingereicht am 15. Mai 1951, beschrieben. Siehe auch Moroz et al., 1985, Clinicachemicaacta 148: S. 111 - 118.

17 SUBSTANZEN UND VERFAHREN

Für die Herstellung der monoklonalen Antikörper wurden die nachgenannten Medien und Lösungen verwendet:

a. RPMI-0 (Kein Kälberfötenserum)

b. RPMI 1640-HY

500 ml steriles destilliertes Wasser
55 ml 10 x RPMI-1640
6 ml 1,0 N Natriumhydroxid
14 ml 7,5 % Natriumbicharbonat
6 ml Pen/Strep )
10ml glutamin ) +DMEM
86,5 ml Kälberfötenserum)

c. RPMI-HY-HATD - vom Tag 0 bis zum 7. Tag

Für 100 ml Medium

95 ml RPMI-1640 + 20 % Kälberfötenserum
1,0 ml Pyruvat (100 x)
2,0 ml 50 x HAT
2,0 ml 50 x Deoxycytidin

d. RPMI-HY-HT - vom 8. Tag bis zum 14. Tag

Für 100 ml Medium

97 ml RPMI-1640 + 20 % Kälberfötenserum
2,0 ml 50 x HT
1,0 ml Pyruvat (100 x)
Für Hybride: vom 15. Tag ab RPMI-1640 + 20 % Kälberfötenserum und Pyruvat verwenden oder weiter in RPMI-HY-HT halten

e. PEG 33 und 25 % Gew./Vol.

Muß geruchlos und weiß sein. Für 100 ml autoklavenrelevantes Gewicht in Gramm in einer Glasflasche bei einem Druckvon 15 lbs für 10 bis 15 Minuten. Ist die Flasche kühl genug, um sie in der Hand halten zu können (ca. 50ºC), soviel RPMI-1640-0 hinzufügen, bis auf 100 ml ergänzt ist, durch Schütteln mixen und bei Raumtemperatur lagern.

f. HATD - Endkonzentrationen der Reagenzien

H = Hypoxanthin 10&supmin;&sup4; M
A = Aminopepterin 10&supmin;&sup6; M
T=Thymidin 2x10&supmin;&sup5;M
D = Deoxycytidin 2 x 10&supmin;&sup6; M

f. HT-Vorrat 100 x - 100 cm³

Thymidin (MW 242,33): 0,04846 g
Hypoxanthin (MW 136,1): 0,1361 g
H&sub2;O bis zu 100 ml hinzufügen und auf 60 - 70ºC erhitzen, um es aufzulösen. Endmenge mit zweifach destilliertem Wasser (dd H&sub2;O) nochmals einstellen. 50fach verdünnen, sterilfiltern (0,2 µ) und in 2-ml-Aliquoten bei -20ºC lagern.

g. A-Vorrat 1.000 x - 100 cm³

Aminopepterin (MW 440,4): 0,44 g
Mit zweifach destilliertem Wasser auf 50 ml auffüllen, 0,1 N NaOH tropfenweise solange hinzufügen, bis das Aminopepterin in Lösung geht. Mit zweifach destilliertem Wasser auf eine Endmenge von 100 ml auffüllen. Endmenge auf 100 ml einstellen. Sterilfiltern (0,2 µ) und bei -20ºC lagern.

h. D-Vorrat 100 x - 100 cm³

Deoxycytidin (MW 227,2): 0,00454 g
In zweifach destilliertem Wasser auflösen, auf 100 ml abgleichen, zur Vorratshaltung 50fach verdünnen. Sterilfiltern (0,2 µ) und bei -20ºC lagern.

i. HAT 50 x - 200ml

100 ml 100 x HT mit 10 ml 1.000 x A + 90 ml zweifach destilliertes Wasser zusammengeben = 50 x HAT. Sterilfiltern (0,2 µ) und in 2-ml-Aliquoten bei -20ºC lagern.

18 IMMUNISIERUNGSPROTOKOLL

Balb/c-Mäuseweibchen (anfänglich 4 bis 6 Wochen alt) wurden mit 3 wöchentlichen Impfungen mit 50 µg saurem plazentarem Ferritin (das gemäß Abs. 6.1 hergestellt worden war) in komplettem Freund-Adjuvans immunisiert. 3 Tage nach der letzten Impfung von 10 µg saurem plazentarem Ferritin wurden Hybridisierungen vorgenommen. Hyperimmune Mäuse wurden mindestens einen Monat vor der letzten Auffrischimpfung in Ruhe gelassen.

19 MILZZELLEN-MYELOM-FUSIONEN

Milzzellen wurden wie folgt präpariert:
a. Mäusen wurde in RPMI-0 die Milz entfernt
b. Die entnommenen Organe wurden 2 x in Petrischalen mit RPMIgespült
c. Dann wurden sie in RPMI-0 mit 18 Ga.-Nadeln zerrupft
d. Die Zellsuspension wurde in ein Röhrchen übertragen, und große Gewebestücke setzten sich ab
e. Eine einzelne Zellsuspension wurde in ein neues Röhrchen übertragen und mit 800 min&supmin;¹ (160 x g) 5 Minuten lang zentrifugiert Rote Blutkörperchen wurden mit 0,83 % NH&sub4;Cl, pH 7,5 lysiert
f. Die Zellen wurden 3 x mit RPMI-0 gewaschen und anschließend in RPMI-0 erneut suspendiert
g. Die Zellen wurden mit Hilfe von Trypan Blau ausgezählt
Für die Fusion benötigte Myelomzellen, PB/NS1/1-Ag4-1, wurden in RPMI-1 640 mit 20 % Kälberfötenserum herangezüchtet und wie folgt präpariert:
a. Myelomzellen wurden aus Kulturflaschen durch sorgfältiges Pipettieren entfernt und in ein 50-ml-Falcon/Corning-Röhrchen gegeben
b. Sie wurden mit 900 min&supmin;¹ (200 x g) 5 Minuten lang zentrifugiert
c. Dann wurden sie 1 x mit RPMI-0 gewaschen, in RPMI-0 erneut suspendiert und mit Hilfe von Trypan Blau ausgezählt
Die Fusion von Milzzellen mit den Myelomzellen wurde wie folgt durchgeführt:
a. Milz- und Myelomzellen wurden in einem Verhältnis von 10 :1 in einem konischen 50-ml-Falcon/Corning-Einweg-Zentrifugenröhrchen zusammengegeben
b. Die Zellen wurden durch 5-minütiges Zentrifugieren mit 900 min&supmin;¹ (200 x g) pelletiert
c. Das Medium wurde so vollständig wie möglich abgesaugt
d. Sämtliche von diesem Moment an verwendeten Lösungen und Medien wiesen Raumtemperatur auf; das Zentrifugenröhrchen mit dem Zell-Pellet wurde in ein Bad mit 37ºC eingetaucht, und folgendes wurde unter leichtem Schütteln hinzugegeben: 0,2 ml 33 % PEG 1500 mit 1-minütigem Schütteln und anschließendem 5-minütigen Zentrifugieren mit 200 x g. Die Zellen wurden erneut suspendiert und eine Minute lang leicht geschüttelt, dann wurden unter leichtem Schütteln 5 ml RPMI-0 und anschließend 5 ml RPMI-0 20 % Kälberfötenserum hinzugegeben. Das Hybridgemisch sah zu diesem Zeitpunkt wie eine schlecht resuspendierte Zellsuspension mit vielen kleinen Klümpchen aus
e. Das Gemisch wurde durch 5-minütiges Zentrifugieren mit 200 x g pelletiert
f. Die Zellen wurden in RPMI-HY-HATD (bei 37ºC) mit einer Konzentration von 3 x 10&sup6;/cm³ erneut suspendiert durch Aufspritzen von Medium auf das Zellpellet
g. Hybride wurden auf Platten mit 96 Vertiefungen und flachem Boden ausplattiert durch Hinzufügen von 2 Tropfen Zellsuspension aus einer 5-ml-Pipette oder mit einem Multi-Pipettiergerät mit Abschalt-Spitzen (ca. 65 ml), das 100 - 120 RPMI-HY-HATD (ca. 2 x 10&sup5; Zellen) enthielt
h. Es wurden Kontrollvertiefungen, die NS-1 -Zellen + RPMI-HY- HATD mit 1 x 10&sup6;/ml enthielten, eingerichtet
i. Die Platten wurden 7 Tage lang kultiviert
j. Am 8. Tage und danach zweimal wöchentlich wurde die Hälfte des Kulturmediums durch sorgsames Absaugen entfernt und mit 80 - 100 ml RPMI-HY-HT-Medium gespeist
k. Positive Vertiefungen wurden 3 und 4 Wochen nach der Hybridisierung durchmustert

