CN104897863B - 一种检测黄曲霉毒素m1的荧光微球免疫层析试纸条及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测黄曲霉毒素M1的荧光微球免疫层析试纸条，包括由样品结合垫、层析膜、吸水垫和粘性底衬组成的试纸条，所述样品结合垫上含有荧光微球标记黄曲霉毒素M1单克隆抗体；所述层析膜上有检测区和质控区，检测区包被有黄曲霉毒素M1半抗原‑载体蛋白偶联物，质控区包被有羊抗鼠抗抗体。用本发明试纸条检测黄曲霉毒素M1的方法简单、快速、适用范围广、成本低、易推广使用。

Description

一种检测黄曲霉毒素M1的荧光微球免疫层析试纸条及方法

技术领域

本发明涉及一种检测黄曲霉毒素M1的试纸条及方法，具体涉及一种用于检测牛奶中黄曲霉毒素M1的荧光微球免疫层析试纸条。

背景技术

黄曲霉毒素（aflatoxin，AF）是迄今发现污染农产品毒素最强的一类生物毒素，也是强致癌物。最为常见的有AF B1、B2、G1、G2，其中AF B1的存在量与毒性都是最大的。黄曲霉毒素M1是黄曲霉毒素B1的4-羟基衍生物，是B1在体内经过羟化而衍生成的代谢产物，一部分从尿和乳汁排出，另一部分存在于动物的可食部分中。主要存在于土壤、动植物、霉变谷物、各种坚果、食品、调味品、食用油、牛奶和奶制品等霉变制品中，直接或间接进入人类食物链，是致癌致畸致突变的毒物，严重威胁人类健康和生命安全。牛乳及其制品是易受到黄曲霉毒素污染的食品之一。为保证其安全卫生，各国都制定了严格的限量标准。美国FDA规定牛乳中黄曲霉毒素M1的限量水平为0.5μg/kg，我国也规定牛乳中黄曲霉毒素M1含量不得超过0.5μg/kg。

目前，对黄曲霉毒素检测的方法主要有薄层色谱法、高效液相色谱法、免疫分析法、质谱法、免疫亲和荧光光度法等。薄层色谱法操作繁琐、污染大、定量差、耗时长；高效液相色谱法具有灵敏度高、分离能力强、特异性好和测定结果可靠等特点，但如果食品成分复杂，在进行液相色谱分离前，需对样品作彻底有效的净化处理，不适合于大批量样品的检测，应用受到限制；酶联免疫吸附法是目前常使用的一种检测方法，它具有快速、灵敏、对样品纯度要求不高等优点，特别适用于大批量样品的检测，荧光免疫层析法与酶联免疫法相比检测时间更短，稳定性好、操作简便、无需其他仪器设备，结果判断直观可靠，适用于现场进行快速筛选。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种检测黄曲霉毒素M1的荧光微球免疫层析试纸条。

本发明所提供的检测黄曲霉毒素M1的荧光微球免疫层析试纸条，其特征在于包括由样品结合垫、层析膜、吸水垫和底衬组成的试纸条；所述样品结合垫上含有荧光微球标记黄曲霉毒素M1单克隆抗体；所述层析膜上有检测区和质控区，检测区包被有黄曲霉毒素M1半抗原-载体蛋白偶联物，质控区包被有羊抗鼠抗抗体。所述样品结合垫是将荧光微球抗体偶联物以特定缓冲体系稀释后，将样品结合垫浸泡于稀释缓冲液中，经真空冷冻干燥后制备而得；所述荧光微球是内部包埋荧光染料、表面修饰有羧基官能团的微球悬液，荧光微球由聚苯乙烯包被，粒径100～300nm，固体含量1%～10%，官能团密度100～600uEq/g。

所述的荧光微球标记黄曲霉毒素M1单克隆抗体是通过EDC和NHS介导的与蛋白表面氨基的酰胺化反应制备获得的。

所述的黄曲霉毒素M1半抗原是由黄曲霉毒素M1与对苯二胺反应获得，包括如下步骤：

65mg黄曲霉毒素M1溶于1mL二甲基亚砜（DMSO），60℃下缓慢滴加入25mg对苯二胺和0.1mL吡啶在1mL DMSO的混合液中，滴加完毕后，继续反应15h，旋蒸除去溶剂，柱层析纯化后得到黄曲霉毒素M1的对苯二胺单缩合物。

