CN102520180B - 一种胶体金融合乳胶法半定量检测盐酸克伦特罗的检测试剂、试剂条和试剂盒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种胶体金融合乳胶法半定量检测盐酸克伦特罗的检测试剂、试剂条和试剂盒及其制备方法，包括胶体金的制备、胶体金标记物的制备和纯化、乳胶颗粒的标记、胶体金和乳胶标记物的固相化、包被硝酸纤维素膜、试剂条的制备以及检测试剂盒的制备；本发明的优点在于：成本低，准确性高、稳定性强，显色更快、更均一、更稳定，使用方便，操作简单，真正达到复杂原理与简易操作的有机统一，同时该试剂盒具有保存方便，有效期长的特点。

Description

一种胶体金融合乳胶法半定量检测盐酸克伦特罗的检测试剂、试剂条和试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种盐酸克伦特罗的检测试剂，具体地说是一种胶体金融合乳胶法半定量检测盐酸克伦特罗的检测试剂、试剂条和试剂盒及其制备方法，属于盐酸克伦特罗检测试剂领域。

背景技术

盐酸克伦特罗（Clenbuterol，CL），又名瘦肉精，分子式为C₁₂H₁₈C₁₂N_2O·HCl，药品名为克喘素、氨哮素等，为白色或类白色的结晶粉末，无臭、味苦，易溶于水、甲醇、乙醇，微溶于丙酮、氯仿，不溶于乙醚和苯，化学性质稳定；它是一种人工合成的β-肾上腺素受体激动剂，具有扩张支气管的作用，常用来防治哮喘、肺气肿等肺部疾病。当其应用剂量达到治疗量的5～10倍时，又具有能量重分配作用，可使肌肉合成增加，脂肪沉积减少，因此将其俗称为“瘦肉精”，在养猪业中一些非法使用者将其作为一种生长促进剂添加到饲料中，用以改善胴体的品质，但同时也造成了猪肉中盐酸克伦特罗的残留。当人们食用含有盐酸克伦特罗残留的肉品后，常常造成心动过速，低血钾，低磷酸盐血症，肌肉震颤，头晕，口干，失眠甚至于瘫痪等中毒症状，对心脏病患者更有生命危险。国家农业部农牧发[2002]1号文《关于发布食品动物禁用的兽药及其他化合物清单的通知》中，盐酸克伦特罗被列为所有食品动物禁止使用。

目前已有多种方法用于对CL的残留分析，主要包括酶联免疫检测法（ELISA）、化学发光法（CLIA）、高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱-质谱联用法（GC/MS）、液相色谱-质谱联用法（LC/MS）等。CLIA对单个样本的检测速度快，灵敏度和自动化程度高，但试剂稳定性差、价格高、需要多次定标，不能重复检测，易受环境干扰，检测精度不高。ELISA最大优势在于避免了对环境的污染和人体的危害，但酶的纯度和反应过程易受环境因素的影响，导致稳定性不高。色谱技术对CL的检测分离效率高、回收率高等自身优势，但操作繁琐费时，从样品预处理到得出检测结果至少需要2天时间，另外这种检测方法还需要价格昂贵的仪器设备，且需专业人员操作，每次只能检测一个样品，严重阻碍了这种检测方法的普及推广，更无法实现现场检测。近年来，随着胶体金免疫层析技术的发展，用胶体金竞争抑制免疫层析法检测样本中的盐酸克伦特罗已成为现实，但是与乳胶法相比，胶体金法检测成本高，同时在检测临界样本时，胶体金法检测结果不稳定。

发明内容

为了解决上述问题，本发明设计了一种胶体金融合乳胶法半定量检测盐酸克伦特罗的检测试剂、试剂条和试剂盒及其制备方法，该检测试剂克服了胶体金竞争抑制免疫层析法检测临界样本显色慢、显色不均一的缺陷，同时采用该方法制备的试剂成本低、可多水平半定量检测盐酸克伦特罗的含量，且使用方便，操作简单。

