CN1547024A - 克伦特罗快速半定量检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种检测克伦特罗半定量快速检测方法。本方法在试纸的背衬上依次粘贴有样液吸收部分、胶体金标记部分、检测反应部分及吸水部分。检测反应部分上包被有克伦特罗抗体1－3条或检测用抗原1－3条作为检测线，同时包被有抗第二种属动物蛋白的IgG1－3条作为参考线，组合时检测线和参考线不能同时多于1条，组合线条数为2－4条。该快速检测试纸条特异性强、灵敏度达到0.09ng/mL、4－40℃都可使用，2min以后便可观察结果，适合于卫生、质监、海关、肉品加工厂、家畜养殖场等单位或个人对饲料、肉类、尿液、乳品等样品中的克伦特罗进行快速检测。

Description

克伦特罗快速半定量检测方法

                        技术领域

本发明涉及一种检测克伦特罗(clenbuterol，CLB)方法。

                        背景技术

克伦特罗又称盐酸克伦特罗，或克喘素，俗称“瘦肉精”，本用于治疗哮喘等疾病，在发现它能显著提高动物的产量和瘦肉率之后，曾一度作为饲料添加剂广泛用于畜牧业。但是，它毒性大，易在动物组织中残留，人们常因食入其动物食品而引起中毒。我国虽继欧美之后，1997年禁止它在饲料中使用，但由于受经济利益驱使，违法滥用现象仍然存在。据农业部在网上公布的资料，一些不法商贩把克伦特罗制成小包装零售或与饲料搭配销售，违法销售转入地下，更趋隐蔽。因此，在抓紧源头控制的时，必须加强其安全检测。

对克伦特罗残留的检测目前主要采用高效液相色谱法(HPLC)、气质联用法(GC-MS)和酶联免疫吸附测定法(ELISA)。GC-MS法和HPLC法灵敏、准确，检测下限可达0.25ng/mL，但由于这两种方法需要贵重仪器、样品前处理繁琐、分析速度慢，需要几小时至几十小时、检测样品量少，难以对批量样品进行检测，需受过专门训练的人员才能操作、检测费用高，几百上千元/样，所以应用面窄，仅以一些重要的卫生防疫和质量检验监督部门采用为主，通常对初步检测为阳性的样品确认时采用。ELISA法是目前研究较多的克伦特罗检测方法，具有灵敏度高，检测量大，样品前处理简单，比仪器分析时间短、成本低，检测下限可达0.09ng/mL以下。欧美多家公司已有ELISA试剂盒投放市场，如英国Randox公司的试剂盒销往全球。但该方法仍需酶标仪等部分设备，分析时间1-3小时，难以在现场采用。

为克服其缺点，使对克伦特罗的检测更方便、时间更短、成本更低，一些单位开展了胶体金检测试纸研究，并有“盐酸克伦特罗快速检测试纸条”、“一种免疫层析一步法检测肾上腺素激动剂类药物的方法及试纸的制备”的报道，这两则报道所描述的技术只能定性检测，不能半定量检测，且组合线只有2条，而本申请所描述的试纸，为半定量试纸，加有延长部分或增厚部分，组合线数2-4条。另外也有“半定量快速检测盐酸克伦特罗的胶体金试纸条及生产和使用方法”的报道，其与本申请不同之处在于：第一、其无参考线；第二、在使用方法上，其样品中盐酸克伦特罗含量越高，检测线显色条数多，而本申请的所描述的试纸，样品中克伦特罗含量越高，检测线颜色越浅，检测线显色条数越少。以上几则其他研究者的报道，在胶体金标记部分和检测反应部分之间都无任何其他材料，而本申请所描述的试纸在胶体金标记部分和检测反应部分之间加有延长部分，或在胶体金标记部分之下或之上加有增厚部分。因此，本申请克服了上述几则报道的缺点，研制出了克伦特罗半定量检测试纸。