DURCHMUSTERUNGSPROTOKOLLE

Die Durchmusterung und die Bestimmung der Spezifität der monoklonalen Antikörper erfolgte durch einen Hämagglutinationstest. Embryo-Plazenta- Ferritin und Erwachsenen-Milz-Ferritin wurden an Ox RBC (Ox Rote Blutkörperchen) mittels CRCl&sub2; gekoppelt. 50 µl von zunehmenden Verdünnungen (beginnend mit 1:10 Hybridomkulturmedium-Überstand) wurden mit 10 µl Erwachsenen- und Embryo-Ferritin-Ox-RBC gemischt, und die Hämagglutination wurde bestimmt.
Es wurden die Überstände von Klonen ausgewählt, die einen Hämagglutinationstiter von mindestens 1:1.000 lieferten.
Ein Klon, CM-OF-3 bezeichnet, wurde ausgewählt (im folgenden CM-3 genannt). Der Klon CM-3 produziert einen monoklonalen Antikörper, der für Embryo-Ferritin spezifisch ist und mit Erwachsenen- und Embryo-Ferritin kreuzreagiert.
Ein anderer Klon, CM-G8 bezeichnet, produziert einen monoklonalen Antikörper, der an plazentares Ferritin andockt und mit Milz- und Leber-Ferritin kreuzreagiert. CM-G8 definiert dasselbe Epitop, das von CM-3 erkannt wird.

21 HERSTELLUNG VON MONOKLONALEN ANTIKÖRPERN DIE FÜR PLAZENTARES FERRITIN SPEZIFISCH SIND UND DIE NICHT MIT NORMALFERRITIN KREUZREAGIEREN

Für die Herstellung von monoklonalen Antikörpern, die für PLF spezifisch sind und die nicht mit anderen Isoferritinen kreuzreagieren, wurde nach dem folgenden Protokoll verfahren. Insbesondere der oben beschriebene monoklonale Antikörper CM-3 wurde zur Hemmung der kreuzreaktiven Determinanten von fötalem und Erwachsenen-Ferritin eingesetzt, um einen anderen monoklonalen Antikörper, CM-H9, herzustellen, der auf eine spezifische fötale Determinante ausgerichtet ist.

22 IMMUNISATIONS- UND FUSIONS-PROTOKOLLE

Das nachgenannte Immunisations- und Fusionsverfahren wurde angewandt, um monoklonale Antikörper zu gewinnen, die ein einziges Epitop von PLF definieren und die nicht mit anderen Isoferritinen kreuzreagieren. Aus Human-Plazenta isoliertes Embryo-Ferritin (das gemäß Abs. 6.1 isolierte Protein pl 4,8) wurde mit monoklonalen Antikörpern CM-3 in dem folgenden Verhältnis zur Reaktion gebracht: Embryo-Ferritin (90 µg in phosphatgepufferter Kochsalziösung) wurde mit Aszitesflüssigkeit von einer BALB/c-Maus, die monoklonale CM-3-Antiferritin-Antikörper (10 mglml) enthielt, gemischt.
Das Gemisch wurde 30 Minuten bei 37ºC inkubiert und anschließend über Nacht bei 4ºC inkubiert. Das Gemisch wurde dann mit 10.000 x g zentrifugiert, das entstandene Präzipitat wurde weggeschüttet und der Überstand wurde zur Immunisierung verwendet. Jede BALB/c-Maus wurde mit dem obengenannten, mit komplettem Freund-Adjuvans vermischten Überstand immunisiert, der intradermal einmal pro Woche über insgesamt drei Wochen verabreicht wurde. Eine Auffrischimpfung mit einer Dosis, die einem Fünftel der oben verabreichten Dosis entsprach, wurde intraperitoneal verabreicht.
Drei Tage nach der Auffrischimpfung wurde der Maus unter aseptischen Bedingungen die Milz entnommen und wurde die Fusion vorgenommen durch Inkubieren von 10&sup8; Milzzellen mit 10&sup7;/P3-NSI/1-Ag4-Myelomzellen, wie oben ausgeführt. Positive Klone wurden wie oben beschrieben identifiziert. Es wurde ein Klon, CM-OF-H9 bezeichnet (im folgenden CM-H9 genannt), gewonnen.

23 CHARAKTERISIERUNG DES MONOKLONALEN ANTIKÖRPERS CM-H9

Der monoklonale Antikörper CM-H9 gehört zu der Klasse IgG; er bildet keine Präzipitate mit Ferritin, er bindet Kaninchen-Komplement. In der gewonnenen Aszitesflüssigkeit betrug der Antikörper-Gehalt ca. 7 mg pro ml. Ein Milliliter Aszitesflüssigkeit bindet ca. 2 mg plazentares Ferritin, jedoch kein Erwachsenen-Milz- oder -Leber-Ferritin.

24 IMMUNTESTS ZUM NACHWEIS VON LYMPHOZYTEN-GEBUNDENEM PLACENTAREM FERRITIN, BEI DENEN DER MONOKLONALE ANTIKÖRPER CM-H9 ZUM EINSATZ KOMMT

Der monoklonale Antikörper CM-H9 kann in Immuntests zum Nachweis von PLF in Testproben wie zum Beispiel Serum oder von an zirkulierende Lymphozyten des peripheren Bluts (PBL) gebundenes PLF eingesetzt werden. Das Vorkommen von PLF kann unter Verwendung des CM-H9 in jedem beliebigen Immuntestsystem bestimmt werden, so u.a. in ELISA-Tests, Radioimmuntests (RIAs) oder zytotoxischen Tests (bei denen Zielzellen impliziert sind).
Im allgemeinen kann der Test zum Nachweis von plazentarem Ferritin, das an Lymphozyten des peripheren Bluts gebunden ist, durchgeführt werden, indem man (a) Lymphozyten aus dem peripheren Blut isoliert und (b) das Vorhandensein von PLF auf den Lymphozyten unter Anwendung eines herkömmlichen Tests ermittelt, der auf der Verwendung der neuartigen monoklonalen Antikörper, die für PLF spezifisch sind, basiert.
Entsprechend einer bevorzugten Ausführungsart dieser Erfindung kann der Test wie folgt durchgeführt werden:
a. Isolierung von Lymphozyten aus dem peripheren Blut durch Ficoll- Hypaque(R)-Gradientenzentrifugation
b. Bestimmung des Vorkommens oder Nichtvorkommens von an der Oberfläche der Lymphozyten gebundenem PLF anhand eines herkömmlichen Tests wie z.B. eines ELISA, zytotoxischen Tests oder Radioimmuntests (RIA)

25 SAMMLUNG VON LYMPHOZYTEN

Lymphozyten werden wie folgt gesammelt:
(a) 15 ml Blut in einem heparin haltigen Blutauffangröhrchen auffangen; im Verhältnis 1:2 in phosphatgepufferter Kochsalzlösung, pH 7,2, verdünnen
(b) Der Zellsuspension 10 ml Ficoll-Hypaque-Dichtelösung (1,077 g/ml) zugrundelegen
(c) 30 Minuten lang mit 300 x g bei Raumtemperatur zentrifugieren
(d) Mononukleare Zellen aus der Grenzfläche zwischen Medium und Ficoll-Hypaque mit Hilfe einer Pasteur-Pipette einsammeln und in ein frisches 15 ml Röhrchen geben
(e) Zeilen dreimal waschen durch Suspension in 15 ml Wasch lösung (phosphatgepufferte Kochsalzlösung, pH 7.2) und mit 300 x g 10 Minuten lang bei 4ºC zentrifugieren
(f) In Wasch medium wieder suspendieren und die Zelle nzahl ermitteln

26 RADIOIMMUNTEST (RIA) - VERFAHREN

Der Radioimmuntest wurde nach zwei Verfahren durchgeführt:

