WO2005093415A1

WO2005093415A1 - アポリポタンパク質ｂ－４８の測定方法およびその用途

Info

Publication number: WO2005093415A1
Application number: PCT/JP2004/004434
Authority: WO
Inventors: Masaaki Kojima
Original assignee: Shibayagi Co., Ltd.
Priority date: 2004-03-29
Filing date: 2004-03-29
Publication date: 2005-10-06
Also published as: CN1957255A; US20070207505A1; EP1744159A1; JPWO2005093415A1; EP1744159A4

Abstract

　この発明は、検体をトリス緩衝剤および必要に応じて添加される界面活性剤で希釈し、この希釈検体に抗アポＢ−４８モノクローナル抗体を反応させてアポＢ−４８を測定することからなるアポＢ−４８測定方法およびそれに使用するアポＢ−４８測定用キットを提供する。これによって、特に血液中のアポＢ−４８を正確に、迅速にかつ簡便に測定することができる。　また、この発明のアポＢ−４８測定方法および/またはそれに使用するアポＢ−４８測定用キットはアポＢ−４８関連疾患を診断するとともに、血液中のアポＢ−４８を増減させる高脂血症治療薬成分並びに機能性食品成分の効能評価にも応用できる。

Description

アポリポタンパク質 B— 48の測定方法およびその用途技術分野

この発明は、アポリポタンパク質 B— 48の測定方法およびその用途に関するものである。更に詳細には、この発明は、アポリポタンパク質 B— 48の測定方法ならびにアポリポタンパク質 B— 48測定用キットまたはそれらを用いたアポリポタンパク質 B— 48関連疾患の診断方法ならびに血液中のァポリポタンパク質 B— 48を増減させる高脂血症治療薬成分並びに機能性食品成分の効能評価法に関するものである。背景技術

現在、日本人の死因は、心疾患と脳血管疾患、いわゆる動脈硬化性疾患が、悪性新生物 (がん）に次いで多ぐ動脈硬化の予防ならびに治療により、この動脈硬化性疾患による死亡率を低下させることは、高齢化社会における国民健康の上からも急務である。

ところが、動脈硬化性疾患は、必ずしも確実で効果的な診断法も治療法も確立されていないのが現状であるところから、確実でかつ有効な診断法ならびに治療法の開発が待望されている。しかしながら、この動脈硬化性疾患の発症の原因は、一様ではなぐ高脂血症、高血圧症、糖尿病、肥満、喫煙、遺伝、加齢など実に多くの要因が関係していることが明らかになっている。その中でも、最大の危険因子といわれているのが、高脂血症である。

高脂血定は、全身の血管に動脈硬化を発症させ、動脈硬化が進展すると、血液の流れが悪くなリ、各種臓器 Iこ障害が発生する。この動脈硬化が心臓血管 (冠動脈)に発症すると、虚血性心疾患 (狭心症や心筋梗塞)の原因となり、脳血管に発症すると、脳血管疾患 (脳梗塞)の原因となる。

高脂血症とは、血液中の脂肪、特にコレステロールと中性脂肪（トリグリセリド)などの脂質が過剰に存在している状態である。コレステロールとトリグリセリド（中性脂肪）は、そのままでは水分が大半を占める血液中には溶け込むことができなし、。そこで、コレステロ一ルと中性脂肪は、球状のリポタンパク質という粒子に形を変えて血液中に溶け込んでいる。このリポタンパク質は、その表層が親水性のリン脂質、遊離コレステロール、アポタンパク質から構成され、その内部の核層には、疎水性のコレステロール（多くはエステル型コレステロール）とトリグリセリド（中性脂肪）とが存在している。これらの脂肪は、体内の細胞膜を構成するとともに、ステロイドホルモンなどの材料として元来重要な役割を担っている。しかしながら、血液中の脂肪、特にコレステロールと Jグリセリドとが過剰に存在すると、高脂血症の原因となる。

高脂血症などにより動脈硬化力《起こると、体内を循環する血液中に存在するコレステロールやトリグリセリド（中性脂肪)を構成しているリポタンパク質のうち、血管内壁へのコレステロールの沈着促進または沈着防止に関与する種々のリポタンパク質が増減する。これらのリポタンパク質の血中量を正確に測定することができれば、高脂血症や動脈硬化症の診断および治療に役立てることができることになる。