所述荧光微球标记黄曲霉毒素M1单克隆抗体的黄曲霉毒素M1单克隆抗体是以黄曲霉毒素M1半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得的。

所述黄曲霉毒素M1半抗原-载体蛋白偶联物是由黄曲霉毒素M1半抗原与载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白可为牛血清白蛋白、卵清白蛋白、甲状腺蛋白、血蓝蛋白、人血清白蛋白。

所述样品结合垫是将样品结合垫置于含牛血清白蛋白（牛血清白蛋白在缓冲体系中的终浓度为0.5%体积百分含量）、pH7.2、0.1mol/L磷酸盐缓冲液中均匀浸泡2h，将处理完的样品结合垫平铺于干燥网上置于37℃干燥室干燥2h（湿度要求30%），将荧光微球抗体偶联物以贮存缓冲液稀释后，将样品结合垫浸泡于其中经真空冷冻干燥后制备而得，备用。

所述底衬为PVC底板或其他硬质不吸水的材料；所述样品结合垫为玻璃纤维膜；所述吸水垫为吸水纸；所述层析膜为硝酸纤维素膜。

本发明的另一个目的是提供一种制备上述黄曲霉毒素M1荧光微球免疫层析试纸条的方法，其包括步骤：

1）制备黄曲霉毒素M1单克隆抗体；

2）制备荧光微球标记黄曲霉毒素M1单克隆抗体，并在样品结合垫中包埋荧光微球抗体偶联物；

3）将样品结合垫、层析膜、吸水垫由一端依次粘贴在底衬上组装成试纸条；

4）切割、组装成试纸条用于检测黄曲霉毒素M1。

具体地说，步骤包括：

1）将黄曲霉毒素M1与对苯二胺反应，制备黄曲霉毒素M1半抗原；

2）将黄曲霉毒素M1半抗原与载体蛋白偶联，制备黄曲霉毒素M1半抗原-载体蛋白偶联物；

3）用黄曲霉毒素M1半抗原-载体蛋白偶联物免疫小鼠，将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞通过融合、筛选，得到分泌黄曲霉毒素M1单克隆抗体的杂交瘤细胞株；

4）提取小鼠IgG免疫健康山羊，得到羊抗鼠抗抗体；

5）通过EDC和NHS介导的与蛋白表面氨基的酰胺化反应完成荧光微球标记黄曲霉毒素M1单克隆抗体，得到荧光微球抗体偶联物；

6）将荧光微球抗体偶联物以特定缓冲体系稀释后，将样品结合垫浸泡于稀释缓冲液中，经真空冷冻干燥后制备得到样品结合垫；

7）将样品结合垫、层析膜、吸水垫由一端依次粘贴在底衬上组装成试纸条；

8）将制备好的试纸条进行切割、组装用于检测黄曲霉毒素M1。

本发明的另一个目的是提供一种黄曲霉毒素M1荧光微球免疫层析试纸条用于检测牛奶中的黄曲霉毒素M1残留的方法，包括如下步骤：

1）用荧光微球免疫层析试纸条进行检测；

2）用荧光检测仪分析检测结果。

本发明中用试纸条检测样品时，样本中的黄曲霉毒素M1在流动的过程中与荧光微球标记的特异性单克隆抗体结合，抑制了抗体和层析膜检测区（T线）上的黄曲霉毒素M1半抗原-载体蛋白偶联物的结合，从而导致检测线荧光抗体信号强度的变化。

本发明采用将黄曲霉毒素M1单克隆抗体与荧光微球偶联物包埋在样品结合垫上，具有亲水性佳、可大容量吸附抗体偶联物、迅速重湿润、抗体结合物释放充分、性能特好、释放快、形态好等优势，从而减少误差，增加整个体系的反应灵敏度。本发明的试纸条具有成本低、操作简单、检测时间短、储存简单等优点。用本发明的试纸条检测黄曲霉毒素M1，方法简单、快速、适用范围广、成本低、易推广使用。

附图说明

图1为试纸条剖面结构示意图。

图2为试纸条俯视图。

图3为黄曲霉毒素M1半抗原合成路线图。

图4为黄曲霉毒素M1半抗原核磁共振氢谱图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1检测黄曲霉毒素M1的荧光微球免疫层析试纸条的构成