A. Radioimmuntest - 1

Mononukleare Zellen des peripheren Bluts wurden durch Ficoll-Hypaque- Gradientenzentrifugation isoliert. Der Test wurde dreifach ausgeführt (A Blindprobe, B Testprobe):
1. 2 x 10&sup6; bis 3 x 10&sup6; Zellen in jedem von sechs Teströhrchen dispensieren; Zellen durch 10-minütiges Zentrifugieren mit 300 x g pelletieren
2. 20 µl Normalkaninchenserum, 1:10 verdünnt in phosphatgepufferter Kochsalzlösung, hinzufügen und 60 Minuten lang bei 4ºC inkubieren
3. 30 µl Aszitesflüssigkeit (Verdünnung 10&supmin;&sup5; in 5 % Rinderserumalbumin) in jedes von 3 Röhrchen geben
A. Kontroll-Aszitesflüssigkeit, die einen IgG-nichtspezifischen monoklonalen Antikörper enthält, der mit PLF nicht reaktiv ist
B. Monoklonale Antikörper CM-H9 Gut mischen und bei Raumtemperatur 2 Stunden lang inkubieren
4. Zellen zweimal mit 10 ml RPMI-1640 durch 10-minütiges Zentrifugieren mit 300 x g bei 4ºC waschen
5. 0,1 µCi von I¹²&sup5;-Kaninchen-Anti-Maus-IgG (¹²&sup5;-I-Kaninchen-IgG 1 µCi/µg) hinzufügen, 60 Minuten lang bei 4ºC inkubieren, zweimal mit kaltem RPMI-1 640 waschen wie unter Pkt. 4, Radioaktivität messen
Positiver Test: Cpm A - Cpm B < 500; oder
Cpm A : Cpm B > 1,6 (cpm: Impulse je Minute)

B. Radioimmuntest - 2

Nach Stufe 1, RIA-1, wird das Testverfahren wie folgt fortgesetzt: CM-H9 F(ab)&sub2; wird gewonnen durch Peptid-Aufspaltung von CM-H9 IgG wie von Utsumi und Karush (1965, Biochem. 4: S. 1766) beschrieben. Kontroll-F(ab)&sub2; wird auf gleiche Weise aus nichtspezifischem IgG gewonnen (siehe Kontrolle von RIA-1). Die so gewonnenen F(ab)&sub2;-Fragmente werden wie folgt verwendet:
Röhrchen A: Kontroll-F(ab)&sub2; in 5 % Rinderserumalbumin (pH 7,2) 0,025 % Natriumazid
Röhrchen B: CM-H9 F(ab)&sub2; in 5 % Rinderserumalbumin (pH 7,2) 0,025 % Natriumazid
Bei Raumtemperatur 60 Minuten lang inkubieren, einmal mit 2 mli % Rinderserumalbumin in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (pH 7,2) waschen; mit ¹²&sup5;I markierten Liganden in die Röhrchen A und B geben (ca. 105 cpm [Impulse je Minute]); entweder mit ¹²&sup5;I markiertes PLF oder einen Komplex aus ¹²&sup5;I-polyklonalem Anti-PLF mit PLF. Der Komplex wurde zuvor hergestellt in Antigenlantikörper-Molverhältnissen von 1:1 bis 1:2; sie wurden vorab miteinander 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Den markierten Liganden zusammen mit Zeilen 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubieren, anschließend zweimal mit 1 % Rinderserumalbumin in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (pH 7,2) waschen, um ungebundenen Liganden zu entfernen, danach auszählen. Liegt B über A, dann ist der Test positiv.

1. ZYTOTOXISCHER TEST - VERFAHREN

Dieser Test wird dreifach ausgeführt: (A) Kontrollprobe; (B) Testprobe
a. Lymphozyten des peripheren Bluts (PBL) in einer Dichte von 5 x 10&sup6; Zellen/ml in RPMI-1640 suspendieren
b. 150 µl der Lymphozyten des peripheren Bluts in jedes von vier 12 x 75 mm großen Teströhrchen geben. Aszitesflüssigkeit (30 µl Verdünnung 10&supmin;&sup4;) hinzufügen: A. Kontroll-Aszitesflüssigkeit (2 Röhrchen); B: CM-H9 (2 Röhrchen). 45 Minuten lang bei 4ºC inkubieren.
c. Kaninchen-Komplement (100 ml, 1: 5 in phosphatgepufferter Kochsalzlösung verdünnt) hinzufügen und 60 Minuten lang bei 37ºC unter leichtem Schütteln inkubieren
d. Lebensfähige Zellen mittels Trypan Blau auszählen
Positiver Test:
= Anzahl lebensf. Zellen in A - Anzahl lebensf. Zellen in B/Anzahl lebensfähiger Zellen in A x 100 > /=6%

2. ERGEÄNISSE: BEREITSCHAFT DES MONOKLONALEN ANTIKÖRPERS ZUR REAKTION MIT LYMPHOZYTEN BEI BESTIMMTEN KRANKHEITEN

Bei den obenbeschriebenen Tests wurden zwei monoklonale Antikörper, CM-H9 und CM-3, eingesetzt, um Serum und Lymphozyten des peripheren Bluts, das bzw. die Patienten mit verschiedenen Krankheiten sowie auch gesunden Personen entnommmen worden waren, zu überprüfen. Die in nachfolgender Tabelle I präsentierten Ergebnisse zeigen, daß die beiden Antikörper einen schnellen und bequemen Nachweis von Malignitäten der Brust sowie auch der Hodgkin-Krankheit erlauben und eine Differenzierung dieser Krankheiten von Thalassämie, das einen Anstieg des normalen Ferritinspiegels hervorruft, gestattet. TABELLE I BEREITSCHAFT DES PLF-mAK ZUR REAKTION MIT VERSCHIEDENEN PATIENTENPROBEN

27 ISOFERRITINE BEI HIV-INFEKTION: BEZIEHUNG ZUM KLINISCHEN STADIUM BINDUNG AN CD8&spplus;- LYMPHOZYTEN UND DIE PATHOGENESE VON AIDS

In den im folgenden beschriebenen Beispielen wurde festgestellt, daß plazentare Isoferritine (PLF) in Seren von Personen erhöht vorlagen, die mit HIV infiziert waren. PLF wurde durch Anwendung eines "Sandwich"-Antigen- Einfang-ELISA unter Einsatz von zwei monoklonalen Antikörpern quantifiziert.
Personen mit Lymphadenopathie, mit oder ohne Symptome, die einen AIDS- bezogenen Komplex vermuten lassen, wiesen die höchsten Serumspiegel auf, die mit fortschreitender Immuninsuffizienz zurückgingen. Demgegenüber stieg die Gesamtmenge der (Normal-) Ferritine allmählich mit dem Krankheitsstadium. PLF wurde auf der Zelloberfläche einer Untermenge von CD8&spplus;- Lymphozyten aufgespürt und schien den Nachweis des CD8-Antigens durch spezifische monoklonale Antikörper zu blockieren. Eine durch Inkubation mit Levami sole nicht jedoch durch Kulturmedium alleine erzielte Elution des PLF von der Zelloberfläche führte zur Deblockierung der CD8-Determinanten auf diese Zellen. Profile von Isoferritinen bei einer HIV-Infektion können somit Hinweise für die Prognose liefern. PLF, ein physiologischer Abwärtsregulator von Hämatopoese und zellulärer Immunität, kann anormalerweise auf dem Wege der Transaktivierung durch HIV-Gen-Produkte exprimiert werden und könnte eine Rolle bei der progressiven Immuninsuffizienz, Markhemmung und HIV-Expression spielen, die zu AIDS führen.

1. SUBSTANZEN UND VERFAHREN

1. PERSONEN

Seren von HIV-seropositiven Patienten wurden aus Material gewonnen, das bei -70ºC gelagert und im Rahmen einer früheren Untersuchung (Siegal, F. P., et al., 1986, J. Clin. Invest. 78: S. 115 - 123) sowie Patienten im Rahmen einer laufenden Untersuchung entnommen worden war. Die Patienten wurden nach ihrem klinischen Stadium eingeteilt mit der Modifikation, daß alle berücksichtigten Personen als HIV-seropositiv bestätigt wurden. Die Stadien wurden wie folgt definiert: Stadium A: HIV-seropositiv, jedoch ohne klinische Erscheinungen oder körperliche Befunde; B: Lymphadenopathie und/oder Spienomegahe; C: klinische Symptome oder Befunde, die mit ARC zusammenhängen; D: Kaposi-Sarkome, Lymphome oder Erkrankung des Zentralnervensystems (ZNS), jedoch ohne systemische opportunistische Infektionen; E: opportunistische Infektionen, die nach den ursprünglichen CDC-Kriterien (CDC - Center for Disease Control) AIDS definieren (Center for Disease Control, Update on acquired immune deficiency syndrome (AIDS) - United States, 1982, Morbid. Mortal. Weekly Rep. 31: S. 507 - 514). Außerdem wurden Seren von 40 hämato logisch normalen Blutspendern gewonnen.

2. ISOLIERUNG VON LYMPHOZYTEN

Mononukleare Zellen des peripheren Bluts wurden aus frisch heparinisiertem Blut durch Ficoll-Hypaque-Dichtegradientenzentrifugation isoliert.

