CN109187996A - 一种测定载脂蛋白c-ⅲ浓度的试剂盒及制备方法 - Google Patents

一种测定载脂蛋白c-ⅲ浓度的试剂盒及制备方法 Download PDF

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CN109187996A CN201811103692.7A CN201811103692A CN109187996A CN 109187996 A CN109187996 A CN 109187996A CN 201811103692 A CN201811103692 A CN 201811103692A CN 109187996 A CN109187996 A CN 109187996A
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杜微微
李磊
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Abstract

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种载脂蛋白C‑Ⅲ浓度的试剂盒及制备方法。本发明采用的技术方案是:一种测定载脂蛋白C‑Ⅲ浓度的试剂盒，其特征在于：包括试剂R1和试剂R2，其中试剂R2中加入了生物素和链霉亲和素,且生物素结合载脂蛋白C‑Ⅲ抗体比例为2：1，链霉亲和素结合生物素‑载脂蛋白C‑Ⅲ抗体比例为1:1。本发明的优点是:本发明的测定载脂蛋白C‑Ⅲ浓度的试剂盒，采用级联放大反应，即载脂蛋白C‑Ⅲ抗体连接生物素1:2，再与链霉亲和素1:1混合反应，可明显改善重复性和灵敏度，线性范围可做到2‑100mg/L。

Description

一种测定载脂蛋白C-Ⅲ浓度的试剂盒及制备方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种测定载脂蛋白C-Ⅲ浓度的试剂盒及制备方法。
背景技术
载脂蛋白一般分为载脂蛋白A、载脂蛋白B、载脂蛋白C、载脂蛋白D、载脂蛋白E和载脂蛋白(a)，每种又分为若干亚型。载脂蛋白的主要功能有：①维持脂蛋白的结构与脂类运输；②调控脂代谢有关酶的活性；③作为细胞表面脂蛋白受体的配体而参与脂蛋白的代谢。载脂蛋白C(apoC)是血浆中一组水溶性的低分子量蛋白质，包括四个亚类：载脂蛋白CⅠ、CⅡ、CⅢ和CⅣ，它们主要分布在极低密度脂蛋白(VLDL)、乳糜微粒(CM)和高密度脂蛋白(HDL)。载脂蛋白C-Ⅲ(apoCⅢ)是载脂蛋白C族中含量最丰富的一类。apoCⅢ对体内富含三酰甘油脂蛋白的分解代谢具有重要的调节作用。载脂蛋白C-Ⅲ是脂蛋白代谢的重要调节剂，它与高三酰甘油血症和心血管疾病密切相关。载脂蛋白C-Ⅲ的主要生理功能是抑制脂蛋白脂酶活性和肝脏脂蛋白受体摄取富含三酰甘油脂蛋白及其残粒。。目前采用的免疫透射比浊法测定载脂蛋白C-Ⅲ浓度的试剂盒存在大量的非特异反应，且试剂应用的灵敏度和重复性差，已越来越不能满足使用要求。因此，应该提供一种新的技术方案解决上述问题。因此，应该提供一种新的技术方案解决上述问题。
发明内容
本发明的目的是：提供一种灵敏度高，重复性好的一种测定载脂蛋白C-Ⅲ浓度的试剂盒及制备方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种测定载脂蛋白C-Ⅲ浓度的试剂盒，包括试剂R1和试剂R2，所述试剂R1的各组分及浓度包括：
