CN104977410A - 三聚氰胺荧光微球免疫层析试纸条及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种三聚氰胺荧光微球免疫层析试纸条及其制备方法和用途。本发明所述试纸条由样品结合垫、层析膜、吸水垫和粘性底衬组成。本发明基于抗原抗体的免疫学原理检测牛奶中的三聚氰胺污染。本研究提供的三聚氰胺荧光微球免疫层析试纸条可以用于三聚氰胺的现场快速检测，只需10min；与荧光检测仪连用，可实现定量检测；操作者不需要专业培训，因此将具有良好的市场前景。
Description
技术领域
本发明涉及牛奶中三聚氰胺污染的检测技术，具体涉及一种三聚氰胺荧光微球免疫层析试纸条及其制备方法和用途。
背景技术
三聚氰胺简称三胺，化学名1,3,5-三嗪-2,4,6-三氨，分子式为C3N6H6，相对分子质量为126.12，是一种低毒无味的纯白色单斜棱晶体，广泛应用于涂料、建材、造纸、皮革、纺织等行业中。由于三聚氰胺的含氮量高达66%，是蛋白质平均含氮量的4倍，而常用的凯氏定氮法测定样品中的蛋白质含量时却不能区分这种非蛋白氮，因此被不法商贩利用添加在饲料和食品中以提高食品和饲料中粗蛋白质检测数值。动物实验表明，三聚氰胺对于哺乳动物属于微毒、低毒类化学物质，长期饲喂可能造成生殖、泌尿系统的损害，膀胱、肾部出现结石，并可进一步诱发膀胱癌。联合国负责食品安全标准的机构国际食品法典委员会2010年7月6日表示，该委员会已就食品中三聚氰胺的允许含量设立了新标准。新标准规定，每千克婴儿配方奶粉中的三聚氰胺含量不能超过1mg，而每千克其他食品或动物饲料中的三聚氰胺含量不能超过2.5mg。因此，加强对三聚氰胺检测技术的研究和快速检测技术的发展是非常有必要的。
目前，检测三聚氰胺比较经典的方法有高效液相色谱法（HPLC）、液相色谱-质谱/质谱法（LC-MS/MS）、气相色谱-质谱联用法（GC-MS）等，这些都是比较传统的方法，也是目前的确证方法。另外，目前常用的还有酶联免疫法（ELISA）。但由于以上方法均需先进检测仪器，检测费用昂贵、步骤繁琐耗时，且对操作人员专业性要求较高，不适用于基层企事业单位的大通量快速筛查检测。胶体金免疫层析法具有检测速度快、价格便宜、操作简单等优点，是目前国内外检测三聚氰胺的主要监控方法，但仍存在一些缺陷，如稳定性较差、灵敏度较低、无法实现定量检测、基质效应明显背景干扰大，且颜色单一，难以实现多检和联检。
荧光微球免疫层析技术是继胶体金免疫层析技术后，在荧光染料标记技术上发展起来的，作为一种免疫学检测方法，它是免疫亲和技术、免疫标记技术、免疫层析技术的结合，与胶体金免疫层析技术一样具有快速、操作简便等优点。但是相比胶体金等传统标记物，荧光微球的发光强度可以随激发光的强度增强而增强，所以荧光微球标记有望提高免疫层析技术的检测限；而在微球壳结构的作用下，荧光微球具有相对稳定的形态结构，粒度均一、单分散性好、稳定性好、发光效率高、重复性好，有较好的生物相容性；且形成微球后染料荧光猝灭大大减少，发射强而稳定，且基本不受外界环境介质变化的影响。因此相比上述检测方法，荧光微球免疫层析技术同时具有检测灵敏度高、操作简便的优点。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术中的不足，提供一种操作简单、携带方便且制备成本低、可快速检测三聚氰胺污染的三聚氰胺荧光微球免疫层析试纸条。
本发明的另一个目的是提供上述三聚氰胺荧光微球免疫层析试纸条的制备方法。
本发明的另一个目的是提供上述三聚氰胺荧光微球免疫层析试纸条在检测牛奶中三聚氰胺污染的应用。