ところで、血液中のリポタンパク質は、血清脂質とアポリポタンパク質とが結合してできていて、血清脂質の運搬体としての役割を果たしている。

また、リポタンパク質は、その脂質構成などによって比重や粒子サイズが異なり、一般的には、力イロミクロン (CM)、超低比重リポタンパク質 (VLDし)、中間比重リポタンパク質 (ェ DL)、低比重リポタンパク質（LDL)、高比重リポタンパク質（HDL)の 5種類に分けられる。このリポタンパク質は、この順に比重が重くなリ、粒子の大きさはこの順に小さくなつている。また、これらのリポタンパク質は、コレステロールと中性脂肪（トリグリセリド TG)との割合がそれぞれ異なっており、大きい粒子では中性脂肪の割合が多より、小さい粒子ではコレステロールの割合が多くなつている。

これらリポタンパク質のうち、カイロミクロン（CM)は、トリグリセリド（中性脂肪）が主成分であり、食物由来のトリグリセリドゃコレステロールから合成され、小腸から産生分泌される。また、 CMは、胸管リンパ管を経て血液中に分泌され、リポタンパクリパーゼ（LPL)により、トリグリセリドが分解されてその粒子力小さぐより、コレステロールに富んだカイロミクロンレムナント（CM— R)になる。このカイロミクロンレムナントは、アポリポタンパク質 Eを介して肝臓に取り込まれる。このように、カイロミクロン (CM)は、外因性 (食事由来）トリグリセリドを脂肪組織や筋肉に運搬するとともに、コレステロールを肝臓に運搬する役目を果たしている。

超低比重リポタンパク質 (VLDL)も、卜リグリセリド（中性脂肪)が主成分であり、肝臓と小腸で生成され分泌された後、主に内因性の脂質、つまり、肝細胞で合成された内因性トリグリセリドと内因性コレステロールとを肝臓から血液中に運搬する。 VLDLは、その 1部は直接組織に取り込まれる力そのほとんどはリボタンパクリパーゼ（LPL)によってそのトリグリセリドが分解されて中間比重リポタンパク質（IDL=VLDLレムナント）になる。

この中間比重リポタンパク質 (IDL)は、アポリポタンパク質 Eを介して肝臓に取り込まれ、リパーゼによって分解されて低比重リポタンパク質 (LDL)になる。

この低比重リポタンパク質（LDL)は、上記したように、超低比重リポタンパク質 (VLDL)から中間比重リポタンパク質 (IDL)を介して代謝されて生成される。 LDLは、コレステロールが最も多く含まれていて、約 40%がコレステロールで構成されていて、主としてコレステロールを肝臓を始めほとんど全ての組織に供給している。この LDLは、粒子が小さいことから、動脈壁を透過しやすいという性質を持っている。動脈壁中に透過した LDLは、血液中とは異なって、非常に酸化されやすくなつて、酸化 LDLになる。この酸化 LDLが動脈硬化発症の引き金として作用している。したがって、動脈硬化の予防-治療には、コレステロールの量を減らすとともに、この酸化から守ることが重要と考えられるようになった。

他方、高比重リポタンパク質（HDL)は、主に小腸と肝臓で生成されるほ力、、カイロミクロン（CM) や超低比重リポタンパク質 (VLDL)がリポタンパクリパーゼの作用を受けて異化される過程でも生成される。この HDLは、末梢組織の細胞での余剰なコレステロールや動脈壁に蓄積したコレステロ —ルを回収して肝臓に運搬して異化する役目を果たしている。したがって、この HDLの量を増やすことは、高脂血症を改善することになリ、動脈硬化の予防'治療に繋がることになる。

ところ力最近では、空腹時の脂質レベルのみでは、動脈硬化のリスクを評価するには不十分であることが明らかとなってきている。この食後の脂質レベルによって動脈硬化のリスク、つまり食後高脂血症の評価が必要であると考えられている。

食後に増加する脂質としては、トリグリセリド (TG)がある。高 Jグリセリド血症は、 TGを豊富に含むリポタンパク質、つまり、 TGリツチリポタンパク質であるカイロミクロン（CM)、超低比重リポタンパク質 (VLDL)および代謝物であるレムナントリポタンパク質の増加による。この高トリグリセリド血症の原因となる 3つのリポタンパク質の内、レムナン Jポタンパク質が動脈硬化の危険性評価をする場合には最も重要と考えられている。