                    发明内容

本设计的目的：研制出简便、灵敏、价格低廉的克伦特罗快速半定量检测方法。

现结合附图对发明进行说明：

附图1为本发明的结构示意图。图中1为样液吸收部分、2为胶体金标记部分、3为检测反应部分、4为检测线、5为参考线、6为吸水部分。它们按照下列次序粘贴在背衬上：样液吸收部分、胶体金标记部分、检测反应部分、吸水部分。胶体金标记部分为玻璃纤维或醋酸纤维或尼龙膜，其上标记的物质为第二种属动物蛋白与克伦特罗抗体的混合物，或第二种属动物蛋白与克伦特罗检测用抗原的混合物。混合物的混合方法：第二种属动物蛋白与克伦特罗抗体或抗原的混合比例：以标准的克伦特罗样品为标准，当阴性样品检测时，参考线和检测线刚好出现肉眼可见的红色为准。检测反应部分上面包被有克伦特罗检测用抗原1～3条作为检测线，或包被有克伦特罗抗体1～3条作为检测线，同时还包被有抗第二种属动物蛋白的IgG 1～3条作为参考线。检测线和参考线组合时不能同时多于1条，组合线条数为2～4条，组合方式为1条检测线和1条参考线、1条检测线和2条参考线、1条检测线和3条参考线、2条检测线和1条参考线、3条检测线和1条参考线五种形式。根据半定量检测的准确度要求，组合线数越多，半定量越准确。

当胶体金标记部分标记对象为第二种属动物蛋白和克伦特罗抗体混合物时，为了提高检测试纸的灵敏度，在胶体金标记部分和检测反应部分之间用玻璃纤维纸或滤纸或吸水纸加有延长部分或在胶体金标记部分之上或之下加有增厚部分。

其中检测用抗原是指克伦特罗与蛋白质类物质或多糖类物质形成的偶合物，所说蛋白质为牛血清白蛋白、匙孔血、蓝蛋白、卵清白蛋白。多糖为葡聚糖、壳聚糖、纤维素。在用胶体金标记抗原时此混合物作为标记的对象，或在用胶体金标记抗体时此混合物作为检测线上的包被物质；第二种属动物蛋白指非抗体来源属动物的蛋白。

本发明所描述的试纸的各部分处理与功能如下：

背衬：为一面涂有不干胶的不吸水的韧性材料，起固定支持试纸其他组成部分的作用。

样液吸收部分制备：将滤纸或玻璃纤维纸浸入pH7.0～8.4的PBS中2min，取出，80℃烘干或其他方式干燥，即作为样液吸收部分，检测时起吸收样品溶液的作用，便于样品溶液向上移动。

胶体金标记部分的制备：该部分起固定胶体金标记的抗原或抗体的作用。制备步骤包括胶体金溶胶的制备、胶体金标记克伦特罗抗体或克伦特罗抗原、胶体金标记部分处理。

(1)胶体金溶胶的制备：将氯金酸(HAuCL₄)用超纯水配置成1％的母液，取1mL的母液，用超纯水定容到100mL，配成0.01％的溶液，加热至沸腾，加入1～5mL的1％柠檬酸三钠水溶液，继续加热到出现透明的橙红色为止，即为胶体金溶胶。

(2)胶体金标记克伦特罗抗体：将克伦特罗单克隆抗体或多克隆抗体和第二种属动物蛋白分别用PBS(0.01mol/L，pH7.0～7.5)溶解稀释至2～4mg/mL，每100mL胶体金溶胶加入1～3mL 2～4mg/mL的克伦特罗抗体和1～1.5mL 2～4mg/mL第二种属动物蛋白，震荡2min，用0.2mol/L的K₂CO₃调节pH至8.4，振荡5min，加入11％PEG-10000 2mL，振荡5min，8000～15000r/min离心15min，除去上清，用PBS(0.01mol/L，pH7.0～7.5)复溶，以6000～13000r/min离心15min，除去上清，将沉淀用PBS(0.01mol/L，pH7.0～7.5)稀释500～2000倍，产物作为金标克伦特罗抗体(GAb)。