本发明的上述目的是通过如下方案实现的：
一种三聚氰胺荧光微球免疫层析试纸条，由样品结合垫、层析膜、吸水垫、粘性底衬组成，粘性底衬上依次粘贴样品结合垫、层析膜和吸水垫；所述层析膜上依次包被有三聚氰胺半抗原-载体蛋白偶联物和羊抗鼠抗抗体，以三聚氰胺半抗原-载体蛋白偶联物所在区域为测试线，以羊抗鼠抗抗体所在区域为质控线；所述样品结合垫包埋有荧光微球标记的抗三聚氰胺单克隆抗体，所述荧光微球是内部包埋荧光染料、表面修饰有羧基官能团的微球悬液，荧光微球由聚苯乙烯包被，粒径100～300nm，固体含量1%～10%，官能团密度100～600uEq/g。
三聚氰胺荧光微球免疫层析试纸条的制备方法，包括如下步骤：
1）制备三聚氰胺单克隆抗体；
2）制备荧光微球标记的抗三聚氰胺单克隆抗体，并将其包埋在样品结合垫上；
3）将样品结合垫、层析膜、吸水垫由一端依次粘贴在粘性底衬上，切割、组装试纸条，用于检测三聚氰胺。
具体地说，步骤包括：
1）将三聚氰酸二酰胺与邻苯二甲酸酐反应，制备三聚氰胺半抗原；
2）将三聚氰胺半抗原与载体蛋白偶联，制备三聚氰胺半抗原-载体蛋白偶联物；
3）用三聚氰胺半抗原-载体蛋白偶联物免疫小鼠，将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞通过融合、筛选，得到分泌三聚氰胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株；
4）提取小鼠IgG免疫健康山羊，得到羊抗鼠抗抗体；
5）将样品结合垫用含牛血清白蛋白（牛血清白蛋白在缓冲体系中的终浓度为0.5%体积百分含量）、pH7.2、0.1mol/L的磷酸盐缓冲液均匀浸泡2h，37℃下烘干2h；
6）通过EDC和NHS介导的与蛋白表面氨基的酰胺化反应完成荧光微球标记抗三聚氰胺单克隆抗体，并将其以特定缓冲体系稀释后，将5）处理过的样品结合垫浸泡于稀释缓冲液中，经真空冷冻干燥后备用；
7）将三聚氰胺半抗原-载体蛋白偶联物和羊抗鼠抗抗体分别包被在层析膜上，三聚氰胺半抗原-载体蛋白偶联物所在区域作为测试线，羊抗鼠抗抗体所在区域作为质控线；
8）将样品结合垫、层析膜、吸水垫由一端依次粘贴在粘性底衬上，切割、组装试纸条，用于检测三聚氰胺。
所述的荧光微球-抗三聚氰胺抗体偶联物是通过EDC和NHS介导的与蛋白表面氨基的酰胺化反应完成荧光微球标记抗三聚氰胺单克隆抗体，制备方法如下：
荧光微球-抗三聚氰胺抗体偶联物的制备：取内部包埋荧光染料、表面修饰有羧基官能团的微球悬液100μL混悬于900μL活化缓冲液（pH5.5～6.5的0.05mol/L的2-(N-吗啡啉)乙磺酸溶液）中，10000r/min于4℃离心10min弃上清，重悬微球于1mL活化缓冲液中，以此法洗涤微球2次，加入适量活化剂[摩尔质量比EDC∶NHS∶COOH=(1.5～3)∶(8～20)∶1]，混匀后室温振荡活化10min；混悬液于4℃10000r/min离心10min弃上清，重悬于偶联缓冲液（pH7.5～8.50.05mol/L硼酸盐缓冲液）中，以此法洗涤微球2次，加入15～30μL三聚氰胺单克隆抗体溶液（蛋白浓度1mg/mL），混匀后室温振荡偶联120min；混悬液于4℃10000r/min离心10min弃上清，重悬于封闭缓冲液[pH7.4的磷酸盐缓冲液（PB），含0.1～0.4mol/L的伯胺（盐酸羟胺、乙醇胺、氨基乙醇）和1%～10%BSA]中，以此法洗涤微球1次，混匀后室温振荡封闭30min；混悬液于4℃10000r/min离心10min弃上清，重悬于贮存缓冲液[pH7.4的磷酸盐缓冲液（PB），含防腐剂（0.03%Proclin300）和0.1%BSA]中，以此法洗涤微球1次，混匀后于4℃避光保存。