本发明的技术方案为： 

一种胶体金融合乳胶法半定量检测盐酸克伦特罗的检测试剂，所述试剂的制备方法包括以下步骤：

（1）胶体金的制备

制备质量分数为0.01%的氯金酸和0.02%的柠檬酸三钠的混合水溶液；

（2）胶体金标记物的制备和纯化

将上述步骤（1）中制备的胶体金100ml调节pH值至8.0，加入抗盐酸克伦特罗单克隆抗体1.5mg，再逐滴加入25mg/ml聚乙二醇2ml，离心弃上清液，离心沉淀用含0.4mg/mlPEG的PBS缓冲液10ml清洗2次，再将清洗后得到的沉淀用含体积分数为2％BSA的PBS缓冲液5ml溶解，然后将溶解液用无菌过滤器过滤，得到胶体金-抗体结合物，4℃保存；

（3）乳胶颗粒的标记

取乳胶颗粒用MES缓冲液透析盐酸克伦特罗单克隆抗体；将盐酸克伦特罗单克隆抗体和体积分数为1%的Tween-20溶液加入到乳胶颗粒中，并补充MES缓冲液，使盐酸克伦特罗单克隆抗体浓度大于5mg/ml，乳胶颗粒浓度为25mg/ml；超声混匀并室温震荡；加入体积分数为1.2%的60mg/ml的NHS溶液和体积分数为1.2% 的100mg/ml的EDAC溶液，室温震荡；加入体积分数为20%的100mg/ml BSA溶液封闭，室温震荡；离心纯化标记后的乳胶颗粒，去上清，用体积分数为20%的100mg/mL的BSA溶液悬浮沉淀，得到乳胶-抗体结合物，并稀释到体积分数为10%后，分装；

（4）胶体金和乳胶标记物的固相化：将上述步骤（2）中制备的胶体金-抗体结合物和步骤（3）中制备的乳胶-抗体结合物溶液，分别固相于玻璃纤维和聚酯膜上；

（5）包被硝酸纤维素膜

5.1将CL-BSA偶联物稀释成三个不同浓度，例如为1.0mg/mL、3.0mg/mL、10mg/mL，呈横带状间隔喷于硝酸纤维素膜上；

5.2将羊抗鼠IgG单克隆抗体稀释到0.5mg/mL，喷于上述步骤5.1制得的硝酸纤维素膜上；

5.3将上述步骤5.2制得的固定有偶联物和抗体的硝酸纤维素膜置37℃烘箱中干燥，得到检测试剂产品。

一种盐酸克伦特罗检测试剂条，所述试剂条包括上述方法制备的胶体金融合乳胶法半定量检测盐酸克伦特罗的硝酸纤维素膜检测试剂； 

所述试剂条的制备方法，具体包括以下步骤：

（1）在支持板的中间位置粘贴上述检测试剂的方法制备的胶体金融合乳胶法半定量检测盐酸克伦特罗的检测试剂硝酸纤维素膜；

（2）在支持板固定上述硝酸纤维素膜位置的上方，粘贴吸水垫，吸水垫覆盖硝酸纤维素膜边沿0.5-1.5毫米；

（3）在支持板固定上述硝酸纤维素膜位置的下方粘贴上述检测试剂的制备方法中步骤（4）制备的标有胶体金-抗体结合物的玻璃纤维样品垫以及标有乳胶-抗体结合物的聚酯膜；所述聚酯膜下方粘贴所述玻璃纤维样品垫覆盖聚酯膜0.5-1.5毫米；

