JPH03504272A

JPH03504272A - 免疫抑制の予知および診断のための胎盤イソフェリチン

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Publication number: JPH03504272A
Application number: JP1503991A
Authority: JP
Inventors: モロズ，チャヤ; ミズロック，エス，レスリー
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1988-03-07
Filing date: 1989-03-06
Publication date: 1991-09-19
Anticipated expiration: 2013-08-20
Also published as: AU3440989A; EP0403554A4; DE68928079T2; JP2788314B2; EP0403554A1; DE68928079D1; ATE153765T1; EP0403554B1; WO1989008842A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】免疫抑制の予知および診断のための胎盤イソフェリチン１、緒言本発明は免疫抑制状態の診断及び予知のための方法に関する。本発明の方法は血清のような患者試料中（こおけるかまたは末梢血液リンノく球における胎盤フェリチン（ＰＬＦ）の検出を包含する。ＰＬＦレベルの上昇（ま免疫抑制の初期段階にある患者において検出される。患者の免疫抑制状態に関連した疾病の性質の如何（こ応じ、上昇したＰＬＦレベルが疾病の進行に伴って低下し得る。

ＰＬＦの検出及び測定は本明細書に記載のモノクローナル抗体を用いて達成できる。

本発明は、ＰＬＦの高まりがヒト免疫不全ウィルス（Ｈｍに感染した被験者の血清において検出された実　。

絶倒によって説明する。疾病の初期段階にある個体（ま最高レベルのＰＬＦを示し、これは疾病か進行する（こ伴い低減した。

２、発明の背景フェリチンは、利用可能な無毒性形態で鉄をイ呆持する鉄貯蔵タンパク質である。種々のイソ型フェリチンが異なる組織から単離されている。フェリチン特性の変動性は、多量体タンパク質殻中に異なる種類のサブユニットが存在することによって主として引き起こされると考えられる（Ｄｒｙｓｄａｌｅ、　１９７７、　Ｃ１ｂａ　Ｆｏｕｎｄ、　Ｓｙｍｐ。

５１：４１；　Ａｒｏｓｉｏ　ら、　　１９７８．　　Ｊ、　　Ｂｉｏｌ、　　Ｃｈｅｍ、　　２５３：４４５１；Ｗａｔａｎａｂｅら、　　１９８１．　　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　　Ｒｅｓ、　　Ｃｏｍｍ。

１０３：２０７）。実際に、３種のフェリチンサブユニットが報告されている。

即ち、鉄負荷組織で広く存在するしサブユニット（１９ｋｄ）、鉄欠乏及び悪性細胞において優勢なＨサブユニット（２１ｋｄ）　（Ｄｒｙｓｄａｌｅ、　１９７７、上記；Ａｒｏｓｉｏ、　１９７８．上記）および血清から単離されるグリコジル化Ｇサブユニット（２４ｋｄ）　（Ｃｒａｇｇら、　１９８１．　Ｂｉ。

ｃｈｅｍ、　Ｊ、　１９９：５６５）の３種である。異なるイソフェリチンはＬサブユニット型とＨサブユニット型を異なる割合いで含有する。さらに最近になって、ｃＤＮＡクローンの予備分析から、ＨおよびＬサブユニットがどちらかといえば複雑な遺伝子群によってコードされることが明示されたが（Ｂｒｏｗｎら、　１９８３．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　　ＵＳＡ、　　７３：８５７；　Ｃｏ５ｔａｎｚｏら、　　１９８４．　　ＥＭＢＯＪ、　　３：２３）、このことはフェリチン分子の異質性が現在測定されているより大きい可能性さえあることを示唆している。

種々のイソ型フェリチンが正常組織及び悪性組織から単離されており、最も酸性の強いものは、腫瘍組織および胎児組織で優勢である（Ｄｒｙｓｄａｌｅ、　１９７６、　Ｃ１ｂａ　Ｆ。

ｕｎｄ、　　Ｓｙｍｐ、５１：４１；　Ａｒｏｓｉｏら、　　１９７８．　　Ｊ、　　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ。

２５３：４４５１）。血清中の酸性イソフェリチンのアッセイは悪性疾患の診断に重要である可能性があることが示唆されている（Ｈａｚａｒｄら、　１９７７、　Ｎａｔｕｒｅ　２６５ニア７５）。

血清フェリチン濃度の上昇は、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）　（Ｍａｔｚｎｅｒら、　　１９８０．　　Ａｍ、　　Ｊ、　Ｈｅｍａｔｏｌ、　　９：１３）、肝癌（Ｇｉａｎｎｏｕｌｉｓ、　１９８４．　Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ、　３０：２３６）　、乳癌（Ｊａｃｏｂｓら、　１９７６、　Ｂｒ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ　３４：２８６）、および最近ではホジキン病（Ｂｅｚｗｏｄａら、　１９８５，５ｃａｎｄ、Ｊ、Ｈａｅｍａｔｏｌ。

３５：５０５）を含む種々の悪性疾患に罹患している患者で見られた。ＨｅＬａ細胞フェリチンに対する抗体に基づくアッセイにおいて、Ｈａｚａｒｄと叶ｙｓｄａｌｅは、種々の腫瘍患者からの血清中においては、正常肝フェリチンに対する抗体によってアッセイした同一血清におけるよりも高濃度のフェリチンを見出した（Ｈａｚａｒｄら、上記）。

他の人々は、腫瘍組織（Ｃｒａｇｇら、　１９７７、　Ｂｒ−Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ。

３５：６３５；　Ｈａｌｌｉｄａｙら、　　１９７６、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、３６：４４８６）　、又は腫瘍患者から得た血清（Ｊｏｎｅｓら、　１９７８．Ｃｌ１ｎ、Ｃｈｉｍ、　Ａｃｔａ、　　８５　：　８１；　Ｊｏｎｅｓら、　　１９８０．　　Ｃｌ１ｎ、　　Ｃｈｉｍ、　　Ａｃｔａ、　　１０６：２０３）におけるイソフェリチンの一貫したパターンを示すことができなかった。したがって、悪性疾患における血清フェリチン上昇の起源および特異性に関して対立する見解が認められる。

３、発明の要約本発明は、血清のような患者試料中の、または末梢血液リンパ球上の特定のイソ型のフェリチン、即ち胎盤フェリチン（ＰＬＦ）の検出を包含する、免疫抑制状態の診断及び予知のための方法に関する。本発明の方法は、一部、ＰＬＦ（他のイソフェリチンではない）が、免疫抑制患者の疾病の初期段階で上昇する、という驚くべき発見に基づくものである。免疫抑制患者の疾病の性質の如何により、ＰＬＦのレベルは上昇したままもしくは疾病が進行すると低下する可能性がある。ＰＬＦと対照的に、成人イソフェリチンレベルは免疫不全の後期に上昇する。

この発見は、一部分、肝臓または牌臓のイソ型のようなその他のフェリチンを除＜　ＰＬＦと結合する本明細書に（そして関連の原出願に）記載のＣＭ−８９のようなモノクローナル抗体の開発によって可能となった。これらのモノクローナル抗体によって、疾病の経過中に患者のＰＬＦレベルのみを検出することが可能となった。本発明によれば、この種の特異性を示すモノクローナル抗体を患者試料中のＰＬＰのレベルを監視するためのイムノアッセイに使用できる。かかるＰＬＦプロフィルは免疫抑制の診断及び予知に用いるこＡＩＤＳ＝後天性免疫不全症候群ＡＲＣ＝エイズ関連症候群ＢＳＡ　＝ウシ血清アルブミンＣＤ４　＝Ｔ４＝ヘルパー／インデューサーＴリンパ球のマーカーＣＤ８　＝７８−細胞障害性／サプレッサーＴリンパ球のマーカーＣＤ２　＝Ｔ１１＝総Ｔ細胞集団のマーカー、ヒツジ赤血球ロゼツトレセプターＥＬＩＳＡ　＝酵素結合イムノソルベントアッセイ旧■＝ヒト免疫不全ウィルス、　ＨＴＬＶ−Ｉ［［；　ＬＡＶＭｃＡｂ＝モノクローナル抗体ＰＢＳ　＝燐酸緩衝食塩水ＰＬＦ　＝胎盤イソフェリチン（がん胎児性フェリチンともいう）ＳＤ　　＝標準偏差５、図面の説明第１図：ＨＩＶ感染患者、および健康な血液銀行献血者で同時に測定したＰＬＦ（Ａ）と正常フェリチン（Ｂ）の平均血清レベル。ｎ＝試験した被験者数。バーは、平均＋ｌ５Ｄ（標準偏差）を表わす。（つは、ｔテストによれば血液銀行献血者におけるよりも有意に高い値を表わす（ｐ　＜０．０１；　ｘｘ、　　ｐ　＜０．００１）。

第２図：　旧■感染患者のＣＤ４”リンパ球当たりの血清ＰＬＦの比率。バーは平均＋ＩＳＤを表わす。

第３図：　　ＨＩＶ感染患者Ａ−Ｅ群におイテ、ＣＭ−Ｈ９ＭｃＡｂによりＰＬＦに関して陽性に染色された循環リンパ球のパーセンテージの散布図。各点は、単一患者における測定値を表す。

第４図：Ｔ４”、Ｔ８”及びＰＬＦ”細胞の検出可能数に及ぼすＨＩＶ感染患者からのリンパ球のレバミソール処理効果。リンパ球をレバミソール（４０μｇ／ｒｎｌ）または培地（未処置細胞）と共に、３７°Ｃで３０分間インビトロでインキュベートし、次に接合ＭｃＡｂとインキュベートした。

第５図：血液学的悪性疾患患者（最初の７カラム）、および健常個体（右カラム）における総血清フェリチンレベルを示す散布図。総フェリチンは、標準物として肝臓フェリチンを用い、Ａ型ＭｃＥＬＩＳＡによって測定した。

第６図：血液学的悪性疾患患者（最初の７カラム）、および健康個体（右カラム）における血清ＰＬＦレベルを示す散布図。ＰＬＦは標準物として胎盤フェリチンを用いるＢ型ＭｃＥＬＩＳＡによって測定した。

第７Ａ図：　　ＰＬＦの溶離プロフィル。胎盤フェリチンを下記のようにして調製し、そして０．０２Ｍ〜０．０５Ｍのトリス−塩酸（ｐＨ７，５）グラジェントを用いて、ＤＥＡＥ−セルロースカラムからＰＬＦを溶離した。

第７Ｂ図：　　ＥＬＩＳＡによってアッセイした各フラクション中のＰＬＦ含量。ＥＬＩＳＡサンドイッチアッセイには、次の捕捉／検出抗体を用いた：ＣＭ− ８９捕捉／ＣＭ−８９検出、ＣＭ−Ｇ８捕捉／ＣＭ−Ｇ８検出：及びＣＭ−Ｇ　８捕捉／ＣＭ−Ｈ９検出。

第８図：自己免疫疾患患者で検出されたＰＬＦレベルの散布図。ＰＬＦレベルは免疫抑制を特徴とする疾患において上昇する。

６、発明の詳細な説明本発明は、任意の多数の疾患または薬剤によって引き起こされつる免疫不全または免疫抑制状態の診断及び予知方法に関する。例えば、旧■感染によって引き起こされる後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、ある種のリンパ腫および白血病、並びにリウマチ様関節炎、重症筋無力症、多発性硬化症等のようなある種の自己免疫状態で生じる免疫抑制を本発明の方法を用いて診断し、段階づけし得る。

本発明は、一部分、ＰＬＦ（胎盤フェリチン）がイソ型の成人フェリチンと反対に、免疫抑制患者の疾病初期段階で上昇する、という驚くべき発見に基づいている。

免疫抑制患者の疾病の性質の如何により、ＰＬＦレベルは高まったままであるか、あるいは疾病の進行と共に低減し得る。ＰＬＦレベルと対比すると、成人フェリチンは免疫不全の後期で上昇する。この発見は、一部分、ＰＬＦに特異的でありそして成人フェリチンとは交差反応しないモノクローナル抗体、ＣＭ−Ｈ９（本明細書並びに原出願に記載）の開発によって可能になった。

本発明によれば、患者試料中のＰＬＦレベルの測定を免疫抑制の早期診断に使用できる。さらに、ＰＬＦおよび正常成人フェリチン両レベルの監視を用いて免疫抑制の進行段階を予知できる。ＰＬＦおよび／または成人フェリチンの存在に関して種々の組織を試験し得るけれども、血清および末梢血液リンパ球（ＰＢＬ）か好都合な試験試料である。成人フェリチンは血清中（および身体の種々の組織）においてアッセイできるが、一方ＰＬＦは血清中に存在するのみならず、循環リンパ球の特定のサブセットの表面に結合すると思われる。それゆえ、ＰＬＦが疾病の非常に早い段階で先ず産生される場合、循環リンパ球サブセットは利用可能なＰＬＦのすべてを結合し、従ってＰＬＦの血清レベルは正常であるように見えるかも知れないが、循環リンパ球はＰＬＦ試験に関して陽性であろう。しかしながら、免疫抑制の初期段階中にＰＬＦ産生量が増加する場合は、ＰＬＦと結合するリンパ球のサブセットは「飽和」となり、その時点でＰＬＦの血清レベル上昇が検出される筈である。

