CN103217531B - 同步检测黄曲霉毒素、赭曲霉毒素a和玉米赤霉烯酮混合污染的免疫层析试纸条及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及同步检测黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮混合污染的免疫层析试纸条及制备方法。它包括纸板，纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫、金标垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，上设横向质控线和检测线，所述检测线位于质控线的下方，个数为三条，呈间隔分布，分别包被OTA-BSA、ZEA-BSA和AFB1-BSA，质控线包被有兔抗鼠多克隆抗体；金标垫横向喷涂有纳米金标记的抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体、纳米金标记的抗赭曲霉毒素A单克隆抗体和纳米金标记的抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体。其可用于黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮的同步检测，操作简单快速、灵敏度高。

Description

同步检测黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮混合污染的免疫层析试纸条及制备方法

技术领域

本发明提供了一种同步检测黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮混合污染的免疫层析试纸条及制备方法。

背景技术

真菌毒素是真菌在食品或饲料里生长所产生的代谢产物，粮食和饲料在收获时未被充分干燥或贮运过程中温度或湿度过高，就可能为真菌的生长繁殖提供适宜条件，从而引起真菌毒素的污染。黄曲霉毒素、赭曲霉毒素和玉米赤霉烯酮是粮食饲料中常见的真菌毒素。黄曲霉毒素主要由黄曲霉和寄生曲霉产生，赭曲霉毒素主要由多种曲霉和青霉产生，玉米赤霉烯酮主要由禾谷镰刀菌产生，三种真菌毒素在粮食包括小麦、玉米、大麦、燕麦、黑麦、大米和黍类等及花生、豆类等粮食和饲料中广泛发生。真菌毒素对人和动物都有极大危害，黄曲霉毒素能强烈破坏人和动物的肝脏组织，严重时会导致肝癌甚至死亡；赭曲霉毒素主要引起肾脏损伤，大量的毒素也可能引起动物的肠黏膜炎症和坏死；玉米赤霉烯酮具有雌激素样作用，能造成动物急慢性中毒，引起动物繁殖机能异常甚至死亡。鉴于真菌毒素的危害作用及其在粮食和饲料中的广泛发生，世界各国对其含量进行了严格限定。因此为了加强对粮食和饲料中这些真菌毒素的检测，尤其是快速检测，是了解和掌握食品及饲料安全卫生信息，增强食品安全消费的重要环节。

现有对黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮三种真菌毒素的检测方法主要包括薄层层析法、精密仪器分析法和免疫学分析法。薄层层析法检测真菌毒素时，不需要特殊的仪器设备，在一般实验室都可进行，但检测试剂用量大、操作繁琐、其它组分干扰严重、准确性差，不能准确定量，且对实验人员和周围环境污染危害较大，不适于现场快速检测。精密仪器分析法包括高效液相色谱法、液相色谱与质谱及串联质谱联用的方法，其灵敏度高，准确性好，但仪器昂贵，要求所检测的样品的纯化程度高，样品前处理过程繁琐，耗时长，对实验环境和检测人员要求高，难以实现快速检测，检测成本高。免疫分析方法克服了薄层层析法和仪器分析法的缺点，由于其特异性强、灵敏度高、样品前处理简单、成本低、对实验人员和周围环境的污染危害小、适于现场批量检测等优点在近年来获得了快速发展。基于胶体金标记抗体与抗原特异性结合反应的免疫层析试纸条的检测结果肉眼可见，不需要大型仪器设备，检测成本低，分析时间短，从而可实现对各种真菌毒素等微量残留物的定性、在线、快速检测。然而现有用于真菌毒素检测的免疫层析试纸条大都主要只能检测一种真菌毒素。而我国小农户分散型的种植方式，农产品中真菌毒素发生率高，且同一农产品受多种真菌毒素污染的可能性大，因此迫切需要能快速、同步检测多种真菌毒素的检测技术，以实现对粮食及饲料中多种真菌毒素的同步、快速、准确监测。

发明内容

本发明所要解决的问题是提供一种同步检测黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮混合污染的免疫层析试纸条及制备方法。其可用于样品中黄曲霉毒素，赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮三种真菌毒素含量的同步检测，具有操作简单、快速、灵敏度高的特点。

