CN104569408A - 一种非诺特罗的胶体金检测卡及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种非诺特罗的胶体金检测卡及其制备方法，包括卡壳及设置于卡壳内的试纸条，试纸条上沿液体流动方向依次设置有样本垫、金标结合物垫、硝酸纤维素膜、吸水垫，金标结合物垫上包被有抗非诺特罗单克隆抗体-胶体金结合物，抗非诺特罗单克隆抗体-胶体金结合物中的抗非诺特罗单克隆抗体是以非诺特罗偶联抗原Ⅰ为免疫抗原制备的，硝酸纤维素膜上邻近金标结合物垫的一端设置有检测线，且硝酸纤维素膜上邻近吸水垫的一端设置有质控线，检测线上包被有非诺特罗偶联抗原Ⅱ，质控线上包被有抗鼠二抗。本发明制备的非诺特罗的胶体金检测卡具有成本低、灵敏度高、操作简便、无需仪器、特异性强、稳定性好、结果准确、易于判读、可现场检测等优点。
Description
技术领域
本发明涉及食品安全检测领域，尤其涉及一种非诺特罗的胶体金检测卡及其制备方法。
背景技术
非诺特罗，属于选择性β2型受体激动剂，它可用于治疗支气管哮喘，尤其对儿童支气管哮喘有较好的疗效。β2型受体激动剂种类较多，其它有盐酸克仑特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、西布特罗、马布特罗、溴布特罗、妥布特罗、氯丙那林、班布特罗等。在畜牧养殖中，有少部分人将盐酸克仑特罗等β2型受体激动剂作为一种生长促进剂非法添加到饲料中，用以改善胴体的品质，但同时也造成食品中β2型受体激动剂的残留。当人们食用残留量大的食品后可能会出现一系列的中毒症状。我国已明令禁止在畜牧业中使用盐酸克仑特罗，沙丁胺醇等β2型受体激动剂。
免疫层析技术是出现于80年代初期，通常以条状纤维层析材料为固相，通过毛细作用使样品在层析条上爬动，层析材料上的受体(如抗体或抗原)与样品中的待测物发生特异性免疫反应而显色。免疫层析技术常见的示踪粒子有胶体金、乳胶、胶体硒、明胶等，其中运用最成功的标记物为胶体金。用胶体金作为特殊标记物的研究始于60年代初，1962年Feldberr等报道了用胶体金标记细胞进行电子显微镜的研究。1971年，Taylor等将胶体金引入电镜免疫标记技术中。90年代以来，由于早孕试纸条的快速推广和使用，使得胶体金检测卡成为开发最多，使用最广，最为成熟的体外诊断试剂。
目前，用于检测非诺特罗公开报道的方法和标准较多：如农业部标准《动物源性食品中β-受体激动剂残留检测液相色谱－串联质谱法》(1025号公告-18-2008)，非诺特罗检测限可达0.25μg/kg；辽宁省地方标准《牛羊组织中β-受体激动剂残留检测超高效液相色谱-串联质谱法》(DB 21/3004—2013)，非诺特罗检测限可达0.25μg/kg；吉林省地方标准《动物源性食品中24种受体激动剂残留量的测定液相色谱-串联质谱法》(DBS22 012-2013)，非诺特罗检测限可达0.1μg/kg；然而用于检测非诺特罗的产品鲜有报道，中国专利文献公开号CN102359961A的专利，公开了一种用于β-肾上腺素受体激动剂类化合物检测的试剂盒，该方法是通过比较样品溶液与空白溶液的变色时间来定性检测非诺特罗，其存在灵敏度低，准确性差，不能定性检测非诺特罗等问题。
发明内容
本发明的目的在于针对上述问题，提供一种非诺特罗的胶体金检测卡及其制备方法，其具有成本低、灵敏度高、检测方便、快捷的特点。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现：
