CN101178408A - 载脂蛋白e4 elisa试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了载脂蛋白E4 ELISA试剂盒及其制备方法，应用纯化的人载脂蛋白E4制备抗人ApoE4抗体，亲和纯化后包被酶标板。试剂盒组成包括抗人ApoE4单克隆抗体包被的酶标板、酶标记抗体、ApoE4标准品冻干粉、样品稀释液、TMB底物显色液、浓缩洗涤液和终止反应液。固定在酶标板微孔表面上的抗体捕获标准液或样品液中的ApoE4，酶标记抗体识别ApoE4并与之结合，形成抗体－ApoE4－抗体－酶的复合物，酶与底物反应显色后测出吸光度，从标准曲线计算出样本中ApoE4浓度。该试剂盒检测人血清、血浆或脑脊液中载脂蛋白E4浓度，具有灵敏、快捷、简便、准确的优点，为体外诊断确定ApoE4基因型及基因剂量提供了有效的手段。
Description
技术领域
本发明涉及一种定量检测人血清、血液或脑脊液中载脂蛋白E4酶联免疫吸附分析(ELISA)试剂盒及其制备方法。
背景技术
载脂蛋白(ApoE)为由299个已知序列氨基酸构成的单链蛋白，分子量为34.2kDa，是人血浆蛋白中主要脂蛋白如乳糜微滴、极低密度脂蛋白和高密度脂蛋白等组成部分，由肝、脑及其它器官组织合成。ApoE参与甘油三脂--胆固醇在细胞间的转运和体内代谢，在脂蛋白代谢中起重要作用。ApoE还参与体内脂代谢过程中几种和酶蛋白活性的调节(Mahley RW，Rall SCJr，2000，Apolipoprotein E：far more than a lipid transport protein，Annu RevGenomics Human Genet，1：507-537)。
ApoE的基因编码定位在第19染色体的长臂(19q13.32)上含多个多态位点，基因的2059(T/C)及2197(C/T)位置处的两个单核苷酸多态型(single-nucleotide polymorphisms，SNPs)确定了ApoE的三个常见异构型：ApoE2，ApoE3，ApoE4，确定途径是基因的编码子编码成熟蛋白的112及158位点处的氨基酸。2059-T等位基因确定112位点处的半胱氨酸(Cys112)，2059-C等位基因确定同一位点的精氨酸(Arg112)；2197-C等位基因确定158位点处的精氨酸(Arg158)，2197-T等位基因确定该位点处的半胱氨酸(Cys158)。人群中分布最广的是ApoE3异构型(Cys112/Arg158)；分布稀少的ApoE2异构型(Cys112/Cys158)使个体中的ApoE受体的亲和性下降，易患高血脂症。分布少的ApoE4异构型(Arg112/Arg158)因增加个体体内极低密度脂蛋白(VLDL)的肝脏合成，故提高了阿尔茨海默症(Alzheimer’s disease，AD)和其他神经类疾病发生的危险性(Pantelidis P et al，2003，Simplesequence-specific-primer-PCR method to identify the three main apolipoprotein Ehaplotypes，Clin Chem，49：1945-1948)。人体组织液中存在由这三种异构体组成的六种不同表型，即E2/E2，E3/E3、E4/E4三种纯合子和E2/E3，E3/E4，E2/E4三种杂合子(Rall SC，Weisgraber KH，Mahley RW，1982，Human apolipoproteinE：the complete amino acid sequence，J Biol Chem，257：4171-4178)。
血液和脑脊液中ApoE4基因型及基因剂量可直接作为AD，精神抑郁症，帕金森氏病等神经系统疾病患病危险性的临床辅助诊断指标(DavignonJ，Gregg R，Sing C，1998，Apolipoprotein E polymorphism and atherosclerosis，Arteriosclerosis，8：1-21)。