为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为：

同步检测黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮混合污染的免疫层析试纸条（见图1和图2），包括纸板，纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫、金标垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，所述检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜上设有横向质控线和检测线，所述检测线位于质控线的下方，个数为三条，呈间隔分布，所述三条检测线上分别包被有赭曲霉毒素A-牛血清白蛋白偶联物(OTA-BSA)、玉米赤霉烯酮-牛血清白蛋白偶联物(ZEA-BSA)和黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶联物(AFB1-BSA)，所述质控线包被有兔抗鼠多克隆抗体；所述金标垫横向喷涂有纳米金标记的抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体、纳米金标记的抗赭曲霉毒素A单克隆抗体和纳米金标记的抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体；所述抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体由保藏编号为CCTCC NO.C201013的杂交瘤细胞株1C11分泌产生，抗赭曲霉毒素A单克隆抗体由保藏编号为CCTCC NO.C201329的杂交瘤细胞株1H2分泌产生，抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体由保藏编号为CCTCC NO.C201328的杂交瘤细胞株2D3分泌产生。

按上述方案，所述的吸水垫长16～18mm，宽3～4mm，检测垫长18～30mm，宽3～4mm；金标垫长10～12mm，宽3～4mm；样品垫长12～15mm，宽3～4mm，相邻各垫的交叠长度为1～3mm。

按上述方案，所述的吸水垫为吸水纸。

按上述方案，所述检测垫上每相邻两条检测线之间的间距为2-3mm，靠近质控线的检测线与硝酸纤维素膜上沿的间距为15～20mm，所述靠近质控线的检测线与质控线的间距为5～7mm。

按上述方案，所述检测垫包被黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶联物(AFB1-BSA)的检测线上每厘米所需要的黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶联物(AFB1-BSA)的包被量为100～300ng；包被玉米赤霉烯酮-牛血清白蛋白偶联物的检测线上每厘米所需要的玉米赤霉烯酮-牛血清白蛋白偶联物(ZEA-BSA)的包被量为100～300ng；包被黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶联物(AFB1-BSA)的检测线上每厘米所需要的黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶联物(AFB1-BSA)的包被量为100～300ng；质控线上每厘米所需要的兔抗鼠多克隆抗体的包被量为50～200ng。

按上述方案，所述金标垫中所用的纳米金的粒径为15～20nm；所述金标垫上每厘米喷涂长度所需的纳米金标记的抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体的用量为100～200ng，所需的纳米金标记的抗赭曲霉毒素A单克隆抗体的用量为100～200ng，所需的抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体的用量为200～400ng。

如上所述同步检测黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮混合污染的免疫层析试纸条的制备方法，包括以下步骤：

(1)吸水垫的制备

将吸水纸剪裁即得吸水垫；

(2)检测垫的制备

检测线的包被：

将黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶联物(AFB1-BSA)、玉米赤霉烯酮-牛血清白蛋白偶联物（ZEA-BSA）和黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白的偶联物（AFB1-BSA）用包被缓冲液分别配制成0.25～0.5mg/mL的包被液，用点喷方式将其于硝酸纤维素膜上进行分别包被，得到两条检测线，然后于37～40℃条件下干燥30～60分钟；所述包被黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶联物(AFB1-BSA)的检测线上每厘米所需要的黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶联物(AFB1-BSA)的包被量为100～300ng；包被玉米赤霉烯酮-牛血清白蛋白偶联物的检测线上每厘米所需要的玉米赤霉烯酮-牛血清白蛋白偶联物(ZEA-BSA)的包被量为100～300ng；包被黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶联物的检测线上所需要的黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶联物（AFB1-BSA）的包被量为100～300ng，所述每相邻两条检测线之间的间距为2-3mm，靠近质控线的检测线与硝酸纤维素膜上沿的间距为15～20mm；

质控线的包被：

将兔抗鼠多克隆抗体用包被缓冲液液配制成0.2～0.4mg/mL的包被液，于距靠近质控线的检测线5～7mm的位置，用点喷方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上，得到质控线，每厘米质控线上所需兔抗鼠多克隆抗体的包被量为50～200ng，然后于37～40℃条件下干燥1～2小时；

(3)样品垫的制备

将玻璃纤维膜放入封闭液中浸湿，取出，于37～40℃条件下干燥6～10小时，得样品垫，然后置干燥器中室温保存。

(4)金标垫的制备

将玻璃纤维膜放入封闭液中浸湿，取出，于37～40℃条件下干燥6～10小时，于已干燥的玻璃纤维膜上，用点喷方式向已干燥的玻璃纤维膜上横向喷涂纳米金标记的抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体溶液、纳米金标记的抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体溶液和纳米金标记的抗赭曲霉毒素A单克隆抗体溶液的混合溶液，其中：每厘米喷涂长度所需的纳米金标记的抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体的用量为100～200ng，所需的纳米金标记的抗赭曲霉毒素A单克隆抗体的用量为100～200ng，所需的抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体的用量为200～400ng，然后真空冷冻干燥2～4小时，置干燥器中室温保存；所述的抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体由保藏编号为CCTCC NO.C201013的杂交瘤细胞株1C11分泌产生，抗赭曲霉毒素A单克隆抗体由保藏编号为CCTCC NO.C201329的杂交瘤细胞株1H2分泌产生，抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体由保藏编号为CCTCC NO.C201328的杂交瘤细胞株2D3分泌产生；