免疫抑制患者の疾患の性質の如何により、ＰＬＦレベルは高まったままであるか、あるいは疾病が進行した場合には低減し得る。例えば、ＨＩＶ感染患者においては、ＰＬＦレベルは疾病の初期段階で上昇し、しかも疾病の後期には低減する。これに対して、ホジキンリンパ腫、低度および中開度の非ホジキンリンパ腫、並びに急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）患者のようなリンパ増殖性患者においては、ＰＬＦレベルは疾病初期に上昇しそして疾病が進行した場合にも依然として高いままである。本出願人は本発明のメカニズムを説明する義務も責務もないが、しかしＡＩＤＳの場合の感染リンパ球、またはリンパ腫および白血病の場合の悪性リンパ球がＰＬＦの細胞性供給源であって、これが免疫抑制中の細胞当たりのレベルが上昇したところで発現されるのであろう。したがって、ＡＩＤＳ患者においては、感染リンパ球の集団が減少すると、検出されるＰＬＦレベルか低下しよう。これに対して、リンパ腫および白血病では、悪性リンパ球集団が増殖するに伴い、ＰＬＦレベルは依然として高いままであろう。

患者試料中のＰＬＦの検出は多数の方法のいずれかによって行い得る。以下でさらに詳細に述べるように、ＰＬＦを検出するための好都合な方法には、イソ型の成人フェリチンを除＜　ＰＬＦを特定し、それと結合するモノクローナル抗体を用いるイムノアッセイが包含される。かかるモノクローナル抗体は、「サンドイッチ」または競合フォーマットまたは細胞障害アッセイにおける、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ、蛍光イムノアッセイ等を含むがこれらに限定されないＰＬＦ検出のための任意のイムノアッセイフォーマットに使用できる。本明細書に記載の詳細な実施例においては、サンドイッチイムノアッセイフォーマットに特に有用な２種類のモノクローナル抗体か記載される。一方のモノクローナル抗体はＰＬＦおよび成人フェリチンの両方と交差反応するか、ＰＬＦに特異的な第２のモノクローナル抗体は、成人フェリチンとは交差反応しない。交差反応性抗体は、試料中に存在する全てのイソ型フェリチン、例えばＰＬＦおよび成人フェリチンを捕捉するための「捕捉抗体」として、サンドイッチイムノアッセイに使用できる。

ＰＬＦ特異的モノクローナル抗体を標識して、捕捉されたＰＬＦを検出するのに使用できるが、一方交差反応性モツクローナル抗体は、標識して全ての捕捉されたイソ型フェリチンを検出するのに使用し得る。

以下の小節では、ＰＬＦの特性決定、ＰＬＦを特定するモノクローナル抗体、および自己免疫状態におけるＰＬＦの診断及び予知的用途を記載する。本発明は、ＨＩＶ感染患者、並びにリンパ腫または白血病、およびある種の自己免疫疾患患者における血清ＰＬＦおよび成人フェリチンのレベルを、ＥＬＩＳＡサンドイッチフォーマットで、ＰＬＦおよび成人フェリチンに対するモノクローナル抗体を用いて疾病の経過中監視した実施例によって説明する。

７、胎盤フェリチンおよび胎盤フェリチンに特異的なモノクローナル抗体２種のモノクローナル抗体、即ち専らＰＬＦと反応するＣＭ−Ｈ９、およびＰＬＦおよび成人フェリチンの両方と交差反応するＣＭ−０８を用いて胎盤フェリチンの特性決定を行った。ＣＭ−８９と反応性の胎盤フェリチンはＣＭ−Ｇ８反応分子に比較して極めて酸性か強く、このことはヒト胎盤フェリチンにおける構造的異質性を示している。我々の分析によって、胎盤フェリチンの３種のサブユニット構造が明らかになった：即ち、１８ｋｄ軽い（Ｌ）サブユニットおよび２０ｋｄの重い（Ｈ）サブユニット、並びに４３ｋｄサブユニツトの３種である。１８ｋｄＬおよび２０ｋｄ　Ｈサブユニットは、牌臓および肝臓フェリチンに関して以前に示されている：しかしながら第三の高分子量サブユニット（４３ｋｄ）はヒト胎盤フェリチンに特有であると思われる。ＣＭ−８９反応性胎盤フェリチンは、４３ｋｄサブユニツトのみで構成されていた。この４３ｋｄサブユニツトは、徹底的な還元状態下でもそれ以上分解できなかった。

このように同定されたヒト胎盤フェリチンの４３ｋｄの特有のサブユニットは、フェリチン分子の一部分かあるいはそれに関連したものであると思われる。この見解は、このサブユニットが牌臓および肝臓フェリチンに存在するＣＭ−Ｇ　８反応性抗原エピトープを含有するという所見に基づくものである。さらに、ＣＭ −８９反応性フェリチンは、そのフェロシアン化カリウムとの反応性によって明らかであったように、測定可能量の鉄を含有したので、それゆえ胎盤関連イソフェリチンとみなされうる。ＤＥＡＥカラムから溶離されたＰＬＦのフラクションを分析するのにＣＭ−Ｈ９およびＣＭ−Ｇ　８を用いると、４３ｋｄサブユニツトはＬ鎖またはＨ鎖を存するホモポリマーまたはダイマーとして生じ得ることが明らかとなった。

２０ｋｄＨサブユニツトと４３ｋｄサブユニツトとの間にはいくつかの構造的類似性が観察された。両サブユニットは■８タンパク分解に感受性であり、両者ともに、還元条件下でのＳＯ３処理後にＣＭ−Ｇ　８とのその抗原反応性を失った。それは、胎盤フェリチンの高分子量サブユニット（４３ｋｄ）が安定したダイマーであるかまたはＨサブユニット（２０ｋｄ）の前駆体であるということであろう（Ｐａｒｈａｍｉ−３ｅｒｅｎ　ａｎｄ　Ｍｏｒｏｚ、　１９８６．　Ｇ、　１．　Ｐａｔ、Ｃｈｉｎ。

１（１）：１７をも参照）。

最後に、ＣＭ−Ｈ９と反応する胎盤フェリチン中に存在する特有の４３ｋｄサブユニツトは乳癌細胞により合成されたフェリチン中にも見出されたが、正常な乳房細胞によって合成されたフェリチン中には見出されなかった。さらに、ＣＭ− ）１９反応性フェリチンは乳癌患者の血液中で検出されたが、しかし健康個体においては検出されなかった。それゆえ我々はＣＭ−Ｈ９反応性４３ｋｄサブユニツトは癌胎児性フェリチンの特徴であることを示唆する。

８、胎盤フェリチンの分子異質性ＤＥＡＥ−セルロースクロマトグラフィー後に得られた胎盤フェリチン（下記６．１節に記載）を等電点電気泳動（ＩＥＦ）処理し、そしてさらニ’　”　Ｉ− ＣＭ−８９まタハ’　２５１ｃＭ−Ｇ　８　ＭｃＡｂと反応させた。　”’Ｉ− ＣＭ−Ｈ９ＭｃＡｂは、ｐＨ４，７〜５．２の範囲で胎盤フェリチンと反応した。

他方、寒天上で等電点電気泳動処理した牌臓フェリチンは”５■−ＣＭ−Ｈ９ＭｃＡｂと反応しなかった。’　２’　Ｉ−ＣＭ−Ｇ８ＭｃＡｂはｐＨ５，１〜５．４で泳動した胎盤フェリチンと、そしてＩ）８５．４〜５．５で泳動した牌臓フェリチンと反応した。　ＩＥＦの結果は、胎盤フェリチンが異質性であることを示している。ｉ＆も酸性の高いフェリチン（ｐ１４．７〜５．０）はＣＭ−Ｈ９ＭｃＡｂと反応したが、一方より酸性の低い分子（ｐ１５．１〜５．２　）はＣＭ−８９及びＣＭ−Ｇ８　ＭｃＡｂの両方と反応した。ｐＨ５，４〜５．５で泳動した牌臓フェリチンは’　２’　Ｉ−ＣＭ−Ｇ　８　ＭｃＡｂと反応したが、一方ががるｐＨでは’　２５１−ＣＭ−８９ＭｃＡｂとの反応性は観察されないことも判明した。

ＤＥＡＥ−セルロースカラムから溶離されたＰＬＦフラクション（下記６．１節に記載）をさらに、次の捕捉／検出抗体を用いたＥＬＩＳＡアッセイによって分析した：（ａ）ＣＭ−８９捕捉／ＣＭ−Ｈ９検出、　（ｂｌｃＭ−Ｇ　８捕捉／ＣＭ−Ｇ８検出；および（Ｃ）ＣＭ−Ｇ　８捕捉／ＣＭ−８９検出。第７Ａ及び７Ｂ図に示した結果は、これらフラクション中の異なるＰＬＦの相対量を示す。

ＭａｔＺｎｅｒ等（１９８５，Ｂｒ１ｔ、　Ｊ、　Ｈａｅｍａｔｏｌ、５９　：　４４３−４４８）は、フラクション■が最大生物学的活性（即ちインビトロでのＴ細胞機能に及はす免疫抑制効果）を示すか、一方フラクション■はこのような活性を示さないことを報告した。興味深いことに、我々の結果ては、より活性の高いフラクション■が最大量のＣＭ−）１９反応性ＰＬＦを含有することを明示している。

９、ＣＭ−Ｈ９およびＣＭ−Ｇ　８モノクロ一ナル抗体と反応性の胎盤フェリチンのサブユニット構造還元条件下テ（７）　５ＤＳ−ＰＡＧＥ処理ニ続＜　　’　”　’　Ｉ−ＣＭ− Ｈ９または’　”　’　Ｉ−ＣＭ−Ｇ　８を用いるイムノブロッティングによって胎盤フェリチンを分離した結果、　’　”　’　Ｉ−ＣＭ−）１９は胎盤フェリチンの単一サブユニット構造物（４３ｋｄ）と反応することか明らかとなった。　”　’　Ｉ−ＣＭ−Ｇ　８　ＭｃＡｂとの反応性は胎盤フェリチンでも牌臓フェリチンでも観察されなかった。これらの結果は、胎盤および牌臓の両方のＣＭ−０８反応性フェリチン抗原決定基が還元条件下でのＳＤＳ処理に感受性であることを示唆している。

さらに、ポリクローナルウサギ抗ヒト牌臓フェリチンおよび＋２８■−プロティンＡを用いてイムノブロッティング実験を実施した。５ＤＳ−ＰＡＧＥ後、胎盤および牌臓フェリチンの両方において、１８ｋｄの１個のバンドが明白に認められた。

胎盤及び牌臓フェリチンのＣＭ−Ｇ　８反応性決定基はともにＳＤＳ処理後には検出され得なかったため、５ＤＳ−ＰＡＧＥに先立って、アフィニティ精製胎盤フェリチンを放射性標識しそしてモノクローナル抗体で免疫沈降する実験を計画した。種々の濃度のＣＭ−Ｈ９ＭｃＡｂて免疫沈降させモして５ＤＳ−ＰＡＧＥ上で電気泳動処理した”’Ｉ−ＣＭ−８９反応性フェリチンは４３ｋｄの１個のサブユニット構造物を示した。このサブユニット構造物は徹底的な還元条件（２％ＳＤＳおよび５％β−メルカプトエタノール中で、または６Ｍ尿素中で１０分間沸騰）ではそれ以上分解されなかった。他方、種々の濃度のＣＭ−Ｇ８　ＭｃＡｂで免疫沈降させそして上記条件下で５ＤＳ−ＰＡＧＥ処理した’　２’　Ｉ −ＣＭ−Ｇ　８反応性フェリチンは、４３．２０および１８ｋｄの３種の別個のサブユニットを示した。これらの結果は、４３ｋｄサブユニツト構造の存在はＣＭ−８９およびＣＭ−Ｇ８の両方に反応性のフェリチンには共通するがＣＭ−Ｇ　８のみに反応性のフェリチンは、４３ｋｄサブユニツトに加えて、Ｈ及びＬ鎖を含有したことを示している。

１０、　Ｖ８プロテアーゼによる胎盤イソフェリチンの酵素的消化ｖ８プロテアーゼによる限定されたタンパク加水分解に対するフェリチンサブユニットの感受性を測定するためにさらに実験を行なった。ＣＭ−８９反応性フェリチンの４３ｋｄサブユニツトの大部分はｖ８プロテアーゼと６０分間インキュベーション後に消化された。しかしながら、このサブユニットの完全な消化は、　１２０分間インキュベート後でさえ達成できなかった。ＣＭ−Ｇ　８反応性フェリチンを■８プロテアーゼで処理した場合は、４３ｋｄ並びに２０ｋｄサブユニツトは完全に消化された。

１１、胎盤フェリチンの検出患者試料中のＰＬＦの検出に好都合な方法には、イソ型の成人フェリチンを除（ＰＬＦを特定するモノクローナル抗体を用いるイムノアッセイが包含される。かかる抗体は、「サンドイッチ」、競合、または細胞障害性／標的細胞フォーマットにおける、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、蛍光イムノアッセイ等を含むがこれらに限定されない種々のイムノアッセイにおいて適切に配置して使用できる。

