CN201429617Y - 一种检测三聚氰胺的检测卡 - Google Patents

Abstract

本实用新型公开了一种检测三聚氰胺的检测卡。本实用新型包括底板、滤膜、反应膜、样品垫、结合物释放垫和吸水垫；底板(1)分为加样区、反应膜设置区和吸水垫设置区；反应膜(2)设于反应膜设置区上；加样区上，靠近反应膜设置区处设有结合物释放垫(5)，远离反应膜设置区处设有滤膜I(3)；滤膜I上设有样品垫(4)；样品垫上设有滤膜II(7)；滤膜II上设有滤膜III(8)；吸水垫设置区上设有吸水垫(6)；反应区上设有T线(9)和C线(10)，T线包被三聚氰胺特异性抗体，C线包被载体蛋白抗体；结合物释放垫上包被胶体金标记的三聚氰胺－载体蛋白偶联物。本实用新型具有以下的特点：5分钟内显示结果；能同时检测大批样品；结果判定简单；制备工艺简单，成本低。本实用新型具有较高的应用价值和经济社会效益。

Description

一种检测三聚氰胺的检测卡

技术领域

本实用新型涉及一种检测三聚氰胺的检测卡。

背景技术

三聚氰胺(英文名Melamine)，分子式C₃N₆H₆，简称三胺，是一种三嗪类含氮杂环有机化合物。三聚氰胺呈弱碱性，与盐酸、硫酸、硝酸、乙酸、草酸等都能形成三聚氰胺盐。三聚氰胺是重要的氮杂环有机化工原料，在中性或微碱性情况下，与甲醛缩合而成各种羟甲基三聚氰胺，但在微酸性中(pH5.5～6.5)与羟甲基的衍生物进行缩聚反应而生成树脂产物。三聚氰胺的是一种用途广泛的基本有机化工中间产品，最主要的用途是作为生产三聚氰胺甲醛树脂的原料。该树脂硬度比脲醛树脂高、不易燃、耐水、耐热、耐老化、耐电弧、耐化学腐蚀，有良好的绝缘性能、光泽度和机械强度，广泛运用于木材、塑料、涂料、造纸、纺织、皮革、电气、医药等行业。三聚氰胺还可以作阻燃剂、减水剂、甲醛清洁剂等。

三聚氰胺目前被认为毒性轻微，大鼠口服的半数致死量大于3g/kg体重。动物长期摄入三聚氰胺会造成生殖、泌尿系统的损害，膀胱、肾部结石，并可进一步诱发膀胱癌。

蛋白质主要由氨基酸组成，其含氮量一般不超过30％，而三聚氰胺分子中含氮量为66％左右。三聚氰胺作为一种白色结晶粉末，没有什么气味和味道，加之食品和饲料工业蛋白质含量测试方法的缺陷，奶粉中掺杂了三聚氰胺后也不易被发现，为此三聚氰胺也常被不法商人用作食品添加剂，以提升食品检测中的蛋白质含量指标，因此三聚氰胺也被人们称为“蛋白精”。

目前检测三聚氰胺的方法主要有气相色谱-质谱法、高效液相色谱法、液相色谱-质谱联用法、液相色谱-串联质谱法以及超高效液相色谱-串联质谱法等。应该说色谱技术对三聚氰胺检测是非常有效、准确、敏感的。但待检测样品需要经过一系列的处理，繁琐费时，从样品前处理到得出检测结果需要较长的时间；同时色谱法需要价格昂贵的仪器设备，且需专业人员操作，严重阻碍了这种检测方法的普及推广，更无法实现现场检测。

实用新型内容

本实用新型的目的是提供一种检测三聚氰胺的检测卡。

为实现上述目的，本实用新型的技术方案如下：本实用新型提供的检测三聚氰胺的检测卡，其特征在于：它包括底板、滤膜、反应膜、样品垫、结合物释放垫和吸水垫。

沿样品液流动方向底板1分为三个区域：加样区、反应膜设置区和吸水垫设置区；反应膜2设于所述反应膜设置区上；所述加样区上，靠近所述反应膜设置区处设有结合物释放垫5；所述结合物释放垫上包被有胶体金标记的三聚氰胺-载体蛋白偶联物；所述加样区上，远离所述反应膜设置区处设有滤膜I(3)；所述滤膜I上设有样品垫4；所述样品垫上，远离所述结合物释放垫处设有滤膜II(7)；滤膜II上设有滤膜III(8)；所述吸水垫设置区上设有吸水垫6；所述反应区上设有T线9和C线10，T线包被有三聚氰胺特异性抗体，C线包被有载体蛋白抗体。