(5)试纸条的组装

在纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫、金标垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，交叠长度为1～3mm，即得同步检测黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮混合污染的免疫层析试纸条。

按上述方案，所述的包被缓冲液每10mL中含有：牛血清白蛋白0.1～0.2g，氯化钠0.08g，十二水磷酸氢二钠0.029g，氯化钾0.002g，磷酸二氢钾0.002g；

按上述方案，所述步骤（3）和步骤（4）中的封闭液每100mL中含有：卵清白蛋白1～2g，蔗糖2～5g，叠氮化钠0.02～0.05g，氯化钠0.8g，十二水磷酸氢二钠0.29g，氯化钾0.02g，磷酸二氢钾0.02g。

按上述方案，所述纳米金标记的抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体溶液是采用不饱和标记法制备的，其具体方法为：取50.0mL市售质量浓度为0.01%的纳米金溶液，用0.4mL0.1mol/L碳酸钾水溶液调节pH值，在搅拌的状态下缓慢加入2mL0.1mg/mL的抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体水溶液，继续搅拌30min；加入质量浓度为10%牛血清白蛋白水溶液至牛血清白蛋白的终质量浓度为1%，继续搅拌30min；于4℃放置2h后，1500r/min离心15min，取上清液，弃沉淀；将上清液12000r/min离心30min，弃去上清液，加入40.0mL标记洗涤保存液；再以12000r/min离心30min，弃去上清液，将沉淀用标记洗涤保存液重悬，得到5.0mL浓缩物，置4℃冰箱备用；

所述纳米金标记的抗赭曲霉毒素A单克隆抗体是采用不饱和标记法制备的，其具体方法为：取50.0mL市售质量浓度为0.01%的纳米金溶液，用0.4mL0.1mol/L碳酸钾水溶液调节pH值，在搅拌的状态下缓慢加入1.5mL0.1mg/mL的抗赭曲霉毒素A单克隆抗体水溶液，继续搅拌30min；加入质量浓度为10%牛血清白蛋白水溶液至牛血清白蛋白的终质量浓度为1%，继续搅拌30min；于4℃放置2h后，1500r/min离心15min，取上清液，弃沉淀；将上清液12000r/min离心30min，弃去上清液，加入40.0mL标记洗涤保存液；再以12000r/min离心30min，弃去上清液，将沉淀用标记洗涤保存液重悬，得到5.0mL浓缩物，置4℃冰箱备用；

所述纳米金标记的抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体溶液是采用不饱和标记法制备的，其具体方法为：取50.0mL市售质量浓度为0.01%的纳米金溶液，用0.425mL0.1mol/L碳酸钾水溶液调节pH值，在搅拌的状态下缓慢加入2.5mL0.1mg/mL的抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体水溶液，继续搅拌30min；加入质量浓度为10%牛血清白蛋白水溶液至牛血清白蛋白的终质量浓度为1%，继续搅拌30min；于4℃放置2h后，1500r/min离心15min，取上清液，弃沉淀；将上清液12000r/min离心30min，弃去上清液，加入40.0mL标记洗涤保存液；再以12000r/min离心30min，弃去上清液，将沉淀用标记洗涤保存液重悬，得到5.0mL浓缩物，置4℃冰箱备用；

所述的0.1mol/L碳酸钾水溶液为：13.8g碳酸钾溶于纯水定容至1000mL，0.22μm滤膜过滤所得；所述的标记洗涤保存液为：2.0g聚乙二醇-20000，0.2g叠氮钠，0.1235g硼酸，纯水定容至1000mL，0.22μm滤膜过滤所得。