つまり、小腸で産生され食事由来の外因性 TGを豊富に含んでいるカイロミクロン（CM)は、リポタン / クリノ一ゼ (LPL)により分解され CMレムナントになり、肝臓でァポリポタン/ ク質 Eを認識するレムナントレセプターに取り込まれ処理される。

今のところ、食物由来の循環中の外因性脂質の結合体、つまリカイロミクロンならびにカイロミクロンレムナントと、肝臓から分泌された内因性脂質の結合体、つまり超低比重リポタンパク質 (VLDL) ならびに低比重リポタンパク質（LDL)とを識別する簡単で、再現性ある迅速なアツセィ法は存在してし、なし、（Lovegrove , J. A . , et al .： Biochim. et Biophy . Acta , 1301 (1996) 221-229) o

しかし、カイロミクロン (CM)と超低比重リポタンパク質 (VLDL)は食事の前後では大きな変動は認められない。これに対して、このレムナン Jポタンパク質は、カイロミクロン（CM)と超低比重リポタンパク質 (VLDL)力リボタンパクリバ一ゼ（LPL)によって、そのトリグリセリドが分解代謝されて生成する代謝産物 (CMレムナントと VLDLレムナント)であり、健常人では肝細胞などによって速やかに吸収分解される。したがって、このレムナントリポタンパク質は、食後には増加するものの空腹時血中には存在していない。しかし、このレムナントリポタンパク質は、代謝異常や、過食'運動不足などにより代謝が遅くなリ、食後の血液中に停滞すると、動脈壁のマクロファージに容易に取り込まれ、動脈硬化の初期病変の原因となると考えられている。このレムナントリポタンパク質は、レムナント様リポタンパク質（remnant-like particles： RLP) と呼ばれていて、食後高脂血症を構成する重要な因子であると考えられている。

—方、このレムナント様リポタンパク質を構成するタンパク質成分としてアポリポタンパク質 (アポタンパク質）が存在する。このアポタンパク質は、水に不溶性の脂質 (エステル型コレステロール、中性脂肪など)に結合して脂質を血液中に溶解しやすくして運搬する役目を持っているとともに、アポタン/ ク質自体も各種の脂質代謝に深く関与している。かかるアポタンク質として、アポタン/ ク質 A— I、アポタンパク質 A— II,アポタンパク質 B、アポタンパク質 C—I、アポタンパク質 C一 II、アポタンパク質 Eなど現在 1 0数種類が存在していることが確認されている。

このうち、アポタン/ ク質 Bにはアポタン/ ク質 B— 1 00 (アポ B— 1 0O)とアポタンク質 B— 48 (アポ B— 48)の 2種類がある。前者は肝臓で合成される。ヒト血漿 VLDLの主要なタンパク質成分であり、その合成ならびに分泌に重要な役割を果たしている。後者は小腸で産生され、カイロミクロン（CM)の合成に関与しているアポ B— 48とがある。アポ B— 1 00は、超低比重リポタンパク質 (V LDL)中に存在するタンパク質の約 40 60%を、また低比重リポタンパク質（LDL)の約 98%を占めてし、る (Mahley , R . W . , et al : J . (1984 ) Lipid Res . 25 , 1277 -1294 )。また、アポ B— 48は、ヒト血中にあって高脂血症と密接に関連しているリポタンパク質の構成タンパク質であり、その測定が正確に可能であれば、高脂血症や動脈硬化症の診斷及び治療に有用である。ところ力アポ B— 48は、肝臓によって分泌されたアポ B— 1 00の N末端アミノ酸配列と 48%が同一のアミノ酸配列を有していて相同性が非常に高いので、アポ B— 48と、アポ B—1 00とは正確に区別することが非常に困難である（Lovegrove , J . A . , et al . : ibid)