本明細書に記載の詳細な実施例においては、かかるアッセイに特に有用な２種類のモノクローナル抗体が記載される：即ち、ＰＬＦ及び成人フェリチンの両方と交差反応するＣＭ−Ｇ　８のようなモノクローナル抗体、並びにＰＬＦに特異的で成人フェリチンとは交差反応しないＣＭ−Ｈ９のようなモノクローナル抗体である。これらの抗体は、患者におけるＰＬＦおよび成人フェリチンの両レベルを監視するためのサンドイッチ型アッセイにおいて多数の配置で使用できる。例えば、ＰＬＦ特異的抗体は、ＰＬＦレベルを監視するための捕捉および検出抗体のいずれとして用いることもできる。あるいはまた、交差反応性抗体は試料中の全てのイソ型フェリチン（即ち、ＰＬＦと成人フェリチンの両方）を捕捉するのに使用できる。この場合、ＰＬＦ特異的抗体は試料中のＰＬＦイソ型を検出するのに使用てき、そして交差反応性抗体は控えの試料に関して使用して、試料中に存在する全ての交差反応性フェリチンを検出てきる。かかるサンドイッチアッセイの結果から、患者試料中におけるＰＬＦおよび成人フェリチンの相対的なレベルのプロフィールが提供される。

本発明の別の実施態様においては、ＰＬＦおよび交差反応性抗体を区別して標識しそして試料中のＰＬＦと成人フェリチンの相対的比率を測定するのに用いることもできる。このように使用する場合は、各抗体を異なる蛍光、発色団、発光物質、または酵素で標識して、異なる蛍光的または比色定量的シグナルを生成させることができる。各シグナルの測定により、単−試料中のＰＬＦおよび成人フェリチンの示差分析が提供されよう。

本発明のイムノアッセイは、ＣＭ−８９およびＣＭ−Ｇ　８モノクロ一ナル抗体の使用に限定されない。事実、ＣＭ−Ｈ９およびＣＭ−Ｇ　８と機能的に等価のその他のモノクローナル抗体が本発明に従って使用されることが意図される。この目的には、本発明に従って使用てきる機能的に等価の抗体分子を生成させるために、ＣＭ−Ｈ９およびＣＭ−Ｇ　８を用いてそれぞれのＰＬＦおよび成人フェリチン分子を単離することかできる。かかるモノクローナル抗体は培養中の連続細胞系による抗体分子の産生を提供する任意の方法を用いて調製できる。例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９８０，Ｓｃｉ、　Ａｒｎ、　２４３（４）：６６−７４）によって最初に開発されたハイブリドーマ法、並びにヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Ｋｏｚｂｏｒら、　１９８３．　ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙＴｏｄａｙ　４ニア２）およびヒトモノクローナル抗体を産生ずるためのＥＢ■−ハイブリドーマ法（Ｃｏ１ｅら、　１９８５゜Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａｎｄ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｔｈｅｒａｐｙ、　Ａｌａｎ　Ｒ。

Ｌｉ５ｓ、　Ｉｎｃ、、　ｐｐ、７７−９６）等のような最近用いられるようになったその他の方法は本発明の範囲内である。ＣＭ−８９およびＣＭ−Ｇ　８エピトープ（例えば、ＣＭ−８９またはＣＭ−Ｇ　８とその標的抗原との結合を競合的に阻害するもの）を特定する、かかる方法により生成される抗体分子が本発明に従って使用するために選択されよう。

しかしながら、本発明はＰＬＦ検出のためのモノクローナル抗体分子の使用に限定されない。ＰＬＦの単離および特性決定のためのさらなるかまたは異なる方法が開発されれば、かかる技法もＰＬＦに関して患者試料を監視するために本発明に従って用い得ることは当業者には明白となろう。

１２、胎盤フェリチンおよび免疫抑制状態下記の実施例に示される結果を以下で考察する。特に第７節に示されるデータは、ＰＬＦがＨＩＶ感染患者において産生されること、およびＰＬＦの存在がＡＩＤＳにおける免疫不全の病因におけるかなりの役割を演じていようことを示している。第８および第９節に示されるデータは、ＰＬＦレベルが免疫抑制を特徴とするある種のリンパ腫および白血病、並びに自己免疫疾患患者で高まっていることを示している。

ＰＬＦを特異的に特定する別個のモノクローナル抗体の利用可能性により、成人フェリチンの量とは関係なく、特異的にＰＬＦの血清レベルを測定するためのア・ソセイを設計することが可能となった。これらの測定値から、旧■血清陽性患者のＡＲＣおよびＡＩＤＳへの進行に関する予知的指標として役立つ可能性があるイソフェリチンプロフィールが得られた。

１３、　８ＴＶ感染における胎盤イソフェリチン次の段階により分類した患者においてＰＬＦを測定した：段階Ａ、　　ＨＩＶ血清陽性であるが、しかし臨床的徴候または身体的所見は認められない：段階Ｂ、リンノく節症および／または巨牌腫；段階Ｃ，ＡＲＣに関連する臨床的症候または所見；段階り、全身的日和見感染を伴わないカボジ肉腫、リンパ腫、またはＣＮ５（中枢神経系）疾患：段階Ｅ、　ＡＩＤＳの診断としてＣＤＣによって最初に定義された日和見感染。これらの結果から、初期の臨床的徴候を有する旧Ｖ感染患者の大多数が血清ＰＬＦ濃度の有意な上昇を示すことが明示される。これらの上昇は、段階Ｃ（ＡＲＣ）のほとんどの患者で保持される。

これに対して、疾患がさらに進行してＡＩＤＳになるのは総血清フェリチンレベルの有意な上昇によるのであってＰＬＦ濃度の低下によるのではない。ＡＩＤＳ患者における正常フェリチンレベルの増大は、他の研究者によって以前に報告されている（Ｂｌｕｍｂｅｒｇ、　Ｂ、ら、　１９８４゜Ｌａｎｃｅｔ　１：３４７；　Ｇｕｐｔａ、　　Ｓ、　　ら、　　１９８６．　　Ｊ、　　Ｃ１１ｎ、　　Ｌａｂ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、　２０：１ｌ−１３）。

本出願人らは本発明を説明する義務はないけれども、ＨＩＶ感染個体における血清ＰＬＦの増大はリンパ節症の発症およびＡＩＤＳ関連症候群の後期の臨床的徴候と密接に関連していることを我々は示唆する。正常フェリチンレベルの増大は、ＡＲＣからＡＩＤＳへの疾患の進行に主として関連があると思われる。臨床的に潜在性の旧Ｖ感染被験者（段階Ａ）は、血清イソフェリチンの上昇を示さない。

ＨＩＶ感染患者における血清ＰＬＦの細胞性起源は未だ知られていない。しかしながら、疾患の進行に伴って、ＰＬＦの血清レベルの低下がＣＤ４＋リンパ球の総数の減少と明確に相関したという観察は、ＰＬＦがこれらのＣＤ４”リンパ球に起源し得ることを示唆している。事実、血清ＰＬＦレベルとＣＤ４リンパ球の総数はともに、疾患の進行中は低下する。しかしながら、これら細胞の減少集団内でのＨＩＶ感染ＣＤ４＋リンパ球の割合は、この時間中はおそらく増大する。

ＨＩＶ感染ＣＤ４＋リンパ球の割合におけるこの増大は、段階Ｅにおける個々のＣＤ４”リンパ球当たりの血清ＰＬＦ濃度の比率において観察された増大を説明し得る（第２図）。これらの結果は、血清ＰＬＦがＨＩＶ感染ＣＤ４＋細胞に起源しており、従って、ＣＤ４＋リンパ球当たりの血清ＰＬＦレベル比は感染程度の診断指標として用い得ることを示唆している。要するに、血清ＰＬＦの絶対的最高濃度が初期旧■感染と関連がある一方、循環ＣＤ４”リンパ球当たりのＰＬＦ濃度の比は細胞性感染度の指数として有用でありうる。

これらの結果はまた、旧■感染被験者においては、ＰＬＦが結合してＣＤ８抗原をマスクするＣＤ８＋細胞のサブセットが存在する（１５．２＋　６．４％）ことも示している。

ＰＬＦに対するレセプターかＣＤ８抗原であるか、あるいはＣＤ８が立体障害を介してＰＬＦによりマスクされるようなそれに近接した部位であるかは明らかでない。大多数のＣＤ８“リンパ球はＰＬＦ陽性でもなく、またＭｃＡｂ−Ｔ８とのそれらの反応を遮断されるわけでもないため、前者の可能性は非常に考えにくい。腫瘍由来のイソフェリチンによるＴ細胞表面レセプターのマスキングは、癌患者で観察されている（Ｈａｎｎ、　Ｈ，Ｗ、　Ｌ、ら、　１９８４゜Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）２６５ニア５５−７５６；　Ｍｏｒｏｚ、　　Ｃ，ら、　　１９７７゜Ｃｌ１ｎ、　　Ｅｘｐ、　　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　　２９：３０−３５；　Ｍｏｒｏｚ、　　Ｃ，ら、　　１９７７゜Ｎ、　　Ｅｎｇｌ、　　Ｊ、　Ｍｅｄ、　　２９６：１１７５；　Ｍｏｒｏｚ、　　Ｃ，ら、　　１９７７゜Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ、　　３：１０１−１０４；　Ｍｏｒｏｚ、　　Ｃ。

ら、　１９８４．　Ｃａｎｃｅｒ　５４：８４−８９）。これらの患者において、イソフェリチンは、マスクされたＴ細胞によるＥ−ロゼツト形成を阻害した。

ＡＩＤＳ患者において抗−Ｔｌｌ　ＭｃＡｂを用いて試験した場合、Ｅ−レセプター（Ｔｌｌ抗原）はマスクされなかった。上記観察間の矛盾は、Ｅ−レセプターを同定するのに用いたりガントにあるのであろう。

完全組織培地での平行インキュベーションによってではなく、ＨｒＶ感染リンパ球をレバミソールで処理することによって表面ＰＬＦが除去されたことは恐らく重要である。

レバミソールとのインキュベーションにより正常ＣＤ８表面マーカーの脱マスキングか惹起された。この観察は、ホジキン病および乳癌患者からのリンパ球に及ぼすレバミソールの遮断解除効果に関する以前の所見（Ｍｏｒｏｚ、　　Ｃ，ら、１９７７、　　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　　Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ、　　３：１０１−１０４；　Ｒａｍｏｔ、　　Ｂ、ら、　　１９７６、　Ｎ、　　Ｅｎｇｌ、　　Ｊ、　Ｍｅｄ、　２９４：８０９）と適合する。レバミソールは免疫強化薬として作用することが示されている（Ｌｅｖｏ、　Ｙ、ら、　１９７５゜Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ　２３：１９８−２００；　Ｎｅｋａｍ、　　Ｋ、ら、　　１９８１．　１ｍｍｕ−ｎｏｐｈａｒｍ、　３：３ｌ−４０）が、その作用様式は未だに理解されていない。

ＨＩＶ感染の臨床範囲全体にわたるイソフェリチン発現のパターンは、ＰＬＦがホジキン病の病因において演じていると考えられると同様に、進行性免疫不全の病因においである役割を演じている可能性を示唆している。現在の研究並びに従来の分析（Ｍｏｒｏｚ、　Ｃ，ら、　１９８４゜Ｃａｎｃｅｒ　５４：８４−８９）の両方において、正常被験者の末梢血液リンパ球の小部分（６〜７％まで）が、最もありそうなのはＣＤ８プール内で、ＰＬＦを結合する。この比率は、旧 ■感染患者においては拡大されると思われる。

さらに、血清ＰＬＦは、臨床段階ＢおよびＣにおける最大リンパ系活性化期間に相当して、比較的初期のＨＩＶ感染で劇的に上昇する。Ｗａｌｋｅｒ等（１９８６，５ｃｉｅｎｃｅ　２３４：　１５６３−１５６６）からの先行データは、ある種のＣＤ８リンパ球が旧Ｖのインビトロ増殖を阻害し得ることを示唆している。仮説としては、ＰＬＦはこれらのＣＤ８細胞の免疫適格性を阻害し、それによって、後期疾患（同上）の特徴であるＨＩＶの漸進的発現に寄与して得るのであろう。

ＨＩＶ感染初期におけるＰＬＦの上昇と、その後の感染後期の低下に関する説明は、今日までのところなされていない。我々の予備データにより支持される１つの可能性は、トランス活性化ウィルス遺伝子（ｔａｔＩ［）産物かウィルス感染ＣＤ４細胞におけるＰＬＦ　ｍＲＮＡ発現を増大させるというものである。ＡＩＤＳ後期におけるこれらの細胞の総数の減少は、血清ＰＬＦ濃度において観察された低減を説明でき、この間の総フェリチンは急性期反応体としての非特異的刺激（例えば二次感染）に応答して増大する。

既知の免疫強化剤であるレバミソールかＣＤ８＋サブセツトからのＰＬＦの溶離を増強するという所見は、特に疾病の初期に用いられた場合のＦ（ＩＶ感染の治療におけるこの薬剤の役割を示しているのかも知れない。

１４、胎盤フェリチンに特異的なモノクローナル抗体の調製以下の小節では、胎盤フェリチン（ＰＬＦ）　、および胎盤フェリチンの特有のエピトープを特定するモノクローナル抗体（例えばＣＭ−Ｈ９ＭｃＡｂ）の調製について記載する。これらの抗体は、牌臓フェリチンとも肝臓フェリチンとも交差反応しない。