一种非诺特罗的胶体金检测卡，包括卡壳及设置于卡壳内的试纸条，所述试纸条上沿液体流动方向依次设置有样本垫、金标结合物垫、硝酸纤维素膜、吸水垫，所述金标结合物垫上包被有抗非诺特罗单克隆抗体-胶体金结合物，所述抗非诺特罗单克隆抗体-胶体金结合物中的抗非诺特罗单克隆抗体是以非诺特罗偶联抗原Ⅰ为免疫抗原制备的，所述硝酸纤维素膜上邻近金标结合物垫的一端设置有检测线，且硝酸纤维素膜上邻近吸水垫的一端设置有质控线，所述检测线上包被有非诺特罗偶联抗原Ⅱ，所述质控线上包被有抗鼠二抗。
作为本发明的优选方案，所述卡壳由底卡及面卡构成，且卡壳由塑料材料制成。
作为本发明的优选方案，所述面卡上开有加样孔，所述加样孔位于样本垫的上方。
作为本发明的优选方案，所述面卡上开有观察窗，所述观察窗位于硝酸纤维素膜的上方。
一种非诺特罗的胶体金检测卡制备方法，包括以下步骤：
一、金标结合物垫的制备：
a、合成非诺特罗偶联抗原Ⅰ：取载体蛋白，用双蒸水溶解后，再用NaOH调pH至10，加入1,4-丁二醇二缩水甘油醚，在氮气保护下，避光搅拌24小时，通过柱层析纯化制得接臂载体蛋白，所述1,4-丁二醇二缩水甘油醚与蛋白载体的摩尔比为100：1，将非诺特罗调成碱性后，在搅拌条件下缓慢加入到接臂载体蛋白中，氮气保护下室温避光搅拌24小时，反应产物在4℃用0.01mol/L的磷酸盐缓冲液透析3天，透析后得到非诺特罗偶联抗原Ⅰ；
b、免疫动物：将上述步骤a中制成的非诺特罗偶联抗原Ⅰ与等量弗氏完全佐剂乳化完全后，免疫小鼠；
c、细胞融合和杂交瘤细胞筛选：取经非诺特罗偶联抗原Ⅰ免疫的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合，并采用HAT培养基进行培养，对培养上清进行检测，筛选获得稳定分泌抗非诺特罗单克隆抗体的细胞株14F8-B3-C9；
d、制备腹水：将分泌抗非诺特罗单克隆抗体的细胞株14F8-B3-C9培养后，注射入BALB/C小鼠腹腔，收集其腹水；
e、抗非诺特罗单克隆抗体的纯化制备：采用硫酸铵沉淀法对腹水进行透析、过滤处理，采用非诺特罗亲和层析柱对经透析、过滤处理的上清进行纯化，提纯制备出抗非诺特罗单克隆抗体；
f、胶体金溶液制备：在超纯水中加入1％氯金酸，加热煮沸，迅速加入1％柠檬酸三钠，继续煮沸15分钟，所述超纯水、氯金酸、柠檬酸三钠的体积比为99：1：1，冷却后用超纯水恢复至原来的体积，4℃保存备用；
g、抗非诺特罗单克隆抗体-胶体金结合物溶液的制备：将胶体金溶液调pH至6.0，用20μg/mL浓度的抗非诺特罗单克隆抗体反应1小时，然后用10％牛血清白蛋白进行封闭，4℃7500g离心30分钟，去上清，胶体金沉淀用1/10胶体金体积的金标复溶液进行溶解，制成抗非诺特罗单克隆抗体-胶体金结合物溶液，所述胶体金溶液、抗非诺特罗单克隆抗体、牛血清白蛋白的体积比为100：10：5；
h、制备金标结合物垫：将上述制备的抗非诺特罗单克隆抗体-胶体金结合物溶液以4μL/cm喷量喷涂于结合物垫上，37度干燥3小时后，放于湿度低于20％的干燥柜保存备用；
二、硝酸纤维素膜的制备：
a、合成非诺特罗偶联抗原Ⅱ：将对氨基苯甲酸、亚硝酸钠溶于pH2.0的溶液中，在冰浴和避光条件下振荡反应4小时，制得重氮盐，所述对氨基苯甲酸、亚硝酸钠的质量比为1：2，将该重氮盐与非诺特罗反应，生成非诺特罗衍生物，产物经柱层析纯化，将纯化后的非诺特罗衍生物与载体蛋白按摩尔比50:1，采用EDC/NHS法合成非诺特罗偶联抗原Ⅱ，然后在4℃用0.01mol/L磷酸盐缓冲液透析3天，得到纯化的非诺特罗偶联抗原Ⅱ；