このように、このレムナントリポタンパク質は、動脈硬化の危険因子であることは知られていた力その測定が容易でなかったために、実際の臨床検査には長年利用されてこなかった。これまでの測定法としては、密度で分ける超遠心分離法や、荷電で分けるァガロース電気泳動法、またサイズで分ける電気泳動法や、アポタンパク質に対する抗体を使用したリポタンパク質を測定する方法などがあるが、これらはいずれも測定が困難であつたり、定量性に欠けたり、または特異性がないなどの理由により、実用的ではなかった。

し力、しな力《ら、レムナント様リポタンパク質（RLP)自体を正確に測定することは非常に難しい。そこで、レムナント様リポタンパク質（RLP)の血中濃度を、そのレムナン卜タンパク質中に存在するコレステロール、つまり、レムナント様リポタンパク質コレステロール（remnant-like particles-cholesterol： RLP-C) として ί則定する方法力開発された。

この RLP—C測定法は、抗アポ Α—Ιモノクローナル抗体と抗アポ Β—1 00モノクローナル抗体とを用いて、アポ Α—Ιとアポ Β—1 00とを上記モノクローナル抗体に結合させて除去して、上清中に残存する未結合リポタンパク質の量をコレステロールの量として測定するものである。つまり、アポ A — Iは CM HDLの主要なアポタンパク質として存在し、またアポ B— 1 00は VLDし VLDLレムナント、 LDLの主要なアポタンパク質として存在するところから、抗アポ A—Iモノクローナル抗体には、 C Mと HDLとが結合し、抗アポ B— 1 00モノクロ一ナル抗体には、 nascent (原始型） VLDL (又は V LDL-2 )と LDLとが結合することになる。し力、し、この抗アポ B_ 1 00モノクローナル抗体は、アポ B— 1 00の特定アミノ酸領域を特異的に認識するものであり、アポ B— 1 00のアミノ酸配列の 1部からなるアポ B— 48を認識しなし、。したがって、 RLP— C測定法では、アポ B— 48含有カイロミクロンと APO— E rich VLDLが測定される。

しかしながら、この RLP— C測定法は、吸着除去操作が必須であり、作業が煩雑であるとともに、完全な吸着が必要であるところから測定操作に熟練が要求される。

上記したように、アポ B— 48は、 CMと CMレムナントにアポタンパク質として含有されている。 C Mは、食後速やかにリポタンパク質リパーゼにより CMレムナントに変換されるので、空腹時等においては、血中に CMは存在しない。した力て、 CMレムナントに含まれるアポ B— 48のみの量を正確に測定することができれば、より確実な高脂血症の診断が可能となり、動脈硬化症の診断および治療に大いに役立つものと考えられる。アポ B— 48だけを特異的に認識できる抗アポ B— 48モノクローナル抗体が開発できれば、血中に含まれる CMレムナントのみの量を直接測定することができると考えられる。

かかる測定方法の 1つとして、食後高脂血症を定量的に診断するためにアポ B— 48モノクロ一ナル抗体を用いた ELISA測定方法が報告されている（木下誠ら、「アポ B— 48含有リポ蛋白の測定法の開発」、第 30回日本動脈硬化学会総会抄録集（ 1 999年 6月 1 1一 1 2曰）、 1 33頁）。この方法は、アポ B— 48を特異的に認識するモノクロ一ナル抗体 (4C8)を作成し、それを用いたプレー卜に 2%SDSを含む PBSで希釈した血清を添加して、アポ B— 48含有リポ蛋白を測定することからなっている。し力、しながら、 2%SDS中では血清中のアポ B— 48を測定できず、 SDSは、逆に免疫反応を阻害するため、アポ B— 48のェピトープを露出させるための界面活剤として好ましくないとの記載がある（日本国特許 P3440852、第 8欄、 7— 9頁）。

また、抗アポ B— 48モノクローナル抗体を用いた別の測定方法として、換体を、非イオン性界面活性剤および陰イオン性界面活性剤としてのデォキシコール酸ナトリウムから選択される界面活性剤による処理または凍結融解処理してェピトープを露出させるための処理後、該検体と、実質的なアポ B— 1 00には反応せず、アポ B— 48を特異的に認識するモノクロ一ナゾレ抗体とを反応させることを特徴とするアポ B— 48および'またはアポ B— 48含有リポ蛋白の免疫測定方法からなっている (日本国特開 P2003— 270247 A)。