所述试纸条是由样品结合垫、层析膜、吸水垫和底衬组成，如图1所示；

所述样品结合垫1、层析膜2、吸水垫3依次按顺序粘贴在底衬6上，样品结合垫的末端与层析膜的始端相连，层析膜的末端与吸水垫相连，样品结合垫的始端与底衬的始端对齐，吸水垫的末端与底衬的末端对齐；

所述层析膜上有检测区4和质控区5，均呈与所述试纸条的长相垂直的条带状，检测区位于近于样品结合垫的一端，质控区位于远离样品结合垫的一端。样品结合垫上含有荧光微球标记黄曲霉毒素M1单克隆抗体；检测区包被有黄曲霉毒素M1半抗原-载体蛋白偶联物（黄曲霉毒素M1半抗原-卵清白蛋白的偶联物），质控区包被有羊抗鼠抗抗体；

所述底衬为PVC底板或其他硬质不吸水的材料；所述样品结合垫为玻璃纤维膜；所述吸水垫为吸水纸；所述层析膜为硝酸纤维素膜。

将制备好的试纸条进行切割、装在特制的塑料制卡中，组装成试纸条在2～8℃阴凉避光干燥保存，有效期12个月。

实施例2实施例1中所述的荧光微球免疫层析试纸条的制备方法

一、试纸条的制备

试纸条的制备方法主要包括以下步骤：

1）制备黄曲霉毒素M1单克隆抗体；

2）制备荧光微球标记黄曲霉毒素M1单克隆抗体，并在样品结合垫中包埋荧光微球抗体偶联物；

3）将样品结合垫、层析膜、吸水垫由一端依次粘贴在底衬上组装成试纸条；

4）切割、组装成试纸条用于检测黄曲霉毒素M1。

下面分步详细叙述：

（一）各部件的制备

1.黄曲霉毒素M1抗原和单克隆抗体的制备

（1）黄曲霉毒素M1半抗原的合成和鉴定

半抗原的合成（合成路线如图3）

65mg黄曲霉毒素M1溶于1mL DMSO，60℃下缓慢滴加入25mg对苯二胺和0.1mL吡啶在1mL DMSO的混合液中，滴加完毕后，继续反应15h，旋蒸除去溶剂，柱层析纯化后得到黄曲霉毒素M1的对苯二胺单缩合物。

半抗原的鉴定

取上述产物经核磁共振氢谱测定，如图4所示，图谱中7.0ppm左右增加的2组芳环信号峰，说明半抗原合成成功。

（2）免疫原的制备

取8.4mg黄曲霉毒素M1半抗原溶于2mL水中得到溶液Ⅰ；取戊二醛50μL逐滴加入到溶液Ⅰ中，室温搅拌反应24h得到溶液Ⅱ；取50mg牛血清白蛋白（BSA）用4mL水溶解得到溶液Ⅲ；将溶液Ⅱ缓慢加入到溶液Ⅲ中，室温搅拌反应过夜，加入30mg硼氢化钠（NaBH₄）还原，用0.02mol/L的PBS透析三天，每天更换透析液三次，得到免疫原。

（3）包被原的制备

将BSA替换成卵清白蛋白（OVA）按上述（2）的步骤制备得到黄曲霉毒素M1包被原。

（4）黄曲霉毒素M1单克隆抗体的制备

用上述（2）的步骤制备得到的黄曲霉毒素M1免疫原免疫Balb/c小鼠制备黄曲霉毒素M1单克隆抗体。

2.羊抗鼠抗抗体的制备

以羊作为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原对无病原体羊进行免疫，得到羊抗鼠抗抗体。

3.荧光微球标记黄曲霉毒素M1单克隆抗体

（1）荧光微球

标记用的荧光微球是内部包埋荧光染料、表面修饰有羧基官能团的微球悬液，荧光微球由聚苯乙烯包被，粒径100～300nm，固体含量1%～10%，官能团密度100～600uEq/g。