测定人组织液中ApoE4基因型及基因剂量的方法有等位点聚焦电泳(KaneJW，Gowland E，1986，A method for the identification of apolipoprotein E isoformsemploying chemical precipitation and flat bed isoelectric focusing in agarose，AnnClin Biochem，23：509-513)，DNA测序(Parker S et al，1993，Application ofdenaturing gradient gel electrophoresis to detecet DNA sequence differencesencoding apolipoprotein E isoforms，Genomics，16：245-247)，RT-PCR(Bemard PS etal，1999，Color multiplexing hybridization probes using the apolipoprotein E locus asa model system for genotyping，Anal Biochem，273：221-228)等，这些科研测定方法要求的技术较强，难以在临床诊断中推广。ELISA方法经20多年来技术的不断完善，如抗原、抗体的生产、分离纯化；酶标记抗体的制备、纯化，酶底物显色(或荧光、化学发光)系统的改进，具有特异性强，灵敏度高，在体外临床诊断中使用方便、快速(Uchida Y et al，2000，Sandwich ELISA for measurementof ApoE4 levels in serum and the estimation of the allelic status of ApoE4isoforms，J Clin Lab Anal，14：260-264)。
发明内容
本发明的目的在于提供一种灵敏度高、特异性强、使用方便、快速的定量检测人血清、血浆或脑脊液中的载脂蛋白E4浓度的ELISA试剂盒及其制备方法。
本发明的载脂蛋白E4(Apolipoprotein E4，ApoE4)ELISA试剂盒，其组成包括抗人ApoE4单克隆抗体包被的酶标板、酶标记抗体、ApoE4标准品冻干粉、样品稀释液、TMB底物显色液、浓缩洗涤液和终止反应液；其中：
酶标记抗体：辣根过氧化物酶标记的抗人ApoE多克隆抗体；
TMB底物显色液：2.08mmol/L3，3’，5，5’-四甲基联苯胺，12mmol/L过氧化氢，10mmol/Lβ-环糊精，0.1mol/L pH5.0的醋酸缓冲液；
样品稀释液：10mmol/L pH7.4-7.6的磷酸盐缓冲液中含有1％BSA，0.05％Tween-20和1mg/L庆大霉素；
浓缩洗涤液：0.1mol/L pH7.4-7.6的磷酸盐缓冲液中含有1％胎牛血清，0.5％Tween-20和20mg/L庆大霉素；
终止反应液：1.0mol/L H2SO4。
载脂蛋白E4ELISA试剂盒的制备方法：其中所述抗人ApoE4单克隆抗体及酶标记抗体的制备方法是：
(1)抗人ApoE4单克隆抗体的制备：用重组纯化的人载脂蛋白E4免疫小鼠，制备特异性的抗人ApoE4单克隆抗体；
(2)抗体的纯化：将步骤(1)中制得的抗血清，过葡萄球菌蛋白A-Separose CL-4B柱，浓缩、透析，得纯化的抗体；
(3)酶标记抗体的制备：用辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidose，HRP)标记抗人ApoE多克隆抗体；
(4)酶标板包被：用步骤(2)中所得的纯化抗体包被96孔(12×8)酶标板，并封闭、抛光。