(3)胶体金标记克伦特罗抗原：将克伦特罗检测用抗原和第二种属动物蛋白分别用PBS(0.01mol/L，pH7.0～8.4)溶解稀释至2～4mg/mL，每100mL胶体金溶胶加入1～3mL 2～4mg/mL的检测用抗原和1～1.5mL 2～4mg/mL第二种属动物蛋白，震荡2min，用0.2mol/L的K₂CO₃调节pH至8.4，振荡5min，加入11％PEG-100002mL，振荡5min，8000~15000r/min离心15min，除去上清，用PBS(0.01mol/L，pH7.0～7.5)复溶，以6000～13000r/min离心15min，除去上清，将沉淀用PBS(0.01mol/L，pH7.0～7.5)稀释500～2000倍，产物作为金标记的克伦特罗抗原(GAg)。

(4)胶体金标记部分处理：将GAb或GAg倒入一槽中，将玻璃纤维纸或滤纸浸入1min，取出，室温干燥后，即作为胶体金标记部分。

检测反应部分制备：用0.8％的戊二醛溶液或0.2％的碳二亚胺溶液浸泡硝酸纤维膜或醋酸纤维膜或尼龙膜30min，取出，37℃烘干，上边包被1～3条不同浓度的克伦特罗检测用抗原线或克伦特罗抗体线作为检测线，同时包被1～3条不同浓度的抗第二种属动物蛋白的IgG线作为参考线。当胶体金标记部分标记对象为第二种属动物蛋白和克伦特罗抗体混合物时，检测线则包被克伦特罗检测用抗原；当胶体金标记部分标记对象为第二种属动物蛋白和克伦特罗检测用抗原混合物时，检测线则包被克伦特罗抗体；检测线和参考线不能同时多于1条，组合线数2～4条。此即为检测反应部分，该部分主要作用是将反应结果以肉眼可见的颜色表征出来。

吸水部分制备：将玻璃纤维纸或滤纸或吸水纸室温干燥后，即作为吸水部分。该部分主要作用在于将移动上来的多余的样品溶液吸收。

延长部分或增厚部分的制备：将玻璃纤维纸或滤纸或吸水纸室温干燥后，加在胶体金标记部分和检测反应部分之间，即为延长部分；覆盖在胶体金部分之上或粘贴在胶体金部分之下背衬之上，即为增厚部分。

试纸组装：在背衬上依次粘贴样液吸收部分、胶体金标记部分、延长部分、检测反应部分和吸水部分，即成克伦特罗半定量检测试纸。当胶体金标记部分标记对象为克伦特罗抗体和第二种属动物蛋白时，背衬上增加粘贴延长部分或增厚部分。

检测原理：检测原理因胶体金标记的对象不同，而稍有差异。

当胶体金标记部分的标记物为第二种属动物蛋白和克伦特罗抗体混合物时，如果样品中含有克伦特罗，样品溶液被试纸的样液吸收部分吸收并通过毛细作用上移到达胶体金标记部分，样品溶液中的克伦特罗与胶体金标记的克伦特罗抗体反应形成结合物，结合物继续上移到检测线，因胶体金标记的克伦特罗抗体只有一个结合位点，样品溶液中的克伦特罗与之结合后，检测线上的检测用抗原就不能再与胶体金标记的克伦特罗抗体结合，于是检测线无色；当样品中没有克伦特罗时，胶体金标记的克伦特罗抗体到达检测线时被检测用抗原捕获，则形成肉眼可见红色，此即为阴性。无论样品中是否含有克伦特罗，胶体金标记的第二种属动物蛋白上移到达参考线时都可被参考线上包被的抗第二种属动物蛋白的IgG捕获形成肉眼可见的红色，此即为参考线。