（2）相关溶液的制备

活化缓冲液：pH5.5～6.5的0.05mol/L的2-（N-吗啡啉）乙磺酸（MES）溶液。

偶联缓冲液：pH7.5～8.5的0.05mol/L硼酸盐缓冲液（避免使用存在游离胺的溶剂）。

封闭缓冲液：pH7.4的磷酸盐缓冲液（PB），含0.1～0.4mol/L的伯胺（盐酸羟胺、乙醇胺、氨基乙醇），1%～10%BSA。

贮存缓冲液：pH7.4的磷酸盐缓冲液（PB）含0.03%Proclin300及0.1%BSA。

活化剂：水溶性碳二亚胺（摩尔质量比EDC:COOH=(1.5～3):1NHS:COOH=(8～20):1)，临用前以活化缓冲液稀释至所需浓度。

（3）荧光微球标记黄曲霉毒素M1单克隆抗体

通过EDC和NHS介导的与蛋白表面氨基的酰胺化反应完成荧光微球标记黄曲霉毒素M1单克隆抗体。

荧光微球标记黄曲霉毒素M1单克隆抗体的制备：取内部包埋荧光染料、表面修饰有羧基官能团的微球悬液100μL混悬于900μL pH6.0的0.05mol/L的MES缓冲液中，10000r/min于4℃离心10min弃上清，重悬微球于1mL MES缓冲液中，以此法洗涤微球2次，加入适量活化剂（摩尔质量比EDC:NHS:COOH=1.5:8:1），混匀后室温振荡活化10min；混悬液于4℃10000r/min离心10min弃上清，重悬于偶联缓冲液中，以此法洗涤微球2次，加入10μL黄曲霉毒素M1单克隆抗体溶液（蛋白浓度1mg/mL），混匀后室温振荡偶联120min；混悬液于4℃10000r/min离心10min弃上清，重悬于封闭缓冲液（pH7.4的PB含0.1mol/L盐酸羟胺及1%BSA）中，以此法洗涤微球1次，混匀后室温振荡封闭30min；混悬液于4℃10000r/min离心10min弃上清，重悬于贮存缓冲液（pH7.4的PB含0.03%Proclin300及0.1%BSA）中，以此法洗涤微球1次，混匀后于4℃避光保存。

4.样品结合垫的制备

将样品结合垫置于含牛血清白蛋白（牛血清白蛋白在缓冲体系中的终浓度为0.5%体积百分含量）、pH7.2、0.1mol/L磷酸盐缓冲液中均匀浸泡2h，将处理完的样品结合垫平铺于干燥网上置于37℃干燥室干燥2h（湿度要求30%），将荧光微球抗体偶联物以贮存缓冲液稀释后，将样品结合垫浸泡于其中经真空冷冻干燥后制备而得，备用。

5.层析膜的制备

包被过程：用0.05mol/L的pH7.2的磷酸缓冲液将黄曲霉毒素M1半抗原-卵清白蛋白偶联物稀释到100μg/mL，用Isoflow点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的检测区（T线），包被量为1.0μL/cm；用0.01mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液将羊抗鼠IgG抗体稀释到200μg/mL，用Isoflow点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的质控区（C线），包被量为1.0μl/cm。将包被好的反应膜置于37℃条件下干燥16h，备用。

（二）各部件的组装

将所述样品结合垫、层析膜、吸水垫依次按顺序粘贴在所述底衬上；样品结合垫的末端与层析膜的始端相连，层析膜的末端与吸水垫的始端相连，样品结合垫的始端与底衬的始端对齐，吸水垫的末端与底衬的末端对齐，层析膜上有检测区和质控区，检测区（T线）和质控区（C线）均为与所述试纸条的长相垂直的条状带；检测区位于近于样品结合垫的一侧；

质控区位于远离样品结合垫的一侧；将试纸条用机器切成3.96mm宽度的小条，装在特制的塑料制卡中，形成试纸条用于检测黄曲霉毒素M1残留，试纸条在2～8℃阴凉避光干燥保存，有效期为12个月。

实施例3样品中黄曲霉毒素M1的检测

1.用试纸条检测样品

从原包装中取出所需数目的试纸条，并做好标记；同时将待检牛奶样本置于60～70℃水浴5min，取出；用微量移液器吸取150μl待检牛奶样品溶液垂直滴加3～4滴（约100μL）于加样孔中，液体流动时开始计时，反应3～5min；将试纸条插入KFT-100A型荧光检测仪的承载器中，通过触摸显示屏选择待检项目，按下“开始检测”按键，荧光检测仪将自动对检测卡进行扫描测试；通过仪器的显示屏幕上读取检测结果。