所述试剂R2的各组分及浓度包括：
进一步的技术方案：
所述试剂R1中的第一缓冲液A和第一缓冲液B为PBS缓冲液、HEPES缓冲液、MES缓冲液、Tris缓冲液、甘氨酸缓液中的一种或几种的组合。
所述试剂R1中的防腐剂为叠氮钠、Proclin-950、Proclin-300、硫柳汞中的一种或几种的组合。
所述试剂R2中第二缓冲液A和第二缓冲液B为PBS缓冲液、HEPES缓冲液、MES缓冲液、Tris缓冲液、甘氨酸缓液中的一种或几种的组合。
所述试剂R2中稳定剂为牛血清白蛋白、酪蛋白、明胶、甘露醇中的一种或几种的组合。
所述试剂R2中的助悬剂为葡萄糖、D-海藻糖、甘露醇、蔗糖、麦芽糖、乳糖、丙三醇中的一种或几种的组合。
所述试剂R2中的防腐剂为叠氮钠、Proclin-950、Proclin-300、硫柳汞等中的一种。
所述R1试剂pH在6.00-8.50之间，所述R2试剂pH在6.00-8.50之间。
所述生物素结合载脂蛋白C-Ⅲ抗体比例为1:1-4:1之间，链霉亲和素结合生物素-载脂蛋白C-Ⅲ抗体比例为0.5:1-4:1之间。
测定载脂蛋白C-Ⅲ的试剂盒的制备方法，包括如下步骤，
A)、试剂R1制备；
在配液罐中先加入适量纯化水于磁力搅拌器上，调节搅拌子至中档转速，使溶液保持中速转动状态，以0.8-3.2g/L标准，边搅拌边投入第一缓冲液A，以8.75-24.31g/L的标准投入第一缓冲液B，搅拌5-30分钟至物料完全溶解，溶液清澈透明配液罐底部无沉淀后，调节pH值到6.00-8.50之间，之后以5.8-20.0g/L标准，投入氯化钠，待物料完全溶解后再按照上述投料方式分别以40-120g/L、0.8％-2.0％的标准，依次投入PEG 6000、Proclin-950,投料完成后，继续搅拌5-30分钟至全部物料完全溶解，溶液清澈透明，配液罐底部无沉淀，定容至最终体积；
溶解完的配液按照微孔过滤器操作规程，通过微孔滤膜过滤，过滤后的溶液存放在成品罐中，进行标识；
B)、试剂R2制备；
在配液罐中先加入适量纯化水于磁力搅拌器上，打开磁力搅拌器电源开关，调节搅拌子至中档转速，使溶液保持中速转动状态，以0.5-2.8g/L的标准，边搅拌边投入第二缓冲液A，以8.75-24.31g/L的标准，投入第二缓冲液B，注意不要让水溅出,搅拌5-30分钟至物料完全溶解，溶液清澈透明配液罐底部无沉淀后，调节pH值到6.00-8.50之间，之后以5.8-20.0g/L标准投入氯化钠，待物料完全溶解后再按照上述投料方式分别以1-10g/L、5-30g/L、0.8-2.0ml/L的标准依次投入稳定剂、助悬剂和第二防腐剂，投料完成后，继续搅拌5-30分钟至全部物料完全溶解，溶液清澈透明，配液罐底部无沉淀；
烧杯中以5-20g/L的标准加入生物素于磁力搅拌器上，打开磁力搅拌器电源开关，调节搅拌子至中档转速，使溶液保持中速转动状态，以25-75ml/L的标准，边搅拌边加入载脂蛋白C-Ⅲ抗体，搅拌1-4h反应，反应结束后透析去除未结合的游离抗体，以5-20g/L标准加入链霉亲和素反应1-4h，反应结束后透析去除未结合的生物素-抗体；
最后把偶联有链霉亲和素-生物素-载脂蛋白C-Ⅲ抗体加入配液罐中，继续搅拌5-30分钟至溶液清澈透明，配液罐底部无沉淀。
溶解完的配液按照微孔过滤器操作规程，通过微孔滤膜过滤，过滤后的溶液存放在成品罐中，进行标识。
由于上述技术方案的应用，本发明与现有技术相比具有如下优点：