（4）将上述步骤（3）得到的产品压平整后，切成条。

一种盐酸克伦特罗的检测试剂盒，包括检测条和检测卡，

其中，所述检测条为上述方法制备的盐酸克伦特罗检测试剂条，包括底板；

所述底板分为手柄区、观察区、标记区和加样区；

所述手柄区的底板上设有用来吸水的滤纸支撑层；

所述观察区的底板上设有上述方法制备的硝酸纤维素膜，所述硝酸纤维素膜靠近手柄区的一端设有包被羊抗鼠抗体的对照线，另一端设有包被CL-BSA偶联物的3条检测线；

所述标记区的底板上标记有CL单克隆抗体； 

所述加样区的底板上设有玻璃纤维样品垫。

进一步地，所述检测卡包括卡盖和盒状卡体；

所述卡盖的一端设有用来滴加测试样品的漏斗状的加样孔，所述状加样孔与所述底板的加样区的位置相对应；所述卡盖的中间部位设有用来观察测试结果的条形的观测孔，所述观测孔与所述底板的观察区的位置相对应；所述卡盖的底面上设有若干个用来固定卡盖和卡体的定位销，所述卡体上设有与定位销配合的定位槽；所述检测条设置在卡盖与卡体之间。 

作为上述技术方案的再一种优选方案，所述卡盖的底部设有固定柱和块状凸起；所述卡体上也设有块状凸起。

作为上述技术方案进一步的优选方案，所述卡体上设有用来固定检测条水平位置的卡位突起。

作为上述技术方案的另一种优选方案，所述卡盖上对应对照线的一侧标注有字母“C”，对应检测线的一侧标注有字母“T”。

检测样的处理方法：

（1）尿液样本：用干燥、洁净的离心管或容器采集尿液；如果不立即检测，可将尿样冷冻保存；短期可进行冷藏保存，注意避免腐败造成失效或污染；如果尿样出现沉淀或浑浊物，要离心后再检测。

（2）血清样本：抽取待检动物血液，离心或静置，取透明的上清液血清层，若血清有过度溶血现象，将血清以蒸馏水稀释一倍后再检测；

（3）饲料样本：样品粉碎后过20目筛，得试样。取2g试样于50ml离心管中，加入10mL的水提取液，混匀，置于超声波水浴中超声30分钟，其间每10分钟取出混匀1次，然后取出恢复至室温，4000转/分钟，离心5分钟，取上清液检测；

（4）肌肉或内脏样本：样品完全匀浆后，称取4.0g置于离心管中，加入50mmol/L盐酸溶液20mL，充分振荡混匀5min或超声混匀5min，再静置10分钟；或者加入盐酸后直接摇床振摇30min；称取6.0g完全均质的样品，置于另一个离心管中，加入2mol/L的NaOH溶液125μl，混匀5min之后4000rpm或更高速离心20min ，离心温度保持在10℃左右，吸取上清直接用于检测；

检测方法：测试过程中向加样孔中用吸管吸取待检样本，滴加3滴待检样本于加样孔中，样本沿样品垫缓慢上移，在加样后5-10分钟判读结果。

检测结果判断：通过计算显色条带数量的多少，从而确定样本中CL的含量，色带数量越少，样本中CL含量越高。

如果出现四条红色条带，不管色带深浅如何，都表明结果为阴性；如果第一条带不显红色，后三条显红色，结果为阳性，含量≥0.1ng/mL；如果第一、二条带不显红色，后两条带显红色含量为3.0ng/mL；如果第一、二、三条带不显红色，仅第四条带显红色含量≥100ng/mL。

本发明检测试剂采用纳米级胶体金和乳胶颗粒作为标记示踪物，应用CL-BSA偶联物，结合单克隆抗体，依据免疫竞争法原理，检测样本中的盐酸克伦特罗抗体。

本发明采用竞争抑制免疫层析的原理，检测CL抗体时，将CL单克隆抗体分别固相于聚酯膜的乳胶和玻璃纤维的胶体金上，再将不同浓度的CL-BSA（牛血清白蛋白）偶联物喷于硝酸纤维素膜上，滴加样本后，由于毛细管作用，如果样本中存在CL，CL在流动过程中与胶体金和乳胶标记的特异性抗体结合，抑制了抗体与固相载体膜上的CL-BSA偶联物的结合，通过计算显色条带数量的多少，从而确定样本中CL的含量，色带数量越少，样本中CL含量越高，使用方便，操作简单。

本发明的优点在于：

1、成本低：不需特殊仪器及其他试剂，使现场检测一步到位，见效快；成本主要取决于原料，乳胶和所标抗体用量仅为胶体金和所标抗体用量的一半，乳胶法原料成本仅为胶体金法的1/5～1/6，在达到同样灵敏度、特异性和稳定性的情况下，成本大大降低；