2.检测结果分析

测试完成后，仪器将根据检测得到的荧光信号的强弱，自动计算出牛奶样本中黄曲霉毒素M1的浓度值，并根据预设的阈值给出阴阳性判断。

阴性（－）：若荧光检测仪的显示屏幕上结果显示为阴性，表示牛奶样本不含有黄曲霉毒素M1或其浓度低于检测限。

阳性（+）：若荧光检测仪的显示屏幕上结果显示为阳性，表示牛奶样本黄曲霉毒素M1浓度等于或高于检测限。

无效：若质控区未检出荧光信号强度，表明不正确的操作过程或试纸条已失效。

实施例4试纸条技术参数的确定

1.检测限试验

向空白牛奶样品中分别添加黄曲霉毒素M1标准品至终浓度为0、0.05、0.1、0.2μg/L，用试纸条进行牛奶样品检测，结果为：当黄曲霉毒素M1标准品浓度为0、0.05μg/L时，荧光检测仪结果显示为阴性，当黄曲霉毒素M1标准品浓度为0.1、0.2μg/L时，荧光检测仪结果显示为阳性，表明本试纸条对牛奶样品黄曲霉毒素M1检测限为0.1μg/L。

2.假阳性率、假阴性率试验

取已知黄曲霉毒素M1含量大于0.1μg/L的牛奶阳性样品20份和黄曲霉毒素M1含量小于0.1μg/L的牛奶阴性样品20份，用3个批次生产的试纸条分别进行检测，结果见表1、表2。

表1检测阳性样品结果

表2检测阴性样品结果

结果表明：用3个批次生产的试纸条检测阳性牛奶样品时，荧光检测仪结果显示全为阳性，可知阳性样本符合率为100%，假阴性率为0。检测20份阴性牛奶样品时，荧光检测仪结果显示全为阴性，可知阴性符合率为100%，假阳性率为0。本发明的检测黄曲霉毒素M1试纸条可以对牛奶样品中黄曲霉毒素M1残留进行快速检测。

Claims (5)

1.一种检测黄曲霉毒素M1的荧光微球免疫层析试纸条，其特征在于包括由样品结合垫、层析膜、吸水垫和底衬组成的试纸条；所述样品结合垫上含有荧光微球标记黄曲霉毒素M1单克隆抗体；所述层析膜上有检测区和质控区，检测区包被有黄曲霉毒素M1半抗原-载体蛋白偶联物，质控区包被有羊抗鼠抗抗体；所述样品结合垫是将荧光微球黄曲霉毒素M1单克隆抗体偶联物以特定缓冲体系稀释后，将样品结合垫浸泡于其中，经真空冷冻干燥后制备而得；标记用的荧光微球悬液是内部包埋荧光染料和表面修饰有羧基官能团的微球悬液，固体含量1％～10％，荧光微球由聚苯乙烯包被，粒径100～300nm，官能团密度100～600uEq/g；所述的黄曲霉毒素M1半抗原是由黄曲霉毒素M1与对苯二胺反应获得，包括如下步骤：65mg黄曲霉毒素M1溶于1mL DMSO，60℃下缓慢滴加入25mg对苯二胺和0.1mL吡啶在1mLDMSO的混合液中，滴加完毕后，继续反应15h，旋蒸除去溶剂，柱层析纯化后得到黄曲霉毒素M1的对苯二胺单缩合物。

2.如权利要求1所述的检测黄曲霉毒素M1的荧光微球免疫层析试纸条，其特征在于所述的荧光微球标记黄曲霉毒素M1单克隆抗体是通过EDC和NHS介导的与蛋白表面氨基的酰胺化反应获得的。

3.如权利要求1所述的检测黄曲霉毒素M1的荧光微球免疫层析试纸条，其特征在于所述荧光微球标记黄曲霉毒素M1单克隆抗体的黄曲霉毒素M1单克隆抗体是以黄曲霉毒素M1半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得的。

4.权利要求1所述的检测黄曲霉毒素M1的荧光微球免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

1)制备黄曲霉毒素M1单克隆抗体；

2)制备荧光微球标记黄曲霉毒素M1单克隆抗体，并在样品结合垫中包埋荧光微球黄曲霉毒素M1单克隆抗体偶联物；

3)将样品结合垫、层析膜、吸水垫由一端依次粘贴在底衬上组装成试纸条；

4)将制备好的试纸条进行切割、组装用于检测黄曲霉毒素M1。

5.权利要求1所述的检测黄曲霉毒素M1的荧光微球免疫层析试纸条用于检测牛奶中的黄曲霉毒素M1残留的方法，其特征在于包括如下步骤：

1)用权利要求1-3任一项所述的荧光微球免疫层析试纸条进行检测；

2)用荧光检测仪分析检测结果。