b、制备硝酸纤维素膜：以0.01mol/L，pH7.4的磷酸盐缓冲液为稀释液，将非诺特罗偶联抗原Ⅱ稀释至0.5mg/mL，并以1μL/cm喷量喷涂于硝酸纤维素膜的一端作为检测线，将抗鼠二抗稀释至1.0mg/mL，并以1μL/cm喷量喷涂于硝酸纤维素膜的另一端作为质控线，37℃干燥2小时后，密封，室温保存备用；
三、非诺特罗的胶体金检测卡的组装：
在底板上依次粘贴样本垫、金标结合物垫、硝酸纤维素膜、吸水垫从而组装成试纸条，所述硝酸纤维素膜包被非诺特罗偶联抗原Ⅱ的一端搭接金标结合物垫，且硝酸纤维素膜包被抗鼠二抗的一端搭接吸水垫，将试纸条剪切成一定宽度后装于卡壳中。
作为本发明的优选方案，所述载体蛋白为牛血清白蛋白或阳离子化牛血清白蛋白或卵清蛋白或钥孔血蓝蛋白。
作为本发明的优选方案，所述抗鼠二抗为羊抗鼠IgG抗体或兔抗鼠IgG抗体或驴抗鼠IgG抗体。
作为本发明的优选方案，所述金标复溶液的质量体积百分比组成为：0.29％十二水合磷酸氢二钠，0.02％磷酸二氢钾，0.02％二水合磷酸二氢钠，0.8％氯化钠，5％-20％蔗糖，0.5％-5％牛血清白蛋白，0.1％叠氮钠。
本发明中，采用非诺特罗偶联抗原Ⅰ进行免疫制备的抗非诺特罗单克隆抗体对于非诺特罗的特异性要好于采用非诺特罗偶联抗原Ⅱ进行免疫制备的抗非诺特罗单克隆抗体，其是通过以下对比实验得出的。
以载体蛋白选用牛血清白蛋白为例，选用6周龄BALB/C雌性小鼠作为免疫动物，将非诺特罗偶联抗原Ⅰ-牛血清白蛋白，非诺特罗偶联抗原Ⅱ-牛血清白蛋白分别按照相应的免疫剂量，即100μg/只/次与等量弗氏完全佐剂乳化完全后采用皮下分点注射；每间隔3周进行一次加强免疫，共进行4次免疫；加强免疫是将非诺特罗偶联抗原Ⅰ-牛血清白蛋白，非诺特罗偶联抗原Ⅱ-牛血清白蛋白分别与弗氏不完全佐剂乳化完全后，采用皮下分点注射。详情如下表中所示：
第4次免疫后10天，断尾采血，分离血清。血清分别以与免疫原相对应的非诺特罗偶联抗原Ⅰ-卵清蛋白，非诺特罗偶联抗原Ⅱ-卵清蛋白作为检测原，采用间接ELISA方法，测定小鼠血清效价，具体检测方法如下：
a)包被检测原：用0.05mol/L，pH9.6碳酸盐缓冲液分别稀释与免疫抗原制备方法相同的检测抗原非诺特罗-卵清蛋白至终浓度为10μg/mL，再分别稀释至终浓度为2.5、1、0.25、0.05、0.01μg/mL，分别包被酶标板，100μL/孔，4℃包被过夜。
b)洗板：0.01mol/L PBS(含0.05％吐温-20)洗板两次。
c)封闭：每孔加入3％BSA 360μL，37℃孵育1小时后，拍干。
d)加血清：将采集的小鼠尾血清稀释1000倍，再倍比稀释6个梯度至128000倍；以免疫前小鼠血清作为阴性对照；以0.01mol/L PBS作为空白对照。100μL/孔，37℃孵育0.5小时。
e)洗板：0.01mol/L PBS(含0.05％吐温-20)洗板三次。
f)加二抗：酶标记羊抗鼠二抗，用0.01mol/L PBS稀释，100μL/孔，37℃孵育0.5小时。
g)洗板：0.01mol/L PBS(含0.05％吐温-20)洗板五次。
h)显色：加入TMB显色液，100μL/孔，37℃孵育15分钟。
I)终止及测定：每孔加入50μL 2mol/L硫酸溶液后，酶标仪测定OD450。
根据以上方法确定各组小鼠血清效价，并确定后期阻断实验及阳性克隆筛选中检测原的包被浓度。先采用以上方法对两组免疫原各一只免疫小鼠进行棋盘滴定，确定检测原包被浓度，再对两组中6只小鼠进行效价测定。