本发明的测定载脂蛋白C-Ⅲ浓度的试剂盒，在试剂R2中加入了生物素和链霉亲和素采用级联放大反应，即载脂蛋白C-Ⅲ抗体连接生物素1:2，再与链霉亲和素1:1混合反应，可明显改善重复性和灵敏度，线性范围可做到2-100mg/L。
附图说明
图1是本发明实施例4未采用级联放大反应R2试剂的定标曲线图。其中X轴表示标准品浓度，Y轴表示吸光度。
图2是本发明实施例4采用级联放大反应R2试剂的定标曲线图。其中X轴表示标准品浓度，Y轴表示吸光度。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步描述：
实施例1：
一种测定载脂蛋白C-Ⅲ浓度的试剂盒，包括试剂R1和试剂R2，所述试剂R1的各组分及浓度包括作为第一缓冲液A的二水合磷酸二氢钠，其浓度为0.8g/L，作为第一缓冲液B的十二水合磷酸氢二钠，其浓度为24.31g/L，作为第一电解质的氯化钠，其浓度为5.8g/L,作为第一高分子促进剂的PEG 6000，其浓度为40g/L，以及作为第一防腐剂的Proclin-950，其浓度为2.0％，所述试剂R2的各组分及浓度包括作为第二缓冲液A的二水合磷酸二氢钠，其浓度为0.5g/L，作为第二缓冲液B的十二水合磷酸氢二钠，其浓度为23.4g/L，作为第二电解质的氯化钠，其浓度为5.8g/L，作为第二稳定剂的牛血清白蛋白，其浓度为10g/L，作为第二助悬剂的D-海藻糖，其浓度为5g/L，作为第二防腐剂的Proclin-950，其浓度为0.8ml/L，以及载脂蛋白C-Ⅲ抗体、链霉亲和素和生物素，这三者的浓度分别为25ml/L、5g/L和5g/L。
以上测定载脂蛋白C-Ⅲ浓度的试剂盒的制备方法，包括如下步骤，
A)、试剂R1制备；
在配液罐中先加入适量纯化水于磁力搅拌器上，调节搅拌子至中档转速，使溶液保持中速转动状态，边搅拌边投入浓度为0.8g/L二水合磷酸二氢钠和浓度为24.31g/L的十二水合磷酸氢二钠，搅拌5-30分钟至物料完全溶解，溶液清澈透明配液罐底部无沉淀后，调节pH值为6.00，之后投入浓度为5.8g/L的氯化钠，待物料完全溶解后，再按照上述投料方式依次投入PEG 6000和Proclin-950，以上两者的浓度分别为40g/L和2.0％，投料完成后，继续搅拌5-30分钟至全部物料完全溶解，溶液清澈透明，配液罐底部无沉淀，定容至最终体积；
溶解完的配液按照微孔过滤器操作规程，通过微孔滤膜过滤，过滤后的溶液存放在成品罐中，进行标识；
B)、试剂R2制备；
在配液罐中先加入适量纯化水于磁力搅拌器上，打开磁力搅拌器电源开关，调节搅拌子至中档转速，使溶液保持中速转动状态，边搅拌边投入浓度为0.5g/L的二水合磷酸二氢钠和浓度为23.4g/L的十二水合磷酸氢二钠，注意不要让水溅出,搅拌5-30分钟至物料完全溶解，溶液清澈透明配液罐底部无沉淀后，调节pH值到8.5，之后投入浓度为5.8g/L的氯化钠，待物料完全溶解后再按照上述投料方式分别以浓度为10g/L、5g/L、0.8ml/L的标准依次投入牛血清白蛋白、D-海藻糖和Proclin-950，投料完成后，继续搅拌5-30分钟至全部物料完全溶解，溶液清澈透明，配液罐底部无沉淀；
烧杯中以5g/L的标准加入生物素于磁力搅拌器上，打开磁力搅拌器电源开关，调节搅拌子至中档转速，使溶液保持中速转动状态，以25ml/L的标准，边搅拌边加入载脂蛋白C-Ⅲ抗体，搅拌1-4h反应，反应结束后透析去除未结合的游离抗体，以5g/L标准加入链霉亲和素反应1-4h，反应结束后透析去除未结合的生物素-抗体；