所述T线和所述C线可互相平行且与样品液流动方向垂直。

所述T线可靠近所述结合物释放垫，所述C线可靠近所述吸水垫。

所述检测卡还可包括固定膜11。所述滤膜III和所述结合物释放垫上可覆盖有所述固定膜，固定膜上与所述滤膜III对应的区域设有样品孔12。所述吸水垫上可覆盖有所述固定膜。所述固定膜为防水材质的，用于固定检测卡的各个组件，避免样品或试剂与外界环境中的物质发生反应，影响检测卡的检测效果。

为了保证样品液流动的连续性，所述样品垫和所述结合物释放垫可设有2mm的重叠区，所述结合物释放垫和所述反应膜可设有2mm的重叠区，所述吸水垫和所述反应膜可设有5mm的重叠区。

沿样品液流动方向，所述滤膜III的长度可为15mm，所述滤膜I与所述滤膜II的长度均可为12mm，所述样品垫的长度可为22mm，所述结合物释放垫的长度可为6mm，所述反应膜的长度可为20mm，所述吸水垫的长度可为20mm。

所述T线距离所述结合物释放垫的垂直距离可为6mm；所述C线距离所述吸水垫的垂直距离可为6mm；所述T线和所述C线的垂直距离可为5mm。

所述反应膜、所述滤膜I、所述结合物释放垫、所述吸水垫可通过双面胶固定在所述底板上，它们与底板之间可设有高分子材料制成的背衬膜(隔离膜)，用以阻止粘合剂中的有机溶剂对包被蛋白和包被抗体的破坏。

所述检测卡具体可为长80mm，宽5mm的条状。

使用检测卡时，将样品液滴加在样品孔中，样品液先经过滤膜III过滤除去一些杂质，再通过滤膜II二次过滤，到达样品垫，达到样品垫的样品流速会很快，滤膜I能够平衡速度，实现样品匀速流动。

所述载体蛋白可为牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、卵清蛋白(OVA)、血兰蛋白(KLH)等。

所述三聚氰胺特异性抗体可为三聚氰胺单克隆抗体或三聚氰胺多克隆抗体。所述载体蛋白抗体为牛血清白蛋白多克隆抗体。

对于一个检测卡来说，具体可用15-20nm的胶体金标记三聚氰胺-载体蛋白偶联物。

所述底板可由不吸水的韧性材料制成，如硬质塑料、不吸水硬纸，具体可为PVC板材。所述样品吸收垫可由玻璃纤维棉或玻璃棉制成。所述结合物释放垫可由玻璃纤维或玻璃棉制成。所述吸水垫可为厚滤纸、无纺布或其他吸水性材料。所述反应膜可为硝酸纤维素膜(NC膜)。所述保护膜可为PE材质的保护膜。

本实用新型的检测原理：当样品溶液中含有三聚氰胺时，在扩散过程中，样品中的三聚氰胺通过竞争结合抑制了胶体金-三聚氰胺-载体蛋白偶联物同T线上的三聚氰胺特异性抗体结合，T线无法显色，而C线的载体蛋白抗体可与胶体金-三聚氰胺-载体蛋白偶联物中的载体蛋白特异结合，C线即显示红棕色(紫红色)印迹。当样品中不含三聚氰胺或其含量低于检测卡检测限时，胶体金-三聚氰胺-载体蛋白偶联物可与T线上的三聚氰胺特异性抗体结合，T线显示红棕色(紫红色)印迹，液体渗透到C线时，C线上的抗载体蛋白抗体可与胶体金-三聚氰胺-载体蛋白偶联物特异结合，C线显示红棕色(紫红色)印迹。

本实用新型的检测三聚氰胺的检测卡具有以下的特点：

(1)特异性强，敏感性高。检测卡上的胶体金-三聚氰胺-载体蛋白偶联物和三聚氰胺特异性抗体结合时具有很高的特异性，在实际检测中和其他添加剂，比如抗生素类药物没有交叉反应。本检测卡的检测限为200μg/L(kg)。

(2)操作简便，结果显示快速。检测过程中无需其他试剂，将检测卡插入待检样品中10秒左右或将样品滴加到检测卡上，在5分钟左右即有结果显示。

(3)对样品的前处理要求低，样品前处理过程简单，能同时快速检测大批样品。

(4)结果判定简单明了。三聚氰胺检测检测卡以肉眼可见的红棕色检测印迹作为判定标准。一条印迹表示被检样品中含有三聚氰胺，两条印迹表示被检样品中不含三聚氰胺。

(5)制备工艺简单，成本低。

(6)应用价值高。检测卡操作简单，人人可以操作，可以判定结果阴阳性。

本实用新型可具有较高的应用价值和较大的经济社会效益，将在食品和饲料三聚氰胺的检测中发挥重要作用。

附图说明

图1为本实用新型的结构示意图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本实用新型，但并不限定本实用新型。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