下表为非诺特罗偶联抗原Ⅰ-牛血清白蛋白免疫小鼠(3号)血清棋盘滴定实验数据。以与阴性对照孔OD值的比值(P/N)大于2.1且OD值大于0.3为限，作为判断为阳性或确定效价的临界点，经过计算，确定各组小鼠血清效价。
注：空白对照OD值为0.098，阴性对照OD值为0.167。
通过上表可知，该免疫小鼠血清效价大于1：128000，从棋盘结果可知，抗原包被浓度从10μg/mL至1μg/mL显色出现上升趋势，而1μg/mL到0.01μg/mL时显色处于明显下降趋势，因此确定该组其它小鼠效价测定时包被抗原浓度为1.0μg/mL。
下表为非诺特罗偶联抗原Ⅱ-牛血清白蛋白免疫小鼠(5号)血清棋盘滴定实验数据。同样以与阴性对照孔OD值的比值(P/N)大于2.1且OD值大于0.3为限，作为判断为阳性或确定效价的临界点。
注：空白对照OD值为0.15，阴性对照OD值为0.253。
通过上表可知，该免疫小鼠血清效价为1：16000，从棋盘结果可知，抗原包被浓度从10μg/mL至2.5μg/mL显色无明显差异，因此确定该组其它小鼠效价测定时包被抗原浓度为2.5μg/mL。
根据通过以上方法，进一步测定其它小鼠的血清效价，最后确定采用非诺特罗偶联抗原Ⅰ-牛血清白蛋白进行免疫的小鼠血清效价高。该抗原免疫血清效价高是因为非诺特罗偶联抗原Ⅰ在原有非诺特罗分子的基础上只引入了连接手臂，改变较小，所产生的抗体对于非诺特罗特异性好，效价高；而非诺特罗偶联抗原Ⅱ在原有非诺特罗分子的基础上引入了苯环，导致非诺特罗分子改变较大，所产生的抗体特异性差，效价低。
本发明的有益效果为：
a、本发明制备的非诺特罗的胶体金检测卡，采用非诺特罗偶联抗原Ⅰ作为免疫抗原，制备的抗非诺特罗单克隆抗体对于非诺特罗特异性好，效价高；采用非诺特罗偶联抗原Ⅱ作为检测抗原，包被于硝酸纤维素膜上，使其具有较高的检测灵敏度。
b、本发明具有成本低、灵敏度高、操作简便、无需仪器、特异性强、稳定性好、结果准确、易于判读、可现场检测等优点。
c、在当前我国食品安全问题日益突出的情况下，使用本发明制备的非诺特罗的胶体金检测卡，可实现现场检测与实验室检测有益互补，能大幅度提高监管部门及相关企业的工作效率，同时降低检测成本，对保障食品安全有着重要的意义。
附图说明
图1为本发明一种非诺特罗的胶体金检测卡的结构示意图；
图2为本发明一种非诺特罗的胶体金检测卡的试纸条结构示意图。
图中:
1、卡壳；11、底卡；12、面卡；13、加样孔；14、观察窗；2、试纸条；21、样本垫；22、金标结合物垫；23、硝酸纤维素膜；24、吸水垫；25、检测线；26、质控线。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。可以理解的是，此处所描述的实施例仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
请参照图1及图2所示，图1为本发明一种非诺特罗的胶体金检测卡的结构示意图；图2为本发明一种非诺特罗的胶体金检测卡的试纸条结构示意图。
于本实施例中，一种非诺特罗的胶体金检测卡，包括由塑料材料制成的卡壳1及设置于卡壳1内的试纸条2，所述卡壳1由底卡11及面卡12构成，所述试纸条2上沿液体流动方向依次设置有样本垫21、金标结合物垫22、硝酸纤维素膜23、吸水垫24，所述面卡12上开有加样孔13、观察窗14，所述加样孔13位于样本垫21的上方，所述观察窗14位于硝酸纤维素膜23的上方，所述金标结合物垫22上包被有抗非诺特罗单克隆抗体-胶体金结合物，所述抗非诺特罗单克隆抗体-胶体金结合物中的抗非诺特罗单克隆抗体是以非诺特罗偶联抗原Ⅰ为免疫抗原制备的，所述硝酸纤维素膜23上邻近金标结合物垫22的一端设置有检测线25，且硝酸纤维素膜23上邻近吸水垫24的一端设置有质控线26，所述检测线25上包被有非诺特罗偶联抗原Ⅱ，所述质控线26上包被有羊抗鼠IgG抗体。