最后把偶联有链霉亲和素-生物素-载脂蛋白C-Ⅲ抗体加入配液罐中，继续搅拌5-30分钟至溶液清澈透明，配液罐底部无沉淀，生物素结合载脂蛋白C-Ⅲ抗体比例为2：1，链霉亲和素结合生物素-载脂蛋白C-Ⅲ抗体比例为1:1。
溶解完的配液按照微孔过滤器操作规程，通过微孔滤膜过滤，过滤后的溶液存放在成品罐中，进行标识。
实施例2
一种测定载脂蛋白C-Ⅲ浓度的试剂盒，包括试剂R1和试剂R2，所述试剂R1的各组分及浓度包括作为第一缓冲液A的二水合磷酸二氢钠，其浓度为3.2g/L，作为第一缓冲液B的十二水合磷酸氢二钠，其浓度为8.75g/L，作为第一电解质的氯化钠，其浓度为20.0g/L,作为第一高分子促进剂的PEG 6000，其浓度为80g/L，作为第一防腐剂的Proclin-300，其浓度为0.8％，所述试剂R2的各组分及浓度包括作为第二缓冲液A的二水合磷酸二氢钠，其浓度为2.8g/L，作为第二缓冲液B的十二水合磷酸氢二钠，其浓度为11.5g/L，作为第二电解质的氯化钠，其浓度为20.0g/L，作为第二稳定剂的酪蛋白，其浓度为1g/L，作为第二助悬剂的葡萄糖，其浓度为30g/L，作为第二防腐剂的Proclin-300，其浓度为2.0ml/L，以及载脂蛋白C-Ⅲ抗体、链霉亲和素和生物素，这三者的浓度分别为75ml/L、20g/L和20g/L。
以上测定载脂蛋白C-Ⅲ浓度的试剂盒的制备方法，包括如下步骤，
A)、试剂R1制备；
在配液罐中先加入适量纯化水于磁力搅拌器上，调节搅拌子至中档转速，使溶液保持中速转动状态，边搅拌边投入浓度为3.2g/L二水合磷酸二氢钠和浓度为8.75g/L的十二水合磷酸氢二钠，搅拌5-30分钟至物料完全溶解，溶液清澈透明配液罐底部无沉淀后，调节pH值为7.00，之后投入浓度为20g/L的氯化钠，待物料完全溶解后，再按照上述投料方式依次投入PEG 6000和Proclin-300，以上两者的浓度分别为80g/L和0.8％，投料完成后，继续搅拌5-30分钟至全部物料完全溶解，溶液清澈透明，配液罐底部无沉淀，定容至最终体积；
溶解完的配液按照微孔过滤器操作规程，通过微孔滤膜过滤，过滤后的溶液存放在成品罐中，进行标识；
B)、试剂R2制备；
在配液罐中先加入适量纯化水于磁力搅拌器上，打开磁力搅拌器电源开关，调节搅拌子至中档转速，使溶液保持中速转动状态，边搅拌边投入浓度为2.8g/L的二水合磷酸二氢钠和浓度为11.5g/L的十二水合磷酸氢二钠，注意不要让水溅出,搅拌5-30分钟至物料完全溶解，溶液清澈透明配液罐底部无沉淀后，调节pH值到7，之后投入浓度为20.0g/L的氯化钠，待物料完全溶解后再按照上述投料方式分别以浓度为1g/L、30g/L、2.0ml/L的标准依次投入酪蛋白、葡萄糖和Proclin-300，投料完成后，继续搅拌5-30分钟至全部物料完全溶解，溶液清澈透明，配液罐底部无沉淀；
烧杯中以20g/L的标准加入生物素于磁力搅拌器上，打开磁力搅拌器电源开关，调节搅拌子至中档转速，使溶液保持中速转动状态，以75ml/L的标准，边搅拌边加入载脂蛋白C-Ⅲ抗体，搅拌1-4h反应，反应结束后透析去除未结合的游离抗体，以20g/L标准加入链霉亲和素反应1-4h，反应结束后透析去除未结合的生物素-抗体；
最后把偶联有链霉亲和素-生物素-载脂蛋白C-Ⅲ抗体加入配液罐中，继续搅拌5-30分钟至溶液清澈透明，配液罐底部无沉淀，生物素结合载脂蛋白C-Ⅲ抗体比例为2：1，链霉亲和素结合生物素-载脂蛋白C-Ⅲ抗体比例为1:1。