１５、胎盤フェリチンの調製Ｂｅａｍｉｓｈ等（１９７１，Ｊ、　Ｃ１１ｎ、　Ｐａｔｈ、　２４：５８１）が用いた方法の改変によって、ヒト胎盤から胎盤フェリチンを調製した。胎盤組織（５００ｇ）を薄切し、水を加えて総量を２００（Ｗにした。ホモジナイズ後、組織懸濁液を７５°Ｃに２０分加熱した。冷却し、１０．０００ｒｐｍで１５分間遠心分離後、上清を酢酸で処理してｐＨを４．６とした。１０．００Ｏｒｐｍで１５分間遠心分離することにより沈降タンパク質を除去しそして透明な上清を希ＮａＯＨで中性ｐＨに調整した。透明な褐色上清を１００，０００Ｘｇで２４０分超遠心分離すると、懸濁フェリチンか遠心管の底に少量集まった。沈澱物を０．９％食塩水中に再溶解しそしてさらに５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ２００カラムに通すことにより精製した。このカラムから得られたフェリチンフラクションをｐＨ７，５および０．０２〜０．５グラジエントのトリス塩酸緩衝液を用いてＤＥＡＥセルロース陰イオン交換樹脂に通した。

３個のタンパク質ピークが得られ、最も酸性の高いビークｐｌ＝４．８を集め、分析に用いた。その純度は等電点電気泳動、および抗−フェリチン血清および抗 −ヒト全血清に対する免疫電気泳動によって示した。、二のタンパク質を以下に記載するマウスの免疫化に用いた。

１６、胎盤フェリチンと結合するモノクローナル抗体の調製ＰＬＦと結合するが、しかしその他のイソフェリチンとも交差反応し得るモノクローナル抗体を生成させるのに、下記プロトコルを用いた。そのプロトコルおよび作成されたモノクローナル抗体は以下の出願に記載されている：　１９８１年５月１５日出願のイスラエル出願番号６２８７９を優先権とする、１９８２年４月３０日出願の出願番号３７３．７１５号の一部継続出願である１９８４年１月４日出願の出願番号５６８．２７５号の継続出願である１９８８年１月２２日出願の同時係属出願出願番号０００００号。これらはそれぞれその全体が参照として本明細書中に取り込まれるものとする。Ｍｏｒｏｚら、　　１９８５．　Ｃ１ｉｎＣ１１ｎｊｃａＣｈｅ　Ａｃｔａ　１４８：１１１−１１８も参照されたい。

１７、材料および方法下記の培地および溶液をモノクローナル抗体の調製に使用した。

ａ、ＲＰＭＩ−０（Ｆｅ２なし）ｂ、　ＲＰＭＩ　１６４０−ＨＹ５０（Ｗ　　滅菌蒸留水５５ｙｄ　　ＩＯＸ　ＲＰＭＩ−１６４０６ｍ／　　１．ＯＮ水酸化ナトリウム１４ｍ１　７．５％重炭酸ナトリウムｃ、　ＲＰＭＩ−ＨＹ−ＨＡＴＤ　−０日目から７日月培地１００ｍ／当り９５ｒｎｌＲＰＭ■−１６４０＋２０％ＦＣ３１、Ｏｍｌ　　ピルベート（１００Ｘ）２、　Ｏｍｌ　　５０Ｘ　ＨＡＴ２、Ｏｍｌ　　５０Ｘデオキシシチジンｄ、　ＲＰＭＩ−ＨＹ−ＨＴ−８日目から１４日巨塔地１００ｍＡ’当り９７ｒＩＬＩＲＰＭ！−１６４０＋２０％ＦＣＳ２、　Ｏｍｌ　　５０Ｘ　ＨＴ１．０−　ビルベー）　（１００Ｘ）＋２０％ＦＣ３およびピルベート使用、またはＲＰＭＩ−ＨＹ−ＨＴ中に維持。

ｅ、　ＰＥＧ　３３および２５％Ｗ／Ｖ無臭および白色でなければならない。１００ｍ１用に、相当量グラムをガラスビンで１５ポンドの圧力にて１０−１５分間オートクレーブする。ビンが手で持てる位に冷えたところで（約５０°Ｃ）　、ＲＰＭＩ−１６４０−０を１００−になるまで加え、ぐるぐるかきまぜ、室温にて貯蔵。

ｆ、　ＨＡＴＤ−試薬の最終濃度Ｈ＝ピポキサンチン　１０−’ＭＡ＝ニアミノプテリン１０−＠ＭＴ−チミジン２×ｌＯ−ｓＭ− Ｄ＝ニブオキシシチジン２Ｘ１０−’Ｍ１（Ｔ＝貯蔵液１００Ｘ　−１００ｃｃチミジン（Ｍ、Ｗ、　２４２．３３）　：　０．０４８４６ｇピポキサンチン（Ｍ、Ｗ、　１３６．１）　：　０．１３６１ｇ１００ｍ１になるまで水を加え、６０−７０°Ｃに加温して溶解させる。二度蒸留した水（ｄｄＨｔｏ）を用いて最終容量を再調整。５０Ｘに希釈し、滅菌濾過（０，２μ）し、２ｍｌずつ一２０°Ｃにて貯蔵。

ｇ、　Ａ貯蔵液１０００Ｘ　−］００ｃｃアミノプテリン（Ｆ、Ｗ、　４４０．４）　：　０．４４ｇ解するまで０．ＩＮのＮａＯＨを１滴ずつ加える。ｄｄＨ２０を用いて最終容量を１００−となす。１００−に容量を調整する。滅菌濾過（０，２μ）しそして−２０℃にて貯蔵する。

ｈ、　Ｄ貯蔵液１００Ｘ　−１００ｃｃデオ牛シシチジン（Ｍ、Ｗ、　２２７．２）　：　０．００４５４ｇｄｄＨ，０中に溶解させ、１００ＣＣに調整し、５０Ｘ貯蔵液に希釈する。滅菌濾過（０，２μ）しそして−２０℃にて貯蔵する。

ｉ、　ＨＡＴ−５０Ｘ−２００ｍｊ１００ｍｌの１００Ｘ　ＩＴと１０ｍ１の１００ＯＸＡを一緒にし９０ｍ１ｄｄＨ２０ヲ加え、５０Ｘ　ＨＡＴをツ＜ル。滅菌濾過（０，２μ）しそして２ｉずつ一２０°Ｃにて貯蔵する。

１８、免疫化プロトコル雌Ｂａ１ｂ／ｃマウス（開始時点にて４−６週令）を完全フロインドアジュバント中の５０μｇ酸性胎盤フェリチン（上記第６．１節記載のようにして調製）を週１回接種を３回することにより免疫した。１０８ｇ酸性胎盤フェリチンを最後に注射して３日後にハイブリダイゼーションを行った。高度免疫マウスは、最後のブースターの少なくとも１ケ月前は休息させた。

１９、牌臓細胞−ミエローマ融合牌臓細胞は下記の様に調製した。

ａ、マウスより牌臓を、取り出しＲＰＭＩＯに入れ：ｂ、ペトリ皿中でＲＰＭＩ −０て２度すすぎ；ｃ、　ＲＰＭＩＯ中で１８ゲージ針を用いる細く裂きばらばらにし：ｄ、細胞懸濁液をチューブに移し、沈んだ組織の大きなかたまりは捨て；ｅ、単一細胞懸濁液は新しいチューブに取り出し８００ＰＰＭ（１６０Ｘ　ｇ）にて５分間遠心し：赤血球を０．８３％ＮＨ４Ｃｌ、　ｐＨ７，５を用いて溶解させ；ｆ、細胞をＲＰＭｉＯで３度洗浄し、ＲＰＭＩＯ中に再懸濁させ：ｇ、細胞をトリバンブルーを用いて数えた。

ミエローマ細胞を融合に使用した。ＰＢ／ＮＳＩ／ｌ−Ａｇ４−１を２０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を補添したＲＰＭＩ−１６４０中で増殖させそして下記のように調製した。

ａ、　　ミエローマ細胞を培養フラスコから静かなピペット操作て取り出し、５０ｍ１のＦａｌｃｏｎ／Ｃｏｒｎｉｎｇチューブに入れた：ｂ、　９００ＰＰＭ（２００Ｘ　ｇ）で５分間遠心し：ｃ、　ＲＰＭｉＯで１回洗浄し、ＲＰＭＩ、Ｏ中に再懸濁しそしてトリバンブルーを用いて計数した。

牌臓細胞を下記のようにしてミエローマ細胞に融合させた。

ａ、牌臓およびミエローマ細胞を１個の５０ｍ（！の円錐形Ｆａｌｃｏｎ／Ｃｏｒｎｉｎｇ使い捨て遠心チューブ中で１０対ｌの割合で混合し；ｂ、細胞を９０ＯＲＰＭ（２００Ｘ　ｇ）で５分間遠心してペレットとなし；Ｃ０培地はできるだけ完全に吸い出し：ｄ、以後、使用した全ての溶液および培地は室温であった。細胞ペレットを含有する遠心チューブを３７°Ｃの水浴に浸しそして下記のものを静かにかき混ぜながら添加した。０．２ｍｌ！　３３％ＰＥＧ１５００を１分間加え、２００Ｘｇで５分間遠心した。細胞を再懸濁し、１分間穏やかにかき混ぜ、次に５　ｍｊ’ｆ７）ＲＰＭｉＯを穏やかにかき混ぜながら添加し、そして２０％ウシ胎児血清を含有する５ｍｌのＲＰＭｒ−０を添加した。この時点において、バイブＩＪッド混合物は多くの小さなかたまりが存在してあまり再懸濁されてない細胞浮遊物のように見えた。

ｅ、混合物を２００×ｇで５分間遠心してペレットとなし；ｆ、細胞は、培地を細胞ペレットに噴出させてＲＰＭＩ−ＨＹ−ＨＡＴＤ中に濃度が３　ｘ　１０’／ｃｃになるように、　（３７°Ｃにて）再懸濁させ；ｇ、ハイブリッドは２滴の細胞懸濁液を、５１１Ｎ１ピペツトから、あるいは先を切り取ったピペットチップをにより　（約６５マイクロリツター）、１００− １２ＯＲＰＫ＋Ｉ−ＨＹ−ＨＡＴＤを含有する平底の９６ウエルプレートに塗布しく約２Ｘ１０’細胞）；ｈ、　ＲＰＭＩ−ＨＹ−ＨＡＴＤ中にｌＸｌ０’／ｍｊでＮ５−１細胞を含有する対照ウェルを準備し：１、プレートを７日間培養し；ｊ、８日月およびそれから後は週に２度、培地の半分を注意深く吸い出しそして８０−１００μｌのＲＰＭＩ−ＨＹ−ＨＴ培地を注入し；に、ハイブリダイゼーション後、３および４週目に陽性細胞を選別した。

２０、スクリーニングプロトコルスクリーニングおよびモノクローナル抗体の特異性の判定は赤血球凝集試験により行った。胚胎盤および成人牌臓フェリチンをＣｒＣ１ｚによりウシ赤血球、０ｘＲＢＣに結合させた。５０μｌの漸増希釈度（１：　１０から出発）のハイプリドーマ培養上清を１０μβの成人および胚フェリチン０ＸＲＢＣと混合しそして赤血球凝集を測定した。

少なくとも１　：　１０００の赤血球凝集力価を生じるクローンの上清を選択した。

ＣＭ−ＯＦ−３で示されるひとつのクローン（以下ＣＭ−３と呼ぶ）を選択した。このクローンＣＭ−３は胚フェリチンに特異的なモノクローナル抗体を生産しそしてこのものは成人および胚フェリチンの両方と交差反応する。

ＣＭ−Ｇ　８で示されるもうひとつのクローンは胎盤フェリチンに結合し、牌臓および肝臓フェリチンと交差反応するモノクローナル抗体を生産する。ＣＭ−Ｇ　８はＣＭ−３により認識されると同じエピトープを特定する。

２１、胎盤フェリチンに特異的で正常のフェリチンとは交差反応しないモノクローナル抗体の調製法のプロトコルを使用して、ＰＬＦに特異的で、他のイソフェリチンとは交差反応しないモノクローナル抗体を調製した。特に、特異的な胎児決定基に対する異なるモノクローナル抗体、ＣＭ−Ｈ９を生成させるために、上記記載のモノクローナル抗体ＣＭ−３を胎児および成人フェリチンの交差反応性決定基を阻止するのに使用した。

２２、免疫化および融合プロトコル下記の免疫化および融合操作を、ＰＬＦの特有のエピトープを特定しそして他のイソフェリチンとは交差反応しないモノクローナル抗体を得るのに使用した。ヒト胎盤から単離した胚フエ＋）チン（上記第６．１節記載のようにして単離したり１４．８のタンパク質）はモノクローナル抗体ＣＭ−３と下記の割合で反応させた。すなわち、胚フェリチン（ＰＢＳ中９０μｇ）をＣＭ−３抗−フェリチンモノクローナル抗体（１０ｍｇ／ｍｌ）を含有するＢＡＬＢ／ｃマウスからの腹水液と混合した。

この混合液を３７°Ｃで３０分間インキュベートし続いて４°Ｃで一夜インキユベートした。混合物を１０．ＯＯＯＸｇで遠心し、生成した沈澱は捨てそして上清を免疫化に使用した。各ＢＡＬＢ／ｃマウスを、完全フロインドアジュバントと混合した上記上清を週に一度、３週間皮肉注射することにより免疫した。上記投与量の１１５のブースター免疫化は腹腔内に注射した。