值得一提的是，虽然本实施例中质控线26上包被羊抗鼠IgG抗体，但是本发明不限于此，质控线26亦可包被兔抗鼠IgG抗体或其他抗鼠二抗。
上述非诺特罗的胶体金检测卡是通过以下方法制备而成，其包括以下步骤：
一、金标结合物垫的制备：
a、合成非诺特罗偶联抗原Ⅰ：称取100mg牛血清白蛋白，用双蒸水溶解后，再用NaOH调pH至10，加入45.28mg1,4-丁二醇二缩水甘油醚，在氮气保护下，避光搅拌24小时，通过柱层析纯化制得接臂牛血清白蛋白，将非诺特罗调成碱性后，在搅拌条件下缓慢加入到接臂牛血清白蛋白中，氮气保护下室温避光搅拌24小时，反应产物在4℃用0.01mol/L的磷酸盐缓冲液透析3天，透析后得到非诺特罗偶联抗原Ⅰ；
b、免疫动物：将上述步骤a中制成的非诺特罗偶联抗原Ⅰ与等量弗氏完全佐剂乳化完全后，免疫小鼠；
c、细胞融合和杂交瘤细胞筛选：取经非诺特罗偶联抗原Ⅰ免疫的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合，融合细胞在含饲养细胞的96孔板中，采用HAT培养基进行培养，融合细胞生长至第4天及第7天，分别更换一次HAT及HT培养基；第9天，观察融合孔克隆生长情况并计算融合率；第10～12天，吸取克隆培养上清并采用间接ELISA方法进行检测，筛选获得稳定分泌抗非诺特罗单克隆抗体的细胞株14F8-B3-C9；
d、制备腹水：将分泌抗非诺特罗单克隆抗体的细胞株14F8-B3-C9培养至对数生长期，离心收集后用DEME培养液将其重悬，腹腔注射入已提前一周用液体石蜡致敏的BALB/C小鼠体内，剂量为100万细胞/0.5mL/只小鼠，收集其腹水；
e、抗非诺特罗单克隆抗体的纯化制备：将腹水以4000g离心去除细胞碎片，取上清至干净烧杯中，磁力搅拌，冰浴下，多次缓慢加入固体硫酸铵，硫酸铵终浓度为50％，4℃放置过夜，10000g离心30min,弃上清,将沉淀用0.01mol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液(含0.05％叠氮钠)放入透析袋，用0.01mol/LpH7.4的磷酸盐缓冲液(含0.05％叠氮钠)4℃透析72小时，每隔12小时换透析缓冲液一次，透析液离心，上清用0.22μm滤膜过滤，采用非诺特罗亲和层析柱对经透析、过滤处理的上清进行纯化，提纯制备出抗非诺特罗单克隆抗体；
f、胶体金溶液制备：在99mL超纯水中加入1mL1％氯金酸，加热煮沸，迅速加入1mL1％柠檬酸三钠，继续煮沸15分钟，冷却后用超纯水恢复至原来的体积，4℃保存备用；
g、抗非诺特罗单克隆抗体-胶体金结合物溶液的制备：将100mL胶体金溶液调pH至6.0，用10mL20μg/mL浓度的抗非诺特罗单克隆抗体反应1小时，然后用5mL10％牛血清白蛋白进行封闭，4℃7500g离心30分钟，去上清，胶体金沉淀用10mL金标复溶液进行溶解，制成抗非诺特罗单克隆抗体-胶体金结合物溶液，所述金标复溶液的质量体积百分比组成为：0.29％十二水合磷酸氢二钠，0.02％磷酸二氢钾，0.02％二水合磷酸二氢钠，0.8％氯化钠，15％蔗糖，2％牛血清白蛋白，0.1％叠氮钠；
