CN112285356A - α1-抗胰蛋白酶免疫比浊法检测试剂盒的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了α1‑抗胰蛋白酶免疫比浊法检测试剂盒的制备方法,其特征在于:包括如下制备步骤:A:试剂R1的制备,B:试剂R2的制备:在试剂R2的制备中,生物素结合α1‑抗胰蛋白酶抗体比例为1:1‑4:1之间,链霉亲和素结合生物素‑α1‑抗胰蛋白酶抗体比例为1:1‑4:1之间。本发明的优点是:采用级联放大反应,即α1‑抗胰蛋白酶抗体连接生物素2:1,再与链霉亲和素1:1混合反应,可明显改善重复性和灵敏度,线性范围可做到0.10‑6.00g/L,该发明具有操作简单、快速检测、灵敏度高、稳定性好的特点,能够适用于全自动生化分析仪。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,尤其涉及α1-抗胰蛋白酶免疫比浊法检测试剂盒的制备方法。
背景技术
α1-抗胰蛋白酶(简称α1-AT或AAT)是一种糖蛋白。含糖10%-20%,主要由肝脏合成。它是血清中最主要的蛋白酶抑制剂,对凝血酶、尿激酶等其他酶也有抑制作用;也是一种急性时相反应蛋白,在炎症性疾患时,α1-抗胰蛋白酶可透过毛细血管进入组织液,在炎症局部往往浓度很高,对急性炎性疾病有一定限制作用。α1-抗胰蛋白酶为呼吸系统的非特异性可溶因子,与呼吸道抵抗力关系密切,它可抑制多种酶的活性,包括细菌的酶,以及中性白细胞溶酶体分泌的蛋白酶、弹性蛋白酶、胶原酶、纤维蛋白溶酶和凝血酶。α1-抗胰蛋白酶的缺乏与慢性阻塞性肺病的形成关系密切,因为它的缺乏,不能及时控制感染和炎症产生的多种蛋白酶,而造成肺组织破坏。
与α1-抗胰蛋白酶缺乏直接相关的疾病主要是肺气肿和肝脏硬化。目前α1-抗胰蛋白酶主要用于因遗传性α1-抗胰蛋白酶缺乏引起的肺气肿患者的终身替补治疗和肺部炎症性疾病的防止,如慢性阻塞性肺气肿、肺囊性纤维化、急性肺损伤等。
α1-抗胰蛋白酶的检测方法有血清胰蛋白酶抑制容量试验、单项免疫扩散法、免疫比浊法。血清胰蛋白酶抑制容量试验操作过程复杂,易受血清中非抗胰蛋白酶的干扰,结果不够稳定,不宜用于开发临床检测试剂盒。而单向免疫扩散法操作简单,灵敏度尚可,但实验分析需要1-2天,并且沉淀环的直径很难精确测量,因此结果的特异性和精密度不高。
α1-抗胰蛋白酶免疫比浊法是一种精密度和特异性更高的分析方法。由于该方法不需要昂贵的设备,可以实现自动化,且可测定大量标本,因此受到临床广泛推广。但是普通的α1-抗胰蛋白酶检测试剂分析灵敏度不高,准确性和稳定性也不好,不利于临床分析检测的推广应用。
发明内容
本发明的目的是:针对上述不足,提供一种改善重复性和灵敏度的α1-抗胰蛋白酶免疫比浊法检测试剂盒的制备方法。
为达到上述目的,本发明采用的技术方案是:
α1-抗胰蛋白酶免疫比浊法检测试剂盒的制备方法,包括如下制备步骤:
A:试剂R1的制备:
在配液罐中先加入部分纯化水于磁力搅拌器上,调节搅拌子至中档转速,使溶液保持中速转动状态,边搅拌边投入浓度为1.6-4.8g/L的第一缓冲液A、浓度为8.75-24.31g/L的第一缓冲液B、浓度为8.0-20.0g/L的电解质、浓度为60-120g/L的高分子促进剂、浓度为0.8-2.0ml/L第一防腐剂,搅拌20-30分钟至物料完全溶解、溶液清澈透明配液罐底部无沉淀后,调节pH值到7.00-9.50之间,继续搅拌5-10分钟至全部物料完全溶解,溶液清澈透明,配液罐底部无沉淀,定容至最终体积,