载脂蛋白E4ELISA试剂盒的使用方法，包括如下操作步骤：
(1)加入样品和标准品到相应的酶标板微孔中，使样品或标准品中的载脂蛋白E4与固相载体上的抗体结合，洗去未结合的杂蛋白和其他物质；
(2)使已结合的载脂蛋白E4与HRP标记的抗人ApoE多克隆抗体相结合，洗去多余的酶标抗体；
(3)加入TMB酶底物显色液，室温孵育反应，终止酶反应后检测显色反应的强度。
本发明的有益效果在于：
本发明建立了双抗夹心ELISA方法间接测定样品中的载脂蛋白E4含量，检测灵敏度小于8.0ng/ml，剂量-反应曲线的线性相关系数＞0.980，具有灵敏、快捷、简便、准确的优点，利用本发明的试剂盒，结合测定同一样本中载脂蛋白E的浓度，可以确定ApoE4基因型及基因剂量，为体外诊断确定ApoE4基因型及基因剂量提供了有效的手段。
具体实施方法
以下结合实施例进一步说明本发明。
实施例1
本发明的载脂蛋白E4 ELISA试剂盒，其组成包括抗人ApoE4单克隆抗体包被的酶标板、酶标记抗体、ApoE4标准品冻干粉、样品稀释液、TMB底物显色液、浓缩洗涤液和终止反应液；其中：
酶标记抗体：辣根过氧化物酶标记的抗人ApoE多克隆抗体；
TMB底物显色液：2.08mmol/L3，3’，5，5’-四甲基联苯胺，12mmol/L过氧化氢，10mmol/Lβ-环糊精，0.1mol/L pH5.0的醋酸缓冲液；
样品稀释液：10mmol/L pH7.4-7.6的磷酸盐缓冲液中含有1％BSA，0.05％Tween-20和1mg/L庆大霉素；
浓缩洗涤液：0.1mol/L pH7.4-7.6的磷酸盐缓冲液中含有1％胎牛血清，0.5％Tween-20和20mg/L庆大霉素；
终止反应液：1.0mol/L H2SO4。
上述的酶标板为96孔(12条8孔或8条12孔)。
载脂蛋白E4ELISA试剂盒的制备方法：
1.抗人ApoE4单克隆抗体的制备
1.1杂交瘤细胞培养克隆和生产
1.1.1材料
(1)HAT选择培养液；
(2)2％(W/V)甲基纤维素，用培养液配制；
(3)A液：含53.3％(V/V)FCS，2.66％(V/V)HAT贮备液，8×106胸腺细胞，133μg/ml用培养液配制的脂多糖(LPS)；
(4)含15％，5％，2.5％FCS(或新生牛血清)的DMEM培养液；
(5)CO2细胞培养箱，培养瓶，注射器，18号针头，35mm和100mm直径的培养平皿，24孔培养板，混合器等。
1.1.2步骤
(1)将融合后的杂交瘤细胞悬浮在15ml A液中；
(2)用无针头注射器加入25ml 2％甲基纤维素溶液；
(3)用指头轻弹使之混合后，在混合器上混合几秒钟；
(4)用装有18号针头的注射器吸1ml该悬液，放入直径35mm的培养平皿中，且使之均匀展开；
(5)在100mm直径的培养平皿内放入2个上述小平皿和1个开口并盛有1ml水的小平皿，然后在37℃5％CO2条件下培养(培养皿中各成分的终浓度为：甲基纤维素，1.25％；FCS，20％；HAT，1％；LPS，50μg/ml；胸腺细胞，3×106/ml；脾细胞，2.5×106/ml；瘤细胞，2.5×106/ml)；
(6)9天后开始用倒置显微镜检查克隆，每2-3天观察1次；
(7)当克隆达到0.5mm直径以上时，用毛细滴管将其转移到1ml HAT培养液的小培养皿内；
(8)当细胞达到5×105-106/ml时，检查有无抗体存在，若存在则继续下一步骤，若不存在则重复步骤(1)-(7)；
(9)确证得到分泌单抗的细胞克隆后，将细胞克隆移种于24孔培养板培养，待细胞生长良好后，再移种于组织培养管，最后移种于组织培养瓶中生长；培养液中血清量由15％降为5％，细胞浓度以5×104-105为好；
(10)将约20ml细胞悬液接种于800ml容量的组织培养瓶内，用含2.5％FCS或新生牛血清的DMEM培养液稀释至50ml；在37℃10％CO2的干培养箱中加盖培养；1-2天后，加入150ml样品液再继续培养2天或更长时间，达稳定期后至少1天。离心收集上清培养液。