如上所述的同步检测黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮混合污染的免疫层析试纸条的应用，方法如下：称取已磨细待测样品，加入体积浓度为60～80%的甲醇水溶液，混匀，在50～60℃水浴下超声提取5～10分钟，静置5～10分钟，将上层清液即提取液用水稀释，使稀释液中甲醇的终体积浓度为20～30%，得到待测样品溶液，再取80-150μL该待测样品溶液作为检测液逐滴加入到同步检测黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮混合污染的免疫层析试纸条的样品垫上进行检测，其作为检测试纸条，另取等体积的甲醇浓度一致的甲醇水溶液做为阴性对照液，逐滴加入另一同步检测黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮混合污染的免疫层析试纸条的样品垫上，其作为对照试纸条，15-20分钟后将检测试纸条和对照试纸条进行显色对照：

当检测试纸条上包被黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白的偶联物（AFB1-BSA）的检测线颜色与对照试纸条上对应检测线的颜色接近时，表明待测样品溶液中黄曲霉毒素含量低于0.25ng/mL；比对应检测线的颜色浅时，表明待测样品溶液中黄曲霉毒素含量等于或高于0.25ng/mL并低于1ng/mL；不显色时，表明待测样品溶液中黄曲霉毒素的含量等于或高于1ng/mL；

当检测试纸条上包被赭曲霉毒素A-牛血清白蛋白的偶联物（OTA-BSA）的检测线颜色与对照试纸条上对应检测线的颜色接近时，表明待测样品溶液中赭曲霉毒素A含量低于0.5ng/mL；比对应检测线的颜色浅时，表明待测样品溶液中赭曲霉毒素A含量等于或高于0.5ng/mL并低于2ng/mL；不显色时，表明待测样品溶液中赭曲霉毒素A的含量等于或高于2ng/mL；

当检测试纸条上包被玉米赤霉烯酮-牛血清白蛋白偶联物（ZEA-BSA）的检测线颜色与对照试纸条上对应检测线的颜色接近时，表明待测样品溶液中玉米赤霉烯酮含量低于1ng/mL；比对应检测线的颜色浅时，表明待测样品溶液中玉米赤霉烯酮含量等于或高于1ng/mL并低于4ng/mL；不显色时，表明待测样品溶液中玉米赤霉烯酮的含量等于或高于4ng/mL；

当质控线不显色时，无论检测试纸条的检测线是否显色，该试纸条判为无效；

最后经换算即得待测样品中黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮的含量。

该免疫层析试纸条在黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮混合污染同步检测中的工作原理：当待测样品溶液加入到试纸条下端的样品垫上时，待测样品溶液通过毛细作用沿试纸条向吸水垫方向移动，当其移动至金标垫时，纳米金标记的抗黄曲霉毒素单克隆抗体、纳米金标记的抗赭曲霉毒素A单克隆抗体、纳米金标记的抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体被溶解。当样品中含有黄曲霉毒素时，黄曲霉毒素将和金标垫上的纳米金标记的抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体结合并一同向上泳动，其到达固定着黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶联物抗原的检测线时，抗原将和黄曲霉毒素竞争结合纳米金标记的抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体上有限的抗原结合位点，样品中黄曲霉毒素含量越高，检测线上的抗原能够结合的纳米金标记的抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体将越少，在检测线上形成的显色带颜色越浅；当样品中含有玉米赤霉烯酮时，玉米赤霉烯酮将和金标垫上的纳米金标记的抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体结合并一同向上泳动，其到达固定着玉米赤霉烯酮-牛血清白蛋白偶联物（ZEA-BSA）抗原的检测线Ⅰ时，抗原将和玉米赤霉烯酮竞争结合纳米金标记的抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体上有限的抗原结合位点，样品中玉米赤霉烯酮含量越高，检测线上的抗原能够结合的纳米金标记的抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体将越少，在检测线上形成的显色带颜色越浅；当样品中含有赭曲霉毒素A时，赭曲霉毒素A将和金标垫上的纳米金标记的抗赭曲霉毒素A单克隆抗体结合并一同向上泳动，其到达固定着赭曲霉毒素A-牛血清白蛋白偶联物（OTA BSA）抗原的检测线Ⅰ时，抗原将和赭曲霉毒素A竞争结合纳米金标记的抗赭曲霉毒素A单克隆抗体上有限的抗原结合位点，样品中赭曲霉毒素A含量越高，检测线上的抗原能够结合的纳米金标记的抗赭曲霉毒素A单克隆抗体将越少，在检测线上形成的显色带颜色越浅。