ブースターから３日後、マウス牌臓を無菌的に取り出しそして上記のようにして１０７／Ｐ３−ＮＳＩ／１−Ａｇ４ミエローマ細胞と１０’牌臓細胞をインキュベートすることにより融合を行った。陽性クローンは上記のようにして同定した。ＣＭ−ＯＦ−８９で示されるクローン（以下ＣＭ−Ｈ９と呼ぶ）を得た。

２３、モノクローナル抗体ＣＭ−８９の特性決定ＣＭ−）１９モノクロ一ナル抗体はＩｇＧクラスに属する。

すなわち、このものはフェリチンと沈降物を形成せず、ウサギ補体を結合する。

得られた腹水液において、抗体含有量は約７ｍｇ／ｍｌであった。１ｍｌの腹水液は、約２■の胎盤フェリチンと結合しそして成人牌臓あるいは肝臓フェリチンとは結合しない。

２４、　ＣＭ−８９モノクロ一ナル抗体を使用したリンパ球結合胎盤フェリチンのイムノアッセイモノクローナル抗体ＣＭ−Ｈ９は循環中末梢血液リンパ球（ＰＢＬ）に結合した血清またはＰＬＦのような検査試料中のＰＬＦ検出のためのイムノアッセイに使用できる。ＰＬＦの存在はＥＬＩＳＡ　、ラジオイムノアッセイあるいは細胞障害アッセイ（そこでは細胞標的がかかわる）を含むがそれらに限定されない任意の種類のイムノアッセイ系でＣＭ−８９を使用することにより測定できる。

一般に、末梢血液リンパ球に結合した胎盤フェリチン検出のためのアッセイは（ａｌ末梢血液からリンパ球を単離し、そして（ｂｌ　ＰＬＦ特異的な新規モノクローナル抗体の使用に基づく慣用の種類のアッセイを使用してリンパ球上のＰＬＦの存在を測定することにより実施できる。

好ましい実施態様によれば、検査は下記のようにして行われる。

ａ、リンパ球をＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅグラジェント遠心により末梢血液から単離し；ｂ、リンパ球の表面に結合したＰＬＦの存在あるいは非存在をＥＬＩＳＡ　、細胞障害試験あるいはラジオイムノアッセイのような任意の慣用の種類のアッセイにより測定する。

２５、リンパ球の収集り′ンパ球は下記のようにして収集する。

（ａ）１５ｙ＋４’の血液をヘパリン含有血液収集試験管に収集し、ＰＢＳ、　ｐＨ７，２中１：２に希釈。

（ｂ）細胞懸濁液の下に１０ｍ１のＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度溶液（１，０７７ｇｍ＃Ｊ）を入れる。

（ｃ）３００　ｘ　ｇで室温で３０分間遠心する。

（ｄ）培地：　Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ界面からパスツールピペットを使用して単核細胞を収集しそして新しい１５ｍｊ試験管に移す。

（ｅ）１５ｍｔ’の洗浄培地（ＰＢＳ、　ｐＨ７，２）中に懸濁し、３００　Ｘ　ｇおよび４°Ｃで１０分間遠心することにより細胞を３回洗浄する。

（ｆ）洗浄培地中に再懸濁しそして細胞数を測定する。

２６、ラジオイムノアッセイ操作ラジオイムノアッセイのための２つの方法を以下に示す。

Ａ、ラジオイムノアッセイ−１末梢血液単核細胞をＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅグラジェント遠Ｂ試験試料）。

１、　６本の試験管それぞれに２Ｘ１０”から３ＸＩＯ’細胞を分注し、３００Ｘｇて１０分間遠心し細胞をベレット化する。

２、　ＰＢＳで１＝１０に希釈した２０μｌのＮＲ３（正常のウサギ血清）を加え、４°Ｃにて６０分間インキュベートする。

３．３個の試験管それぞれに３０μｌの腹水液（５％ＢＳＡ中で１０−Ｓに希釈）を加える。

Ａ、対照腹水液は、ＰＬＦと反応しないＩｇＧ非特異的モノクローナル抗体を含有する。

Ｂ、　ＣＭ−８９モノクロ一ナル抗体。

よく混合し、室温で２時間インキュベートする。

４、１０ｙｄ　ＰＰＭＩ−１６４０を用い３００Ｘｇおよび４℃（二で１０分間遠心することにより細胞を２回洗浄する。

５、０．１．ｃｚｃｉの１１２５ウサギ抗−マウスＩｇＧ（”’ＩウサギＩｇＧ　１μＣｉ／μｇ）を加え、４°Ｃで６０分間インキュベートし、４におけるようにして冷ＲＰＭＩ−１６４０で２回洗浄し、放射能を計数する。

陽性試験：　　ＣｐｍＡ−ＣｐｍＢ　＜　５００あるいはＣｐｍＡ　：　ＣｐｍＢ＞１．６゜Ｂ、ラジオイムノアッセイ−２段階１すなわちＲＩＡ−１の後、試験操作を以下のようにして続ける。すなわち、ＣＭ−８９Ｆ（ａｂ）２をＵｔｓｕｍｉおよびＫａｒｕｓｈ（１９６５，Ｂｉｏｃｈｅｍ、　４：１７６６）の記載に従い、ＣＭ−Ｒ９１ｇＧのペプシン消化によって得る。対照Ｆ（ａｂ）ｔは、非特異的１ｇＧ　（ＲＩＡ−１の対照参照）から同様にして得る。

このように得られたＦ（ａｂ）ｚフラグメントを下記のように使用する。

チューブＡ：０．０２５％ナトリウムアジドを含有するＰＢＳ（ｐＨ７，２）中の５％ＢＳＡ中における対照Ｆ（ａｂ）２、チューブＢ：０．０２５％ナトリウムアジドを含有するＰＢＳ（ｐＨ７，２）中の５％ＢＳＡ中におけるＣＭ−Ｈ９Ｆ（ａｂ）２゜室温にて６０分間インキュベートし、ＰＢＳ（ｐＨ７，２）中の１％Ｂ５Ａ２ｍ１を用いて１回洗浄し、　＋′Ｉ標識リガンドを試験管ＡおよびＢに加える（約１０５ｃｐｍ）１０５ｃｐ標識ＰＬＦあるいは＋２Ｊ−ポリクローナル抗−ＰＬＦとＰＬＦとの複合体のうちいずれか一方、該複合体は抗原／抗体モル比１：１あるいはｌ：２までで前もって形成させ、相互に室温にて１時間ブレインキュベートする。）標識したリガンドを細胞と室温にて１時間インキュベートし、結合してない標識リガンドを取り除くために１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（ｐＨ７，２）で２度洗浄し、そして計測する。もし、ＢがＡを上回る場合は試験は陽性である。

１、細胞障害アッセイ操作試験は二通り行った。（Ａ）対照および（Ｂ）試験試料。

ａ、　ＲＰＭＩ−１６４０中に５Ｘ１０’細胞／ｍｌの密度でＰＢＬを懸濁させる。

ｂ、　１５０μｌのＰＢＬを４つの１２Ｘ７５順の試験管それぞれに入れる。腹水液（３０μｌ、１０−４希釈物）を加える。

すなわちＡ、対照腹水液（２試験管’）　　；　Ｂ、　ＣＭ−８９（２試験管）。４°Ｃにて４５分間インキュベートする。

Ｃ，ウサギ補体（ＰＢＳ中ｌ：５に希釈したちの１００μβ）を加えそして３７ °Ｃで６０分間ゆっくりした攪拌しながらインキュベート。

ｄ、　　）リパンブルーで生存細胞を数える。

陽性試験：２、結果：特定の疾患におけるリンパ球とのＣＭ−Ｈ９モノクロ一ナル抗体の反応性上記記載のアッセイを用い、２種のモノクローナル抗体ＣＭ−Ｈ９およびＣＭ− ３を疾患のない被験者のみならず種々の病気を有する患者から得た血清およびＰＢＬを選別するのに使用した。下記の第１表に示す結果は、２種の抗体が乳房の悪性腫瘍およびホジキン病の迅速かつ便利な検出ができ、そして正常フェリチンの増大を生じるタラセミアからのこれら識別を可能にすること種々の患者検体とのＰＬＦモノクローナル抗体の反応性Ｉ　、　成人牌臓（タラセミ了）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　＋２、正常血清　　　　　　　　　　　　　　　＋３、乳癌（ＰＢＬ）　　　　　　　　十＋４、乳癌（血清）十干５、ホジキン病（牌臓）＋＋６、良性乳房疾患（ＰＢＬ）　　　　−−７、良性乳房疾患−血清　　　−十２７、　ＨＩＶ感染におけるイソフェリチン：臨床段階との関係、ＣＤ８”リンパ球結合とエイズ病因下記に詳述する例において、胎盤イソフェリチン（ＰＬＦ）はヒト免疫不全ウィルス（旧■）に感染した被験者の血清中で増大することが見い出された。ＰＬＦは２種のモノクローナル抗体を使用する「サンドイッチ」抗原捕捉ＥＬＩＳＡの使用により定量した。エイズ関連症候群を示唆する症状を有するかあるいは存しないリンパ節症患者は、最高の血清レベルを有し、それは免疫不全の進行とともに減少した。それとは対照的に、全（正常）フェリチンは疾患の段階とともに漸進的に増大した。ＰＬＦはＣＤ８＋リンパ球サブセットの細胞表面上に見い出されそして特異的モノクローナル抗体によるＣＤ８抗原の検出を阻止すると思われた。細胞表面からのＰＬＦの溶離は培地だけではできないかレバミソールとのインキュベーションにより達成されてこれらの細胞上のＣＤ８決定基を阻止されないようにすることかできた。したがってＨＩＶ感染におけるイソフェリチンのプロフィルにより、予知手掛かりか提供される。造血および細胞性免疫の生理学的ダウンレギュレーターであるＰＬＦは、旧■遺伝子産物によるトランス活性化を介して異常に発現され、エイズに至る進行性免疫不全、骨髄機能抑制およびＨＩＶ発現においである役割を果すであろう。

１、材料および方法１、被験者ＨＩＶ陽性血清患者の血清は以前の研究期間中に得て一７０°Ｃにて貯蔵した材料から（Ｓｉｅｇａｌ、　Ｆ、　Ｐ、ら、　１９８６゜Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　７８：１１５−１２３）、および現在進行中の研究における患者から得た。患者は、関わるすべての被患者が旧Ｖ陽性血清であると確認されたという改変を加えた臨床段階に従って分離した。

段階は下記のように定義する。すなわちＡ期：　ＨＩＶ陽性血清であるが、臨床的徴候あるいは身体的所見はない；８期：リンパ節症および／または巨牌症：Ｃ期：臨床的症候あるいは、ＡＲＣに関連する所見；Ｄ期：カポジ肉腫、リンパ腫、あるいはＣＮ５（中枢神経系）疾患があるか、全身的日和見感染はない；Ｅ期：Ｃｅｎｔｅｒｆｏｒ　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＣＤＣ）の独自の標準によりエイズを特定する日和見感染（Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ。

Ｕｐｄａｔｅ　ｏｎ　ａｃｑｕｉｒｅｄ　ｉｍｍｕｎｅ　ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ（ＡＩＤＳ）−Ｌｌｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ、　１９８２．　Ｍｏｒｂｉｄ、Ｍｏｒｔａｌ、ＷｅｅｋｌｙＲｅｐ、　３１：５０７−５１４）。また血清は血液銀行の血液学的に正常な４０人の献血者からも得た。

２、リンパ球単離末梢血液単核細胞は、新鮮なヘパリン添加血液からＦｉｃｏｌ　１−Ｈｙｐａｑｕｅグラジェント密度遠心により単離した。

３、モノクローナル抗体ＣＤ４”、ＣＤ８”、およびＣＤ２＋細胞とそれぞれ反応し、フルオレセインまたはフィコエリトリンに直接接合されたモノクローナル抗体（ＭｃＡｂ）　Ｔ４、Ｔ８およびＴｌｌをＣｏｕｌｔｅｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｈｉａｌｅａｈ、　Ｆｌａ、）から得た。

ＣＭ−Ｈｅ　ＭｃＡｂはヒト胎盤フェリチンを特定しそして胎盤イソフェリチンとのみ反応するか肝臓あるいは肝臓フェリチンとは反応しないことか示されている（Ｍｏｒｏｚ。

Ｃ０ら、　　２９８５．　　Ｃｌ１ｎ、　　Ｃｈｉｍ、　　Ａｃｔａ　１４８：１１１−［８）。ＣＭ−Ｇ８ＭｃＡｂはヒト胎盤イソフェリチンに対して生成されるが、ＰＬＦのみならずヒト肝臓および肝臓フェリチンとも反応する（同上）。

４、フローサイトメトリーおよび免疫蛍光染色ＣＤ４”、ＣＤ８″″、およびＣＤ２”細胞は、２色免疫蛍光用に改変を加えたＣｏｕｌｔｅｒ　Ｅｐｉｃｓ５セルソーターを使用し、フローサイトメトリーによりアッセイした。リンパ球は製造業者の指示に従い、フィコエリトリン接合Ｔ４ＭｃＡｂ、およびフルオレセイン−イソチオシアネート接合Ｔ８　ＭｃＡｂあるいはＴｌｌ　ＭｃＡｂと直接反応させた。