2、准确性高、稳定性强：采用本发明所的技术方案，显示条带越少，浓度越高，实现了多水平半定量式检测；在盐酸克伦特罗标准品浓度为0.1ng/mL时，胶体金融合乳胶法的检测结果有199例出现阳性，胶体金法的检测结果有197例出现阳性，说明两种检测方法的灵敏度均能达到0.1ng/mL，但是胶体金融合乳胶法的稳定性要强于胶体金法；

3、显色更快、更均一、更稳定：采用了胶体金融合乳胶法生产检测条，由于乳胶标记除了被动吸附，还可以用共价结合，因此在临界样本时，胶体金融合乳胶法显色更快、更均一、更稳定；

4、使用方便，操作简单：减少了许多繁琐的程序，方便、快捷、直观，易操作，全过程只需10分钟，能够满足食品安全、饲料、屠宰企业及政府检测机构的检测需求，具有较高的社会价值和经济价值；

5、真正达到复杂原理与简易操作的有机统一，同时该试剂盒具有保存方便，有效期长的特点。

胶体金法和乳胶法是免疫层析法中根据标记物不同而出现的两种检测技术，它们在竞争法中的特点对比如下表所示：

表1 胶体金法、乳胶法及胶体金融合乳胶法检测对比

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

附图说明

图1为本发明实施例盐酸克伦特罗检测试剂盒的俯视图；

图2为图1中A-A向的结构示意图；

图3为本发明实施例盐酸克伦特罗检测试剂盒的仰视图；

图4为本发明实施例盐酸克伦特罗检测试剂盒卡体的结构示意图；

图5为本发明实施例盐酸克伦特罗检测试剂盒检测条的结构示意图。

图中：1-检测卡、2-加样孔、3-观测孔、4-定位销、41-定位槽、5-固定柱、51-卡体两侧块状凸起、6-卡盖块状凸起、61-卡位突起、7-卡体中间块状凸起、8-底板、9-手柄区、10-观察区、11-卡盖、12-卡体、13-聚酯膜层、14-玻璃纤维层、15-加样区、101-第一检测线、102-第二检测线、103-第三检测线、104-对照线。

具体实施方式

以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

除非另有说明，本发明中所采用的百分数均为重量百分数。

实施例1

一种胶体金融合乳胶法半定量检测盐酸克伦特罗的检测试剂，所述试剂的制备方法包括以下步骤：

（1）胶体金的制备

取质量分数为0.01%的氯金酸水溶液100mL，加热至沸腾，搅动下加入质量分数为1%的柠檬酸三钠2mL，继续煮沸15 min，冷却后用蒸馏水定容到100mL；

（2）胶体金标记物的制备和纯化

取上述步骤（1）中制备的胶体金100mL用0.1 mol／L碳酸钾溶液调pH到8.0；边搅拌边加入抗盐酸克伦特罗单克隆抗体1.5 mg，搅拌20 min，再逐滴加入25 mg/ml聚乙二醇20000（PEG20000）2ml，搅拌15min；20000r/min离心15min，弃上清液，离心沉淀加人pH7.4含0.4mg/ml PEG的PBS缓冲液10ml清洗2次；再将清洗后的沉淀用pH7.4含体积分数 2％BSA（牛血清白蛋白）的PBS缓冲液（PBS缓冲液为溶剂，BSA为溶质）5ml溶解，最后将溶解液用0.22μm无菌过滤器过滤后，4℃保存备用；