定容后的溶液存放在成品罐中,进行标识;
B:试剂R2的制备:
在配液罐中先加入部分纯化水于磁力搅拌器上,打开磁力搅拌器电源开关,调节搅拌子至中档转速,使溶液保持中速转动状态,边搅拌边投入浓度为1.6-4.8g/L的第二缓冲液A,浓度为8.75-24.31g/L的第二缓冲液B,浓度为8.0-20.0g/L的氯化钠,浓度为1-5g/L的稳定剂,浓度为0.8-2.0ml/L的第二防腐剂,搅拌20-30分钟至物料完全溶解,溶液清澈透明配液罐底部无沉淀后,调节pH值到6.00-7.50之间,继续搅拌5-10分钟;
烧杯中以5-20g/L标准加入生物素于磁力搅拌器上,打开磁力搅拌器电源开关,调节搅拌子至中档转速,使溶液保持中速转动状态,边搅拌边加入15-40mg/L标准的α1-抗胰蛋白酶抗体,搅拌2-4h反应,反应结束后透析去除游离抗体,以5-20g/L标准加入链霉亲和素反应2-4h,反应结束后透析去除未结合的生物素-抗体;
最后把链霉亲和素-生物素-α1-抗胰蛋白酶抗体加入配液罐中,继续搅拌20-30分钟至溶液清澈透明,配液罐底部无沉淀,溶液存放在成品罐中,进行标识。
在试剂R1的制备中,第一缓冲液A和第一缓冲液B包括PBS缓冲液、HEPES缓冲液、MES缓冲液、Tris缓冲液、甘氨酸缓冲体系等中的一种或几种的组合。
在试剂R1的制备中,电解质包括氯化钠、氯化钾、氯化镁、硫酸镁中一种或两种以上的混合物。
在试剂R1的制备中,高分子促进剂包括聚乙二醇8000、聚乙二醇6000、聚乙二醇4000、聚乙二醇2000等中的一种。
在试剂R1的制备中,第一防腐剂包括叠氮钠、Proclin-950、Proclin-300、硫柳汞等中的一种。
在试剂R2的制备中,第二缓冲液A和第二缓冲液B包括BPBS缓冲液、HEPES缓冲液、甘氨酸缓冲体系、MES缓冲液、MOPSO缓冲液、Tris缓冲液等中的一种或几种。
在试剂R2的制备中,稳定剂包括牛血清白蛋白、酪蛋白、明胶、甘露醇中的一种或几种。
在试剂R2的制备中,第二防腐剂包括叠氮钠、Proclin-950、Proclin-300、硫柳汞等中的一种。
在试剂R2的制备中,生物素结合α1-抗胰蛋白酶抗体比例为1:1-4:1之间,链霉亲和素结合生物素-α1-抗胰蛋白酶抗体比例为1:1-4:1之间。
与现有技术相比,本发明所达到的技术效果是:采用级联放大反应,即α1-抗胰蛋白酶抗体连接生物素混合,再与链霉亲和素混合反应,可明显改善重复性和灵敏度,线性范围可做到0.10-6.00g/L,该发明具有操作简单、快速检测、灵敏度高、稳定性好的特点,能够适用于全自动生化分析仪。
附图说明
图1是本发明实施例5未采用级联放大反应R2试剂的定标曲线图。其中X轴表示标准品浓度,Y轴表示dOD。
图2是本发明实施例6采用级联放大反应R2试剂的定标曲线图。其中X轴表示标准品浓度,Y轴表示dOD。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述:
实施例一:
α1-抗胰蛋白酶免疫比浊法检测试剂盒的制备方法,包括如下制备步骤:
A:试剂R1的制备:
在配液罐中先加入部分纯化水于磁力搅拌器上,调节搅拌子至中档转速,使溶液保持中速转动状态,边搅拌边投入浓度为1.6g/L的二水合磷酸二氢钠、浓度为8.75g/L的十二水合磷酸氢二钠、浓度为8.0g/L的氯化钠、浓度为60g/L的聚乙二醇6000、浓度为0.8ml/L的Proclin-950,搅拌20分钟至物料完全溶解、溶液清澈透明配液罐底部无沉淀后,调节pH值到7.00之间,继续搅拌5分钟至全部物料完全溶解,溶液清澈透明,配液罐底部无沉淀,定容至最终体积,
定容后的溶液存放在成品罐中,进行标识;
B:试剂R2的制备:
在配液罐中先加入部分纯化水于磁力搅拌器上,打开磁力搅拌器电源开关,调节搅拌子至中档转速,使溶液保持中速转动状态,边搅拌边投入浓度为1.6g/L的二水合磷酸二氢钠,浓度为8.75g/L的十二水合磷酸氢二钠,浓度为8.0g/L的氯化钠,浓度为1g/L的牛血清白蛋白,浓度为0.8ml/L的Proclin-950,搅拌20分钟至物料完全溶解,溶液清澈透明配液罐底部无沉淀后,调节pH值到6.00之间,继续搅拌5分钟;
烧杯中以5g/L标准加入生物素于磁力搅拌器上,打开磁力搅拌器电源开关,调节搅拌子至中档转速,使溶液保持中速转动状态,边搅拌边加入15mg/L标准的α1-抗胰蛋白酶抗体,搅拌2h反应,反应结束后透析去除游离抗体,以5g/L标准加入链霉亲和素反应2,反应结束后透析去除未结合的生物素-抗体;
最后把链霉亲和素-生物素-α1-抗胰蛋白酶抗体加入配液罐中,继续搅拌20分钟至溶液清澈透明,配液罐底部无沉淀,溶液存放在成品罐中,进行标识。
在试剂R2的制备中,生物素结合α1-抗胰蛋白酶抗体比例为1:2之间,链霉亲和素结合生物素-α1-抗胰蛋白酶抗体比例为1:1之间。
实施例二:
α1-抗胰蛋白酶免疫比浊法检测试剂盒的制备方法,包括如下制备步骤:
A:试剂R1的制备:
在配液罐中先加入部分纯化水于磁力搅拌器上,调节搅拌子至中档转速,使溶液保持中速转动状态,边搅拌边投入浓度为2.6g/L的二水合磷酸二氢钠、浓度为13g/L的十二水合磷酸氢二钠、浓度为12g/L的氯化钾、浓度为80g/L的聚乙二醇8000、浓度为1.2ml/LProclin-300,搅拌22分钟至物料完全溶解、溶液清澈透明配液罐底部无沉淀后,调节pH值到8.00之间,继续搅拌7分钟至全部物料完全溶解,溶液清澈透明,配液罐底部无沉淀,定容至最终体积,
定容后的溶液存放在成品罐中,进行标识;
B:试剂R2的制备:
在配液罐中先加入部分纯化水于磁力搅拌器上,打开磁力搅拌器电源开关,调节搅拌子至中档转速,使溶液保持中速转动状态,边搅拌边投入浓度为2.6g/L的二水合磷酸二氢钠,浓度为13g/L的十二水合磷酸氢二钠,浓度为12g/L的氯化钠,浓度为2g/L的酪蛋白,浓度为1.2ml/L的Proclin-300,搅拌22分钟至物料完全溶解,溶液清澈透明配液罐底部无沉淀后,调节pH值到6.5之间,继续搅拌6分钟;
烧杯中以10g/L标准加入生物素于磁力搅拌器上,打开磁力搅拌器电源开关,调节搅拌子至中档转速,使溶液保持中速转动状态,边搅拌边加入22mg/L标准的α1-抗胰蛋白酶抗体,搅拌3h反应,反应结束后透析去除游离抗体,以10g/L标准加入链霉亲和素反应3h,反应结束后透析去除未结合的生物素-抗体;
最后把链霉亲和素-生物素-α1-抗胰蛋白酶抗体加入配液罐中,继续搅拌24分钟至溶液清澈透明,配液罐底部无沉淀,溶液存放在成品罐中,进行标识。