所述荧光微球-抗三聚氰胺抗体偶联物中的三聚氰胺单克隆抗体是以三聚氰胺半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得的。
所述三聚氰胺半抗原-载体蛋白偶联物是由三聚氰胺半抗原与载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白可为牛血清白蛋白、卵清蛋白、甲状腺蛋白、血蓝蛋白、人血清白蛋白。具体步骤如下：
取三聚氰胺半抗原12.3mg，用2mL水溶解；取碳化二亚胺（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）各20mg，用0.5mL水溶解后，逐滴加入到三聚氰胺半抗原溶液中，室温搅拌反应24h，作为A液；取载体蛋白50mg，用4mL水溶解；将A液缓慢加入到载体蛋白溶液中，室温搅拌反应过夜；加入NaBH430mg；用0.02mol/L的PBS透析三天，每天更换透析液三次，得三聚氰胺半抗原-载体蛋白偶联物。
所述的三聚氰胺半抗原是由三聚氰酸二酰胺与邻苯二甲酸酐反应获得，包括如下步骤：
取三聚氰酸二酰胺127mg、邻苯二甲酸酐222mg、吡啶0.5mL混合溶解在20mL二甲基亚砜中，80℃下搅拌反应10h，蒸除溶剂，柱层析纯化得到邻苯二甲酸单三聚氰酸二酰胺酯，即为三聚氰胺半抗原。
所述粘性底衬为PVC底板或其他硬质不吸水的材料；所述样品结合垫为玻璃纤维；所述吸水垫为吸水纸；所述层析膜为硝酸纤维素膜。
本发明的另一个目的是提供一种三聚氰胺荧光微球免疫层析试纸条在检测牛奶中三聚氰胺残留中的应用，包括如下步骤：
1）待测样品处理；
2）用三聚氰胺荧光微球免疫层析试纸条进行检测；
3）用荧光检测仪分析检测结果。
本发明中用试纸条检测样品时，样本中的三聚氰胺在流动的过程中与荧光微球标记的特异性单克隆抗体结合，抑制了抗体与层析膜测试线（T线）上的三聚氰胺-载体蛋白偶联物的结合，从而导致测试线荧光抗体信号强度的变化。
本发明采用将荧光微球-抗三聚氰胺单克隆抗体偶联物包被在样品结合垫上，具有亲水性佳、可大容量吸附抗体偶联物、迅速重湿润、抗体结合物释放充分、性能特好、释放快、形态好等优势，从而减少误差，增加整个体系的反应灵敏度。本发明的试纸条具有灵敏度高、成本低、操作简单、检测时间短、储存简单等优点。用本发明的试纸条检测三聚氰胺，方法简便、快速、直观、准确、适用范围广、成本低、易推广使用。
附图说明
图1为荧光微球免疫层析试纸条剖面结构示意图；
图2为荧光微球免疫层析试纸条俯视图；
图3为三聚氰胺半抗原合成路线图；
图4为三聚氰胺半抗原核磁共振氢谱图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1三聚氰胺荧光微球免疫层析试纸条的构成
一、试纸条（图1、图2）
试纸条是由样品结合垫、层析膜、吸水垫和粘性底衬组成；
样品结合垫1、层析膜2、吸水垫3依次按顺序粘贴在粘性底衬6上，样品结合垫的末端与层析膜的始端相连，层析膜的末端与吸水垫的始端相连，样品结合垫的始端与粘性底衬的始端对齐，吸水垫的末端与粘性底衬的末端对齐；
层析膜上有测试线4和质控线5，均呈与所述试纸条的长相垂直的条带状，测试线位于近于样品结合垫的一端，质控线位于远离样品结合垫的一端。测试线包被有三聚氰胺半抗原-载体蛋白偶联物（三聚氰胺半抗原-卵清蛋白的偶联物），质控线包被有羊抗鼠抗抗体；
所述粘性底衬为PVC底板或其他硬质不吸水的材料；所述样品结合垫为玻璃纤维；所述吸水垫为吸水纸；所述层析膜为硝酸纤维素膜。