当三条检测线上的抗原所结合的纳米金标记的对应的抗体少于一定的数量时，三条检测线处将不会有红色线条出现。无论样品中是否含有这三种真菌毒素，未被检测线上的抗原截获的纳米金标记的抗真菌毒素的抗体或纳米金标记的抗真菌毒素的抗体与真菌毒素的结合物将继续移动到质控线并与质控线上的兔抗鼠多克隆抗体结合并被富集显色。据此，分别将检测试纸条上包被黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白的偶联物的检测线、包被赭曲霉毒素A-牛血清白蛋白偶联物（OTA-BSA）的检测线和包被玉米赤霉烯酮-牛血清白蛋白偶联物（ZEA-BSA）的检测线与对照试纸条上相应检测线颜色进行显色对照，即可获得样品中黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮这三种真菌毒素的混合污染情况。

本发明的有益效果：

（1）快速、同步检测黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮。本发明提供的免疫层析试纸条能在一条试纸条上实现对黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮三种真菌毒素的同步、快速检测，使用的抗体均为单克隆抗体，特异性好、灵敏度高，各真菌毒素的检测之间无干扰，简单、快速。

（2）灵敏度高。本发明提供的免疫层析试纸条对检测溶液中黄曲霉毒素的最低检测限为0.25ng/mL，对赭曲霉毒素A的最低检测限为0.5ng/mL，对玉米赤霉烯酮的最低检测限为1ng/mL，该检测限能满足欧盟对食品中这三种真菌毒素的限量要求。

（3）样品前处理方法简单。样品前处理只需要将甲醇水提取液加入样品中超声提取5～10分钟，然后静置5～10分钟，取上清液稀释即可进行检测，整个样品前处理过程简单、快速。

附图说明

图1为本发明的同步检测黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮混合污染的免疫层析试纸条的正视图；

图2为本发明的同步检测黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮混合污染的免疫层析试纸条的侧视图；

图3为实施例2的的结果判定图；

图4为实施例3的的结果判定图；

图中：1纸板、2吸水垫、3检测垫、4金标垫、5样品垫、6质控线、7检测线Ⅰ、8检测线Ⅱ、9检测线Ⅲ、10对照试纸条、11检测试纸条。

具体实施方式

实施例1：抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体、抗赭曲霉毒素A单克隆抗体和抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体的获得

a.抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体由保藏编号为CCTCC NO.C201018的杂交瘤细胞株1C11分泌产生，具体根据专利申请号为CN201010245095.5的专利中报道的方法预先制得，制备方法为：将杂交瘤细胞株1C11注射预先用福氏不完全佐剂处理过的BALB/c小鼠，收集该小鼠的腹水，采用辛酸-硫酸铵法纯化抗体，具体操作为：用双层滤纸过滤小鼠腹水，4℃，12000r/min离心15min，吸取上清，将所得腹水上清与4倍体积的醋酸盐缓冲液混合，搅拌下缓慢加入正辛酸，每毫升腹水所需的正辛酸体积为33μL，室温混合30min，4℃静置2h，然后4℃，12000r/min离心30min，弃沉淀，将得到的上清液用双层滤纸过滤后，加入1/10滤液体积的摩尔浓度为0.1mol/L和pH值为7.4的磷酸盐缓冲液，用2mol/L的氢氧化钠溶液调节该混合液的pH值至7.4，4℃预冷，缓慢加入硫酸铵至硫酸铵终浓度为0.277g/mL，4℃静置2h，然后4℃，12000r/min离心30min，弃上清，将所得沉淀用原腹水体积1/10的0.01mol/L磷酸盐缓冲液重悬，装入透析袋，对纯水透析，将充分透析好的蛋白溶液置-70℃冰箱冷冻，之后用冷冻干燥机冻干，收集冻干粉，即得纯化好的抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体，将抗体置于-20℃冰箱中备用；

所述的醋酸盐缓冲液为0.29g醋酸钠，0.141mL醋酸加水定容至100mL所得；所述的0.1mol/L的磷酸盐缓冲液为0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，磷酸二氢钾0.02g，加水定容至100mL所得。