如图1所示，本实用新型的检测三聚氰胺的检测卡，包括底板1、滤膜、反应膜2、样品垫4、结合物释放垫5和吸水垫6。沿样品液流动方向，底板分为加样区、反应膜设置区和吸水垫设置区。反应膜2设于反应膜设置区上。所述加样区上，靠近所述反应膜设置区处设有结合物释放垫5；所述结合物释放垫上包被有胶体金标记的三聚氰胺-载体蛋白偶联物。所述加样区上，远离所述反应膜设置区处设有滤膜I(3)。所述滤膜I上设有样品垫4。所述样品垫4上，远离所述结合物释放垫处设有滤膜II(7)。滤膜II(7)上设有滤膜III(8)。吸水垫设置区上设有吸水垫6。所述反应区上设有T线9和C线10，T线9包被有三聚氰胺特异性抗体，C线10包被有载体蛋白抗体，T线9和C线10互相平行且与样品液流动方向垂直，T线9靠近所结合物释放垫5，C线10靠近吸水垫6。滤膜III(8)和结合物释放垫5上覆盖有固定膜11，固定膜11上与滤膜III(8)对应的区域设有样品孔12。吸水垫6上覆盖有固定膜11。所述固定膜为防水材质的，用于固定试剂盒的各个组件，避免样品或试剂与外界环境中的物质发生反应，影响检测卡的检测效果。反应膜2、滤膜I(3)、结合物释放垫4和吸水垫5通过双面胶固定在底板1上，它们与底板1之间设有高分子材料制成的背衬膜(隔离膜)，用以阻止粘合剂中的有机溶剂对包被蛋白和包被抗体的破坏。为了保证样品液流动的连续性，样品垫4和结合物释放垫5设有2mm的重叠区，结合物释放垫和反应膜设有2mm的重叠区，吸水垫和反应膜设有5mm的重叠区。沿样品液流动方向，所述滤膜III的长度为15mm，所述滤膜I与所述滤膜II的长度均为12mm，所述样品垫的长度为22mm，所述结合物释放垫的长度为6mm，所述反应膜的长度为20mm，所述吸水垫的长度为20mm。所述T线距离所述结合物释放垫的垂直距离为6mm；所述C线距离所述吸水垫的垂直距离为6mm；所述T线和所述C线的垂直距离为5mm。

如果待测样品为奶制品粉末，可以将样品研磨，用生理盐水制成1∶(5-10)的待检样品溶液。如果待测样品是液体奶或蛋，可以直接用生理盐水制成1∶(5-10)的待测样品溶液。

使用时，将三聚氰胺快速检测检测卡平放水平位置，将待测样品溶液中按照检测步骤准备好，用滴管滴加3-5滴待测溶液到检测卡样品端，水平放置约5分钟，观察判定结果(判定标准：阳性样品，卡中C线位置显示一条紫红色印迹；阴性样品，卡中T/C线显示两条紫红色印迹，没有紫红色印迹显示表明检测卡已经失效)。

检测卡中用到的材料均可采用常规方法制备，举例如下：

一、三聚氰胺-载体蛋白偶联物

可通过戊二醛法或重氮化法将三聚氰胺和载体蛋白偶联，得到三聚氰胺-载体蛋白偶联物。

二、三聚氰胺特异性抗体

三聚氰胺特异性抗体可为三聚氰胺单克隆抗体或三聚氰胺多克隆抗体。

1、可采用如下方法制备三聚氰胺鼠单克隆抗体

(1)动物免疫程序

采用BALB/c小鼠作为免疫动物，以三聚氰胺-载体蛋白为免疫原，免疫剂量为50-100μg/只。首次免疫时将免疫原与等量的弗氏完全佐剂混合制成乳化剂，颈背部皮下多点注射；间隔2周取相同剂量免疫原加等量弗氏不完全佐剂混合乳化，加强免疫一次；第四次免疫后腹腔加强免疫一次，腹腔加强免疫3天后取脾细胞。

(2)细胞融合与克隆化

步骤(1)得到的小鼠脾细胞，按(4-8)∶1比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

(3)细胞冻存和复苏

取处于对数生长期的杂交瘤细胞，用冻存液制成1×10⁶-5×10⁶个/mL的细胞悬液，分装于冻存管，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。