实施例2三聚氰胺荧光微球免疫层析试纸条的制备方法
一、试纸条的制备
试纸条的制备方法主要包括以下步骤：
1）制备三聚氰胺单克隆抗体；
2）制备荧光微球标记的抗三聚氰胺单克隆抗体，并将其包埋在样品结合垫上；
3）将样品结合垫、层析膜、吸水垫由一端依次粘贴在粘性底衬上，切割、组装试纸条，用于检测三聚氰胺。
下面分步详细叙述：
1、三聚氰胺半抗原的合成和鉴定
半抗原的合成（合成路线如图3）：取三聚氰酸二酰胺127mg、邻苯二甲酸酐222mg、吡啶0.5mL混合溶解在20mL二甲基亚砜中，80℃下搅拌反应10h，蒸除溶剂，柱层析纯化得到邻苯二甲酸单三聚氰酸二酰胺酯，即为三聚氰胺半抗原。
半抗原的鉴定：取上述产物经核磁共振氢谱测定，如图4所示，图谱中8.0ppm附近增加的芳环信号峰，13.2ppm附近增加的羧基信号峰，说明半抗原合成成功。
2、免疫原的制备
取三聚氰胺半抗原12.3mg，用2mL水溶解；取碳化二亚胺（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）各20mg，用0.5mL水溶解后，逐滴加入到三聚氰胺半抗原溶液中，室温搅拌反应24h，作为A液；取牛血清白蛋白50mg，用4mL水溶解；将A液缓慢加入到牛血清白蛋白溶液中，室温搅拌反应过夜；加入NaBH430mg；用0.02mol/L的PBS透析三天，每天更换透析液三次，得三聚氰胺半抗原-牛血清白蛋白偶联物，即为免疫原。
3、包被原的制备
取三聚氰胺半抗原12.3mg，用2mL水溶解；取EDC和NHS各20mg，用0.5mL水溶解后，逐滴加入到三聚氰胺半抗原溶液中，室温搅拌反应24h，作为B液；取卵清蛋白50mg，用4mL水溶解；将B液缓慢加入到卵清蛋白溶液中，室温搅拌反应过夜；加入NaBH430mg；用0.02mol/L的PBS透析三天，每天更换透析液三次，得三聚氰胺半抗原-卵清蛋白偶联物，即为包被原。
4、三聚氰胺单克隆抗体的制备
用上述步骤2制备得到的三聚氰胺免疫原免疫Balb/c小鼠制备三聚氰胺单克隆抗体。
5、羊抗鼠抗抗体的制备
以羊作为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原对无病原体羊进行免疫，得到羊抗鼠抗抗体。
6、荧光微球-抗三聚氰胺抗体偶联物
（1）荧光微球
标记用的荧光微球为内部包埋荧光染料、表面修饰有羧基官能团的微球悬液，荧光微球由聚苯乙烯包被，粒径100～300nm，固体含量1%～10%，官能团密度100～600uEq/g。
（2）相关溶液的制备
活化缓冲液：pH5.5～6.5的0.05mol/L的2-（N-吗啡啉）乙磺酸（MES）溶液。
偶联缓冲液：pH7.5～8.50.05mol/L硼酸盐缓冲液（避免使用存在游离胺的溶剂）。
封闭缓冲液：pH7.4的磷酸盐缓冲液（PB），含0.1～0.4mol/L的伯胺（盐酸羟胺、乙醇胺、氨基乙醇）和1%～10%BSA。
贮存缓冲液：pH7.4的磷酸盐缓冲液（PB），含防腐剂（0.03%Proclin300）和0.1%BSA。
活化剂：水溶性碳二亚胺（EDC:COOH=1.5～3:1NHS:COOH=8～20:1），临用前以活化缓冲液稀释至所需浓度。
待标记单抗溶液：临用前以偶联缓冲液稀释至所需浓度。
（3）荧光微球-抗三聚氰胺抗体偶联物的悬液
通过EDC和NHS介导的与蛋白表面氨基的酰胺化反应完成荧光微球标记抗三聚氰胺单克隆抗体，制备方法如下：
