CN102297964A - 一种三聚氰胺免疫层析检测试纸条 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种三聚氰胺免疫层析检测试纸条，所述试纸条由样品垫、玻璃纤维膜标记垫、硝酸纤维素包被膜、吸水纸顺次搭接粘贴在底板上构成，所述玻璃纤维膜标记垫上涂覆有彩色胶乳颗粒标记的三聚氰胺抗体，硝酸纤维素包被膜包括检测区和控制区，所述检测区包被偶联有载体蛋白的三聚氰胺全抗原，所述控制区包被抗鼠抗体IgG。采用本发明的试纸条进行定性检测不需要任何辅助仪器，操作简便，一步完成，可以检测动物饲料、肌肉组织等处理检材，检测灵敏度达到100～500ng/mL，准确率大于97％。

Description

一种三聚氰胺免疫层析检测试纸条

技术领域

本发明属于医学检验领域，具体地说，本发明涉及一种三聚氰胺免疫层析检测试纸条。

背景技术

三聚氰胺(英文名Melamine)，简称三胺，又叫2，4，6-三氨基-1，3，5-三嗪、1，3，5-三嗪-2，4，6-三胺、2，4，6-三氨基脲、蜜胺、三聚氰酰胺、氰脲三酰胺，是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，是重要的氮杂环有机化工原料。在食品工业中，需要测定食品的蛋白质含量，而直接测量蛋白质技术上比较复杂，所以通常采用凯氏定氮法测定蛋白质含量，即通过测定食品中氮的含量来间接推算蛋白质的含量。由于三聚氰胺与蛋白质相比含有更多的氮原子，所以添加在食品中的三聚氰胺可以造成食品蛋白质含量较高的假象，因而被不法商贩所利用。三聚氰胺被摄入人体后，通过小肠吸收进入血液循环并最终进入肾脏，形成肾结石，尤其对于哺乳期的婴儿，更容易造成结石。

三聚氰胺的检测目前主要采用仪器检测的方法。主要方法有：GC-MS法、Spectra-Quad在线检测、超高效液相色谱-电喷雾串联质谱法、反相高效液相色谱法、高效液相色谱-二极管阵列法、高效液相色谱法(HPLC)、高效液相色谱-四极杆质谱联用、固相萃取与高效液相色谱联用、液相色谱串联质谱法(LC-MSMS)等。这些仪器方法价格昂贵，且方法操作复杂，需受过专门训练的人员才能操作，而且存在着适用范围窄、设备昂贵、成本高等问题。20世纪80年代兴起的胶体金免疫层析检测技术，基于免疫层析原理，操作简便快捷，结果清晰，无需复杂的实验技能和设备，特别适用于现场检测。但是胶体金技术只能实现定性检测，且胶体金的制备成本较高。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术的缺陷，提供一种成本低廉、操作简便、灵敏性高的三聚氰胺免疫层析检测试纸条。

为实现上述目的，本发明采取了以下技术方案：

一种三聚氰胺免疫层析检测试纸条，所述试纸条由样品垫、玻璃纤维膜标记垫、硝酸纤维素包被膜、吸水纸顺次搭接粘贴在底板上构成，所述玻璃纤维膜标记垫上涂覆有彩色胶乳颗粒标记的三聚氰胺抗体，硝酸纤维素包被膜包括检测区和控制区，所述检测区包被偶联有载体蛋白的三聚氰胺全抗原，所述控制区包被抗鼠抗体IgG。

所述彩色乳胶颗粒为粒径100～500nm的聚苯乙烯颗粒，所述聚苯乙烯颗粒的表面修饰有-COOH、-NH₂或-SH基团。

所述三聚氰胺抗体为三聚氰胺单克隆抗体或三聚氰胺多克隆抗体。

所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵血清白蛋白或人血清白蛋白。优选地，所述载体蛋白为卵清蛋白OVA。

优选地，所述三聚氰胺抗体与彩色胶乳颗粒的比例为75～150μg/100μg，所述彩色胶乳颗粒标记的三聚氰胺多克隆抗体涂敷在玻璃纤维膜上的稀释参数为25cm²/ml～35cm²/ml。