1.2杂交瘤细胞动物体内繁殖法生产单抗
1.2.1材料
(1)液体石蜡(或降植烷)；(2)BALB/C纯系小鼠(已在15-20天前经腹腔注射入0.5ml/鼠液体石蜡(或降植烷))；(3)PBS；(4)杂交瘤细胞(1-5×107/ml)；(5)注射器，离心机等。
1.2.2步骤
(1)组织培养液中培养健康生长的杂交瘤细胞，至适当繁殖后计数，400×g离心，吸出上清；
(2)收集细胞在适量PBS溶液(或无血清的培养液)中悬浮，计数，然后将细胞浓度调节到1-5×107/ml；
(3)将细胞悬液吸到5ml注射器中，左手固定好小鼠，用右手将细胞注入其腹腔；每只小鼠注入0.5ml(含细胞1-5×107个)；
(4)每天观察注入细胞后的小鼠，通常7-10天，当小鼠腹部明显肿胀，象正常怀孕的母鼠时，及时采集腹水和血清；
(5)左手固定小鼠，用乙醇消毒腹部皮肤后在小鼠下面放一收集试管，用消毒灭菌过的21g针头刺入腹腔，让腹水滴入管内；当液滴停止时，可轻轻移动针头，或轻揉鼠的腹部，让腹水继续滴出，滴完(约收集2-5ml腹水)；
(6)将小鼠采血，分离血清；
(7)腹水以1500×g离心10min，收集上清液贮存在-20℃下。
2.抗体纯化
2.1材料
(1)葡萄球菌蛋白A-Sepharose CL-4B；(2)0.4mol/L PBS，pH6.0，pH8.0；
(3)0.2mol/L PB，PH3.5，pH4.5； (4)7mol/L脲； (5)注射器等。
2.2步骤
(1)将1g葡萄球菌蛋白A-Sepharose CL-4B浸泡悬浮在pH8.0的PBS中，脱气后装柱；
(2)将样品(约4ml腹水或200ml无血清培养液对pH8.0的PBS透析平衡)；
(3)将透析平衡后的样品液加入色谱柱中，流速为0.5-1.0ml/min；
(4)用pH6.0的PBS洗脱IgG1；用pH4.5的PB洗脱IgG2a；用pH3.5的PB洗脱IgG2b。
流速均为1ml/min；
(5)用收集管分别收集各组洗脱液，并用A280nm监测洗脱液；将各类IgG蛋白分别合并，保存；
(6)将葡萄球菌蛋白A-Sepharose CL-4B柱再生，平衡待用。
3.抗体效价的测定
(1)用1.0μg/ml浓度纯化的重组人ApoE4包被酶标板，3％BSA溶液封闭；
(2)将购得的已知效价的标准抗人ApoE4单抗(Biodesign公司)倍比稀释成标准系列加入标准孔中，每孔100ul；
(3)自制纯化的抗体适度倍比稀释后加入样品孔，每孔100ul；
(4)37℃下孵育30min后洗板三次，最后拍干；
(5)样品和标准孔中各自加入100μl HRP-羊抗兔IgG1(1∶1000，晶美生物工程公司)，37℃孵育30min，再洗板三次，拍干；
(6)每孔加入TMB酶底物/显色液100μl。室温孵育15min；
(7)每孔加入100μl 1mol/L H2SO4终止液终止反应，在酶标仪的450nm波长下测出各孔的吸光度值；
(8)以标准品系列的各平均吸光度值对其相应效价计算出剂量-反应曲线，将样品的平均吸光度值代入剂量-反应曲线计算出自制纯化的抗体效价。
4.酶标记抗体的制备
4.1材料
(1)辣根过氧化物酶(HRP，RZ＞3.2，活性＞200U/ml)；
(2)N-琥珀酰咪唑基-3-(2-吡啶二硫基)丙烷酸(SPDP)；
(3)抗人ApoE抗体；
(4)二硫苏糖醇(DTT)；
(5)PBS(0.1mol/L磷酸，0.1mol/L NaCl，0.001mol/L EDTA，0.02％硫柳汞，pH7.5)；
(6)无水乙醇；
(7)Sephadex G-25F凝胶柱；Sephacryl S-200HR凝胶柱等。
4.2步骤
(1)溶解10mgHRP在1.0ml硼酸盐缓冲液(0.05mol/L硼酸，0.3mol/LNaCl，0.5％正丁醇，pH9.0)中，搅拌下逐滴加入含150μg SPDP的无水乙醇溶液25μl；