在试剂R2的制备中,生物素结合α1-抗胰蛋白酶抗体比例为1:2之间,链霉亲和素结合生物素-α1-抗胰蛋白酶抗体比例为1:1之间。
实施例三:
α1-抗胰蛋白酶免疫比浊法检测试剂盒的制备方法,包括如下制备步骤:
A:试剂R1的制备:
在配液罐中先加入部分纯化水于磁力搅拌器上,调节搅拌子至中档转速,使溶液保持中速转动状态,边搅拌边投入浓度为3.6g/L的二水合磷酸二氢钠、浓度为19g/L的十二水合磷酸氢二钠、浓度为10g/L的氯化镁、浓度为100g/L的聚乙二醇4000、浓度为1.6ml/L叠氮钠,搅拌27分钟至物料完全溶解、溶液清澈透明配液罐底部无沉淀后,调节pH值到9.00之间,继续搅拌7分钟至全部物料完全溶解,溶液清澈透明,配液罐底部无沉淀,定容至最终体积,
定容后的溶液存放在成品罐中,进行标识;
B:试剂R2的制备:
在配液罐中先加入部分纯化水于磁力搅拌器上,打开磁力搅拌器电源开关,调节搅拌子至中档转速,使溶液保持中速转动状态,边搅拌边投入浓度为3.6g/L的二水合磷酸二氢钠,浓度为19g/L的十二水合磷酸氢二钠浓度为16g/L的氯化钠,浓度为3g/L的明胶,浓度为1.6ml/L的叠氮钠,搅拌27分钟至物料完全溶解,溶液清澈透明配液罐底部无沉淀后,调节pH值到7.0之间,继续搅拌7分钟;
烧杯中以15g/L标准加入生物素于磁力搅拌器上,打开磁力搅拌器电源开关,调节搅拌子至中档转速,使溶液保持中速转动状态,边搅拌边加入30mg/L标准的α1-抗胰蛋白酶抗体,搅拌3h反应,反应结束后透析去除游离抗体,以15g/L标准加入链霉亲和素反应4h,反应结束后透析去除未结合的生物素-抗体;
最后把链霉亲和素-生物素-α1-抗胰蛋白酶抗体加入配液罐中,继续搅拌27分钟至溶液清澈透明,配液罐底部无沉淀,溶液存放在成品罐中,进行标识。
在试剂R2的制备中,生物素结合α1-抗胰蛋白酶抗体比例为1:2之间,链霉亲和素结合生物素-α1-抗胰蛋白酶抗体比例为1:1之间。
实施例四:
α1-抗胰蛋白酶免疫比浊法检测试剂盒的制备方法,包括如下制备步骤:
A:试剂R1的制备:
在配液罐中先加入部分纯化水于磁力搅拌器上,调节搅拌子至中档转速,使溶液保持中速转动状态,边搅拌边投入浓度为4.8g/L的二水合磷酸二氢钠、浓度为24.31g/L的十二水合磷酸氢二钠、浓度为20.0g/L的硫酸镁、浓度为120g/L的聚乙二醇2000、浓度为2.0ml/L硫柳汞,搅拌30分钟至物料完全溶解、溶液清澈透明配液罐底部无沉淀后,调节pH值到9.50之间,继续搅拌10分钟至全部物料完全溶解,溶液清澈透明,配液罐底部无沉淀,定容至最终体积,
定容后的溶液存放在成品罐中,进行标识;
B:试剂R2的制备:
在配液罐中先加入部分纯化水于磁力搅拌器上,打开磁力搅拌器电源开关,调节搅拌子至中档转速,使溶液保持中速转动状态,边搅拌边投入浓度为4.8g/L的二水合磷酸二氢钠,浓度为24.31g/L的十二水合磷酸氢二钠,浓度为20.0g/L的氯化钠,浓度为5g/L的甘露醇,浓度为2.0ml/L的硫柳汞,搅拌30分钟至物料完全溶解,溶液清澈透明配液罐底部无沉淀后,调节pH值到7.50之间,继续搅拌10分钟;