当胶体金标记部分的标记物为第二种属动物蛋白和克伦特罗检测用抗原混合物时，如果样品中含有克伦特罗，样品溶液被试纸的样液吸收部分吸收并通过毛细作用上移，样品中的游离克伦特罗分子量小移动速度快，先到达检测线，先与检测线上包被的克伦特罗抗体结合，因检测线上包被的克伦特罗抗体只有一个结合位点，而且样品中游离的克伦特罗结合能力比偶合态的克伦特罗检测用抗原强，于是胶体金标记的检测用抗原不能再被检测线上的克伦特罗抗体捕获，于是检测线无色，此即为阳性；如果样品中无克伦特罗，则胶体金标记的克伦特罗检测用抗原到达检测线后就被检测线上包被的克伦特罗抗体捕获，形成肉眼可见的红色，此即为阴性。无论样品中是否含有克伦特罗，胶体金标记的第二种属动物蛋白上移到达参考线时都可被参考线上包被的抗第二种属动物蛋白的IgG捕获形成肉眼可见的红色，此即为参考线。

以上两种方式的试纸，可以通过调节检测线和参考线包被物浓度，调节显色深浅，通过设置多条组合线，并将组合线颜色或显色条数与标准物质浓度对应起来，即可达到半定量检测目的。

使用方法：

(1)1条检测线+1条参考线形式的试纸

检测线包被有浓度为0.1-30μg/mL的克伦特罗单克隆抗体或克伦特罗检测用抗原1条，宽1mm；参考线包被有浓度为0.01-30μg/mL的抗第二种属动物蛋白的IgG 1条，宽1mm；两条线之间间隔2-6mm。当检测线颜色与参考线颜色相同时，则样品为阴性；当检测线与参考线颜色相同时，则样品为阳性，浓度大于Ang/mL，A为设定的检测限，可以是大于或等于0.1ng/mL的某一浓度。参考线始终显色，若参考线不显色，表明试纸失效。

(2)2条检测线+1条参考线形式的试纸

2条检测线包被有0.01-30μg/mL克伦特罗单克隆抗体或克伦特罗检测用抗原，第2条检测线上包被物的浓度小于第1条检测线参考线包被物浓度；参考线包被有浓度为0.01-30μg/mL的抗第二种属动物蛋白的IgG，宽1mm；各条线之间间隔2-6mm。当两条检测线都呈现颜色时，则样品为阴性；当检测线第1条检测线呈色，第2条检测线不呈色时，则样品中克伦特罗浓度大于Ang/mL，小于Bng/mL；当两条检测线都不呈色时，样品中克伦特罗浓度大于Bng/mL。A、B为设定的检测限，可以是大于或等于0.1ng/mL的某一浓度。参考线始终显色，若参考线不显色，表明试纸失效。

(3)3条检测线+1条参考线形式的试纸

3条检测线包被有0.01-30μg/mL克伦特罗单克隆抗体或克伦特罗检测用抗原，三条检测线上包被物的浓度依次递减；参考线包被有浓度为0.01-30μg/mL的抗第二种属动物蛋白的IgG；各条线之间间隔2-6mm。当3条检测线都呈现颜色时，则样品为阴性；当检测线第1，2条检测线呈色，第3条检测线不呈色时，则样品中克伦特罗浓度大于Ang/mL，小于Bng/mL，当第1条检测线呈色，第2，3条检测线都不呈色时，样品中克伦特罗浓度大于Bng/mL，小于Cng/mL；当3条检测线都不呈色时，样瓶中克伦特罗含量大于Cng/mL；A、B、C为设定的检测限，可以是大于或等于0.1ng/mL的某一浓度，B大于A，C大于B。参考线始终显色，若参考线不显色，表明试纸失效。