荧光微球-抗三聚氰胺抗体偶联物的制备：取内部包埋荧光染料、表面修饰有羧基官能团的微球悬液100μL混悬于900μL活化缓冲液中，10000r/min于4℃离心10min弃上清，重悬微球于1mL活化缓冲液中，以此法洗涤微球2次，加入适量活化剂，混匀后室温振荡活化10min；混悬液于4℃10000r/min离心10min弃上清，重悬于偶联缓冲液中，以此法洗涤微球2次，加入15～30μL三聚氰胺单克隆抗体溶液（蛋白浓度1mg/mL），混匀后室温振荡偶联120min；混悬液于4℃10000r/min离心10min弃上清，重悬于封闭缓冲液中，以此法洗涤微球1次，混匀后室温振荡封闭30min；混悬液于4℃10000r/min离心10min弃上清，重悬于贮存缓冲液中，以此法洗涤微球1次，混匀后于4℃避光保存。
7.样品结合垫的制备
（1）将样品结合垫用含牛血清白蛋白（BSA在缓冲体系中的终浓度为0.5%体积百分含量）、pH7.2、0.1mol/L的磷酸盐缓冲液均匀浸泡2h，37℃下烘干2h。
（2）将贮存的荧光微球-抗三聚氰胺抗体偶联物以贮存缓冲液稀释后，将（1）处理过的样品结合垫浸泡于稀释缓冲液中，经真空冷冻干燥后备用。
8.层析膜的制备
包被过程：用0.05mol/L pH7.2的磷酸缓冲液将三聚氰胺半抗原-卵清蛋白偶联物稀释到100μg/mL，用Isoflow点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的测试线区域，包被量为1.0μL/cm；用0.01mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液将羊抗鼠抗抗体稀释到200μg/mL，用Isoflow点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的质控线区域，包被量为1.0μL/cm。将包被好的反应膜置于37℃条件下干燥16h，备用。
（二）各部件的组装
将所述样品结合垫、层析膜、吸水垫依次按顺序粘贴在所述粘性底衬上；样品结合垫的末端与层析膜的始端相连，层析膜的末端与吸水垫的始端相连，样品结合垫的始端与粘性底衬的始端对齐，吸水垫的末端与粘性底衬的末端对齐，层析膜上有测试线区域和质控线区域，测试线区域（T线）和质控线区域（C线）均为与所述试纸条的长相垂直的条状带；测试线位于近于样品结合垫的一侧；质控线位于远离样品结合垫的一侧；将试纸条用机器切成3.96mm宽的小条，装在特制的塑料制卡中，形成试纸卡。试纸卡在2～8℃阴凉避光干燥保存，有效期为12个月。
实施例3样品中三聚氰胺的检测
1、样品前处理
将待检牛奶样本置于60～70℃水浴5min，取出，待检。
2、操作步骤
吸取100μL待检样本溶液垂直滴加于试纸卡加样孔中，液体流动时开始计时，反应10min；将试纸卡插入KFT-100A型荧光检测仪的承载器中，通过触摸显示屏选择待检项目，按下“开始检测”按键，荧光检测仪将自动对试纸卡进行扫描测试；通过仪器的显示屏幕上读取或打印检测结果。
3、检测结果分析
测试完成后，仪器将根据检测得到的荧光信号的强弱，自动计算出牛奶样本中三聚氰胺的浓度值，并根据预设的阈值给出阴阳性判断。
阴性（-）：若荧光检测仪的显示屏幕上结果显示为阴性，表示牛奶样本不含有三聚氰胺或其浓度低于检测限。
阳性（+）：若荧光检测仪的显示屏幕上结果显示为阳性，表示牛奶样本三聚氰胺浓度等于或高于检测限。
无效：若质控线未检出荧光信号强度，表明不正确的操作过程或试纸条已失效。
实施例4试纸条技术参数的确定
1、检测限试验