（3）乳胶颗粒的标记

将存在于纯水溶液中浓度大于20mg/ml的乳胶颗粒，在标记前用pH=6的100mM MES[2-（N-吗啉代）乙烷磺酸]缓冲液清洗2次；去除上清液，得到的乳胶颗粒微粒待用；用pH～6的100mM的MES缓冲液透析盐酸克伦特罗单克隆抗体两次，使盐酸克伦特罗单克隆抗体在溶液中的浓度大于5mg/ml；将抗体和体积分数为1%的Tween-20（吐温20）溶液（Tween-20占溶液总体积的1%）加入到上述清洗后去除上清液的乳胶颗粒微粒中，并补充pH6的MES缓冲液，使盐酸克伦特罗单克隆抗体浓度大于5mg/ml，乳胶颗粒浓度25mg/ml；超声混匀并室温震荡30分钟；加入体积分数1.2%的60mg/ml NHS（N-羟基琥珀酰亚胺）溶液（NHS占溶液总体积的1.2%）和体积分数为1.2%的100mg/ml EDAC（碳二亚胺）溶液（EDAC占溶液总体积的1.2%）；在室温震荡上述溶液2小时；加入体积分数为20%的100mg/ml BSA溶液（BSA占溶液总体积的20%）封闭，并在室温下震荡过夜；以12000 r/min离心纯化标记后的乳胶颗粒，去上清，用20%的100mg/mL BSA悬浮沉淀，得到乳胶-抗体结合物溶液，用体积分数为100m mol/L MES缓冲液（BSA占溶液总体积的20%）稀释到体积分数为10%，分装到2毫升小瓶或小管中；（上述涉及的溶液总体积，可按照总体积计算）

（4）胶体金和乳胶标记物的固相化：将上述步骤（2）得到的胶体金-抗体结合物和步骤（3）得到的乳胶-抗体结合物溶液，分别固相于玻璃纤维和聚酯膜上；

（5）包被硝酸纤维素膜

5.1将CL-BSA偶联物稀释成1.0mg/mL、3.0mg/mL、10mg/mL，以4mm为间距呈横带状喷于硝酸纤维素膜上；

5.2将羊抗鼠IgG单克隆抗体稀释到0.5mg/mL，用喷膜机以泵速16 mm/s、膜速320 mm/s喷于上述步骤5.1制得的硝酸纤维素膜上；

5.3将上述步骤5.2制得的固定有偶联物和抗体的硝酸纤维素膜置37℃烘箱中干燥2h；

5.4置干燥环境中保存。

实施例2

一种盐酸克伦特罗检测试剂条，所述试剂条包括上述实施例1制备得到的硝酸纤维素膜检测试剂，所述试剂条的制备方法如下：

（1）在支持塑料板的中间位置粘贴上述实施例1方法制备的胶硝酸纤维素膜检测试剂；

（2）在支持塑料板上固定上述硝酸纤维素膜位置的上方，粘贴吸水垫（whatman公司），吸水垫覆盖硝酸纤维素膜边沿0.5-1.5毫米；

（3）在所述硝酸纤维素膜下方粘贴上述实施例1中步骤（4）制备得到的标有胶体金-抗体结合物的玻璃纤维样品垫以及标有乳胶-抗体结合物的聚酯膜；所述聚酯膜下方粘贴所述玻璃纤维样品垫覆盖聚酯膜0.5-1.5毫米；

（4）将上述步骤（3）得到的产品压平整后，在切条机上切成宽度为4mm的检测条；

（5）干燥密闭保存。

实施例3

如图1-5所示，一种盐酸克伦特罗检测试剂盒，包括检测卡1和检测条；检测条自上而下依次分为手柄区9、观察区10、标记区和加样区15；

观察区10的底板8上设有硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜靠近手柄区的一端设有包被羊抗鼠抗体的对照线104，另一端依次设有CL-BSA偶联物的第一检测线101、第二检测线102、第三检测线103。

检测卡1包括卡盖11、盒状卡体12，卡盖11的一端设有用来滴加测试样品的漏斗状的加样孔2，卡盖11的中间部位设有一个用来观察测试结果的条形的观测孔3，卡盖11上对应第一检测线101的一侧标注有字母“T”，对应对照线104的一侧标注有字母“C”，卡盖11的底面上设有8个用来固定卡盖11和卡体12的定位销4，卡体12上设有与定位销4配合的定位槽41，卡盖11的底部设有固定柱5、卡盖块状凸起6，卡体12上设有卡体两侧块状凸起51、卡体中间块状凸起7，卡体12上设有用来固定检测条水平位置的卡位突起61。