3. MONOKLONALE ANTIKÖRPER

Monoklonale Antikörper (mAK) T4, T8 und T11, die mit CD4&spplus;-, CD8&spplus;- bzw. CD2&spplus;-Zellen reaktiv sind und direkt an Fluorescein oder Phycoeythrin konjugiert waren, waren von Coulter Immunology (Hialeah, Fla.) bezogen worden. Der monoklonale Antikörper CM-H9, der Human-Plazenta-Ferritin definiert und der nachgewiesenermaßen ausschließlich mit plazentarem Isoferritin und nicht mit Leber- oder Milz-Ferritinen reagiert (Moroz, C., et al., 1985, Clin. Chim. Acta 148: S. 111 - 118). Der monoklonale Antikörper CM-G8 wurde zwar gegen Human-Plazenta-Isoferritine produziert, er reagiert jedoch außer mit PLF auch mit Human-Leber- und -Milz-Ferritinen (id.).

4. DURCHFLUSSZYTOMETRIE UND IMMUNOFLUORESZENZ-FÄRBUNG

CD4&spplus;-, CD8&spplus;- und CD2&spplus;-Zellen wurden anhand der Durchflußzytometrie unter Einsatz eines Coulter-Epics-5-Zellsortiergeräts, das für Zweifarben- Immunofluoreszenz modifiziert worden war, durchmustert. Die Lymphozyten wurden entsprechend den Herstelleranweisungen direkt mit phycoerythrinkonjugiertem mAK T4 und mit fluoresceinisothiocyanat-konjugiertem mAK T8 oder mAK T11 zur Reaktion gebracht.

5. IMMUNFLUORESZENZ-FÄRBUNG VON ISOFERRITIN AUF LYMPHOZYTEN-MEMBRANEN UNTER EINSATZ DES MONOKLONALEN ANTIKÖRPERS CM-H9

Lymphozyten wurden zweimal bei Raumtemperatur mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), pH 7,2, die 2 % Rinderserumalbumin und 0,01 % Natriumazid (PBS-BSA) enthielt, gewaschen. Zwei aliquote Anteile, die jeweils 1 x 10&sup6; mononukleare Zellen enthielten, wurden in 25 µl verdünntem mAK CM- H9 bei 4ºC über Nacht inkubiert. Ein dritter aliquoter Anteil, der 1 x 10&sup6; Zellen enthielt, wurde mit 25 µl IgG von der Maus (Coulter) als eine negative Kontrolle inkubiert. Nach der Inkubation wurden die mononuklearen Zellen dreimal in PBS-BSA gewaschen, mit 25 µl fluorescein-konjugierten F(ab')&sub2;-Fragmenten von Ziegen-Anti-Maus-IgG-F(ab')&sub2; (1 : 2 verdünnt) (Capell) 30 Minuten lang bei 4ºC inkubiert und danach nochmals dreimal in PBS-BSA gewaschen.
Nach dem Zentrifugieren wurden die gewaschenen Zellpellets in 20 µl PBS-BSA suspendiert und auf einem Mikroskop-Objektträger mit einem Leitz Orthoplan-Epifluoreszenz-Mikroskop mit einer Erregungswellen länge von 288 nm zur Quantifizierung der mit mAK CM-H9 membrangefärbten Lymphozyten untersucht. Es wurden mindestens 400 Lymphozyten gezählt. Monozyten wurden morphologisch anhand ihrer großen Größe und ihres übermäßigen granulären Zytoplasmas identifiziert und wurden aus der Zählung herausgenommen.
Bei einigen Experimenten wurde eine zweifache Färbung des Membran- Isoferritins und CD4-Antigens durchgeführt. Nach der Zugabe von mAK CM-H9 und FITC-Anti-Maus-F(ab')&sub2;-IgG wurden die Lymphozyten zweimal mit PBS- BSA gewaschen und mit Phycoerythrin-Anti-CD4-mAK (5 µl, Coulter) weitere 30 Minuten bei 4ºC inkubiert. Die Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen und mit einem Fluoroszenz-Mikroskop wie oben beschrieben analysiert.

6. IMMUNFLUORESZENZ-FÄRBUNG VON ISOFERRITIN IN LYMPHOZYTENPLASMA UNTER EINSATZ DES MONOKLONALEN ANTIKÖRPERS CM-H9

Lymphozyten (1 x 106) wurden auf vorgereinigten Mikroskop-Objektträgern zentrifugiert (Cytospin, Shandon Sceintific), 5 Minuten lang an der Luft getrocknet und in absolutem Methanol 10 Minuten lang bei -15ºC fixiert. Die Zellen wurden einmal 5 Minuten lang in PBS gewaschen und mit mAK CM-H9 (50 µl) über Nacht in einer Feuchtkammer bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Objektträger dreimal in PBS (jeweils 5 Minuten lang) gewaschen und mit FITC-Ziegen-Anti-Maus-F(ab')&sub2; (25 µl, Capeii)) 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Zellen wurden dreimal mit PBS gewaschen und auf Zytoplasma-Fluoreszenz hin untersucht. Pro Objektträger wurden ungefähr 1 - 4 x 10³ Zellen gezählt.

7. LEVAMISOLE-BEHANDLUNG VON MONONUKLEAREN ZELLEN

Levamisole (Sigma, St. Lucia, MO) wurde zu Vollblut oder zu isolierten mononuklearen Zellen bis zu einer Endkonzentration von 40 µg/ml hinzugegeben, anschließend wurde das Ganze 30 Minuten lang bei 37º wie von Ramot et al. beschrieben (1976, N. Engl. J. Med. 294: S. 809) inkubiert. Dann wurden die mit Levamisole behandelten Zellen als Vorbereitung für die Durchflußzytometrie und Immunofluoreszenz-Färbung wie oben beschrieben mit den verschiedenen monoklonalen Antikörpern vermischt.

8. QUANTITATIVE BESTIMMUNG VON SERUM-ISOFERRITIN

Ferritin und plazentares Isoferritin (PLF) wurden in den Seren von 161 HIV-infizierten Patienten sowie in den Seren von 40 Blutspendern mit Hilfe eines ELISA unter Einsatz eines bestimmten monoklonalen Antikörpers wie bereits beschrieben (Moroz, C., et al., 1987, Exp. Hematol. 15: S. 258 - 262) bestimmt. Es wurde die Sandwich-ELISA-Methode nach Engval und Perlman (1972, J. Immunol. 109: S.129 - 132) in der Abänderung von Vollmer et al. (1975, Lancet 1: S. 426) zur Entwicklung der Tests für Ferritin und PLF herangezogen.
Sowohl in den Testsystemen für Ferritin als auch in den Testsystemen für PLF wurde der mAK CM-G8, der alle Isoferritine bindet, an die feste Phase als Einfang-Reagenz gekoppelt. Wie bereits gezeigt, konkurrieren hohe Konzentrationen von Normal-Ferritin nicht mit der Ankopplung von PLF an die feste Phase (Moroz, C., et al., 1987, Exp. Hematol. 15: S. 258 - 262). Für den Nachweis des eingefangenen Antigens wurde alkalinphosphatase-konjugierter mAK CM- G8 zur Ferritin-Bestimmung und enzym-konjugierter mAK CM-H9 zur PLF- Bestimmung eingesetzt. Die Menge an plazentarem Ferritin, die 2,5 pg alkalinphosphatase-(AP-)-konjugiertem mAK CM-H9 bindet, ist mit 10 Einheiten PLF (10 Einh. PLF) definiert.

9. STATISTISCHE ANALYSEN

Die Datenauswertung erfolgte mit dem Statistik-Paket EPISTAT unter Einsatz eines IBM-AT Personal Computers und Anwendung von "Student's t- test", Korrelationskoeffizient, linearer Regression und Chi-Quadrat.