(4)1条检测线+3条参考线：

检测线上包被有0.01-30μg/mL克伦特罗单克隆抗体或克伦特罗检测用抗原，检测线之后包被有3条参考线，参考线包被有浓度为0.01-30μg/mL的抗第二种属动物蛋白的IgG，调节参考线包被物浓度和胶体金标记的第2种属动物蛋白的标记浓度，使3条参考线的颜色分别与标准样品中克伦特罗含量为C、B、Ang/mL时检测线的颜色相同，依此确定参考线包被物浓度；各条线之间间隔2-6mm；当检测线颜色深于第3条参考线颜色时，表明样品为阴性；当检测线颜色深于第3条参考线颜色浅于第2条检测时，表明样品中克伦特罗浓度大于Ang/mL，小于Bng/mL；当检测线颜色深于第2条参考线颜色浅于第1条参考线时，表明样品中克伦特罗浓度大于Bng/mL，小于Cng/mL；当检测线不呈色时，表明样品中克伦特罗浓度大于Cng/mL。

(5)1条检测线+2条参考线：

检测线上包被有0.01-30μg/mL克伦特罗单克隆抗体或克伦特罗检测用抗原，检测线之后包被有2条参考线，参考线包被有浓度为0.01-30μg/mL的抗第二种属动物蛋白的IgG，调节参考线包被物浓度和胶体标记的第2种属动物蛋白的标记浓度，使2条参考线的颜色分别与标准样品中克伦特罗含量为B、Ang/mL时检测线的颜色相同，依此确定参考线包被物浓度；各条线之间间隔2-6mm；当检测线颜色深于第2条参考线颜色时，表明样品为阴性；当检测线颜色深于第2条参考线颜色浅于第1条检测时，表明样品中克伦特罗浓度大于Ang/mL，小于Bng/mL；当检测线颜色深于第1条参考线颜色浅于第1条参考线时，表明样品中克伦特罗浓度大于Bng/mL。

本发明优点：

①特异性强。由于采用了高质量的克伦特罗单克隆抗体，该试纸检测特异性极强，与肾上腺素、去甲肾上腺素等结构相似物质和土霉素、金霉素、泰乐菌素、有机铬、磺胺二甲基嘧啶、盐酸溴己新、氯霉素、乙氧酰胺苯甲酯、莱克多巴胺、北里霉素、氟苯化考、甲砜霉素等常用兽药及饲料添加剂无交叉反应，可避免假阳性。

②灵敏度高。本试纸检测下限可达到0.09ng/mL，也可根据检测要求在制备试纸时提高检测下限到0.09ng/mL以上某浓度，避免了假阳性和假阴性，使结果保证可靠。

③准确性好，能够半定量。用本试纸检测结果与德国r-Biopharm公司ELISA试剂盒以及仪器分析的检测结果相关性完全符合要求。根据检测线颜色与参考线颜色对比或根据检测线呈色条数达到半定量检测目的。

④操作特别方便，无须任何仪器设备，适用面宽。本试纸不需任何专业培训，不需任何仪器设备，普通人员即可操作，只要将试纸插入检测液中，用肉眼判读。各种样品均可方便地进行测定。因此，本试纸适用面宽，卫生检验监督部门、动物养殖单位、屠宰场以及消费者个人均可使用。

⑤检测速度快，颜色稳定时间长。试纸插入样液中，若为阴性，30s开始显色，2min以后便可观察结果，比目前普遍使用的克伦特罗ELISA试剂盒检测速度快40～160倍以上，并且其颜色可永久保存。