５、　ＣＭ−８９ＭｃＡｂを使用したリンパ球膜上のイソフェリチンの免疫蛍光染色リンパ球を２％ウシ血清アルブミン（ＢＡＳ）および０．０１％アジ化ナトリウムを含有するｐＨ７，２のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）　（ＰＢＳ−ＢＳＡ）を用い、室温で２回洗浄した。

それぞれｌＸｌ０＠単核細胞を含有する２つの部分量を希釈ＣＭ−Ｈ−９Ａｂ　２５μｌ中４°Ｃで１夜インキユベートした。ｌＸｌ０’細胞を含有する三番目の部分量は陰性対照としてマウスＩｇＧ（Ｃｏｕｌｔｅｒ）２５μｌとインキュベートした。インキュベート後、単核細胞をＰＢＳ−ＢＳＡ中で３回洗浄し、ヤギ抗−マウスＩｇＧ　Ｆ（ａｂ’　）２のフルオレセイン接合Ｆ（ａｂ’）ｔフラグメント（ｌ：２希釈ＸＣａｐｅｌｌ）２５μｌと４℃で３０分間インキュベートしそして再びＰＢＳ−ＢＳＡで３回洗浄した。

遠心後、洗浄した細胞ペレットを２０μｌのＰＢＳ−ＢＳＡ中に懸濁し、そしてＣＭ−Ｈｅ　ＭｃＡｂで膜が染色されたリンパ球を定量するのに２８８ｎｍの励起波長で、ＬｅｉｔｚＯｒｔｈＯｐｌａｎエビフルオレセンス顕微鏡を用いて顕微鏡スライド上で検査した。少なくとも４００個のリンパ球が敵側された。単球はその大きなサイズおよび豊富な顆粒状の細胞質により形態学的に同定され、計数から除外された。

いくつかの実験においては、膜イソフェリチンおよびＣＤ４抗原の二重染色が行われた。ＣＭ−Ｈｅ　ＭｃＡｂおよびＦｒＴＣ−抗−マウスＦ（ａｂ’）２１ｇＧを加えた後、リンパ球をＰＢＳ−ＢＳＡで２回洗浄しそしてさらにフィコエリトリンー抗−ＣＤ４　ＭｃＡｂ（５ｕ　１．　Ｃｏｕｌｔｅｒ）と４℃で３０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳで２回洗浄しそして上記のようにして蛍光顕微鏡を用いて分析した。

６、　ＣＭ−Ｈｅ　ＭｃＡｂを使用したリンパ球細胞質中のイソフェリチンの免疫蛍光染色リンパ球（ＩＸＩＯ’）を事前にきれいにしたｌｌｆｆ１鏡スライド（Ｃｙｔｏｓｐｉｎ、　５ｈａｎｄｏｎ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上にのせ遠心し、５分間風乾し、無水メタノール中−１５°Ｃで１０分間固定した。細胞をＰＢＳ中で５分間１回洗浄しそして湿気チェンバー中室温でＣＭ−Ｈｅ　ＭｃＡｂ（５０μ！りと一夜インキユベートした。インキュベート後、スライドをＰＢＳ中３回（それぞれ５分間）洗浄しそしてさらにＦＩＴＣ−ヤギー抗−マウスＦ（ａｂ’　）ａ（２５μｌ　、　Ｃａｐｅｌｌ）と室温で３０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳで３回洗浄しそして細胞質蛍光を調べた。各スライドに約１−４Ｘ１０３個の細胞が計測された。

７、単核細胞のレバミソール処理レバミソール（Ｓｉｇｍａ、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ）を最終濃度４０μ ｇ／ｒｎｌとなるまて全血または単離した単核細胞に加え、続いてＲａｍｏｔら（１９７６、Ｎ、　Ｅｎｇｌ、　Ｊ、　Ｍｅｄ、　２９４：８０９）記載のようにして３７℃で３０分間インキュベートした。次に、レバミソール処理した細胞を、前記したフローサイトメトリーおよび免疫蛍光染色の調製において種々のモノクローナル抗体と混合した。

８、血清イソフェリチンの定量的測定フェリチンおよび胎盤イソフェリチン（ＰＬＦ）を以前記載（Ｍｏｒｏｚ、　Ｃ，ら、　１９８７．　Ｅｘｐ、　ｔ（ｅｍａｔｏｌ、　１５：２５８−２６２）の様にして特異的ＭｃＡｂ　ＥＬＴＳＡを使用し、１６１人のＨＩＶ感染患者の血清および４０人の血液銀行献血者の血清において測定した。ＥｎｇｖａｌおよびＰｅｒｌｍａｎ（１９７２，Ｊ、　ｆｍｍｕｎｏｌ。

１０９：１２９−１３２）の「サンドイッチＪ　ＥＬＴＳＡ法をＶＯｌｌｅｒら（１９７５，Ｌａｎｃｅｔ　１：４２６）が改変した方法を使用してフェリチンおよびＰＬＦのためのアッセイを開発した。

フェリチンのためおよびＰＬＦのための両アッセイ系において、全てのイソフェリチンに結合するＭｃＡｂＣＭ−６８は捕捉試薬として固相に結合させた。以前示されているように、高濃度の正常フェリチンは固相への結合をＰＬＰと競合しなかった（Ｍｏｒｏｚ、　Ｃ，ら、　１９８７．　Ｅｘｐ。

Ｈｅｍａｔｏｌ、　１５：２５８−２６２）。捕捉された抗原を検出するには、アルカリホスファターゼ接合ＣＭ−Ｇ８　ＭｃＡｂをフエリチン測定に使用し、そして酵素接合ＣＭ−Ｈ９ＭｃＡｂをＰＬＦ測定に使用した。２．５９ｇのアルカリホスファターゼ（ＡＰ）−接合ＣＭ−Ｈ９ＭｃＡｂに結合する胎盤フェリチン量とＰＬＦ　１０単位（ＩＯＵＰＬＰ）と定義する。

９、統計分析データをスチューデントのｔテスト、相関系数、直線状回帰、およびカイ２乗テストを使用する統計のパッケージであるＥＰＩＳＴＡＴで、ＩＢＭ−ＡＴパーソナルコンピュータ処理し分析した。

２、結　果１、８ＩＶ感染患者のフェリチンおよびＰＬＦの血清レベルＰＬＦ特異的ＥＬＩＳＡの使用により、ＨＴＶ感染患者および健康な血液銀行献血者の血清中の全フェリチンの量とは独立してＰＬＦ濃度が測定できた。かかる測定結果を第１Ａ図および第■表に示す。

（本頁以下余白）第■表正常な対照者：３６４１（７Ｖ惑染者Ａ　　　　　　１６　　　　　ｇ　　　　３．２４　　０．０４Ｂ　　　　　　１９　　　　３０　　　２２．３６　　２．３ＸＩＯ−’Ｃ８１７２１，０９４，４Ｘ１０−’ Ｄ　　　　　　２６　　　　１１　　　３．６　　　０．０５８Ｂ　　　　　　３３　　　　１８　　　６．５１　　０．０１１正常な対照者：３７３旧■感染者Ａ　　　　　　Ｉ８　　　　４　　　０．７２　　０．３９Ｂ　　　　　　５１　　　　２　　　０．１　　　０．７ＣＩ８　　　　６　　　２．４９　　０．１１Ｄ　　　　　　１４　　　　２３　　　２３．２９　１．４９ｘｌＯ−’Ｅ　　　　　　１７　　　　３７　　　３２．５５　　　＜１０−”ネ正常な対照者と比較して第１Ａ図に示すように、ＰＬＦの平均濃度は健康な献血者において１０±３１．５Ｕ／ｍｌであった。検査した血清の７０％は検出できる程のＰＬＦを含有せず、ＩＯＵ／ｍｌより高い濃度を存するものは１０％のみであったことは注目すべきである（第１Ａ図、第１表）。標準（ｐ　＜０．０１）よりも有意に高く、最高濃度のＰＬＦ（２５±２５．３および１８．２±１６Ｌｌ／ｄ）が臨床的徴候のある疾患の初期の患者で観察された（Ｂ、Ｃ期）（第１Ａ図）。また、正常の血清から得られた結果とは対照的に、これら患者の血清の６１−６８％は、その血清中に１００／−以上のＰＬＦを含有していた（第１Ａ図、第■表）。

一方、さらに進行したＨｒｖｇ染を有する患者（Ｄ。

Ｅ期）は血清中の平均ＰＬＦレベル（７，８±１１．７．９．７±１４．７）が比較的低く、これは正常な対照者のそれとは有意に相異しなかった（第１Ａ図）。さらに、エイズ患者の２９．７％および３５．３％のみが、１００／ｉｔ’以上の血清ＰＬＦを有した（第１Ａ図、第■表）。

上記結果と対照的に、正常のフェリチンレベルは疾患が進行するに伴い漸進的に上昇した（第１Ｂ図、第■表）。進行した疾患を有する患者（Ｄ、Ｅ期）の６２および６８．５％は、２００ｎｇ／ｍ１以上の血清フェリチンを存していた（第１Ｂ図、第■表）。臨床的あるいは身体的徴候のないＨＩＶ陽性血清患者の中で（Ａ期）、平均ＰＬＦレベルは正常値をこえて２０．７±３４．２Ｕ／ｍｅまでわずかに増大し、３３％の患者は正常な対照者の値と有意に相異しない１０Ｕ／ −以上を有していた（第１Ａ図、第■表）。全フェリチンレベルもまた健康な献血者のそれとは有意に異ならなかった（第１Ｂ図、第■表）。

２、疾患の進行に対する高い血清ＰＬＦおよび正常フェリチンの関係第１表に示す個々の結果の分割表分析を、ＰＬＦについてはＩＯＵ／’＋＋＋／　（正常な対照レベルの９０％がこの値より下であるのて選択）そして全フェリチンについては２００ｎｇ／ｍｌ（正常な対照レベルの９２．５％が、この値より下であるので選択）の切り捨てレベルを使用して実施した。得られた結果は、血清ＰＬＦレベルの上昇と比較的初期の１（ｒＶ感染の存在との間の統計的に有意な関係を示しくＢおよびＣ期については、それぞれｐ＝２３ＸｌＯ−′およびｐ＝４．４Ｘ１０−“）、−万全フエリチンレベルの上昇は進行した疾患との関連が高かった（ＤおよびＥ期にはそれぞれり＝１．４９Ｘ１０−＠およびｐ＜１０−〇（第π表）。

患者の末梢血液中におけるＣＤ４“およびＣＤ８＋細胞の数とＰＬＦおよび全フェリチンの血清レベルとの間で行なわれた相関関係調査により、循環しているＣＤ４“細胞の数と血清ＰＬＦレベルとの間の陽性の関係（相関係数０．１７、ｐ＜０．０２）か明らかになった。ＰＬＦレベルは循環しているＣＤ４＋細胞の数の減少とともに減少した。検出できない程のＰＬＦＬか存しない最高に進行した疾患（Ｄ、Ｅ期）を有する患者の大部分は非常に低いかあるいは検出できない程のＣＤ４″″細胞しか有しないことは注目すべきである。

次に我々はＣＤ４＋リンパ球数に対する血清ＰＬＦレベル（検出できる量を有する血清中）の比率を測定した（第２図）。おもしろいことに、エイズ患者（Ｅ期）は疾患初期（Ｂ、Ｃ）の患者で観察されるより有意に高いＰＬＦ　Ｕ／ＣＤ４ ″″細胞（ｐ　＝７．８９Ｘ１０−”）比を有した（第２図）。ＰＬＦレベルとＣＤ８”細胞数との間には有意な相関関係は全く見られなかった。これらの結果は、ＰＬＦはＣＤ４＋細胞により生成され、分泌されるという考えと一致する。

対照的に、陰性の相関関係（係数−０，３、ｐ　＜０．０００１）か、正常のフェリチン濃度とＣＤ４”およびＣＤ８′″両リンパ球の数との間に見られた。全フェリチンの増加が漸進的リンパ球減少と平行しており、このことは通常のフェリチンの主要源がＨｒＶ感染リンパ球ではないことを示唆している。

３、旧■感染患者由来のリンパ球の細胞表面抗原ＰＬＦはＴ細胞に結合しそしてヒツジ赤血球ロゼツトを阻止することは以前示されているので（Ｍｏｒｏｚら、１９７７、　　Ｃ１１ｎ、　　Ｅｘｐｉｔａｌ、　　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　　２９：３０−３５；　Ｇ１１ｌｅｒら。

１９７７、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ、　３：１Ｏ１−１０５）、我々はＰＬＦを担持するリンパ球がＨＩＶ感染患者で確認されつるという可能性について調査した。第３図に示すように、種々の期（Ａ−Ｅ）にあるＨＩＶ感染患者からの循環リンパ球の３−２８％かＣＭ−Ｈ９ＭｃＡｂと反応し、従って表面ＰＬＦを示していた。また低い割合のリンパ球（０，２− ２，５％）は細胞質ＰＬＦも示した（第３図）。