2. ERGEBNISSE

1. FERRITIN- UND PLF-SPIEGEL IM SERUM VON PATIENTEN MIT HIV-INFEKTION

Die Durchführung eines PLF-spezifischen ELISA erlaubte die Bestimmung der PLF-Konzentration - unabhängig von der Menge an Gesamtferritin - im Serum von HIV-infizierten Patienten und gesunden Blutspendern. Die Ergebnisse dieser Messungen sind in ABBILDUNG 1 und TABELLE II dargestellt. TABELLE II ZUSAMMENHANG ZWISCHEN PLF UND FERRITIN UND ARC UND AIDS
Im Vergleich zu normalen Kontrollpersonen
Wie in ABB. 1A gezeigt, betrug die mittlere Konzentration von PLF 10+/- 31,5 Einh./ml bei gesunden Spendern. Es ist bemerkenswert, daß 70 % der untersuchten Seren kein nachweisbares PLF enthielten und nur 10 % Konzentrationen von über 10 Ein h./ml aufwiesen (ABB. 1 A, TABELLE I). Die höchsten Konzentrationen von PLF (25+/- 25,3 und 18,2 +/- 16 Einh./ml), erheblich höher als normal (p (0,01), bei Patienten im Frühstadium der sich klinisch manifestierten Erkrankung (Stadien B, C) (ABB. 1A) festzustellen waren. Hinzu kommt, im Gegensatz zu den bei normalen Seren erzielten Ergebnissen, daß 61 - 68 % dieser Patienten-Seren über 10 Einh./ml PLF im Serum enthielten (ABB. 1A, TABELLE II).
Demgegenüber wiesen Patienten mit fortgeschrittenerer HIV-Infektion (Stadien D, E) relativ niedrigere mittlere PLF-Serumspiegel (7,8+/- 11,7, 9,7+/- 14,7) auf, die nicht erheblich von denen normaler Kontrollseren abwichen (ABB. 1A). Desweiteren wiesen nur 29.7 % und 35,4 % der Patienten mit AIDS mehr als 10 Einh./ml Serum-PLF auf (ABB. 1A, TABELLE II).
Im Gegensatz zu den obengenannten Ergebnissen stiegen die normalen Ferritinspiegel progressiv mit fortschreitender Krankheit an (ABB. 1B, TABELLE II). 62 und 68,5 % der Erkrankten im fortgeschrittenen Stadium (Stadien D,) wiesen mehr als 200 ng/ml Serum-Ferritin auf (ABB. 1B, TABELLE II). Unter den HIV-seropositiven Patienten ohne klinische oder körperliche Anzeichen (Stadium A) lag der durchschnittlich PLF-Spiegel geringfügig über der Norm mit 20,7 +/- 34,2 Einh./ml, wobei 33 % der Patienten über 10 Einh./ml aufwiesen (ABB. 1A, TABELLE II), was nicht bedeutend von normalen Kontrollen abwich. Auch der Gesamtferritin-Spiegel unterschied sich nicht erheblich von dem gesunder Spender (ABB. 1B, TABELLE II).

2. ZUSAMMENHANG ZWISCHEN HOHEM SERUM PLF UND NORMALEM FERRITIN UND FORTSCHREITEN DER ERKRANKUNG

Eine Kontingenztafelanalyse der in ABB. 1 aufgezeigten einzelnen Ergebnisse wurde durchgeführt unter Ansatz eines Grenzniveaus von 10 Einh./ml für PLF (ausgewählt, da 90 % der normalen Kontrollspiegel unter diesem Wert lagen) und 200 ng/ml Gesamtferritin (ausgewählt, da 92,5 % der normalen Kontrollspiegel unter diesem Wert lagen). Die erzielten Ergebnisse offenbarten einen statistisch bedeutenden Zusammenhang zwischen der Erhöhung des Serum-PLF-Spiegels und dem Vorliegen relativ früher Stadien der HIV-Infektion (für die Stadien B und C, p = 23 x 10&supmin;&sup6; bzw. p = 4,4 x 10&supmin;&sup6;), wohingegen eine Erhöhung des Gesamtferritin-Spiegels in hohem Maße mit der Erkrankung im fortgeschrittenen Stadium einherging (für Stadien D und E, p = 1,49 x 10-6 bzw p < 10&supmin;&sup8;) (TABELLE II).
Korrelationen, die zwischen der Anzahl von CD4&spplus;-Zellen und CD8&spplus;-Zellen in dem peripheren Blut der Patienten sowie Serumspiegeln von PLF und Gesamtferritin angestellt wurden, enthüllten einen positiven Zusammenhang (Korrelationskoeffizient von 0,17, p < 0,02) zwischen der Anzahl von zirkulierenden CD4&spplus;-Zellen und dem Serum-PLF-Spiegel. Die PLF-Spiegel sanken mit abnehmender Anzahl von zirkulierenden CD4&spplus;-Zellen. Es ist bemerkenswert, daß die Mehrzahl der Patienten in fortgeschrittenen Stadien der Erkrankung (Stadien D, E), bei denen kein PLF nachweisbar war, nur sehr wenige oder keine nachweisbaren CD4&spplus;-Zellen aufwiesen.
Als nächstes ermittelten wir das Verhältnis zwischen dem Serum-PLF- Spiegel (bei denen mit nachweisbarer Menge) und der CD4&spplus;-Lymphozyten- Anzahl (ABB. 2). Interessanterweise wiesen die AIDS-Patienten (Stadium E) ein erheblich höheres PLF-Einh./CD4&spplus;-Zellen-Verhältnis auf (p = 7,89 x 10&supmin;³) als es bei Patienten in frühen Stadien (B, C) der Erkrankung festzustellen war (ABB. 2). Zwischen den PLF-Spiegeln und der Anzahl von CD8&spplus;-Zellen konnte keine wesentliche Korrelation festgestellt werden. Diese Ergebnisse stimmen mit der Vorstellung überein, daß PLF von CD4&spplus;-Zellen gebildet und ausgeschieden wird.
Demgegenüber wurde eine negative Korrelation (Koeffizient von -0,3, p < 0,0001) zwischen der Konzentration von normalem Ferritin und der Anzahl von CD4&spplus;- und CD8&spplus;-Lymphozyten festgestellt. Der Anstieg des Gesamtferritin- Spiegels lief parallel mit der fortschreitenden lymphoiden Verarmung, was vermuten läßt, daß die Hauptquelle des normalen Ferritins nicht die HIV- infizierten Lymphozyten sind.

3. ZELLOBERFLÄCHENANTIGENE VON LYMPHOZYTEN VON HIV-INFIZIERTEN PATIENTEN

Da bereits aufgezeigt worden war, daß PLF an T-Zellen ankoppelt und Schaferythrozytenrosetten blockiert (Moroz et al., 1977, Clin. Exptal, Immunol 29: S. 30 - 35; Gilleret al., 1977, Cancer Immunol. Immunother. 3:S. 101 - 105), untersuchten wir die Möglichkeit, ob PLF-tragende Lymphozyten in HIV- infizierten Patienten identifiziert werden könnten. Wie in ABB. 3 gezeigt, reagierten 3 - 28 % der zirkulierenden Lymphozyten von HIV-infizierten Patienten in verschiedenen Stadien (A - E) mit mAK CM-H9 und zeigten somit Oberflächen-PLF. Ein kleiner Teil (0,2 - 2,5 %) der Lymphozyten zeigte auch Zytoplasma-PLF (ABB. 3).
Wie erwartet war das T-Zellen-Untermengen-Verhältnis bei HIV-infizierten Patienten umgekehrt (TABELLE III). TABELLE III ZELLOBERFLÄCHENANTIGENE BEI HIV-INFIZIERTEN PATIENTEN UND NORMALEN PERSONEN
a Anzahl der HIV-infizierten Patienten in den nachgenannten Stadien: A = 1, B = 2, C =6, D = 1 E = 2
b Prozentsatz der T11&spplus;-Zellen abzüglich der Summe der Prozentsätze der T4&spplus;- und T8&spplus;-Zellen. Die genannten Ergebnisse differieren erheblich gemäß Messung anhand des "Student's T-Test (p = 9,76 x 10&supmin;&sup6;)
c p < 10&sup6;. Für die PLF-Färbung wurden 15 normale Spender der für die T- Zellen-Teilmengen-Quantifizierung benötigten 35 Spender analysiert. Für alle HIV-infizierten Patienten wurden alle Membran-Marker (einschließlich PLF) gleichzeitig untersucht.
Mit mAK T4 und/oder mAK T8 identifizierte Lymphozyten machten bei HIV-infizierten Patienten im Vergleich zu normalen Personen einen erheblich kleineren Anteil als diejenigen aus, die mit mAK T11 gefärbt waren (TABELLE III). Diese Feststellung offenbarte das Vorhandensein einer ausgedehnten T11&spplus;-Population, die weder mit mAK T4 noch mit mAK T8 reagierte (T11&spplus;T4&supmin; T8&supmin;). Diese Population ist bei HIV-infizierten Patienten erheblich größer (p = 9,76 x 10&supmin;¹&sup0;) als bei normalen Kontrollpersonen (6,9 +/- 7,8 %). Diese Subpopulation (T11&spplus;T4&supmin;T8&supmin;) bei HIV-infizierten Patienten (wo sie um ein Mehr von ca. 13,2 % als bei normalen Personen vorkommt) entspricht der Größe der als PLF-positiv identifizierten Population (15,16 +/- 6,39 %) (TABELLE III) bei denselben HIV-identifizierten Personen.
Weitere Experimente wurden durchgeführt, um zu erhellen, welche der T- Zellen-Untermengen Oberflächen-PLF trug, das mit dem mAK CM-H9 reaktiv war. Eine zweifache Markierung für CD4 und PLF auf Lymphozyten von zwei Personen mit HIV-Infektion im Spätstadium (TABELLE IV) zeigte, daß PLF hauptsächlich mit Nicht-CD4&spplus;-Lymphozyten verbunden ist. TABELLE IV ZWEIFACHE MEMBRAN-IMMUNOFÄRBUNG VON LYMPHOZYTEN VON AIDS-PATIENTEN MIT HILFE DER MONOKLONALEN ANTI-T4- UND ANTI-PLF-(CM-H9-)ANTIKÖRPER