⑥检测温度适宜范围宽。在4～40℃均可使用，结果正常，不需在低温下进行，不需采取保温措施，室内野外均可使用。

⑦试纸保质期长。据加速老化试验结果，试纸保质期可达2年。

⑧成本低廉：本试纸法检测成本大大低于克伦特罗ELISA试剂盒检测法，随着规模化生产后，其成本还会大幅度降低。

                    具体实施例

实施例1：1条检测线+2条参考线试纸检测猪尿中的克伦特罗

1、克伦特罗偶合抗原合成

克伦特罗偶合抗原分为免疫用抗原和检测用抗原，前者用于免疫动物，后者用于抗体制备中抗体的检测筛选和试纸制备中的胶体金标记或检测线包被。

免疫用抗原制备：精确称取克伦特罗22mg，溶解于2mL，pH1.5～2.0的盐酸溶液中。加入pH2.0的亚硝酸钠溶液2mL，反应20min。同时称取100mg牛血清蛋白溶解于5mL pH7.4，0.1mol/L的磷酸缓冲溶液中，将反应好的克伦特罗重氮盐加入其中，用1mol/L的氢氧化钠调pH值至7.5，4℃下反应12小时后。将此反应液用pH7.4，0.01mol/L的PBS溶液透析，分装为免设用抗原。

检测用抗原制备：采用卵清白蛋白替换牛血清白蛋白，其余步骤同免疫用抗原制备，所得产物即作为检测用抗原。

2、克伦特罗单克隆抗体制备

取健康5周龄雌性二级Balb/c小鼠6只进行免疫。第一次基础免疫将0.1mL克伦特罗免疫用抗原与等量完全弗氏佐剂用搅拌器充分混匀乳化，进行腹腔注射，注射量0.2mL/只。四周后开始进行加强免疫，佐剂换为不完全弗氏佐剂，每隔两周加强免疫一次，末次免疫3d后取脾脏融合。

先将HAT培养液、IMDM不完全培养液、IMDM完全培养液和50％PEG-6000溶液于37℃水浴中预温，同时将另一盛水的烧杯放入37℃水浴中预温。将上述制备好的脾细胞和骨髓瘤细胞和脾细胞按1∶5的比例混合，在50mL塑料离心管内用不完全培养液洗1次，1 200r/min离心8min，弃上清，用滴管吸净残留液体。置37℃水浴中，将吸管插入管底，在90s内边搅拌边加入预热的1mL、50％PEG-6000。静置90s后，于37℃水浴中60s内加入10mL预热的完全培养液。轻轻悬浮一次，以1000r/min离心6min，弃去上清，先用6mL左右完全培养液轻轻悬浮。根据所用96孔培养板的数量，补加HAT培养液到76.8mL，轻轻混匀，将混匀悬液接种于有饲养细胞的96孔板中，每孔0.1mL，一次接种8块板。将培养板置于37℃、5％CO₂培养箱中培养。融合后7d，用HT培养液半量换液1次，在13d后根据增殖情况改用20％NBS的完全培养液。约7d后出现杂交瘤细胞集落，细胞大、圆且透亮。待集落长至孔底1/3时，在培养板的盖板上画上克隆生长的标记，此时即可取上清检测相应的特异性抗体。细胞完全克隆化后，将细胞注入小鼠腹腔，间隔一段时间等腹水足够多时，取腹水，将腹水用蛋白A免疫亲和层析纯化后，即得到克伦特罗单克隆抗体。

3、样液吸收部分处理：

将滤纸或玻璃纤维纸等浸入0.1mol/L pH7.4的PBS中2min，取出，80℃烘干或其他方式干燥，即成样液吸收部分。

4、胶体金标记部分的制备和处理：

胶体金标记部分的制备和处理包括胶体金溶胶制备、胶体金标克伦特罗抗体、胶体金标记部分处理。

胶体金溶胶制备：将氯金酸(HAuCL₄)用超纯水配置成1％的母液，取1mL的母液，用超纯水定容到100mL，配成0.01％的溶液，加热至沸腾，加入一定量的1％柠檬酸三钠水溶液，继续加热到出现透明的橙红色为止，即为胶体金溶胶。