检测条设置在卡盖11与卡体12之间，检测条包括底板8，底板8包括手柄区9，手柄区9的底板8上设有用来吸水的滤纸支撑层。观察区10与观测孔3的位置相对应。标记区包括设置在底板8上面的聚酯膜层13和玻璃纤维层14，标记有盐酸克伦特罗单克隆抗体。加样区15与加样孔2的位置相对应，加样区15的底板8上设有玻璃纤维。

实施例4

一、检测样处理

（1）尿液样本：用干燥、洁净的离心管或容器采集尿液；如果不立即检测，可将尿样冷冻保存；短期可进行冷藏保存，注意避免腐败造成失效或污染；如果尿样出现沉淀或浑浊物，要离心后再检测。

（2）血清样本：抽取待检动物血液，离心或静置，取透明的上清液血清层，若血清有过度溶血现象，将血清以蒸馏水稀释一倍后再检测；

（3）饲料样本：样品粉碎后过20目筛，得试样。取2g试样于50ml离心管中，加入10mL的水提取液，混匀，置于超声波水浴中超声30分钟，其间每10分钟取出混匀1次，然后取出恢复至室温，4000转/分钟，离心5分钟，取上清液检测；

（4）肌肉或内脏样本：样品完全匀浆后，称取4.0g置于离心管中，加入50mmol/L盐酸溶液20mL，充分振荡混匀5min或超声混匀5min，再静置10分钟；或者加入盐酸后直接摇床振摇30min；称取6.0g完全均质的样品，置于另一个离心管中，加入2mol/L的NaOH溶液125μl，混匀5min之后4000rpm或更高速离心20min ，离心温度保持在10℃左右，吸取上清直接用于检测；

二、样品检测检测

检测方法：测试过程中向加样孔中用吸管吸取待检样本，滴加3滴待检样本于加样孔中，样本沿样品垫缓慢上移，在加样后5-10分钟判读结果。

三、结果判断和分析

检测结果判断：通过计算显色条带数量的多少，从而确定样本中CL的含量，色带数量越少，样本中CL含量越高。

检测结果分析：如果出现四条红色条带，不管色带深浅如何，都表明结果为阴性；如果第一条带不显红色，后三条显红色，结果为阳性，含量≥0.1ng/mL；如果第一、二条带不显红色，后两条带显红色含量为3.0ng/mL；如果第一、二、三条带不显红色，仅第四条带显红色含量≥100ng/mL。 

将盐酸克伦特罗标准品进行梯度稀释，浓度如下表2中所示，分别采用本发明方法的胶体金融合乳胶法和胶体金法制备的检测试剂进行检测，结果如下：

表2 胶体金融合乳胶法和胶体金法检测结果对比

由以上表格可以看出，在盐酸克伦特罗标准品浓度为3ng/mL时，两种检测方法分别检测200例样本的检测结果均能显示阳性；但在盐酸克伦特罗标准品浓度为0.1ng/mL时，胶体金融合乳胶法的检测结果有199例出现阳性，胶体金法的检测结果有197例出现阳性，说明两种检测方法的灵敏度均能达到0.1ng/mL，但是胶体金融合乳胶法的稳定性要强于胶体金法。

除非另有说明，本发明中所采用的百分数均为重量百分数。

本发明各个实施例中，所用化工料均为本领域生产中的常用原料，均可从市场中得到，且对于生产结果不会产生影响；在各工序中用到的设备，均采用当前生产中所用的常规设备，并无特别之处。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种胶体金融合乳胶法半定量检测盐酸克伦特罗的检测试剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）胶体金的制备

制备质量分数为0.01%的氯金酸和0.02%的柠檬酸三钠的混合水溶液；

（2）胶体金标记物的制备和纯化

将上述步骤（1）中制备的胶体金100ml调节pH值至8.0，加入抗盐酸克伦特罗单克隆抗体1.5mg，再逐滴加入25mg/ml聚乙二醇2ml，离心弃上清液，离心沉淀用含0.4mg/mlPEG的PBS缓冲液10ml清洗2次，再将清洗后得到的沉淀用含体积分数为2％BSA的PBS缓冲液5ml溶解，然后将溶解液用无菌过滤器过滤，得到胶体金-抗体结合物，4℃保存；