溶解完的配液按照微孔过滤器操作规程，通过微孔滤膜过滤，过滤后的溶液存放在成品罐中，进行标识。
实施例3
一种测定载脂蛋白C-Ⅲ浓度的试剂盒，包括试剂R1和试剂R2，所述试剂R1的各组分及浓度包括作为第一缓冲液A的二水合磷酸二氢钠，其浓度为2g/L，作为第一缓冲液B的十二水合磷酸氢二钠，其浓度为16g/L，作为第一电解质的氯化钠，其浓度为12g/L,作为第一高分子促进剂的PEG 6000，其浓度为120g/L，作为第一防腐剂的硫柳汞，其浓度为1％，所述试剂R2的各组分及浓度包括作为第二缓冲液A的二水合磷酸二氢钠，其浓度为1.5g/L，作为第二缓冲液B的十二水合磷酸氢二钠，其浓度为17g/L，作为第二电解质的氯化钠，其浓度为13g/L，作为第二稳定剂的明胶，其浓度为5g/L，作为第二助悬剂的麦芽糖，其浓度为18g/L，作为第二防腐剂的硫柳汞，其浓度1.3ml/L，以及载脂蛋白C-Ⅲ抗体、链霉亲和素和生物素，这三者的浓度分别为50ml/L、12/L和12g/L。
以上测定载脂蛋白C-Ⅲ浓度的试剂盒的制备方法，包括如下步骤，
A)、试剂R1制备；
在配液罐中先加入适量纯化水于磁力搅拌器上，调节搅拌子至中档转速，使溶液保持中速转动状态，边搅拌边投入浓度为2g/L二水合磷酸二氢钠和浓度为16g/L的十二水合磷酸氢二钠，搅拌5-30分钟至物料完全溶解，溶液清澈透明配液罐底部无沉淀后，调节pH值为6.00，之后投入浓度为12g/L的氯化钠，待物料完全溶解后，再按照上述投料方式依次投入PEG 6000和硫柳汞，以上两者的浓度分别为120g/L和1％，投料完成后，继续搅拌5-30分钟至全部物料完全溶解，溶液清澈透明，配液罐底部无沉淀，定容至最终体积；
溶解完的配液按照微孔过滤器操作规程，通过微孔滤膜过滤，过滤后的溶液存放在成品罐中，进行标识；
B)、试剂R2制备；
在配液罐中先加入适量纯化水于磁力搅拌器上，打开磁力搅拌器电源开关，调节搅拌子至中档转速，使溶液保持中速转动状态，边搅拌边投入浓度为1.5g/L的二水合磷酸二氢钠和浓度为17g/L的十二水合磷酸氢二钠，注意不要让水溅出,搅拌5-30分钟至物料完全溶解，溶液清澈透明配液罐底部无沉淀后，调节pH值到6，之后投入浓度为13g/L的氯化钠，待物料完全溶解后再按照上述投料方式分别以浓度为5g/L、18g/L、1.3ml/L的标准依次投入明胶、麦芽糖和硫柳汞，投料完成后，继续搅拌5-30分钟至全部物料完全溶解，溶液清澈透明，配液罐底部无沉淀；
烧杯中以12g/L的标准加入生物素于磁力搅拌器上，打开磁力搅拌器电源开关，调节搅拌子至中档转速，使溶液保持中速转动状态，以50ml/L的标准，边搅拌边加入载脂蛋白C-Ⅲ抗体，搅拌1-4h反应，反应结束后透析去除未结合的游离抗体，以12g/L标准加入链霉亲和素反应1-4h，反应结束后透析去除未结合的生物素-抗体；
最后把偶联有链霉亲和素-生物素-载脂蛋白C-Ⅲ抗体加入配液罐中，继续搅拌5-30分钟至溶液清澈透明，配液罐底部无沉淀。生物素结合载脂蛋白C-Ⅲ抗体比例为2：1，链霉亲和素结合生物素-载脂蛋白C-Ⅲ抗体比例为1:1。
溶解完的配液按照微孔过滤器操作规程，通过微孔滤膜过滤，过滤后的溶液存放在成品罐中，进行标识。
实施例4
本发明一种测载脂蛋白C-Ⅲ浓度的试剂盒的应用，其工作原理是:样本中的载脂蛋白C-Ⅲ与试剂中相应抗体(羊抗人载脂蛋白C-Ⅲ抗体)在液相中相遇，结合成抗原-抗体复合物，形成一定的浊度。该浊度的高低在足量抗体存在时与样本中APO C-Ⅲ的浓度成比例，将吸光度变化与已知浓度的校准品比较，抗原定量得出样本品中APOC-Ⅲ的含量。