4. DIE WIRKUNG VON LEVAMISOLE AUF ZELLOBERFLÄCHENANTIGENE VON LYMPHOZYTEN VON HIV-INFIZIERTEN PATIENTEN

Als die Lymphozyten des peripheren Bluts von HIV-infizierten Patienten in vitro mit Levamisole behandelt wurden, traten zwei Begleitphänomene ein. Die Anzahl der mit mAK T8 gefärbten Zeilen stieg um ca. 20 % an, während die Anzahl der CM-H9-positiven Lymphozyten (PLF-beschichtet) um ca. 15 % zurückging (ABB. 4). Die Anzahl der T4&spplus;-gefärbten Zeilen änderte sich nach einer Levamisole-Behandlung nicht (ABB. 4). Auch die Anzahl der T11&spplus;- (CD2&spplus;-) Zeilen änderte sich nicht nach einer Levamisole-Behandlung. Diese Ergebnisse, zusammen mit den nach der zweifachen Markierung mit CD4- und PLF-spezifischen monoklonalen Antikörpern erzielten Ergebnisse, lassen vermuten, daß Levamisole die Ausschüttung von membrangebundenem PLF veranlaßte, was die Demaskierung von CD8-Determinanten auf einem Teil der CD8&spplus;CD2&spplus;T-Zellen bewirkte. Eine gleichzeitige Inkubation in Gewebekulturmedium blieb ohne äquivalente Wirkung (ABB. 4).

28 ISOFERRITINE BEI PATIENTEN MIT LYMPHOPROLIFERATIVEN KRANKHEITEN

In den weiter unten ausgeführten Beispielen wurden Serumspiegel von Gesamiferritin und PLF bei gesunden Personen und bei Patienten mit lymphoproliferativer Krankheit und multiplem Myelom bestimmt. Bei der Mehrzahl der normalen Personen mangelte es an PLF im Serum. Erhöhte PLF- Serum-Spiegel wurden bei Patienten mit Hodgkin-Lymphom und Nicht-Hodgkin- Lymphom des niedrigen und mittleren Malignitätsgrades sowie bei Patienten mit akuter lymphozytärer Leukämie (ALL) beobachtet. Bei diesen Patienten war auch der Gesamtferritin-Spiegel erhöht. Patienten mit chronischer lymphozytärer Leukämie (CLL) und mit multiplem Myelom zeigten normale allgemeine Serumferritin-Spiegel, während PLF im Serum fehlte (siehe auch Moroz et al., 1987, Exp. Hematol. 15: S. 258 - 262).

1. SUBSTANZEN UND VERFAHREN

1. PERSONEN

Serumproben wurden gewonnen von 40 Blutspendern, die hämatologisch normal waren, und von 70 Patienten mit verschiedenen lymphoproliferativen Erkrankungen sowie von Patienten mit multiplem Myelom. 20 Patienten litten an chronischer lymphozytärer Leukämie (CLL), 18 Patienten an Nicht-Hodgkin- Lymphom, 15 an Hodgkin-Krankheit, 5 an multiplem Myelom und 2 an akuter lymphozytärer Leukämie. Von den Patienten mit Nicht-Hodgkin-Lymphom mittleren Malignitätsgrads lag bei zweien eine Beteiligung des peripheren Bluts vor. Ein Patient mit Nicht-Hodgkin-Lymphom und die zwei Patienten mit ALL erhielten jeweils sechs Packungen mit gepackten Erythrozyten vor den Ferritinbestimmungen. Serumproben wurden während einer der nachfolgenden Zeiträume, bei der Diagnose und während der Behandlung oder manifesten Krankheit entnommen. Nur den Patienten mit Hodgkin-Krankheit wurde Serum auch während des Remissionsstadiums entnommen. Die Lymphom-Klassifizierung erfolgte entsprechend einer Arbeitsformulierung (Krueger et al., 1983, Cancer 52: S. 833).

2. MONOKLONALE ANTIKÖRPER

Die monoklonalen Antikörper CM-G8 und CM-H9 wurden gegen Human- PLF wie bereits in Abs. 6 ff beschrieben hergestellt (siehe auch Moroz et al., 1985, Clin. Chim. Acta 148: S. 111). Monoklonale Antikörper wurden aus Aszitesflüssigkeit nach Ausfällung mit 50 % gesättigter Ammoniumsulfatlösung gewonnen. Das für den Standard benötigte PLF wurde nach Purifikation in einer Diethylaminoethyl-(DEAE-)Cellulose-Säule gewonnen, wie oben beschrieben (siehe auch Moroz et al., 1985, Clin. Chim. Acta 148: S. 111). Leber-Ferritin- Standards wurden aus MELISA-Ferritin-Sätzen (ELISA Medizintechnik, Freiburg, BRD) gewonnen. Die Menge PLF, die 2,50 pg alkalinphosphatase(AP-)konjugierten mAK CM-H9 gebunden hatte, wurde mit 10 Einh. PLF angenommen.

3. QUANTITATIVE BESTIMMUNGEN VON FERRITIN

Im Handel erhältliche MELISA-Ferritin-Sätze wurden bezogen von ELISA Medizintechnik und wurden entsprechen den Herstelleranweisungen benutzt. In diesem Satz wird die Bindung von perioxidase-konjugiertem polyklonalem Antihuman-Leber-Ferritin gemessen.

4. ELISA MIT MONOKLONALEM ANTIKÖRPER-EINSATZ ZUR BESTIMMUNG VON PLF UND ALLGEMEINEN ISOFERRITINEN

Der enzymgekoppelte Immunosorbenstest (ELISA) nach Engval und Perlman (1972, J. Immunol. 109: S. 129) in der Abänderung von Voller et al., (1975, Lancet 1: S. 426) wurde zur Entwicklung eines ELISA zur Messung von Serum-Leber-Ferritin und PLF-Isoformen herangezogen (McELISA Typ A bzw. McELISA Typ B). Bei beiden Tests wurde der monoklonale Antikörper CM-G8, der an alle Ferritine andockt, an die solide Phase gekoppelt. Für die zweite Stelle, mAK-enzym-konjugierte Reaktion, wurde der mAK CM-G8 in McELISA Typ A und mAK CM-H9 in McELISA Typ B eingesetzt.
Die McELISAs vom Typ A und B wurden wie folgt durchgeführt: die Vertiefungen einer Microtiterplatte wurden mit 150 µl des monoklonalen Antikörpers CM-G8 (100 µg/phosphatgepufferte Kochsalzlösung [PBS], pH 7,2) bedeckt und über Nacht bei 4ºC inkubiert. Die Platte wurde dreimal mit PBS- Tween (PBS und 0,05 % Tween 20) gewaschen und trocken geschüttelt.
Testseren (100 µl), im Falle von McELISA Typ A 1 : 2 und im Falle von McELISA Typ B 1 : 4 in PBS-Tween 0,025 % verdünnt, wurden zweifach zu den Vertiefungen hinzugegeben. Serumverdünnungsmittel und Ferritin-Standards wurden ebenso zweifach hinzugegeben. Eine Serumprobe mit einer erhöhten Ferritin-Konzentration wurde in das Verdünnungsmittel gegeben, um die Regenerierung bei starker Verdünnung zu ermitteln. Die Platten wurden bei 4ºC 1 Stunde lang im Falle von McELISA Typ A und über Nacht im Falle von McELISA Typ B inkubiert, dreimal mit PBS-Tween gewaschen, bevor in jede Vertiefung 100 µl AP-mAK-Konjugat (0,4 µg) hineingegeben wurde. Die Platte wurde für weitere 120 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend nochmals dreimal gewaschen. Das Enzymsubstrat (p-Nitrophenylphosphat, 1 mg/ml Diethanolaminpuffer, pH 8,0, und 0,5 mmol MgCl&sub2;) wurde hinzugegeben, und die Reaktion wurde nach 10 bis 30 Minuten durch Zugabe von 0,05 ml 2 M NaOH abgebrochen. Die Menge an gefärbtem Produkt wurde anhand der Absorbanz bei 405 nm bestimmt.