また、この特許記載の方法では、各種界面活性剤を含む PBSで血清を希釈し、この希釈血清にアポ B— 48を特異的に認識するモノクローナル抗体 B48— 1 51 (同特許、第 1 2欄、第 30— 38 行）を添加して、アポ B—48C末ェピトープが露出されているかどうかを判断している。その結果、界面活性剤が含まれていない場合には、上記ェピトープは露出しておらず、全く発色していないのに対し、トライトン™X— 1 00、トライトン™X— 1 1 4、ツイ一 ™— 20、 NP^TM— 40などの非イオン性界面活性剤を使用した場合には、強い発色が認められ、アポ B—48C末ェピト一プが露出されていると判断している（同特許、第 1 4欄、第 1 2— 26行)。

そこで、本発明者らは、アポ B— 48をより正確に測定することができる更に別のアポ B— 48の測定方法を開発すべく種々検討した結果、アポ B— 48をより正確に測定することができるアポ B—48 測定方法を見出して、この発明を完成した。発明の開示

したがって、この発明は各種界面活性剤を必ずしも使用しない測定方法である。トリス緩衝液で希釈した検体を、抗アポ B— 48モノクローナル抗体を用いてアポ B— 48を測定することからなるアポ B— 48測定方法を提供することを目的としている。

また、この発明は、上記アポ B— 48測定方法に利用することができるァ B— 48測定用キットを提供することを目的としている。

この発明の好ましい態様としては、更に界面活性剤を使用することからなるアポ B— 48測定方法およびアポ B— 48測定用キットを提供することを目的としている。

更に、この発明は、上記アポ B— 48測定方法またはアポ B— 48測定用キットを使用して、アポ B —48を正確にかつ迅速簡単に測定することにより、アポ B— 48が関連している各種疾患を診断もしくは治療する方法を提供することを目的としている。

また、アポ B— 48測定用キットを用いて、高脂血症治療薬成分並びに機性食品成分の効能評価方法を提供することを目的としている。発明を実施するための最良の形態

この発明に係るアポ B -48測定方法は、トリス緩衝剤で希釈した検体を、抗アポ B— 48モノクローナル抗体を用いてアポ B— 48を測定することからなる方法である。

この発明に使用することができるモノクローナル抗体は、アポ B— 48の C末端からのアミノ酸配列の 1部を特異的に認識することができる抗アポ B— 48モノクローナル抗体であればいずれも使用することができ、例えば、上記抗アポ B— 48モノクローナル抗体 (4C8)を使用することができる。これらのモノクローナル抗体は、いずれも当業者に周知の慣用方法によって製造することができる。

—方、この発明に使用することができるリス緩衝剤としては、この発明の目的を適うものであればいずれも使用することができ、例えば、トリス（2—アミノー 2—ヒドロキシメチル一 1 , 3—プロパンジオール'トリス）、トリス一塩酸緩衝液（トリス（ヒドロキシメチル)ァミノメタンヒドロクロリド） (pH7. 2 -9. 0)、トリスーマレイン酸緩衝液（トリス（ヒドロキシメチル)ァミノメタンマレエ一ト）（pH5. 2-8. 6)などが挙げられる。また、この発明に使用できるトリス緩衝剤は、 Good ' s buffer (グッドバッファ一）に分類されるものであって、例えば、 MES、 Bis - tris、 ADA, Bis - trisプロパン、 PIPES, AC ES、 MOPSO、コラミンクロリド、 BES、 MOPS, TES、 HEPES、 DIPSO、 TAPSO、 POPSO、 H EPPSO、 HEPPS (EPPS)、Tricine、 Bicine、グリシンアミドなど力挙げられる。

かかるトリス緩衝剤の使用濃度は、その種類などによって適宜変することができるが、例えば、トリス一塩酸緩衝液を使用する場合は、 10mM〜0 · 5Mの範囲であるのが好ましい。

この発明に係るアポ B— 48測定方法においては、界面活性剤を用いる必要はないが、所望によリ、界面活性剤を使用することもできる。かかる界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤が好ましぐトライトン X— 1 00™、トライトン X— 1 14™、ツイーン一20™、 NP— 40™などが例示される。これらの界面活性剤は、単独でも、または混合しても用いることができる。