烧杯中以20g/L标准加入生物素于磁力搅拌器上,打开磁力搅拌器电源开关,调节搅拌子至中档转速,使溶液保持中速转动状态,边搅拌边加入40mg/L标准的α1-抗胰蛋白酶抗体,搅拌4h反应,反应结束后透析去除游离抗体,以20g/L标准加入链霉亲和素反应4h,反应结束后透析去除未结合的生物素-抗体;
最后把链霉亲和素-生物素-α1-抗胰蛋白酶抗体加入配液罐中,继续搅拌30分钟至溶液清澈透明,配液罐底部无沉淀,溶液存放在成品罐中,进行标识。
在试剂R2的制备中,生物素结合α1-抗胰蛋白酶抗体比例为1:2之间,链霉亲和素结合生物素-α1-抗胰蛋白酶抗体比例为1:1之间。
实施例五:
采用R2试剂未采用级联放大反应,使用标准品进行定标,结果如表1所示,定标曲线如图1所示。
表1:R2试剂未采用级联放大反应定标结果
校准品浓度(g/L) | dOD |
0.00 | 9 |
0.75 | 567 |
1.50 | 1082 |
3.00 | 2129 |
6.00 | 2216 |
结果解析:如图1和表1所示,校准品浓度大于4.0g/L时出现hook效应。
采用R2试剂采用级联放大反应,使用标准品进行定标,结果如表1所示,定标曲线如图1所示。
表2:R2试剂采用级联放大反应定标结果:
校准品浓度(g/L) | dOD |
0.00 | 11 |
0.75 | 583 |
1.50 | 1329 |
3.00 | 2541 |
6.00 | 3473 |
结果解析:如图2和表2所示,线性范围可做到0.10-6.00g/L。
实施例六:
精密度CV检测:
R2试剂未采用级联放大反应,使用全自动生化分析仪对同一样本重复检测10次,检测结果如表3所示。
表3:检测样本的α1-抗胰蛋白酶(10次)及变异系数
结果解析:精密度CV>6%,线性范围下端的精密度CV更大,灵敏度较低。
R2试剂采用级联放大反应,使用全自动生化分析仪对同一样本重复检测10次,检测结果如表4所示。
表4:检测样本的α1-抗胰蛋白酶(10次)及变异系数
结果解析:精密度CV<5%。
结果分析:采用级联放大反应,即α1-抗胰蛋白酶抗体连接生物素2:1,再与链霉亲和素1:1混合反应,可明显改善重复性和灵敏度,线性范围可做到0.10-6.00g/L,该发明具有操作简单、快速检测、灵敏度高、稳定性好的特点,能够适用于全自动生化分析仪。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点,其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施,并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰,都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.α1-抗胰蛋白酶免疫比浊法检测试剂盒的制备方法,其特征在于:包括如下制备步骤:
A:试剂R1的制备:
在配液罐中先加入部分纯化水于磁力搅拌器上,调节搅拌子至中档转速,使溶液保持中速转动状态,边搅拌边投入浓度为1.6-4.8g/L的第一缓冲液A、浓度为8.75-24.31g/L的第一缓冲液B、浓度为8.0-20.0g/L的电解质、浓度为60-120g/L的高分子促进剂、浓度为0.8-2.0ml/L第一防腐剂,搅拌20-30分钟至物料完全溶解、溶液清澈透明配液罐底部无沉淀后,调节pH值到7.00-9.50之间,继续搅拌5-10分钟至全部物料完全溶解,溶液清澈透明,配液罐底部无沉淀,定容至最终体积,