2. ERGEBNISSE

Die im folgenden erläuterten Ergebnisse zeigen, daß Serum-PLF-Spiegel bei Patienten mit lymphoproliferativen Krankheiten wie z.B. akuter lymphozytärer Leukämie, manifestem Hodgkin-Lymphom und Nicht-Hodgkin-Lymphom von niedrigem und mittlerem Malignitätsgrad, erhöht sind.

1. BEURTEILUNG DES LEBER-FERRITIN-STANDARDS MIT HILFE VON VERSCHIEDENEN ELISAs

Mit im Handel erhältlichen MELISA-Sätzen gewonnene Leber-Ferritin- Standards wurden mit Hilfe des neuen McELISA Typ A analysiert und mit denen des im Handel erhältlichen MELISA-Satzes verglichen. Das Bindungsmuster von Leber-Ferritin in Konzentrationen im Bereich zwischen 15 und 500 ng/ml war bei beiden Testsystemen gleich.
Serumproben, die niedrige und hohe Ferritinspiegel enthielten, gewonnen anhand von MELISA-Sätzen, wurden mit Hilfe der beiden Systeme analysiert. Die Ferritinkonzentrationen auf dem niedrigem Kontrollniveau betrugen 70 ng/ml und 57 ng/ml beim McELISA Typ A bzw. beim MELISA-Satz. Beide Werte lagen in dem von den MELISA-Herstellern angegebenen Rahmen (40 bis 70 ng/ml). Die Ferritin-Konzentration auf dem hohen Kontrollniveau betrug 500 ng/ml, laut Analyse mit beiden Systemen (vom Hersteller angegebener Rahmen: 350 - 500 ng/ml).
Außerdem wurden Korrelationen zwischen den Ferritin-Ergebnissen, die anhand der Tests mit dem McELISA Typ A und dem MELISA-Satz gewonnen wurden, angestellt: 22 Seren von normalen Spendern, die den Bereich 10 - 150 ng/ml abdeckten, und 21 Seren von Krebspatienten, die den Bereich 50 -400 ng/ml abdeckten, wurden untersucht. Der Korrelationskoeffizient für den normalen Bereich betrug 0,98, bei einer Regressionsgleichung von y = 1,05 +/- 8,1; für den höheren Bereich betrug er 0,967 mit y = 1,37 +/- 21,09.
Die Ergebnisse zeigen, daß sich der McELISA Typ A, bei dem AP- konjugierter monoklonaler Antikörper CM-G8 zum Einsatz kommt, für die quantitative Bestimmung von normalen Spiegeln von leberartigem Ferritin im Serum eignet. Zur Bestimmung von Ferritin im oberen Bereich jedoch wurden größere Mengen statt mit dem MELISA mit dem McELISA Typ A gemessen.

2. BINDUNG VON PLAZENTA- UND LEBER-FERRITINEN AN DIE MONOKLONALEN ANTIKÖRPER CM-G8 und CM-H9

Sowohl Plazenta- als auch Leber-Ferritine wurden mit dem McELISA Typ A unter Einsatz eines Konjugats von AP-CM-G8-mAK gemessen. Es wurde bei diesen beiden Isoformen ein ähnliches Bindungsmuster bei Konzentrationen zwischen 30 und 800 ng/ml festgestellt. Die Ergebnisse zeigten, daß unser neu entwickelter McELISA Typ A zur Messung sowohl von Leber- als auch von PLF- Isoferritinen geeignet ist. Demgegenüber war eine spezielle PLF-Bestimmung nur bei Einsatz des McELISA Typ B möglich.
Die Bindung von AP-konjugiertem CM-H9 mAK an PLF im McELISA Typ B verlief linear bei Konzentrationen im Bereich von 2,5 bis 20 Einheiten, wohingegen Ferritin bei Konzentrationen im Bereich zwischen 100 und 800 ng/ml keine Bindung mit AP-konjugierten CM-H9 mAK einging. Diese Ergebnisse zeigen die Spezifität des McELISA Typ B für den Nachweis von PLF.

3. ISOFERRITINE IM SERUM VON GESUNDEN PERSONEN UND PATIENTEN MIT LYMPHOPROLIFERATIVEN KRANKHEITEN

Die bei gesunden Personen und bei Patienten mit lymphoproliferativer Krankheit gewonnenen Ergebnisse des Tests auf Isoferritine sind in TABELLE V zusammengefaßt: TABELLE V ISOFERRITINE BEI GESUNDEN PERSONEN UND BEI PATIENTEN MIT LYMPHOPROLIFERATIVEN KRANKHEITEN UND MULTIPLEM MYELOM
a Chronische lymphozytäre Leukämie
b Akute lymphozytäre Leukämie
Erheblich abweichend von Blutspendern nach "Student's t-test": * p < 0,025; ** p < 0,005
Die in den Seren von gesunden Personen mit McELISA Typ A gemessene mittlere Konzentration von Ferritin betrug 85,3 +/- 65,9 ng/ml (TABELLE V). Die mittlere Ferritinkonzentration war bei Männern höher (108 +/- 58 ng/ml) als bei Frauen (50,3 +/- 59,8 ng/ml) (TABELLE V). Bedeutend höhere Ferritinspiegel (p < 0,025) wurden in den Seren von Patienten gemessen, die an den nachgenannten malignen Krankheiten litten: Hodgkin-Lymphom (359 +/- 236 ng/ml) und Nicht-Hodgkin-Lymphom vom niedrigem und mittlerem Malignitätsgrad (218,3 +/- 186,9 bzw. 272,8 +/- 180,88 ng/ml) sowie bei zwei Patienten mit ALL (600 +/- 0 ng/ml). Seren von Patienten mit Hodgkin-Lymphom im Remissionsstadium zeigten mittlere Ferritinspiegel (95,1 +/- 46,7 ng/ml) ähnlich denen von gesunden Personen. Patienten mit CLL und multiplem Myelom zeigten normale Ferritinspiegel (66,3 +/- 33 bzw. 68,5 +/- 39,2 ng/ml). Die einzelnen mit McELISA Typ A gemessenen Fem.tinkonzentrationen sind in ABB. 5 angegeben.
Die mit McELISA Typ B gemessene mittlere Serumkonzentration von PLF im Serum von gesundenen Personen betrug 8,1 +/- 14,8 Einh./ml (TABELLE V). Wenngleich auch höhere Konzentrationen im Serum von Männern (10 +/- 10 Einh./ml) als im Serum von Frauen (4,5 +/- 7,7 Einh./ml) gemessen wurden, waren diese statistisch nicht von Bedeutung. Es ist bemerkenswert, daß 70 % der untersuchten Seren kein nachweisbares PLF enthielten. Erhöhte PLF- Konzentrationen, die erheblich höher als normal waren (p < 0,025) wurden in den Seren von Patienten mit Hodgkin-Krankheit (47 +/- 43 ng/ml) und mit Nicht- Hodgkin-Lymphom des niedrigen und mittleren Malignitätsgrads (97,1 + /39 Einh./m/ bzw. 41,9 +/- 35,8 Einh./ml) gemessen. Patienten mit Hodgkin- Lymphom im Remissionsstadium wiesen Serum-PLF-Spiegel auf, die nicht bedeutend von denen gesunder Personen (15,3 +/- 19,3 Einh./ml) abwichen. Hohe PLF-Spiegel wurden auch bei zwei Patienten mit ALL gemessen (im Bereich 80 - 200 Einh./ml). Keine oder nur sehr geringe PLF-Konzentrationen wurden in en Seren von Patienten mit multiplem Myelom (0) und CMM (6,3 + /13,5 Einh./ml) festgestellt, und 85 % der Seren von Patienten mit CLL waren vollständig negativ. Die einzelnen Verteilungen der PLF-Serumkonzentrationen sind in ABB. 6 dargestellt.

29 ISOFERRITINE BEI AUTOIMMUNZUSTÄNDEN

Serumspiegel von PLF wurden im nachhinein ausgehend von eingelagerten Proben gemessen, die Patienten mit unterschiedlichen Autoimmunzuständen entnommen worden waren. Die in ABB. 8 dargestellten Ergebnisse zeigen, daß Serum-PLF-Spiegel bei Patienten erhöht waren, bei denen eine multiple Sklerose, Myasthenia gravis und rheumatische Arthritis diagnostiziert worden war. Jeder dieser Autoimmunzustände ist durch eine Immuninsuffizienz gekennzeichnet.