かかる界面活性剤は、ェピトープを露出させ易くするために用いるものであるが、一般に界面活性剤は免疫反応を阻害するので、ェピト一プの露出効果と免疫反応の阻害作用とのバランスによつて使用濃度を適宜選択することができる。上記界面活性剤は、検体とモノクローナル抗体との免疫反応を行う際の溶液に共存させることもでき、通常 0. 01 %~2%、好ましくは 0. 02%〜0. 5%の濃度で使用するのがよい。上記界面活性剤の処理温度および処理時間は、特に限定されるものではなぐ例えば、通常 4°C〜40°Cの温度で約 5分〜 48時間の範囲であるのがよい。

なお、この発明においては、リポタンパク質のェピトープを露出させるために、検体を凍結融解を繰り返すことも可能であり、この凍結融解処理を行なう場合には、 1回以上行うのがよい。

ここで、この発明に係るアポ B— 48測定方法について更に詳細に説明する。ただし、下記の説明は、この発明を限定するために記載するものでは一切なぐこの発明を具体的に説明するための単なる例示であるものと理解すべきである。したがって、この発明は、下記説明に一切限定されるものではないと理解すべきである。

この発明のアポ B— 48測定方法は、例えば、検体を Jス緩衝剤で希釈し、この希釈検体を抗ァポ B— 48モノクローナル抗体（4C8)IgG精製品を固相化したプレートに添加して、その検体に含まれているアポ B— 48を結合させ、抗アポ B— 48/アポ B— 1 00—ビォチン標識抗体を結合させ、更にアビジン結合西洋ヮサビパ一ォキシダ一ゼ (HRP)を結合させた後、 ELISA法によってアポ B— 4 8を測定することから構成されている。

このアポ B— 48測定方法では、まず、検体としての血清に、例えば、 0. 1 Mトリス塩酸 (ρΗ7· 8) を添加して血清サンプルを調製する。この血清サンプルを、抗アポ Β— 48モノクローナル抗体（4C 8)IgG固相化 96穴プレートに添加して、所定時間反応させて、血清サンプル中のアポ B— 48と抗アポ B— 48モノクローナル抗体（4C8)とを結合させる。その後、抗ァポー 48/B— 1 00—ビォチン標識抗体を添加して、所定時間反応させて、上記標識抗体を結合させる。更に、アビジン結合 HRP などのアビジン結合パーォキシダーゼを反応させて、上記標識抗体に結合させる。その後、テトラメチルベンチジン (TMB)などの発色基質と反応させ、硫酸などの反応停止剤で反応停止させて、 45 Onmでの発色吸光を測定する。

この発明に係るアポ B— 48測定方法は、 ELISAによるィムノアツセィ法（抗原抗体反応を原理とした測定法)に基づいて実施するのが好ましいが、その他のィムノアッセィ法にも使用することができる。例えば、無標識沈降法（比濁法、比ろう法等）、固相法 (ラテックス法、 Surface Plasmon Resonance法、水晶発振子法等）、標識測定法 (ラジオィムノアッセィ法、ェンザィ厶ィムノアッセィ法、発光ィムノアッセィ法、蛍光ィムノアッセィ法、金属標識ィムノアツセィ法等）に応用できる。

この発明の別の態様であるアポ B— 48測定用キットは、上記抗アポ B— 48モノクローナル抗体 (4C8)などの抗アポ B— 48モノクローナル抗体と、トリス塩酸緩衝液などの卜リス緩衝剤と、抗アポ B—48 /アポ B - 100-ビォチン標識抗体と、アビジン結合西洋ヮサビ / 一才キシダ一ゼ ( HRP) などのアビジン結合バーオキシダ一ゼと、テトラメチルベンチジン (TMB)などの発色基質と、硫酸などの反応停止剤と、から構成されている。また、抗アポ B— 48モノクローナル抗体としては、抗ァポ B— 48モノクローナル抗体（4C8)IgG固相化 96穴プレートなどが使用することができる。

以下、この発明を実施例によって更に説明するが、この発明は、下記実施例に一切限定されるものではなぐ下記実施例は、この発明を更に具体的に例示して説明をする目的だけに記載するものと理解すべきである。