(2)室温下搅拌反应30min后，将(1)配制的HRP溶液加入已用PBS预先平衡的Sephadex G-25F柱中，然后用PBS洗脱，收集10-20ml洗脱液，4℃下避光贮存；
(3)溶解25mg抗人ApoE抗体于2.5ml硼酸盐缓冲液中，搅拌下逐滴加入30μl含185μgSPDP的无水乙醇溶液；
(4)室温下搅拌反应30min后，抗体溶液加到用醋酸盐缓冲液(0.1mol/L醋酸，0.1mol/L NaCl，0.001mol/L EDTA，0.02％硫柳汞，pH4.5)平衡好的SephadexG-25F柱中，用平衡液洗脱，收集10-12ml溶液；
(5)用Amicon PM10膜将抗体衍生化溶液超滤浓缩至2.5ml，搅拌下加入0.5ml含22mgDTT的醋酸盐缓冲液；
(6)室温下搅拌反应30min后，将溶液加入用充氮驱氧的PBS平衡的Sephadex G-25F柱中，然后用该PBS洗脱，收集17-20ml洗脱液；
(7)将上述处理过的酶溶液和抗体溶液室温下混合反应20小时，再用Amicon PM10膜超滤浓缩至5ml，加入PBS(0.025mol/L磷酸，0.15mol/L NaCl，pH7.4)平衡的Sephacryl S-200HR柱中，用PBS以0.5ml/min速度洗脱；
(8)以2min收集1ml洗脱液的速度收集洗脱液，并监测A280nm和A403nm，决定哪些管的洗脱液是酶标记抗体溶液；
(9)合并收集的酶标记抗体溶液，冷冻干燥后-20℃下贮存。
5.酶标板包被
(1)用包被液(0.05mol/L碳酸缓冲液，pH9.6)适当稀释抗体溶液成10μg/ml，混匀；待包被的活化处理过的酶标板微孔内每孔加入100μl 10μg/ml的抗体溶液；
(2)酶标板膜封后4℃下反应过夜；
(3)倒掉包被的抗体溶液，洗板，每孔加入250μl 3％BSA封闭液，4℃下封闭过夜；
(4)倒空封闭液，用洗涤液洗板4次；
(5)每孔加入300μl抛光液，反应2小时后，倒去抛光液，在纸巾上拍干；
(6)将酶标板真空干燥后，密封入带干燥剂的金属箔袋内，在4℃下贮存；
6.载脂蛋白E4定量检测的ELISA系统建立及使用
(1)酶标板条安装
已包被的酶标板条平衡至室温后，开启包装袋，取出所需用数目的酶标板条，牢固地安装在酶标板框架上。不需用的酶标板置于包装袋中，驱气密封好，放在2-8℃下贮存。
(2)样品孵育
①移取100μl标准液系列和稀释后的样品加入到相应的包被抗体的酶标板孔中；空白孔中只加入100μl样品稀释液；
②用酶标板盖盖好孔，在37℃下孵育45分钟。
(3)洗板
吸走或倒空孔中液体，用自动洗板仪洗板，洗板4次后拍干。
(4)酶标记抗体孵育
①倒酶标记抗体溶液于容器中，用移液器每孔加入100μl交联剂溶液；
②盖好酶标板，在37℃下孵育反应用45分钟；如步骤(3)洗板4次。
(5)底物反应显色
每孔加入100μlTMB酶底物/显色液，轻轻晃摇30秒钟，室温静置反应15分钟。
(6)终止反应检测
每孔加入100μl终止液，20分钟内在酶标仪的450nm波长下测出每孔的吸光度值。
(7)结果计算
计算重复孔的平均吸光度值；以标准溶液系列的平均吸光度值的对数值对相应浓度的对数值进行线性回归，构建剂量-反应曲线；由样品重复孔的平均吸光度值从剂量-反应曲线计算出样品液的ApoE4含量。
实施例2 实际血清样本检测试剂盒的分析内精密度(CV％)和确定ApoE4基因型及基因剂量
用前述载脂蛋白E4 ELISA试剂盒的使用方法测定随机抽取三份体检的血液样本制成血清样品中的ApoE4浓度并计算方法的分析内精密度(表1)和92例体检健康者的血清样品确定ApoE4基因型(表2)。
表1.试剂盒ELISA方法的分析内精密度
| 血清标本 | NO.1 | NO.2 | NO.3 |
| 重复测定次数 | 10 | 10 | 10 |
| ApoE4浓度(ng/ml) | 67.5 | 245.5 | 162.9 |
| CV％ | 9.7 | 6.9 | 8.1 |