(4)单克隆抗体的制备与纯化

采用体内诱生法，将BALB/c小鼠(8周龄)腹腔注入灭菌石蜡油0.5ml/只，7-14天后腹腔注射步骤(3)的杂交瘤细胞5×10⁵-10⁶个/只，7-10天后采集腹水。经辛酸-饱和硫酸铵法进行腹水纯化，得到三聚氰胺-HAS的单克隆抗体。小瓶分装，-20℃保存。

2、可采用如下方法制备三聚氰胺兔多克隆抗体

采用新西兰大白兔作为免疫动物，以三聚氰胺-载体蛋白为免疫原，免疫剂量为1mg/kg·b.w.。首次免疫时将免疫原与等量的弗氏完全佐剂混合制成乳化剂，颈背部皮下多点注射；间隔3-4周取相同剂量免疫原加等量弗氏不完全佐剂混合乳化，加强免疫一次，共免疫5次，最后一次不加佐剂。最后一次免疫7-10d后采血，测定血清抗体效价，颈动脉放血，经硫酸铵分级沉淀得到纯化的多克隆抗体。

三、载体蛋白抗体

载体蛋白抗体可为载体蛋白单克隆抗体或载体蛋白多克隆抗体。如可以BSA作为免疫抗原免疫动物，得到BSA的多克隆抗体。

四、金标蛋白

(1)用柠檬酸三钠法制备胶体金

在沸腾的100ml的1％氯金酸水溶液中加入2-4ml的0.5-5％柠檬酸三钠溶液，获得直径15-20nm的胶体金。

(2)金标蛋白的制备

用0.1mol/L的K₂CO₃调胶体金pH至8.5，测得最佳蛋白标记浓度后，将待标记的三聚氰胺-载体蛋白加入胶体金溶液中，搅拌30分钟，加入1％BSA，继续搅拌15分钟，加入0.5％PEG8000，接着搅拌15分钟。4℃4000g离心15min，除去未结合的金颗粒。然后4℃12000g离心20分钟，去上清，沉淀用PBS溶解，再次离心20分钟，获得纯化的金标蛋白。

Claims (8)

1、一种检测三聚氰胺的检测卡，其特征在于：它包括底板、滤膜、反应膜、样品垫、结合物释放垫和吸水垫；

沿样品液流动方向底板(1)分为三个区域：加样区、反应膜设置区和吸水垫设置区；反应膜(2)设于所述反应膜设置区上；所述加样区上，靠近所述反应膜设置区处设有结合物释放垫(5)；所述结合物释放垫上包被有胶体金标记的三聚氰胺-载体蛋白偶联物；所述加样区上，远离所述反应膜设置区处设有滤膜I(3)；所述滤膜I上设有样品垫(4)；所述样品垫上，远离所述结合物释放垫处设有滤膜II(7)；所述滤膜II上设有滤膜III(8)；所述吸水垫设置区上设有吸水垫(6)；所述反应区上设有T线(9)和C线(10)，T线包被有三聚氰胺特异性抗体，C线包被有载体蛋白抗体。

2、如权利要求1所述的检测卡，其特征在于：所述T线和所述C线互相平行且与样品液流动方向垂直；所述T线靠近所述结合物释放垫，所述C线靠近所述吸水垫。

3、如权利要求2所述的检测卡，其特征在于：所述检测卡还包括固定膜(11)；所述滤膜III和所述结合物释放垫上覆盖有所述固定膜，固定膜上与所述滤膜III对应的区域设有样品孔(12)；所述吸水垫上覆盖有所述固定膜。

4、如权利要求3所述的检测卡，其特征在于：所述样品垫和所述结合物释放垫有2mm的重叠区，所述结合物释放垫和所述反应膜有2mm的重叠区，所述吸水垫和所述反应膜有5mm的重叠区。

5、如权利要求4所述的检测卡，其特征在于：沿样品液流动方向，所述滤膜III的长度为15mm，所述样品垫的长度为22mm，所述结合物释放垫的长度为6mm，所述滤膜I与所述滤膜II的长度均为12mm，所述反应膜的长度为20mm，所述吸水垫的长度为20mm。

6、如权利要求5所述的检测卡，其特征在于：所述T线距离所述结合物释放垫的垂直距离为6mm；所述C线距离所述吸水垫的垂直距离为6mm；所述T线和所述C线的垂直距离为5mm。

7、如权利要求6所述的检测卡，其特征在于：所述反应膜、所述滤膜I、所述结合物释放垫、所述吸水垫和所述底板之间设有隔离膜。

8、根据权利要求1至7中任一所述的检测卡，其特征在于：所述载体蛋白为牛血清白蛋白、人血清白蛋白、卵清蛋白或血兰蛋白。

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