実施例 1：

検体としての血清に、 0. 1 Mトリス塩酸 (pH7. 8)を添加して測定用検体とした。一方、抗アポ B —48モノクローナル抗体 (4C8)I_gG固相化 96穴プレー卜を洗浄用緩衝液で 3回洗浄した。このプレートに、各ゥエル当たりアポ B— 48標準品（160ng/ml— 2. 5ng/ml) 50 W I並びに上記測定用検体 50 Iを添加した。このプレートを室温で 1時間反応させ、検体中のアポ B— 48と抗アポ B— 48モノクローナル抗体 (4C8)とを結合させた。その後、洗浄用緩衝液で 3回洗浄した。次に、この反応生成物に、抗アポ B—48/B— 1 00-ビォチン標識抗体（各ゥエル当たり 50 jU lづっ）を添加して、室温で 1時間反応させ上記標識抗体を結合させた。その後、洗浄用緩衝液で 3回洗浄した。更に、アビジン結合 HRP (各ゥエル当たり 50 Iづっ）を室温で 30分間反応させて、上記標識抗体に結合させた。その後、テトラメチルベンチジン (TMB) (各ゥエル当たり 50 Iづっ）を添加して、室温で 30分間反応させて、 1 M硫酸 (各ゥエル当たり 50 i Iづっ）を添加して反応停止させて、 450η mでの発色吸光を測定した。その結果は下表 1に示す。実施例 2

検体としての血清に、 0. 1 %トリトン¹ 一1 00含有0. 1 Mトリス塩酸（pH7. 8)を添加して測定用検体とした。一方、抗アポ B— 48モノクローナル抗体（4C8)IgG固相化 96穴プレートを洗浄用緩衝液で 3回洗浄した。このプレートに、各ゥエル当たりアポ B— 48標準品（160ng/ml— 2. 5ng /ml) 50 I並びに上記測定用検体 50〃 Iを添加した。このプレートを室温で 1時間反応させ、検体中のアポ B— 48と抗アポ B— 48モノクローナル抗体（4C8)とを結合させた。その後、洗浄用緩衝液で 3回洗浄した。次に、この反応生成物に、抗アポ B— 48/B— 1 00—ビォチン標識抗体（各ゥエル当たり 50 Iづっ）を添加して、室温で 1時間反応させ上記標識抗体を結合させた。その後、洗浄用緩衝液で 3回洗浄した。更に、アビジン結合 HRP (各ゥエル当たり 50 Iづっ）を室温で 30分間反応させて、上記標識抗体に結合させた。その後、テトラメチルベンチジン (TMB) (各ゥエル当たり 50 Iづっ)を添加して、室温で 30分間反応させて、 1 M硫酸 (各ゥエル当たり 50 Iづっ）を添加して反応停止させて、 450nmでの発色吸光を測定した。その結果は下表 1に示す。

表 1： ( i g/ml)

実施例 3 :キット

この発明の別の態様であるアポ B—48測定用キッ Hよ、次の構成を有している。

抗アポ B— 48モノクローナル抗体 (4C8)IgG固相化 96穴プレート

アポ B— 48標準品 (検量線作製用抗原）

トリス塩酸緩衝液

抗アポ B— 48/アポ B— 100—ピオチン標識抗体

アビジン結合西洋ヮサビパーォキシダーゼ（HRP)

テトラメチルベンチジン (TMB)

硫酸

濃縮洗浄液実施例 4 :

実施例 1と同様にして、健常者の空腹時アポ B-48の量を測定した結果を下表 2に示す。

表 2 :

実施例 5 :

実施例 1と同様にして、ボックり病患者からの検体中のアポ Β—48の量を測定した結果を下表 3 に示す。

表 3 :

実施例 6 :

実施例 1と同様にして、急性心筋梗塞患者からの検体中のアポ B— 48の量を測定した結果を下表 4に示す。

表 4 :

発明の工業利用性

この発明のアポ B— 48測定方法は、検体中のアポ B—48を正確に、迅速にかつ簡単に測定することができることから、高脂血症や動脈硬化症などの疾患の予防や治療に有用である。また、血液中のアポ B— 48を正確にかつ確実に測定することができることから、心冠動脈疾患の検査方法としても有効であり、また突然死 (ボックリ病)の予防に役立てることが可能である。