定容后的溶液存放在成品罐中,进行标识;
B:试剂R2的制备:
在配液罐中先加入部分纯化水于磁力搅拌器上,打开磁力搅拌器电源开关,调节搅拌子至中档转速,使溶液保持中速转动状态,边搅拌边投入浓度为1.6-4.8g/L的第二缓冲液A,浓度为8.75-24.31g/L的第二缓冲液B,浓度为8.0-20.0g/L的氯化钠,浓度为1-5g/L的稳定剂,浓度为0.8-2.0ml/L的第二防腐剂,搅拌20-30分钟至物料完全溶解,溶液清澈透明配液罐底部无沉淀后,调节pH值到6.00-7.50之间,继续搅拌5-10分钟;
烧杯中以5-20g/L标准加入生物素于磁力搅拌器上,打开磁力搅拌器电源开关,调节搅拌子至中档转速,使溶液保持中速转动状态,边搅拌边加入15-40mg/L标准的α1-抗胰蛋白酶抗体,搅拌2-4h反应,反应结束后透析去除游离抗体,以5-20g/L标准加入链霉亲和素反应2-4h,反应结束后透析去除未结合的生物素-抗体;
最后把链霉亲和素-生物素-α1-抗胰蛋白酶抗体加入配液罐中,继续搅拌20-30分钟至溶液清澈透明,配液罐底部无沉淀,溶液存放在成品罐中,进行标识。
2.根据权利要求1所述的α1-抗胰蛋白酶免疫比浊法检测试剂盒的制备方法,其特征在于:在试剂R1的制备中,第一缓冲液A和第一缓冲液B包括PBS缓冲液、HEPES缓冲液、MES缓冲液、Tris缓冲液、甘氨酸缓冲体系等中的一种或几种的组合。
3.根据权利要求1所述的α1-抗胰蛋白酶免疫比浊法检测试剂盒的制备方法,其特征在于:在试剂R1的制备中,电解质包括氯化钠、氯化钾、氯化镁、硫酸镁中一种或两种以上的混合物。
4.根据权利要求1所述的α1-抗胰蛋白酶免疫比浊法检测试剂盒的制备方法,其特征在于:在试剂R1的制备中,高分子促进剂包括聚乙二醇8000、聚乙二醇6000、聚乙二醇4000、聚乙二醇2000等中的一种。
5.根据权利要求1所述的α1-抗胰蛋白酶免疫比浊法检测试剂盒的制备方法,其特征在于:在试剂R1的制备中,第一防腐剂包括叠氮钠、Proclin-950、Proclin-300、硫柳汞等中的一种。
6.根据权利要求1所述的α1-抗胰蛋白酶免疫比浊法检测试剂盒的制备方法,其特征在于:在试剂R2的制备中,第二缓冲液A和第二缓冲液B包括BPBS缓冲液、HEPES缓冲液、甘氨酸缓冲体系、MES缓冲液、MOPSO缓冲液、Tris缓冲液等中的一种或几种。
7.根据权利要求1所述的α1-抗胰蛋白酶免疫比浊法检测试剂盒的制备方法,其特征在于:在试剂R2的制备中,稳定剂包括牛血清白蛋白、酪蛋白、明胶、甘露醇中的一种或几种。
8.根据权利要求1所述的α1-抗胰蛋白酶免疫比浊法检测试剂盒的制备方法,其特征在于:在试剂R2的制备中,第二防腐剂包括叠氮钠、Proclin-950、Proclin-300、硫柳汞等中的一种。
9.根据权利要求1所述的α1-抗胰蛋白酶免疫比浊法检测试剂盒的制备方法,其特征在于:在试剂R2的制备中,生物素结合α1-抗胰蛋白酶抗体比例为1:1-4:1之间,链霉亲和素结合生物素-α1-抗胰蛋白酶抗体比例为1:1-4:1之间。
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