h、制备金标结合物垫：用喷金划膜仪将上述制备的抗非诺特罗单克隆抗体-胶体金结合物溶液以4μL/cm喷量喷涂于结合物垫上，37度干燥3小时后，放于湿度低于20％的干燥柜保存备用；
二、硝酸纤维素膜的制备：
a、合成非诺特罗偶联抗原Ⅱ：将50mg对氨基苯甲酸、100mg亚硝酸钠溶于2mL pH2.0的溶液中，在冰浴和避光条件下磁力搅拌反应4小时，制得重氮盐，将该重氮盐与非诺特罗反应，生成非诺特罗衍生物，产物经柱层析纯化，将纯化后的非诺特罗衍生物与载体蛋白按摩尔比50:1，采用EDC/NHS法合成非诺特罗偶联抗原Ⅱ，然后在4℃用0.01mol/L磷酸盐缓冲液透析3天，得到纯化的非诺特罗偶联抗原Ⅱ；
b、制备硝酸纤维素膜：以0.01mol/L，pH7.4的磷酸盐缓冲液为稀释液，将非诺特罗偶联抗原Ⅱ稀释至0.5mg/mL浓度，并以1μL/cm喷量喷涂于硝酸纤维素膜的一端作为检测线，将抗鼠二抗稀释至1.0mg/mL浓度，并以1μL/cm喷量喷涂于硝酸纤维素膜的另一端作为质控线，37℃干燥2小时后，密封，室温保存备用；
三、非诺特罗的胶体金检测卡的组装：
在底板上依次粘贴样本垫、金标结合物垫、硝酸纤维素膜、吸水垫从而组装成试纸条，所述硝酸纤维素膜包被非诺特罗偶联抗原Ⅱ的一端搭接金标结合物垫，且硝酸纤维素膜包被抗鼠二抗的一端搭接吸水垫，将试纸条剪切成一定宽度后装于卡壳中。
值得一提的是，虽然上述制备方法中，载体蛋白均采用牛血清白蛋白，但是本发明不限于此，载体蛋白亦可采用阳离子化牛血清白蛋白或卵清蛋白或钥孔血蓝蛋白。
下面采用本发明制备的非诺特罗的胶体金检测卡检测猪尿；
1、检测样本：
用20种来自全国不同地方的阴性猪尿进行检测，并分别配制加标样本，添加浓度分别为3ng/mL，4ng/mL，5ng/mL，6ng/mL，8ng/mL。用非诺特罗的胶体金检测卡检测样本，非诺特罗的胶体金检测卡灵敏度为5ng/mL，计算出本方法检测的假阴性率和假阳性率。
2、非诺特罗的胶体金检测卡操作方法：
a)测试前将未开封的非诺特罗的胶体金检测卡和样本标本恢复至室温，若猪尿混浊，可先静置或3000g离心后再进行检测。
b)从原包装铝箔袋中取出非诺特罗的胶体金检测卡，在1小时内使用。
c)将非诺特罗的胶体金检测卡平放，用塑料吸管垂直滴加3滴样本于加样孔。
d)反应5分钟，质控线显色，检测线出现红色条带为阴性；质控线显色，检测线不出现红色条带为阳性。若质控线不显色或只有检测线显色，说明不正确的操作过程或检测卡失效。
3、检测结果
将各配制备好的猪尿样本加入非诺特罗的胶体金检测卡的加样孔中，反应5分钟后判读结果，检测结果如下表所示：
注：“-”标识为阴性，“+”标识为阳性
结果表明，除猪尿10号，13号，17号4ng/mL判为阳性外，其它样本判读结果与添加量相符。因此，非诺特罗的胶体金检测卡检测的假阴性率为0，假阳性率为2.5％。
下面采用本发明制备的非诺特罗的胶体金检测卡检测牛肉
将10份牛肉样品，分别用非诺特罗的胶体金检测卡和液相色谱-串联质谱法进行检测，所用非诺特罗的胶体金检测卡灵敏度为5μg/kg，检测结果如下表所示：
注：“-”标识为阴性，“+”标识为阳性
从上表结果可知，用非诺特罗的胶体金检测卡检测出2号和8号样本为阳性，非诺特罗含量均高于5μg/kg，液相色谱-串联质谱方法检测为5.85μg/kg和6.21μg/kg。非诺特罗的胶体金检测卡检测10个样本的结果与液-质联用检测结果一致。