胶体金标记克伦特罗单克隆抗体制备：将克伦特罗单克隆抗体和猪血清白蛋白分别用PBS(0.01mol/L，pH7.0～7.5)溶解稀释至3mg/mL，每100mL胶体金溶胶加入1mL 4mg/mL的克伦特罗单克隆抗体和1mL 2mg/mL猪血清白蛋白，震荡2min，用0.2mol/L的K₂CO₃调节pH至8.4，振荡5min，加入11％PEG-10000 2mL，振荡5min，15000r/min离心15min，除去上清，用PBS(0.01mol/L，pH7.4)复溶，以6000～13000r/min离心15min，除去上清，将沉淀用PBS(0.01mol/L，pH7.5)稀释1000倍，产物作为金标克伦特罗单克隆抗体。

胶体金标记部分处理：将金标克伦特罗单克隆抗体倒入一槽中，将玻璃纤维纸或滤纸浸入1min，取出，室温干燥或真空冷冻干燥，即成为胶体金标记部分。

5、检测反应部分处理：

用0.8％的戊二醛溶液或0.2％的碳二亚胺溶液浸泡硝酸纤维膜30min，取出，37℃烘干，上边用喷涂机喷涂包被1条克伦特罗检测用抗原线作为检测线，浓度为3μg/mL；包被2条羊抗猪血清白蛋白的IgG线作为参考线，靠近下端的浓度为2μg/mL，另一条为1μg/mL。此即为检测反应部分。

6、延长部分的处理：将玻璃纤维纸室温干燥后，即作为延长部分。

7、吸水部分处理：将吸水纸室温干燥后，即作为吸水部分。

8、试纸组装：在背衬上依次粘贴样液吸收部分、胶体金标记部分、延长部分、检测反应部分和吸水部分，即成克伦特罗半定量检测试纸。

9、检测

尿样直接作为检测液使用。将试纸条直接插入检测液，2min后，观察颜色。若2条检测线都呈现颜色，表明样品为阴性；若第1条检测线呈色，第2条不呈色，则表明样品中克伦特罗含量为1ng/mL；若第1条检测线与第2条检测线都不呈色，则表明样品中克伦特罗含量为5ng/mL。无论样品中克伦特罗含量如何，参考线应该显色，若参考线不显色，表明试纸失效。

其他形式的试纸制备以及其他种类的样品检测与实施例1类似。

Claims (7)

1、克伦特罗快速半定量检测方法，在试纸的背衬上，粘有样液吸收部分、胶体金标记部分、检测反应部分及吸水部分，其特征在于：胶体金标记部分标记的物质为第二种属动物蛋白与克伦特罗抗体的混合物，或第二种属动物蛋白与克伦特罗检测用抗原的混合物，检测反应部分上面包被有克伦特罗检测用抗原1-3条作为检测线、或包被有克伦特罗抗体1-3条作为检测线，同时包被有抗第二种属动物蛋白的IgG 1-3条作为参考线，检测线和参考线不能同时多于1条，组合线数为2-4条。

2、根据权利要求1所说的检测方法，其特征在于：克伦特罗检测用抗原为克伦特罗与蛋白质类物质或多糖类物质形成的偶合物。

3、根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：第二种属动物蛋白为指非抗体来源属动物的蛋白。

4、根据权利要求1所说的检测方法，其特征在于所说的蛋白质物质为牛血清白蛋白、匙孔血蓝蛋白、卵清白蛋白。

5、根据权利要求1所说的检测方法，其特征在于所说的多糖类物质为葡聚糖、壳聚糖、纤维素。

6、根据权利要求1所说的检测方法，其特征为：检测线和参考线的组合方式为1条检测线和1条参考线、1条检测线和2条参考线、1条检测线和3条参考线、2条检测线和1条参考线、3条检测线和1条参考线5种形式。

7、根据权利要求1所述的检测方法，其特征是：当胶体金标记部分标记对象为克伦特罗抗体和第二种属动物蛋白时，胶体金标记部分和检测反应部分之间加有延长部分，或在胶体金标记部分之下或之上加有增厚部分。

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