采用R2试剂未采用级联放大反应的试剂盒，使用标准品进行定标，结果如表1所示，定标曲线如图1所示。
表1、R2试剂未采用级联放大反应定标结果：
校准品浓度(g/L) dOD(吸光度)
0 0.0012
7.12 0.0535
14.61 0.0901
30.92 0.1536
56.36 0.2273
101.19 0.2053
结果解析：如图1和表1所示，校准品浓度大于56.36g/L时出现hook效应。
R2试剂采用级联放大反应的试剂盒，使用标准品进行定标，结果如表2所示，定标曲线如图2所示。
表2、R2试剂采用级联放大反应定标结果：
校准品浓度(g/L) dOD(吸光度)
0 0.0036
7.12 0.0946
14.61 0.1823
30.92 0.3755
56.36 0.6034
101.19 0.8262
结果解析：如图2和表2所示，线性范围可做到2-100g/L。
实施例5
精密度CV检测:
R2试剂未采用级联放大反应的试剂盒，随机取3份临床血清样本，使用全自动生化分析仪对同一样本重复检测10次，检测结果如表3所示。
表3：检测样本的载脂蛋白C-Ⅲ含量(10次)及变异系数
序号 样本1(g/L) 样本2(g/L) 样本3(g/L)
1 9.64 28.27 81.54
2 9.5 28.95 72.95
3 8.81 29.29 82.87
4 8.93 29.3 68.19
5 9.33 31.36 72.34
6 9.12 28.34 80.35
7 9.23 28.1 85.93
8 10.25 33.29 78.22
9 9.59 29.21 71.25
10 9.74 32.55 76.75
均值 9.41 29.87 77.04
SD 0.42 1.86 5.74
CV 4.51％ 6.22％ 7.45％
结果解析：精密度CV＞5％。
R2试剂采用级联放大反应的试剂盒，随机取3份临床血清样本，使用全自动生化分析仪对同一样本重复检测10次，检测结果如表4所示。
表4：检测样本的载脂蛋白C-Ⅲ含量(10次)及变异系数
结果解析：精密度CV＜3％。
结论:采用级联放大反应，即1份的载脂蛋白C-Ⅲ抗体连接2份的生物素，再与1份的链霉亲和素混合反应，可明显改善重复性和灵敏度，线性范围可做到2-100mg/L。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进或替换，这些改进或替换也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种测定载脂蛋白C-Ⅲ浓度的试剂盒，其特征在于：包括试剂R1和试剂R2，所述试剂R1的各组分及浓度包括：
所述试剂R2的各组分及浓度包括：
2.根据权利要求1所述的一种测定载脂蛋白C-Ⅲ浓度的试剂盒，其特征在于：所述试剂R1和R2中的第一缓冲液A、第一缓冲液B、第二缓冲液A以及第二缓冲液B均为PBS缓冲液、HEPES缓冲液、MES缓冲液、Tris缓冲液、甘氨酸缓液中的一种或几种的组合。
3.根据权利要求1所述的一种测定载脂蛋白C-Ⅲ浓度的试剂盒，其特征在于：所述试剂R1中的防腐剂为叠氮钠、Proclin-950、Proclin-300、硫柳汞中的一种或几种的组合。
4.根据权利要求1所述的一种测定载脂蛋白C-Ⅲ浓度的试剂盒，其特征在于：所述所述第一缓冲液A和第二缓冲液A为二水合磷酸二氢钠，第一缓冲液B和第二缓冲液B为十二水合磷酸氢二钠。