本发明合成非诺特罗偶联抗原Ⅰ、合成非诺特罗偶联抗原Ⅱ，然后分别对6周龄BALB/C雌性小鼠进行免疫，再采用间接ELISA方法，测定小鼠血清效价，得出采用非诺特罗偶联抗原Ⅰ免疫的小鼠血清效价远远高于采用非诺特罗偶联抗原Ⅱ免疫的小鼠。原因在于非诺特罗偶联抗原Ⅰ在原有非诺特罗分子的基础只是引入了连接手臂，改变较小，所产生的抗体对于非诺特罗特异性好，效价高，而非诺特罗偶联抗原Ⅱ在原有非诺特罗分子的基础上引入了苯环，导致非诺特罗分子改变较大，所产生的抗体特异性差，效价低。基于上述研究成果，本发明采用非诺特罗偶联抗原Ⅰ作为免疫抗原，制备抗非诺特罗单克隆抗体，采用非诺特罗偶联抗原Ⅱ作为检测抗原，包被于硝酸纤维素膜上，使本发明具有较高的检测灵敏度。
以上实施例只是阐述了本发明的基本原理和特性，本发明不受上述实施例限制，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还有各种变化和改变，这些变化和改变都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (8)
1.一种非诺特罗的胶体金检测卡，其特征在于：包括卡壳及设置于卡壳内的试纸条，所述试纸条上沿液体流动方向依次设置有样本垫、金标结合物垫、硝酸纤维素膜、吸水垫，所述金标结合物垫上包被有抗非诺特罗单克隆抗体-胶体金结合物，所述抗非诺特罗单克隆抗体-胶体金结合物中的抗非诺特罗单克隆抗体是以非诺特罗偶联抗原Ⅰ为免疫抗原制备的，所述硝酸纤维素膜上邻近金标结合物垫的一端设置有检测线，且硝酸纤维素膜上邻近吸水垫的一端设置有质控线，所述检测线上包被有非诺特罗偶联抗原Ⅱ，所述质控线上包被有抗鼠二抗。
2.根据权利要求1所述的非诺特罗的胶体金检测卡，其特征在于：所述卡壳由底卡及面卡构成，且卡壳由塑料材料制成。
3.根据权利要求2所述的非诺特罗的胶体金检测卡，其特征在于：所述面卡上开有加样孔，所述加样孔位于样本垫的上方。
4.根据权利要求2所述的非诺特罗的胶体金检测卡，其特征在于：所述面卡上开有观察窗，所述观察窗位于硝酸纤维素膜的上方。
5.一种非诺特罗的胶体金检测卡制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
一、金标结合物垫的制备：
a、合成非诺特罗偶联抗原Ⅰ：取载体蛋白，用双蒸水溶解后，再用NaOH调pH至10，加入1,4-丁二醇二缩水甘油醚，在氮气保护下，避光搅拌24小时，通过柱层析纯化制得接臂载体蛋白，所述1,4-丁二醇二缩水甘油醚与蛋白载体的摩尔比为100：1，将非诺特罗调成碱性后，在搅拌条件下缓慢加入到接臂载体蛋白中，氮气保护下室温避光搅拌24小时，反应产物在4℃用0.01mol/L的磷酸盐缓冲液透析3天，透析后得到非诺特罗偶联抗原Ⅰ；
b、免疫动物：将上述步骤a中制成的非诺特罗偶联抗原Ⅰ与等量弗氏完全佐剂乳化完全后，免疫小鼠；
c、细胞融合和杂交瘤细胞筛选：取经非诺特罗偶联抗原Ⅰ免疫的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合，并采用HAT培养基进行培养，对培养上清进行检测，筛选获得稳定分泌抗非诺特罗单克隆抗体的细胞株14F8-B3-C9；
d、制备腹水：将分泌抗非诺特罗单克隆抗体的细胞株14F8-B3-C9培养后，注射入BALB/C小鼠腹腔，收集其腹水；
e、抗非诺特罗单克隆抗体的纯化制备：采用硫酸铵沉淀法对腹水进行透析、过滤处理，采用非诺特罗亲和层析柱对经透析、过滤处理的上清进行纯化，提纯制备出抗非诺特罗单克隆抗体；
f、胶体金溶液制备：在超纯水中加入1％氯金酸，加热煮沸，迅速加入1％柠檬酸三钠，继续煮沸15分钟，所述超纯水、氯金酸、柠檬酸三钠的体积比为99：1：1，冷却后用超纯水恢复至原来的体积，4℃保存备用；