更に、この発明は、血液中のアポ B— 48を増減させる高脂血症治療薬成分並びに機能性食品成分の効能評価法に応用できる。

Claims

請求の範囲

1 .検体をトリス緩衝剤で希釈し、この希釈検体に抗アポ B— 48モノクローナル抗体を反応させてァポ B— 48を測定することを特徴とするアポ B— 48測定方法。

2 . 請求の範囲第 1項に記載のアポ B— 48測定方法において、前記希釈検体に抗アポ B— 48モノクローナル抗体を反応させて前記検体中のアポ B— 48を結合させ、抗アポ B— 48 /アポ B— 1 00 -ビォチン標識抗体を添加して前記アポ B— 48に結合させた後、アビジン結合/ 一ォキシダーゼとを反応させ、更に発色基質と反応させることによってアポ B— 48を測定することを特徴とするアポ B— 48測定方法。

3.請求の範囲第 1項または第 2項に記載のアポ B— 48測定方法において、前記トリス緩衝剤がトリス、トリス塩酸緩衝液、トリスマレイン酸緩衝液またはグッドバッファ一であることを特徴とするアポ B— 48測定方法。

4.請求の範囲第 1項ないし第 3項のいずれか 1項に記載のアポ B— 48測定方法において、前記希釈検体に界面活性剤が更に添加されていることを特徴とするアポ B— 48測定方法。

5.請求の範囲第 1項ないし第 4項のいずれか 1項に記載のアポ B— 48測定方法において、前記界面活性剤が非イオン性界面活性剤であることを特徴とするアポ B— 48測定方法。

6.アポ B— 48測定用キットであって、トリス緩衝剤と抗アポ B— 48モノクローナル抗体とを含んでし、ることを特徴とするアポ B— 48測定用キット。

7.請求の範囲第 6項に記載のアポ B— 48測定用キット ίこおいて、抗アポ Β— 48/アポ Β— 1 00— ビォチン標識抗体と、アビジン結合パ一ォキシダーゼと、発色基質とを更に含んでいることを特徵とするアポ Β— 48測定用キット。

8.請求の範囲第 6項または第 7項に記載のアポ Β— 48測定用キットにおいて、前記トリス緩衝剤がトリス、トリス塩酸緩衝液、ド Jスマレイン酸緩衝液またはグッドバッファーであることを特徴とするアポ B— 48測定用キット。

9.請求の範囲第 6項ないし第 8項のいずれか 1項に記載のアポ B— 48測定用キットにおいて、界面活性剤が更に含まれていることを特徴とするアポ B— 48測定用キット。

1 0.請求の範囲第 6項ないし第 9項のいずれか 1項に記載のアポ B— 48測定用キットにおいて、前記界面活性剤が非イオン性界面活性剤であることを特徴とするアポ B— 48測定用キット。

1 1 .請求の範囲第 1項ないし第 5項のいずれか 1項に記載のアポ B— 48測定方法およびまたは請求の範囲第 6項ないし第 1 0項のいずれか 1項に記載のアポ B— 48測定用キットを用いて、検体中のアポ B— 48を測定することを特徴とするアポ B— 48測定方法。

1 2.請求の範囲第 1項ないし第 5項のいずれか 1項もしくは請求の範囲第 1 1項に記載のアポ B— 48測定方法およびまたは請求の範囲第 6項ないし第 1 0項のいずれか 1項に記載のアポ B 一 48測定用キットを用いて、検体中のアポ B— 48を測定することによってアポ B— 48関連疾患を診断することを特徴とする疾患診断方法。

3.請求の範囲第 1 2項に記載の疾患診断方法において、前記アポ B— 48関連疾患が高脂血症、動脈硬化性疾患、心機能不全症またはボックリ病であることを特徴とする疾患診断方法。 4.請求の範囲第 1項ないし第 5項のいずれか 1項もしくは請求の範囲第 1 1項に記載のアポ B— 48測定方法おょぴまたは請求の範囲第 6項なし、し第 1 0項のいずれか 1項に記載のアポ B —48測定用キットを用いて、高脂血症治療薬成分並びに機能性食品成分の効能評価法。 5.請求の範囲第 1項ないし第 5項のいずれか 1項に記載のアポ B— 48測定方法とアポ B— 48 以外の他の測定項目を組みあせて同一検体で同一測定器により同時多項目に測定することを特徴とする疾患分析法。