5.根据权利要求1所述的一种测定载脂蛋白C-Ⅲ浓度的试剂盒，其特征在于：所述试剂R2中稳定剂为牛血清白蛋白、酪蛋白、明胶、甘露醇中的一种或几种的组合。
6.根据权利要求1所述的一种测定载脂蛋白C-Ⅲ浓度的试剂盒，其特征在于：所述试剂R2中的助悬剂为葡萄糖、D-海藻糖、甘露醇、蔗糖、麦芽糖、乳糖、丙三醇中的一种或几种的组合。
7.根据权利要求1所述的一种测定载脂蛋白C-Ⅲ浓度的试剂盒，其特征在于：所述试剂R2中的防腐剂为叠氮钠、Proclin-950、Proclin-300、硫柳汞等中的一种。
8.根据权利要求1所述的一种测定载脂蛋白C-Ⅲ浓度的试剂盒，其特征在于：所述R1试剂pH在6.00-8.50之间，所述R2试剂pH在6.00-8.50之间。
9.根据权利要求1所述的一种测定载脂蛋白C-Ⅲ浓度的试剂盒，其特征在于：所述生物素结合载脂蛋白C-Ⅲ抗体比例为1:1-4:1之间，链霉亲和素结合生物素-载脂蛋白C-Ⅲ抗体比例为0.5:1-4:1之间。
10.如权利要求1-9任一测定载脂蛋白C-Ⅲ浓度的试剂盒的制备方法，其特征在于：包括如下步骤，
A)、试剂R1制备；
在配液罐中先加入适量纯化水于磁力搅拌器上，调节搅拌子至中档转速，使溶液保持中速转动状态，以0.8-3.2g/L标准，边搅拌边投入第一缓冲液A，以8.75-24.31g/L的标准投入第一缓冲液B，搅拌5-30分钟至物料完全溶解，溶液清澈透明配液罐底部无沉淀后，调节pH值到6.00-8.50之间，之后以5.8-20.0g/L标准，投入氯化钠，待物料完全溶解后再按照上述投料方式分别以40-120g/L、0.8％-2.0％的标准，依次投入PEG 6000、Proclin-950,投料完成后，继续搅拌5-30分钟至全部物料完全溶解，溶液清澈透明，配液罐底部无沉淀，定容至最终体积；
溶解完的配液按照微孔过滤器操作规程，通过微孔滤膜过滤，过滤后的溶液存放在成品罐中，进行标识；
B)、试剂R2制备；
在配液罐中先加入适量纯化水于磁力搅拌器上，打开磁力搅拌器电源开关，调节搅拌子至中档转速，使溶液保持中速转动状态，以0.5-2.8g/L的标准，边搅拌边投入第二缓冲液A，以8.75-24.31g/L的标准，投入第二缓冲液B，注意不要让水溅出,搅拌5-30分钟至物料完全溶解，溶液清澈透明配液罐底部无沉淀后，调节pH值到6.00-8.50之间，之后以5.8-20.0g/L标准投入氯化钠，待物料完全溶解后再按照上述投料方式分别以1-10g/L、5-30g/L、0.8-2.0ml/L的标准依次投入稳定剂、助悬剂和第二防腐剂，投料完成后，继续搅拌5-30分钟至全部物料完全溶解，溶液清澈透明，配液罐底部无沉淀；
烧杯中以5-20g/L的标准加入生物素于磁力搅拌器上，打开磁力搅拌器电源开关，调节搅拌子至中档转速，使溶液保持中速转动状态，以25-75ml/L的标准，边搅拌边加入载脂蛋白C-Ⅲ抗体，搅拌1-4h反应，反应结束后透析去除未结合的游离抗体，以5-20g/L标准加入链霉亲和素反应1-4h，反应结束后透析去除未结合的生物素-抗体；
最后把偶联有链霉亲和素-生物素-载脂蛋白C-Ⅲ抗体加入配液罐中，继续搅拌5-30分钟至溶液清澈透明，配液罐底部无沉淀。
溶解完的配液按照微孔过滤器操作规程，通过微孔滤膜过滤，过滤后的溶液存放在成品罐中，进行标识。
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