优选地，所述偶联有载体蛋白的三聚氰胺全抗原的浓度为5～20mg/ml，在所述检测区的用量为15-20μl/35cm；所述抗鼠抗体IgG的浓度为18～30μg/ml，在所述控制区的用量为25μl/35cm。

三聚氰胺为小分子化合物，抗原性弱，不能够刺激机体产生免疫应答，必须把其连接到大分子物质(如载体蛋白质)上，才能形成较为理想的免疫原。常用的蛋白质偶联方法主要有碳二亚胺(EDC)法、混合酸酐法(MA)、戊二醛法、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)法、琥珀酸酐法和重氮法等。本发明的三聚氰胺免疫层析检测试剂条是建立在免疫层析的竞争抑制性原理上，利用化学合成的方法将三聚氰胺连接到大分子载体蛋白上合成三聚氰胺人工全抗原；采用载体蛋白偶联的三聚氰胺全抗原制备高灵敏度的三聚氰胺抗体；利用彩色胶乳标记技术标记三聚氰胺抗体，载体蛋白偶联的三聚氰胺人工全抗原组成层析装置，对样本中的三聚氰胺小分子进行定性检测。

当试纸条以样品垫末端浸入样本后，样品溶液沿着试纸条通过毛细作用从下向上流动，溶解标记垫上涂覆的彩色胶乳颗粒标记的三聚氰胺抗体。如果待测的样品中不含有三聚氰胺时，彩色胶乳颗粒标记的三聚氰胺抗体会和包被在硝酸纤维素包被膜的检测区T线处的偶联有载体蛋白的三聚氰胺全抗原发生反应，从而聚集彩色胶乳颗粒，在检测区T线处显色，未与三聚氰胺全抗原反应的彩色胶乳颗粒标记的三聚氰胺抗体继续向前，与控制区C线上的抗鼠抗体发生反应，在C线处显色，因此在硝酸纤维素包被膜上呈现两条色带，表示样品为三聚氰胺阴性；若待测样品中含有三聚氰胺，则彩色胶乳颗粒标记的三聚氰胺抗体首先与样品中的小分子发生反应，检测区T线处不显色，当反应后的彩色胶乳颗粒标记的抗体和抗原复合物流动到控制区C线处时，与C线处包被的抗鼠抗体反应，C线处显色，硝酸纤维素包被膜上只呈现一条色带，说明检测样品为阳性。由此可见，无论检测样品中是否含有三聚氰胺小分子，控制区C线处均显色，如果C线无色带产生，则说明试纸条失效或者操作有误。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明的检测试纸条是根据竞争抑制性固相免疫层析原理而制备的，即样品中的三聚氰胺小分子和固定在包被膜上的偶联有载体蛋白的三聚氰胺全抗原竞争结合彩色胶乳标记的三聚氰胺抗体，且优化了工艺流程和参数，提高了检测的灵敏度，使用更加便捷；采用本发明的试纸条进行定性检测不需要任何辅助仪器，操作简便，一步完成，检测时间为5～15min；可以检测动物饲料、肌肉组织等处理检材，检测灵敏度达到100～500ng/mL；准确率大于97％。

具体实施方式

以下结合具体实施例来详细说明本发明。

实施例1  三聚氰胺免疫层析检测试纸条

本发明的一种三聚氰胺免疫层析试纸条，是由样品垫、玻璃纤维膜标记垫、硝酸纤维素包被膜、吸水纸顺次搭接粘贴在底板上构成，所述玻璃纤维膜标记垫上涂覆有彩色胶乳颗粒标记的三聚氰胺抗体，硝酸纤维素包被膜包括检测区和控制区，所述检测区包被偶联有载体蛋白的三聚氰胺全抗原，所述控制区包被抗鼠抗体IgG；所述彩色乳胶颗粒为粒径为100-500nm的聚苯乙烯颗粒，所述聚苯乙烯颗粒表面修饰有-COOH、-NH₂或-SH基团。