予想した様に、Ｔ細胞サブセットの比率は旧Ｖ感染患者で逆であった（第■表）。

Ｔ４”　　　　　　　　　　４９；　５±９．４　　２４．７±１４．５７８” 　　　　　　　　　　２２．９±６．３　　３９．８±１３，８Ｔｌｌ”　　　　　　　　７６．２±９．７　　８１．８±９．０Ｔ１１”Ｔ４−Ｔ８−ｂ６．９±７．８　　２０．１±８．２ＰＬＦ＋ｃ０．７８±１．１７　１５．２±６．４ａ　　ＨＩＶ感染患者の数：Ａ期＝１、Ｂ期＝２、Ｃ期＝６、Ｄ期＝１、Ｅ期＝２゜ｂ　　Ｔｌｌ”細胞の％からＴ４”およびＴ８＋細胞の％の合計を引いた値。ここに示される結果は、スチューデントＴテストＣｐ＝９．７６Ｘ１０−’）により測定して有意に異なる。

ｃ　　ｐ＜１０＠。ＰＬＦ染色にはＴ細胞サブセｙト定量に用いた３５人の正常提供者のうち１５人を分析した。全旧■感染患者に関しては、金膜マーカー（ＰＬＦを含む）を同時ＭｃＡｂｓ　Ｔ４および／またはＴ８により同定されるリンノく球により、正常の被験者に比較してＨＩＶ感染患者でＴｌｌＭｃＡｂにより染色されるリンパ球の割合が有意に少ないことの説明ができる（第■表）。この観察により、Ｔ４あるいはＴ８モノクローナル抗体と反応しない増大したＴｌｌ＋集団（Ｔｌ　１”Ｔ４−７８−）の存在が明らかにされた。

この集団は正常な対照者（６，９±７．８）におけるよりもＨＩＶ感染患者における方が有意に高い（ｐ＝９．７６Ｘ１０−”）。

ＨｒＶ感染患者におケルコノサブ集団（Ｔｌ　１”Ｔ４−Ｔ８−Ｘ正常な被験者におけるよりも約１３．２％上回る）は同じ旧■感染被験者においてＰＬＦ陽性（１５，１６±６．３９％）（第■表）として同定された集団の大きさと類似する。

ＣＭ−Ｈ９ＭｃＡｂと反応する表面ＰＬＦをどのＴ細胞サブセットが担持するか解明するためにさらに実験を行なった。後期旧Ｖ感染を有する２人の被験者からのリンパ球上のＣＤ４およびＰＬＦに対する二重標識（第■表）では、ＰＬＦはＣＤ４”でないリンパ球と主に関連していることが示された。

抗−Ｔ４および抗−ＰＬＦ（ＣＭ−８９）モノクローナル抗体を使用した、ＡＩＤＳ患者からのリンパ球の二重の膜免疫染色Ｔ４”　　　　　　　　　　　４２　　　　　　　２８ＰＬＦ　”　　　　　　　　　　１３　　　　　　　１３Ｔ４”ＰＬＦ”　　　　　　　　　０　　　　　　　５染色されず　　　　　　４８５４４、　　ＨＩＶ感染患者からのリンパ球の細胞表面抗原におよぼすレバミソールの作用旧■感染患者の末梢血液リンパ球のインビトロでレバミソールて処理した場合、２種類の同時発生の現象が起った。Ｔ８　ＭｃＡｂで染色された細胞の数は約２０％増大したが、一方ＣＭ−Ｈ９陽性リンパ球（ＰＬＦにおおわれた）の数は約１５％減少した。Ｔ４＋染色細胞の数はレバミソール処理の後変化しなかった（第４図）。Ｔｌｌ”″（ＣＤ２＋）細胞の数もレバミソール処理のあと変化しなかった。

これらの結果は、ＣＤ４およびＰＬＦに特異的なＭｃＡｂで二重標識した後に得られた結果といっしょにする。と、しバミソールは膜に結合したＰＬＦの脱落を生じ、ＣＤ８”ＣＤ２″″Ｔ細胞部分のＣＤ８決定基を露出させることを示唆している。組織培養培地中における平行したインキュベーションでは同等の作用を有しなかった（第４図）。

２８、リンパ増殖性疾患を有する患者のイソフェリチン下記に詳述する例において、血清中の全フェリチンおよびＰＬＦのレベルを健康な個体およびリンパ増殖性疾患や多発性ミエローマを存する患者において測定した。正常な被験者の大部分は血清中にはＰＬＦが欠けていた。血清中のＰＬＦレベルの増大は、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）患者のみならず、ホジキンリンパ腫ならびに低度と中開度の非ホジキンリンパ腫の患者で観察された。またこれらの患者における全フェリチンも上昇していた。慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）および多発性ミエローマ患者は、正常なレベルの普通の血清フェリチンを示したが、一方血清中のＰＬＦはなかった（Ｍｏｒｏｚら。

１９８７、　　ＩＥｘｐ、　Ｈｅｍａｔｏｌ、　　１５：２５８−２６２をも参照）。

１、材料および方法１、被験者血清試料は血液学的に正常な４０人の血液銀行献血者および多発性ミエローマを有する患者のみならず、種々のリンパ増殖性障害を有する７０人の患者から得た。

慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）患者が２０人、非ホジキンリンパ腫患者が１８人、ホジキン病患者か１５人、多発性ミニローマ患者が５人そしてＡＬＬ患者が２人であった。

中程度の非ホジキンリンパ腫患者のうち、２人は末梢血液へのかかわりを存していた。非ホジキンリンパ腫を有する１人の患者およびＡＬＬを有する２人の患者はフェリチン測定に先立ち、それぞれ６包の包装された赤血球の輸血を受けた。

血清試料は追跡期間、診断時および治療中あるいは活動性疾患中に１回採取した。

ホジキン病患者だけは寛解期間中もまた血清を採取した。リンパ腫の分類は実用分類に従ってなされた（Ｋｒｕｅｇｅｒら、　　１９８３．　　Ｃａｎｃｅｒ　５２：８３３）。

２、モノクローナル抗体ＭｃＡｂ　ＣＭ−Ｇ８およびＣＭ−８９は上記第６節以下に記載されるようにしてヒトＰＬＦに対して生成された（Ｍｏｒｏｚら、　　１９８５．　　Ｃｌ１ｎ、　　Ｃｈｉｍ、　　Ａｃｔａ　１４８：１１１も参照）　、　ＭｃＡｂは５０％飽和硫酸アンモニウム溶液で沈降させた後、腹水液から得た。標準物として使用したＰＬＦは、上記したようにジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セルロースカラムで精製した後得られた（Ｍｏｒｏｚら、　１９８５．　Ｃｌ１ｎ。

Ｃｈｉｍ、　Ａｃｔａ　１４８：１１１も参照）肝臓フェリチン標準物はＭＥＬＩＳＡフェリチンキット　（Ｅｌｉａｓ　Ｍｅｄｉｚｉｎｔｅｃｈｎｉｋ。

Ｆｒｅｉｂｕｒｙ、　ＦＲＧ）から得た。２．５０ｐｇのアルカリホスファターゼ（ＡＰ）接合ＣＭ−Ｈ９ＭｃＡｂに結合するＰＬＦの量をｌ０ＬＩのＰＬＦであると見なした。

３、フェリチンの定量的測定ＭＥＬＩＳＡ市販フェリチンキットはＥｌｉｓａ　Ｍｅｄｉｚｉｎｔｅｃｈｎｉｋより得、製造業者の手引書に従って使用した。このキットで、ペルオキシダーゼ接合ポリクローナル抗ヒト肝臓フェリチンの結合を測定する。

４、　ＰＬＦおよび一般イソフェリチンに対するモノクローナル抗体ＥＬＩＳＡＶｏｌｌｅｒら（１９７５，Ｌａｎｃｅｔ　］：４２６）の改変を加えたＥｎｇｖａ　１およびＰｅｒｌｍａｎｎ（１９７２，Ｊ、　１ｍｍｕｎｏ１．１０９：１２９）の酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）を肝臓の血清中フェリチンおよびＰＬＦイソ形態（それぞれＭｃＥＬＩＳＡＡ型およびＭｃＥＬＩＳＡ　Ｂ型）を測定するためのＥＬＩＳＡをフォーマットするのに用いた。両アッセイにおいて、全てのフェリチンに結合するＭｃＡｂ　ＣＭ−Ｇ８を固相に結合させた。第２部位、ＭｃＡｂ−酵素接合反応には、ＣＭ−Ｇ８　ＭｃＡｂをＭｃＥＬｒＳＡ　Ａ型に使用しそしてＣＭ−８９ＭｃＡｂをＫｉｃＥＬＩｓＡ　Ｂ型に使用した。

Ａ型およびＢ型ＭｃＥＬＩＳＡは下記の様に行った二マイクロタイタープレートのウェルに１５０μｌのＣＭ−Ｇ８　ＭｅＡｂ（１００μｇ／−リン酸緩衝食塩水［ＰＢＳ］、　ｐＨ７，２）を被覆して４°Ｃで一夜インキユベートした。プレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ　（ＰＢＳおよび０．０５％のＴｗｅｅｎ２０）で３回洗浄しそして振り動かして乾燥した。

ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ　Ｏ，０２５％中のＭｃＥＬＩＳＡ　Ａ型で１：２にそしてＭｃＥＬＩＳＡ　Ｂ型で１＝４に希釈した試験血清（１００μβ）を二通りずつウェルに加えた。血清希釈物およびフェリチン標準物もまた二通りずつ加えた。

高フェリチン濃度を有する血清試料を、高い希釈度での回収を測定するために希釈物の中に置いた。プレートをＭｃＥＬＩＳＡ　Ａ中では４°Ｃで１時間、そしてＭｃＥＬＩＳＡ　Ｂ中では１夜インキユベートし、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し、そして１００μｌのＡＰ−ＭｃＡｂ接合体（０，４μｇ）を各ウェルに加えた。プレートを室温でさらに１２０分間インキユベートシそして再び３回洗浄した。酵素基板（ｐ−ニトロフェニルホスヘート、１■／　ｍｌジェタノールアミン緩衝液、ｐＨ８，０、および０．５　ｍｍｏｌ　ＭｇＣ１２）を加え、モして１０−３０分後に０．０５ｍ１の２ＭＮａＯＨを添加することにより反応を停止させた。発色した生成物の量は４０５μｍでの吸光度により測定した。

２、結果下記に記載する結果は、血清中のＰＬＦレベルが急性リンパ性白血病、活動性ホジキンリンパ腫および低〜中程度の非ホジキンリンパ腫のようなリンパ増殖性疾患を有する患者においては上昇していることを示している。

１、異なるＥＬＩＳＡによる肝臓フェリチン標準物の評価ＭＥＬＩＳＡ市販キットから得た肝臓フェリチン標準物を新しいＭｃＥＬＩＳＡ　Ａ型によりアッセイしそして市販のＭＥＬＩＳＡキットからのそれと比較した。１１５−５００ｎ／ｍｌの範囲の濃度における肝臓フェリチンの結合パターンは同アンセイシステムにおいて同様であった。

ＭＥＬＩＳＡキットから供給された低および高レベルのフェリチンを含有する血清試料を２種のシステムによりアッセイした。低い対照レベルのフェリチン濃度はＭｃＥＬＩＳＡ　Ａ型およびＭＥＬＩＳＡキッドでそれぞれ７０ｎｇ／ｍｌおよび５７ｎｇ／ｒＡｌであった。両方の値は、ＭＥＬＩＳＡ製造者により指定された範囲（４０−７０ｎｇ／ｍｊ）内であった。

高レベル対照のフェリチン濃度は、両システムによりアッセイして５００ｎｇ／ｒ＋＋１であった（製造者の所定の範囲は３５０−５００ｎｇ／ｍｌ）。

さらに、ＭｃＥＬＩＳＡ　Ａ型およびＭＥＬＩＳＡアッセイにより得られたフェリチン結果間の相関関係を検べた。すなわち、１１０−１５０ｎ／ｍｊ’）の範囲にわたる正常の献血者からの２２血清および５５０−４００ｎ／ｍｊ’の範囲にわたる癌患者からの２１血清を検査した。正常な範囲の相関係数は０．９８で、回帰等式はｙ＝１．０５±８．１であった。高い範囲において、相関係数は０．９６７、回帰等式はｙ＝１．３７±２１、０９であった。

この結果は、ＡＰ接合ＣＭ−Ｇ８　ＭｃＡｂを使用したＭｃＥＬＩＳＡＡ型は血清中の肝臓型フェリチンの正常レベルの定量的測定に好適であることを示している。しかしながら、高い範囲におけるフェリチン測定では、ＭＥＬ［ＳＡによるよりもＭｃＥＬＩＳＡ　Ａ型により高い量が計測された。

２、　ＣＭ−Ｇ８およびＣＭ−Ｈ９ＭｃＡｂに対する胎盤および肝臓フェリチンの結合胎盤および肝臓フェリチンの両方共ＡＰ−ＣＭ−Ｇ８　ＭｃＡｂの接合体を使用したＭｃＥＬＩＳＡ　Ａ型で測定した。これら２種のイソフェリチンの同様な結合パターンが３０−８００１ｇ／ｍ！！の濃度範囲で観察された。この結果は、我々の新しく開発したＭｃＥＬＩＳＡ　Ａ型は肝臓およびＰＬＦイソフェリチン両方の測定に好適であることを示している。

それとは対照的に、ＰＬＦの詳細な測定はλ１ｃＥＬＩｓＡ　Ｂ型が使用された場合のみ可能であった。

ＭｃＥＬＩＳＡ　Ｂ型におけるＰＬＦに対するＡＰ−接合ＣＭ−）１９ＭｃＡｂの結合は２．５から２０単位の濃度範囲では直線状であるが、一方１００から８００ｎｇ／ｍ１の濃度範囲における肝臓フェリチンはＡＰ接合ＣＭ−Ｈ９ＭｃＡｂと結合しなかった。