表2.ELISA方法确定ApoE4的基因型
| 基因型 | N | ApoE4(mg/L) | ApoE(mg/L) | ApoE4/ApoE比值 | 基因剂量 |
| E2/E2，E2/E3，E3/E3 | 79 | 0.68±0.55 | 49.8±16.6 | 0.01 | 0 |
| E2/E4，E3/E4 | 11 | 43.7±11.1 | 80.4±12.3 | 0.54 | 1/2 |
| E4/E4 | 2 | 39.2±8.4 | 38.1±9.5 | 1.03 | 1 |
检测结果表明，应用本发明的试剂盒的检测精密度符合ELISA质量指标的标准要求，分析灵敏度小于8.0ng/ml，可确定ApoE4的基因型，适用于实际临床检测。
实施例3应用本发明的试剂盒检测451例年龄60-90岁的体检老年人(其中正常对照95例(男42例、女53例)，非脂肪肝(nonfatty liver，NFL)组125例(男59例、女66例)，非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver，NAFL)组126例(男60例、女66例)，NAFL+MS(老年代谢综合症(metabolicsyndrome，MS)组105例(男52例、女53例))血清中ApoE4水平，结果如下表：
| 组别 | 正常对照组 | NFL组 | NAFL组 | MS+NAFL组 |
| 例数 | 95 | 125 | 126 | 105 |
| ApoE4浓度(ng/ml) | 35.0±22.7 | 34.4±27.0 | 48.4±35.3* | 49.8±21.4* |
注：*表示显著差异(ρ＜0.01)
结果提示血液中ApoE4浓度在老年体内脂代谢障碍患者身上也有升高的趋势，其中E4/E4基因型占NAFL组的0.8％、占MS+NAFL组的3.8％，而正常对照组和NFL组均为0％；E2/E4、E3/E4型占NAFL组的1.1％、占MS+NAFL组的13.3％、占NFL组的2.8％，而正常对照组为0％。
Claims (3)
1.载脂蛋白E4 ELISA试剂盒，其特征在于该试剂盒的组成包括抗人ApoE4单克隆抗体包被的酶标板、酶标记抗体、ApoE4标准品冻干粉、样品稀释液、TMB底物显色液、浓缩洗涤液和终止反应液；其中：
酶标记抗体：辣根过氧化物酶标记的抗人ApoE多克隆抗体；
TMB底物显色液：2.08mmol/L3，3’，5，5’-四甲基联苯胺，12mmol/L过氧化氢，10mmol/L β-环糊精，0.1mol/L pH5.0的醋酸缓冲液；
样品稀释液：10mmol/L pH7.4-7.6的磷酸盐缓冲液中含有1％BSA，0.05％Tween-20和1mg/L庆大霉素；
浓缩洗涤液：0.1mol/L pH7.4-7.6的磷酸盐缓冲液中含有1％胎牛血清，0.5％Tween-20和20mg/L庆大霉素；
终止反应液：1.0mol/L H2SO4。
2.根据权利要求1所述的载脂蛋白E4 ELISA试剂盒，其特征在于所说的酶标板为96孔。
3.根据权利要求1所述的载脂蛋白E4 ELISA试剂盒的制备方法，其中的抗人ApoE4单克隆抗体及酶标记抗体的制备方法是：
(1)抗人ApoE4单克隆抗体的制备：用重组纯化的人载脂蛋白E4免疫小鼠，制备特异性的抗人ApoE4单克隆抗体；
(2)抗体的纯化：将步骤(1)中制得的抗血清，过葡萄球菌蛋白A-Separose CL-4B柱，浓缩、透析，得纯化的抗体；
(3)酶标记抗体的制备：用辣根过氧化物酶标记抗人ApoE多克隆抗体；
(4)酶标板包被：用步骤(2)中所得的纯化抗体包被96孔酶标板，并封闭、抛光。
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2007
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