三聚氰胺抗体为三聚氰胺单克隆抗体或三聚氰胺多克隆抗体。在该实施例中，使用的是三聚氰胺多克隆抗体。

在该实施例中，包被用三聚氰胺全抗原的载体蛋白为卵血清白蛋白OVA。偶联有载体蛋白的三聚氰胺全抗原的浓度为5mg/ml，在所述检测区的用量为15μl/35cm；所述抗鼠抗体IgG的浓度为18μg/ml，在所述控制区的用量为25μl/35cm。

在该实施例中，所述三聚氰胺多克隆抗体与彩色胶乳颗粒的比例为100μg/100μg，所述彩色胶乳颗粒标记的三聚氰胺多克隆抗体涂敷在玻璃纤维膜标记垫上的稀释参数为30cm²/ml。

该实施例的试纸条是由以下方法制备而得：

A.制备偶联有载体蛋白的三聚氰胺全抗原

采用戊二醛做交联剂，将三聚氰胺与载体蛋白(卵血清白蛋白OVA)进行偶联制备人工抗原。取2mgMEL(三聚氰胺)溶于1ml的PBS溶液中，加入30μL戊二醛，常温反应1h，加入含10mg OVA的PBS溶液，RT搅拌反应过夜。反应液用葡聚糖凝胶Sephadex G-25过柱纯化，制得三聚氰胺全抗原OVA-MEL，零下20摄氏度保存。

B.制备三聚氰胺单克隆抗体或多克隆抗体

制备三聚氰胺多抗：采用常规免疫程序免疫新西兰大白兔，制备多克隆抗体，免疫沉淀实验检测抗体效价，两个月后采用颈动脉取血法收集抗血清，硫酸铵法纯化抗体，0.01mol/L PBS(pH7.2)透析直至透析外液与氯化钡反应无沉淀为止，加入终浓度为0.01％的叠氮钠，分装后置-70℃低温保存。

用重氮法合成三聚氰胺-牛血清白蛋白(作为包被抗原)，用于间接酶联免疫吸附实验，测定三聚氰胺特异性抗体的效价。

C.筛选直径为100-500nm的、表面修饰有-COOH，-NH₂，-SH等基团的彩色乳胶颗粒，将彩色胶乳颗粒与步骤B制得的MEL多克隆抗体相偶联，并涂覆到玻璃纤维膜标记垫上。

D.将步骤A中偶联有载体蛋白的三聚氰胺全抗原喷膜于硝酸纤维素包被膜的检测区，将抗鼠抗体IgG包被于包被膜的控制区，并在35-40℃烘箱干燥15分钟。

E.将涂覆有彩色胶乳颗粒标记的MEL多克隆抗体的玻璃纤维素膜标记垫、包被有载体蛋白-MEL全抗原和抗鼠抗体的包被膜、吸水纸依次搭接在底板上，即得。

使用方法及结果判断：

加样后，反应5分钟内即可看到检测区(T线)和控制区(C线)相应的位置上呈色情况，如果C线和T线均出现颜色条带，结果为阴性，说明样品中不含有三聚氰胺；T线不出现颜色条带，C线出现颜色条带，结果为阳性，说明样品中含有三聚氰胺；C线不出现颜色条带，说明试纸条失效。

实施例2  三聚氰胺免疫层析检测试纸条

在该实施例中，载体蛋白为牛血清白蛋白BSA，三聚氰胺抗体为三聚氰胺单克隆抗体，偶联有载体蛋白的三聚氰胺抗原的浓度为18mg/ml，在所述检测区的用量为18μl/35cm；所述抗鼠抗体IgG的浓度为25μg/ml，在所述控制区的用量为25μl/35cm。所述三聚氰胺抗体与彩色胶乳颗粒的比例为75μg/100μg，所述彩色胶乳颗粒标记的三聚氰胺抗体涂敷在玻璃纤维膜标记垫上的稀释参数为25cm²/ml。该实施例中的试纸条结构均与实施例1相同。