g、抗非诺特罗单克隆抗体-胶体金结合物溶液的制备：将胶体金溶液调pH至6.0后，用20μg/mL浓度的抗非诺特罗单克隆抗体反应1小时，然后用10％牛血清白蛋白进行封闭，4℃ 7500g离心30分钟，去上清，胶体金沉淀用1/10胶体金体积的金标复溶液进行溶解，制成抗非诺特罗单克隆抗体-胶体金结合物溶液，所述胶体金溶液、抗非诺特罗单克隆抗体、牛血清白蛋白的体积比为100：10：5；
h、制备金标结合物垫：将上述制备的抗非诺特罗单克隆抗体-胶体金结合物溶液以4μL/cm喷量喷涂于结合物垫上，37度干燥3小时后，放于湿度低于20％的干燥柜保存备用；
二、硝酸纤维素膜的制备：
a、合成非诺特罗偶联抗原Ⅱ：将对氨基苯甲酸、亚硝酸钠溶于pH2.0的溶液中，在冰浴和避光条件下磁力搅拌反应4小时，制得重氮盐，所述对氨基苯甲酸、亚硝酸钠的质量比为1：2，将该重氮盐与非诺特罗反应，生成非诺特罗衍生物，产物经柱层析纯化，将纯化后的非诺特罗衍生物与载体蛋白按摩尔比50:1，采用EDC/NHS法合成非诺特罗偶联抗原Ⅱ，然后在4℃用0.01mol/L磷酸盐缓冲液透析3天，得到纯化的非诺特罗偶联抗原Ⅱ；
b、制备硝酸纤维素膜：以0.01mol/L，pH7.4的磷酸盐缓冲液为稀释液，将非诺特罗偶联抗原Ⅱ稀释至0.5mg/mL，并以1μL/cm喷量喷涂于硝酸纤维素膜的一端作为检测线，将抗鼠二抗稀释至1.0mg/mL，并以1μL/cm喷量喷涂于硝酸纤维素膜的另一端作为质控线，37℃干燥2小时后，密封，室温保存备用；
三、非诺特罗的胶体金检测卡的组装：
在底板上依次粘贴样本垫、金标结合物垫、硝酸纤维素膜、吸水垫从而组装成试纸条，所述硝酸纤维素膜包被非诺特罗偶联抗原Ⅱ的一端搭接金标结合物垫，且硝酸纤维素膜包被抗鼠二抗的一端搭接吸水垫，将试纸条剪切成一定宽度后装于卡壳中。
6.根据权利要求5所述的一种非诺特罗的胶体金检测卡制备方法，其特征在于：所述载体蛋白为牛血清白蛋白或阳离子化牛血清白蛋白或卵清蛋白或钥孔血蓝蛋白。
7.根据权利要求5所述的一种非诺特罗的胶体金检测卡制备方法，其特征在于：所述抗鼠二抗为羊抗鼠IgG抗体或兔抗鼠IgG抗体或驴抗鼠IgG抗体。
8.根据权利要求5所述的一种非诺特罗的胶体金检测卡制备方法，其特征在于：所述金标复溶液的质量体积百分比组成为：0.29％十二水合磷酸氢二钠，0.02％磷酸二氢钾，0.02％二水合磷酸二氢钠，0.8％氯化钠，5％-20％蔗糖，0.5％-5％牛血清白蛋白，0.1％叠氮钠。
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Denomination of invention: A colloidal gold detection card for non Nortrol and its preparation method Granted publication date: 20160622 Pledgee: Bank of China Limited Wuxi Branch Pledgor: WUXI ZODOLABS BIOTECH Co.,Ltd. Registration number: Y2024980012931 |
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Effective date of registration: 20240809 Granted publication date: 20160622 |