これらの結果はＰＬＦの検出に関するＭｃＥＬＩＳＡ　Ｂ型の特異性を示している。

３、健康個体およびリンパ増殖性疾患を有する患者の血清中のイソフェリチン健康個体およびリンパ増殖性疾患を有する患者から得たイソフェリチンのアッセイ結果を第７表に示す。

（この頁以下余白）健康個体、およびリンパ増殖性疾患および多発性ミエローマを有する患者中のイソフェリチン起源および診断　ユ　フ籾チン（ｎｇ／ｍｌ”）　　　ＰＬＦ（Ｕ／ｍｌ）血液銀行献血者　４０　　８５．３±６５．９　　　８．１±１４．８男性　　２４１０８．０±５８．０　１０．０±１０．０女性　　１６　５０．３±５９．８　４．５±７．７ＣＬし　　　　　　２０　　６６．３±３３．０　　　６．３±１３．５ＡＬＬｂ　　　　　　　　　２　　６００．０±　Ｏ” 　　　　１４０．０±８４．８”多発性ミニ叶？　　　　５　　６８．５±３９．２　　　　０ネジキンリンパ腫活動性　　　　５　３５９．０±２３６．０”　　４７．０±４３．０”寛解期　　　　１０　　９５．１±４６．７　　１５．３±１９．３非ネジキンリンパ腫低度　　７２１８．３±１８６．９°　９７．ｌ±３９．０”中開度　　　　９　２７２．８±１８０．８”　　４１．９±３５．８”高度　　２３８０±３１１６±８．５ａ慢性リンパ性白血病す急性リンパ性白血病スチューデントｔテストによると血液銀行献血者とは有意に異なる”ｐ＜０．０２５；　　”ｐ　＜０．００５゜ＭｃＥＬＩＳＡ　Ａ型により健康個体の血清中で計測されたフェリチンの平均濃度は８５．３±６５．９ｎｇ／ｍ　４７であった（第７表）。平均フェリチン濃度は、女性（５０，３±５９．８ｎｇ／ｍｊｌ ’）よりも男性（１０８±５８ｎｇ／ｍ１）において高かった。

存意に高いフェリチンレベル（ｐ　＜　０．０２５）は下記の悪性疾患に罹患している患者の血清で測定された。すなわち、ホジキンリンパ腫（３５９±２３６ｎｇ／Ｍ）および低度と中開度の非ホジキンリンパ腫（それぞれ２１８．３±１８６、９および２７２．８±１８０．８８ｎｇ／ｍｊ）、ならびにＡＬＬ患者２人（６００±Ｏｎｇ／ｍｊ’）。寛解期のホジキンリンパ腫患者の血清は、健康個体のそれらと同様な平均フェリチンレベル（９５，１±４６．７ｎｇ／ｍｌ）を示した。ＣＬＬ患者および多発性ミエローマ患者は正常なフェリチンレベルを示した（それぞれ６６．３±３３および６８．５±３９．２ｎｇ／ｍｌ）。

ＭｃＥＬＩＳＡ　Ａ型で測定した個々のフェリチン濃度を第５図に示す。

ＭｃＥＬＩＳＡ　Ｂ型により測定した健康個体の血清中におけるＰＬＦの平均血清濃度は８．１±１４．３０／−であった（第７表）。女性（４，５±７．７　Ｕ／ｍｔ’）より男性（ＩＯ＋１００／ｒｎｌ）血清中においてより高い濃度が測定されたが、これらは統計学的に意味はない。検査した血清の７０％が検出できる程のＰＬＦを全く含有してなかったことに注目すべきである。正常（ｐ　＜　０．０２５）より有意に高い濃度のＰＬＦはホジキン病患者（４７±４３ｎｇ／ｍｌ）および低度と中開度の非ホジキンリンパ腫患者（それぞれ９７．１±３９および４１．９±３５．８０／ｍｌ）の血清中で測定された。寛解期のホジキンリンパ腫患者は、健康個体（１５，３±１９．３０／ｍｊ）のそれとは有意に異ならない血清ＰＬＦレベルを存した。またＡＬＬの２人の患者（８０−２０００／ｍ１の範囲）でも高いＰＬＦレベルが測定された。全くないかあるいは非常に低いＰＬＦ濃度は多発性ミエローマ（０）およびＣＬＬ　（６，３±１３．５０／ｍｌ）の患者の血清中で見られ、ＣＬＬ患者の血清の８５％は完全に陰性であった。ＰＬＦの血清濃度の個々の分布を第６図に示す。

２９、自己免疫状態におけるイソフェリチンＰＬＦの血清レベルを、種々の自己免疫状態を存すると診断された患者に由来する貯蔵した試料から回顧的に測定した。第８図に示す結果は、血清ＰＬＰレベルは、多発性硬化症、重症筋無力症およびリウマチ性関節炎を有すると診断された患者において高まっていたことを示している。これら自己免疫状態のそれぞれは免疫不全を特徴とする。

３０、ハイブリドーマの寄託下記ハイブリドーマをフランスのＣｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　Ｎａｔｉｏｎａｌｅｄｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ　ｄｅ　Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅＰａｓｔｅｕｒ　ｉｎ　Ｐａｒｉｓに寄託しそして以下に示される受託番号を得た：ハイブリドーマ　　受託番号ＣＭ−Ｈ９１−２５６本発明は寄託されたハイブリトーマまたは本発明の一局面のひとつの説明として意図される実施例に開示される実施態様によって範囲を限定されるものではなく、そして機能的に同等の任意のハイブリドーマおよび方法は本発明の範囲内にある。事実、ここに示したり記載したことに加え本発明の種々の改変が前出の記載から当業者には明らかであろう。かかる改変は本発明の範囲に該当することが意図される。

（この頁以下余白）ＦＩＧ、ＩＢｎｓ４０　　　　　　　　ｎ５２４　　　　ｎ！４９　　　　ｎ”２５　　　　ｎ冨３７　　　　ｎ−”ＡＦＩＧ、ＩＡ祷Ｘエイス、町・右０イ屑Ｊ釆丁細月色丁ブじットコ ■ ＰＬＦ　　葦位　／ｍｌ月参層インフムワナン　　（４’＋ｆＬ＞国際ｖ４査報告１ｍＩｅｔＭＩ噂１１耐＾９１＋（ａ１４ｍＮＩ１．ｏｒ’ｐｒｌＴＩＣＱＱＩＱｎＱＭ

Claims

【特許請求の範囲】

１．（ａ）患者から血液試料を得ること、および（ｂ）血液試料中の胎盤イソフェリチンの濃度を測定すること、を含んでなり、胎盤イソフェリチンの濃度上昇が免疫抑制の初期段階と相関関係にある、免疫抑制の診断および予知の方法。
２．血液試料が血清からなる請求の範囲１記載の方法。
３．血液試料が末梢リンパ球からなりそして末梢血液リンパ球表面に結合した胎盤イソフェリチンの濃度が測定される請求の範囲１記載の方法。
４．（ａ）患者から血液試料を得ること、および（ｂ）血液試料中の胎盤イソフェリチンの濃度を測定すること、を含んでなり、試料中の胎盤イソフェリチンの濃度上昇が初期段階疾患を示すものである、ＨＩＶ感染に関連した後天性免疫不全の予知および病期判定のための方法。
５．血液試料が血清試料からなる請求の範囲４記載の方法。
６．血液試料が末梢血液リンパ球からなり、そして末梢血液リンパ球の表面に結合した胎盤イソフェリチンの濃度が測定される請求の範囲４記載の方法。
７．（ａ）患者から血清試料および末梢血液リンパ球試料を得ること、（ｂ）（ｉ）血清試料中の胎盤イソフェリチンの濃度および（ｉｉ）末梢血液リンパ球試料中のＣＤ４＋リンパ球の数を測定すること、そして（ｃ）末梢血液リンパ球試料におけるＣＤ４＋リンパ球の数に対する血清試料中の胎盤イソフェリチンの濃度の比率を測定すること、を含んでなり、この比率の増大は疾患の進行を示すものである、ＨＩＶ感染に関連した後天性免疫不全の予知および病期判定のための方法。
８．（ａ）患者から血清試料を得ること、および（ｂ）血清試料中の胎盤イソフェリチンおよび成人フェリチンの濃度を測定すること、を含んでなり、ここで（ｉ）試料中における胎盤イソフェリチンの血清濃度上昇および成人フェリチンの正常血清濃度は初期疾患を示し、一方（ｉｉ）試料中の胎盤イソフェリチンの正常血清濃度および成人フェリチン血清濃度上昇は後期疾患を示すものである、ＨＩＶ感染に関連した後天性免疫不全の予知およ病期判定のための方法。
９．試料中の胎盤イソフェリチンの濃度が、（ａ）試料を胎盤イソフェリチン特異的抗体と接触させること、および（ｂ）試料に結合する抗体の量を測定すること、を含んでなる成人フェリチンと交差反応しない胎盤イソフェリチン特異的抗体を用いるイムノアッセイにより測定され、試料に結合した抗体の量が試料中の胎盤イソフェリチンの量と相関関係にある、請求の範囲１，２，３，４，５，６，７または８記載の方法。
１０．抗体が、ＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎＮａｔｉｏｎａｌｅｄｅＣｕｌｔｕｒｅｓｄｅＭｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓに寄託され、受託番号Ｉ−２５６を有するハイブリドーマ細胞系ＣＭ−Ｈ９により産生されるモノクローナル抗体からなる請求の範囲９記載の方法。
１１．胎盤フェリチン濃度が、２．５ピコグラムのモノクローナル抗体ＣＭ−Ｈ９と結合する胎盤イソフェリチンの量が１０単位であると定義さ、れる単位で測定される請求の範囲１０記載の方法。
１２．胎盤イソフェリチン特異的抗体が、（ａ）試料中の胎盤イソフェリチンが固定化された相上に捕捉されるように、試料を胎盤イソフェリチンに特異的な固定化抗体と接触させること、（ｂ）固定化相からすべての未結合試料を除去すること、（ｃ）胎盤イソフェリチンに特異的な抗体に結合されたシグナル生成性成分を含有する接合体を固定化相に加えること、（ｄ）固定化相から未結合接合体を全て除去すること、そして（ｅ）固定化相に結合する接合体の量を測定すること、を含んでなり、固定化相に結合した接合体の量が試料中に存在する胎盤イソフェリチンの量と相関関係にある、サンドウィッチイムノアッセイ系に配置されて使用される請求の範囲９記載の方法。
１３．胎盤イソフェリチン特異的抗体がＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎＮａｔｉｏｎａｌｅｄｅＣｕｌｔｕｒｅｓｄｅＭｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓに寄託され、受託番号Ｉ−２５６を有するハイブリドーマ細胞系ＣＨ−Ｈ９により産生されるモノクローナル抗体からなる請求の範囲１２記載の方法。
１４．試料中の胎盤イソフェリチンおよび成人フェリチンの濃度が、（ａ）試料を（ｉ）成人フェリチンと交差反応しない胎盤イソフェリチンに特異的な第１の抗体、および（ｉｉ）成人フェリチンと反応する第２の抗体と接触させること、そして（ｂ）試料に結合する第１の抗体量および第２の抗体量を測定すること、を含んでなる少なくとも２種の抗体を使用するイムノアッセイにより測定され、試料に結合する第１の抗体の量が試料中に存在する胎盤イソフェリチン量と相関関係にあり、そして試料に結合する第２の抗体の量が試料中に存在する成人フェリチン量と相関関係にある、請求の範囲８記載の方法。
１５．抗体が、（ａ）試料を、試料中のフェリチンの全イソ形態物が固定化相上に捕捉されるように、胎盤イソフェリチンおよび成人フェリチンの両方と交差反応する固定化された第２の抗体と接触させること、（ｂ）固定化相からすべての未結合試料を除去すること、（ｃ）（ｉ）胎盤イソフェリチンに特異的な第１の抗体または（ｉｉ）胎盤イソフェリチンおよび成人フェリチンの両方と交差反応する第２の抗体、のいずれか一方に接合されたシグナル生成性成分を含有する接合体を固定化相に加えること、（ｄ）固定化相からすべての未結合接合体を除去すること、そして（ｅ）固定化相に結合した接合体の量を検出すること、を含んでなるサンドウィッチイムノアッセイ中に配置して使用され、（ｉ）固定化相に結合した第１の抗体接合体の量が試料中に存在する胎盤イソフェリチンの量と相関関係にあり、そして（ｉｉ）固定化相に結合した第２の抗体接合体の量が試料中に存在する成人フェリチンの量と相関関係にある、請求の範囲１４記載の方法。
１６．（ａ）第１の抗体がＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎＮａｔｉｏｎａｌｅｄｅＣｕｌｔｕｒｅｓｄｅＭｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓに寄託され、受託番号Ｉ−２５６を有するハイプリドーマ細胞系ＣＭ−Ｈ９により産生されるモノクローナル抗体からなり、そして（ｂ）第２の抗体がハイプリドーマ細胞系ＣＭ−Ｇ８より産生され、胎盤イソフェリチンおよび成人フェリチンの両方と交差反応するモノクローナル抗体からなる請求の範囲１４または１５記載の方法。