除了步骤B中制备三聚氰胺单克隆抗体外，其他制备方法与实施例1相同。

步骤B为：

制备三聚氰胺单抗：以50μg-100μg/只的剂量，用三聚氰胺载体蛋白偶联物(步骤A中的BSA-MEL)免疫6-8周龄BALB小鼠3-4次，每次间隔时间3-5周，确定抗体效价符合要求之后强化免疫，之后3-4天，将免疫小鼠眶下窦采血，分离阳性血清，脱颈致死，用75％酒精浸泡小鼠5-10min消毒，无菌取脾脏，将脾脏剪碎并研磨，经过尼龙纱布过滤，1000rpm离心15min，收集脾细胞。将10⁸的脾细胞与NS0骨髓瘤细胞按10∶1比例混合，1000rpm离心10min弃上清，细胞沉淀物于37℃水浴中缓缓加入0.7-1.0ml的50％PEG4000作用1min，然后缓缓加入无血清1640培养基15ml，以终止PEG的作用，37℃水浴5-10min，1000rpm离心10min弃上清，将细胞沉淀物重悬与HAT选择培养基中，并加入96孔细胞培养孔(100μL-200μL/孔)，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养。培养10-14天，用间接ELISA法进行阳性孔筛选，选择强阳性、抑制率高、细胞生长旺盛的孔进行三次有限的稀释克隆化，而后扩大培养，建立杂交瘤细胞株。所制备的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体可特异性地与三聚氰胺反应。

该实施例中的试纸条的使用方法与实施例1相同。

实施例3

在该实施例中，载体蛋白为人血清白蛋白，偶联有载体蛋白的三聚氰胺抗原的浓度为8mg/ml，在所述检测区的用量为20μl/35cm；所述抗鼠抗体IgG的浓度为30μg/ml，在所述控制区的用量为25μl/35cm。在该实施例中，所述三聚氰胺抗体与彩色胶乳颗粒的比例为150μg/100μg，所述彩色胶乳颗粒标记的三聚氰胺抗体涂敷在玻璃纤维膜标记垫上的稀释参数为35cm²/ml。该实施例中的试纸条结构均与实施例1相同。制备和使用方法也与实施例1相同。

实施例1-3中的三聚氰胺免疫层析检测试纸条的检测限和灵敏度在250ng/ml左右。

Claims (7)

1.一种三聚氰胺免疫层析检测试纸条，其特征在于，所述试纸条由样品垫、玻璃纤维膜标记垫、硝酸纤维素包被膜、吸水纸顺次搭接粘贴在底板上构成，所述玻璃纤维膜标记垫上涂覆有彩色胶乳颗粒标记的三聚氰胺抗体，硝酸纤维素包被膜包括检测区和控制区，所述检测区包被偶联有载体蛋白的三聚氰胺全抗原，所述控制区包被抗鼠抗体IgG。

2.根据权利要求1所述的三聚氰胺免疫层析检测试纸条，其特征在于，所述彩色乳胶颗粒为粒径100～500nm的聚苯乙烯颗粒，所述聚苯乙烯颗粒的表面修饰有-COOH、-NH₂或-SH基团。

3.根据权利要求1所述的三聚氰胺免疫层析检测试纸条，其特征在于，所述三聚氰胺抗体为三聚氰胺单克隆抗体或三聚氰胺多克隆抗体。

4.根据权利要求1所述的三聚氰胺免疫层析检测试纸条，其特征在于，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵血清白蛋白或人血清白蛋白。

5.根据权利要求4所述的三聚氰胺免疫层析检测试纸条，其特征在于，所述载体蛋白为卵血清白蛋白。

6.根据权利要求1-5任一项所述的三聚氰胺免疫层析检测试纸条，其特征在于，所述三聚氰胺抗体与彩色胶乳颗粒的比例为75～150μg/100μg，所述彩色胶乳颗粒标记的三聚氰胺抗体涂敷在玻璃纤维膜标记垫上的稀释参数为25～35cm²/ml。

7.根据权利要求1-5任一项所述的三聚氰胺免疫层析检测试纸条，其特征在于，所述偶联有载体蛋白的三聚氰胺全抗原的浓度为5～20mg/ml，在所述检测区的用量为15～20μl/35cm；所述抗鼠抗体IgG的浓度为18～30μg/ml，在所述控制区的用量为25μl/35cm。