（3）乳胶颗粒的标记

取乳胶颗粒用MES缓冲液透析盐酸克伦特罗单克隆抗体；将盐酸克伦特罗单克隆抗体和Tween-20溶液加入到乳胶颗粒中，并补充MES缓冲液，使盐酸克伦特罗单克隆抗体浓度大于5mg/ml，乳胶颗粒浓度为25mg/ml；超声混匀并室温震荡；加入体积分数为1.2%的60mg/ml的NHS溶液和体积分数为1.2% 的100mg/ml的EDAC溶液，室温震荡；加入体积分数为20%的100mg/ml BSA溶液封闭，室温震荡；离心纯化标记后的乳胶颗粒，去上清，用BSA溶液悬浮沉淀，得到乳胶-抗体结合物，并稀释到体积分数为10%后，分装；

（4）胶体金和乳胶标记物的固相化：将上述步骤（2）中制备的胶体金-抗体结合物和步骤（3）中制备的乳胶-抗体结合物溶液，分别固相于玻璃纤维和聚酯膜上；

（5）包被硝酸纤维素膜

5.1将CL-BSA偶联物稀释成三个不同浓度，呈横带状间隔喷于硝酸纤维素膜上；

5.2将羊抗鼠IgG单克隆抗体稀释到0.5mg/mL，喷于上述步骤5.1制得的硝酸纤维素膜上；

5.3将上述步骤5.2制得的固定有偶联物和抗体的硝酸纤维素膜置37℃烘箱中干燥，得到检测试剂产品。

2.一种盐酸克伦特罗检测试剂条的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）在支持板的中间位置粘贴上述权利要求1所述的方法制备得到的盐酸克伦特罗检测试剂硝酸纤维素膜；

（2）在支持板固定上述步骤（1）所述硝酸纤维素膜位置的上方，粘贴吸水垫，吸水垫覆盖硝酸纤维素膜边沿0.5-1.5毫米；

（3）在支持板固定上述步骤（2）所述硝酸纤维素膜位置的下方粘贴上述权利要求1所述方法步骤（4）制备的标有胶体金-抗体结合物的玻璃纤维样品垫以及标有乳胶-抗体结合物的聚酯膜；所述聚酯膜下方粘贴所述玻璃纤维样品垫覆盖聚酯膜0.5-1.5毫米；

（4）将上述步骤（3）得到的产品压平整后，切成条。

3.一种盐酸克伦特罗的检测试剂盒，包括检测条和检测卡，其特征在于：

所述检测条包括底板；

所述底板分为手柄区、观察区、标记区和加样区；

所述手柄区的底板上设有用来吸水的滤纸支撑层；

所述观察区的底板上设有上述权利要求1所述的方法制备得到的盐酸克伦特罗检测试剂硝酸纤维素膜，所述硝酸纤维素膜靠近手柄区的一端设有包被羊抗鼠抗体的对照线，另一端设有包被CL-BSA偶联物的3条检测线；

所述标记区的底板上标记有CL单克隆抗体；

所述加样区的底板上设有玻璃纤维样品垫；

所述检测卡包括卡盖和盒状卡体；

所述卡盖的一端设有用来滴加测试样品的漏斗状的加样孔，所述加样孔与所述底板的加样区的位置相对应；所述卡盖的中间部位设有用来观察测试结果的条形的观测孔，所述观测孔与所述底板的观察区的位置相对应；所述卡盖的底面上设有若干个用来固定卡盖和卡体的定位销，所述卡体上设有与定位销配合的定位槽；所述检测条设置在卡盖与卡体之间；

所述卡盖的底部设有固定柱和块状凸起；所述卡体上也设有块状凸起；

所述卡体上设有用来固定检测条水平位置的卡位突起。

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