向空白牛奶样品中分别添加三聚氰胺标准品至终浓度为0、5.0、10、20μg/L，用试纸条进行牛奶样品检测，结果为：当三聚氰胺标准品浓度为0、5.0μg/L时，荧光检测仪结果显示为阴性，当三聚氰胺标准品浓度为10、20μg/L时，荧光检测仪结果显示为阳性，表明本试纸条对牛奶样品中三聚氰胺的检测限为10μg/L。
2.假阳性率、假阴性率试验
取已知三聚氰胺含量大于10μg/L的牛奶阳性样品20份和三聚氰胺含量小于10μg/L的牛奶阴性样品20份，用3个批次生产的试纸条分别进行检测，结果见表1、表2。
表1检测阳性样品结果
结果表明：用3个批次生产的试纸条检测阳性牛奶样品时，荧光检测仪结果显示全为阳性，可知阳性样品符合率为100%，假阴性率为0；检测20份阴性牛奶样品时，荧光检测仪结果显示全为阴性，可知阴性样品符合率为100%，假阳性率为0。本发明的检测三聚氰胺试纸条可以对牛奶样品中三聚氰胺残留进行快速检测。
Claims (9)
1.一种三聚氰胺荧光微球免疫层析试纸条，由样品结合垫、层析膜、吸水垫、粘性底衬组成，粘性底衬上依次粘贴样品结合垫、层析膜和吸水垫，其特征在于，所述层析膜上依次包被有三聚氰胺半抗原-载体蛋白偶联物和羊抗鼠抗抗体，以三聚氰胺半抗原-载体蛋白偶联物所在区域为测试线，以羊抗鼠抗抗体所在区域为质控线；所述样品结合垫包埋有荧光微球标记的抗三聚氰胺单克隆抗体。
2.如权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述粘性底衬为PVC底板或其他硬质不吸水的材料；所述样品结合垫为玻璃纤维；所述层析膜为硝酸纤维素膜；所述吸水垫为吸水纸。
3.一种权利要求1或2所述的三聚氰胺荧光微球免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）制备三聚氰胺单克隆抗体；
2）制备荧光微球标记的抗三聚氰胺单克隆抗体，并将其包埋在样品结合垫上；
3）将样品结合垫、层析膜、吸水垫由一端依次粘贴在粘性底衬上，切割、组装试纸条，用于检测三聚氰胺。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述荧光微球标记的抗三聚氰胺单克隆抗体是通过EDC和NHS介导的与蛋白表面氨基的酰胺化反应完成。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述荧光微球标记的抗三聚氰胺单克隆抗体中的三聚氰胺单克隆抗体是以三聚氰胺半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述三聚氰胺半抗原-载体蛋白偶联物是由三聚氰胺半抗原与载体蛋白偶联得到。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述载体蛋白可为牛血清白蛋白、卵清蛋白、甲状腺蛋白、血蓝蛋白、人血清白蛋白。
8.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述三聚氰胺半抗原是由三聚氰酸二酰胺与邻苯二甲酸酐反应获得，包括如下步骤：
取三聚氰酸二酰胺127mg、邻苯二甲酸酐222mg、吡啶0.5mL混合溶解在20mL二甲基亚砜中，80℃下搅拌反应10h，蒸除溶剂，柱层析纯化得到邻苯二甲酸单三聚氰酸二酰胺酯，即为三聚氰胺半抗原。
9.一种权利要求1-2所述的三聚氰胺荧光微球免疫层析试纸条在检测三聚氰胺残留中的应用，包括如下步骤：
1）待测样品处理；
2）用三聚氰胺荧光微球免疫层析试纸条进行检测；
3）用荧光检测仪分析检测结果。
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