HINTERLEGUNG VON HYBRIDOMEN

Die nachgenannten Hybridome wurden bei der Collection Nationale de Cultures de Microorganismes des Institute Pasteur in Paris, Frankreich, unter der angegebenen Zugangsnummer hinterlegt:
Die hier beschriebene Erfindung soll in ihrem Umfang nicht beschränkt sein durch die hinterlegten Hybridome oder die in den Beispielen, die nur einen Aspekt dieser Erfindung illustrieren sollen, beschriebenen Ausführungsarten, und alle funktionell äquivalenten Hybridome und Verfahren fallen in den Geltungsbereich dieser Erfindung.

Claims

1. Ein Verfahren für die Prognose und Stadieneinteilung eines erworbenen Immundefekts mit einhergehender HIV-Infektion, umfassend:

(a) Gewinnen einer Blutprobe von einem Patienten; und

(b) Messen der Konzentration von plazentarem Isoferritin in der Blutprobe,

wobei eine erhöhte Konzentration von plazentarem Isoferritin in der Probe eine Erkrankung im Frühstadium anzeigt.

2. Ein Verfahren gemaß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Blutprobe um eine Serumprobe handelt.

3. Das Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Blutprobe Lymphozyten des peripheren Bluts beinhaltet und daß die Konzentration von an der Oberfläche der Lymphozyten des peripheren Blut gebundenem plazentarem Isoferritin gemessen wird.

4. Ein Verfahren für die Prognose und Stadieneinteilung eines erworbenen Immundefekts mit einhergehender HIV-Infektion, umfassend:

(a) Gewinnen einer Serumprobe und einer Probe der Lymphozyten des peripheren Bluts von einem Patienten:

und

(b) Messen (i) der Konzentration von plazentarem Isoferritin in der Serumprobe und (ii) der Anzahl von CD4&spplus;- Lymphozyten in der Probe der Lymphozyten des peripheren Bluts; und

(c) Bestimmen des Verhaltnisses zwischen der Konzentration von plazentarem Isoferritin in der Serumprobe und der Anzahl von CD4&spplus;-Lymphozyten in der Probe der Lymphozyten des peripheren Bluts, wobei eine Zunahme des Verhältnisses ein Fortschreiten der Erkrankung anzeigt.

5. Ein Verfahren für die Prognose und Stadieneinteilung eines erworbenen Immundefekts mit einhergehender HIV-Infektion, umfassend:

(a) Gewinnen einer Serumprobe von einem Patienten; und

(b) Messen der Konzentration von plazentarem Isoferritin und Erwachsenen-Ferritin in der Semmprobe,

wobei (i) eine erhöhte Serumkonzentration von plazentarem Isoferritin und eine normale Serumkonzentration von Erwachsenen- Ferritin in der Probe eine Erkrankung im Frühstadium anzeigt, während (ii) eine normale Serumkonzentration von plazentarem Isoferritin und eine erhöhte Serumkonzentration von Erwachsenen-Ferritin in der Probe eine Erkrankung im Spätstadium anzeigt.

6. Das Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration von plazentarem Isoferritin in der Probe anhand eines Immuntests gemessen wird, bei dem ein Antikörper zum Einsatz kommt, der für plazentares Isoferritin spezifisch ist und mit Erwachsenen-Ferritin nicht kreuzreagiert, und daß es die nachgenannten Verfahrensschritte umfaßt:

(a) Herbeiführen des Kontakts zwischen der Probe und dem für plazentares Isoferritin spezifischen Antikörper; und

(b) Messen der Antikörpermenge, die sich an der Probe anlagert,

wobei die an die Probe gebundene Antikörpermenge mit der in der Probe enthaltenen Menge an plazentarem Isoferritin korreliert.

7. Das Verfahren gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper einen von der in der Collection Nationale de Cultures de Microorganismes unter der Zugangsnummer I-256 hinterlegten Hybridom-Zellinie GM-H9 produzierten monoklonalen Antikörper enthält.

8. Das Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration von plazentarem Ferritin in Einheiten gemessen wird, wobei 10 Einheiten definiert sind als die Menge an plazentarem Isoferritin, die 2,5 Picogramm des monoklonalen Antikörpers CM-H9 bindet.

9. Das Verfahren gemäß Anspmch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der für plazentares Isoferritin spezifische Antikörper in einem Sandwich-Immuntestsystem konfiguriert wird und daß es die nachgenannten Verfahrensschritte umfaßt:

(a) Herbeiführen des Kontakts zwischen der Probe und einem im mobilisierten für plazentares Isoferritin spezifischen Antikörper, so daß in der Probe enthaltene plazentare Isoferritine auf der immobilisierten Phase festgehalten werden;

(b) Entfernen der gesamten ungebundenen Probe von der immobilisierten Phase;

(c) Hinzufügen eines Konjugats zu der immobilisierten Phase, wobei das Konjugat eine signalerzeugende Komponente beinhaltet, die an einen für plazentares Isolerritin spezifischen Antikörper gebunden ist;

(d) Entfernen des gesamten ungebundenen Konjugats von der immobilisierten Phase; und

(e) Messen der Konjugatmenge, die sich an der immobilisierten Phase anlagert,

wobei die an die immobilisierte Phase gebundene Konjugatmenge mit der in der Probe vorliegenden Menge an plazentarem Isoferritin korreliert.

10. Das Verfahren gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der für plazentares Isoferritin spezifische Antikörper einen von der in der Collection Nationale de Cultures de Microorganismes unter der Zugangsnummer I-256 hinterlegten Hybridom-Zellinie CM-H9 produzierten monoklonalen Antikörper enthält.

11. Das Verfahren gemäl3 Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die in der Probe enthaitenen Konzentrationen von plazentarem Isoferritin und Erwachsenen-Ferritin anhand eines Immuntests unter Einsatz von mindestens zwei Antikörpern gemessen werden und daß es die nachgenannten Verfahrensschritte umfaßt:

(a) Herbeiführen des Kontakts zwischen der Probe und

(i) einem ersten für plazentares Isoferritin spezifischen Antikörper, der nicht mit Erwachsenen-Ferritin kreuzreagiert, und

(ii) einem zweiten Antikörper, der sowohl mit plazentarem Isoferritin als auch mit Erwachsenen- Ferritin kreuzreagiert;

(b) Messen der Menge des ersten Antikörpers, die sich an die Probe bindet, und der Menge des zweiten Antikörpers, die sich an die Probe bindet,

wobei die an die Probe gebundene Menge des ersten Antikörpers mit der in der Probe vorkommenden Menge an plazentarem Isoferritin korreliert und die an die Probe gebundene Menge des zweiten Antikörpers mit der in der Probe vorkommenden Menge an Erwachsenen-Ferritin korreliert.

12. Das Verfahren gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet&sub1; daß die Antikörper in einem Sandwich-Immuntestsystem konfiguriert werden und daß es die nachgenannten Verfahrensschritte umfaßt:

(a) Herbeiführen des Kontakts zwischen der Probe und einem immobilisierten zweiten Antikörper, der sowohl mit plazentarem Isoferritin als auch mit Erwachsenen-Ferritin kreuzregiert, so daß alle in der Probe vorliegenden Isoformen von Ferritin auf der immobilisierten Phase festgehalten werden;

(b) Entfernen der gesamten ungebundenen Probe von der immobilisierten Phase;

(c) Hinzufügen eines Konjugats zu der immobilisierten Phase, wobei das Konjugat eine signalerzeugende Komponente beinhaltet, die entweder

(i) mit dem ersten für plazentares Isoferritin spezifischen Antikörper konjugiert ist; oder

(ii) mit dem zweiten Antikörper, der sowohl mit plazentarem Isoferritin als auch mit Erwachsenen- Ferritin kreuzreagiert, konjugiert ist;

(d) Entfernen des gesamten ungebundenen Konjugats von der immobilisierten Phase: und

(e) Erfassen der Konjugatmenge, die sich an der immobilisierten Phase angelagert hat,

wobei (i) die an die immobilisierte Phase gebundene Menge des ersten Antikörper-Konjugats mit der in der Probe vorliegenden Menge an plazentarem Isoferritin korreliert und (ii) die an die immobilisierte Phase gebundene Menge des zweiten Antikörper- Konjugats mit der in der Probe vorliegenden Menge an Erwachsenen-Ferritin korreliert.

13 Das Verfahren gemäß Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß

(a) der erste Antikörper einen von der in der Gollection Nationale de Cultures de Microorganismes unter der Zugangsnummer I-256 hinterlegten Hybridom-Zellinie CM- H9 produzierten monoklonalen Antikörper enthält; und

(b) der zweite Antikörper einen von der Hybridom-Zellinle CM- G8 produzierten monoklonalen Antikörper enthält, der sowohl mit plazentarem Isoferritin als auch mit Erwachsenen-Ferritin kreuzreagiert