b.抗赭曲霉毒素A单克隆抗体由保藏编号为CCTCC NO.C201329的杂交瘤细胞株1H2分泌产生，其制备方法为：将杂交瘤细胞株1H2注射预先用福氏不完全佐剂处理过的BALB/c小鼠，收集该小鼠的腹水，采用辛酸-硫酸铵法纯化抗体，具体操作为：用双层滤纸过滤小鼠腹水，4℃，12000r/min离心15min，吸取上清，将所得腹水上清与4倍体积的醋酸盐缓冲液混合，搅拌下缓慢加入正辛酸，每毫升腹水所需的正辛酸体积为33μL，室温混合30min，4℃静置2h，然后4℃，12000r/min离心30min，弃沉淀，将得到的上清液用双层滤纸过滤后，加入1/10滤液体积的摩尔浓度为0.1mol/L和pH值为7.4的磷酸盐缓冲液，用2mol/L的氢氧化钠溶液调节该混合液的pH值至7.4，4℃预冷，缓慢加入硫酸铵至硫酸铵终浓度为0.277g/mL，4℃静置2h，然后4℃，12000r/min离心30min，弃上清，将所得沉淀用原腹水体积1/10的0.01mol/L、pH值为7.4的磷酸盐缓冲液重悬，装入透析袋，对纯水透析，将充分透析好的蛋白溶液置-70℃冰箱冷冻，之后用冷冻干燥机冻干，收集冻干粉，即得纯化好的抗赭曲霉毒素A单克隆抗体，将抗体置于-20℃冰箱中备用；

所述的醋酸盐缓冲液为0.29g醋酸钠，0.141mL醋酸加水定容至100mL所得；所述的0.1mol/L的磷酸盐缓冲液为8g氯化钠，2.9g十二水磷酸氢二钠，0.2g氯化钾，磷酸二氢钾0.2g，加水定容到100mL所得；所述的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液为0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，磷酸二氢钾0.02g，加水定容至100mL所得。

用市售亚型鉴定试剂盒鉴定杂交瘤细胞株1H2分泌的抗赭曲霉毒素A单克隆抗体的亚型为IgG1。

用常规非竞争酶联免疫吸附分析（ELISA）法测得注射杂交瘤细胞株1H2的BALB/c小鼠腹水抗体效价可达7.2×10⁵，即小鼠腹水抗体稀释7.2×10⁵倍时的溶液测定结果为阳性。用常规间接竞争ELISA法鉴定其对赭曲霉毒素A的灵敏度为52pg/mL，与赭曲霉毒素B，黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2，呕吐毒素，玉米赤霉烯酮，伏马毒素的交叉反应率均小于0.1%。

杂交瘤细胞株1H2的筛选：

（1）动物免疫

购买6周龄BALB/c小鼠6只，免疫市售的赭曲霉毒素A完全抗原OTA-BSA。第一次免疫将赭曲霉毒素A完全抗原与等体积的福氏完全佐剂乳化后，于小鼠颈背部皮下多点注射。第二次免疫于4周后进行，采用福氏不完全佐剂与等体积的赭曲霉毒素A完全抗原乳化，于小鼠腹腔注射。第三次免疫与第二次免疫间隔4周，免疫方式与其相同，第四次免疫于第三次免疫3周后进行，免疫方式与第二次免疫相同，同样为腹腔注射。4次免疫剂量相同，均为每鼠70μg。前3次每次免疫后8～10天，尾静脉采血，分离血清，采用间接ELISA法监测小鼠血清效价。第4次免疫后8天，尾静脉采血，分离血清，采用间接ELISA法监测小鼠血清效价，并用间接竞争ELISA法测定小鼠血清灵敏度，选择效价、灵敏度均相对较高的血清对应的小鼠进行最后一次加强免疫，免疫剂量为前面的2倍。

赭曲霉毒素A完全抗原OTA-BSA购于Sigma-Aldrich公司。

（2）细胞融合

于最后一次加强免疫3天后，采用50%（重量百分数）的聚乙二醇即PEG（分子量为1450）作融合剂，按常规方法进行细胞融合，具体步骤：无菌条件下杀死免疫小鼠，分离脾细胞，与鼠源骨髓瘤细胞SP2/0以5︰1的个数比混合，用RPMI-1640基础培养液洗混合细胞，用50%PEG融合，融合1分钟，然后缓慢加入RPMI-1640基础培养液，离心，移去上清，小鼠脾细胞和鼠源骨髓瘤细胞SP2/0形成的融合细胞用20mL含1%HAT的细胞完全培养基重悬，将悬起的细胞加入到80mL半固体培养基中，混匀后加到6孔细胞培养板上，1.5mL/孔，置于37℃二氧化碳培养箱培养。

所述的含1%HAT的细胞完全培养基含有20%（体积百分数）胎牛血清，75%（体积百分数）RPMI-1640基础培养液，1%（重量百分数）L-谷氨酰胺，1%（体积百分数）HEPES，1%（体积百分数）双抗（10000单位每毫升青霉素和10000微克每毫升链霉素），2%（重量百分数）生长因子（HFCS）和1%（重量百分数）次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶核苷即HAT；半固体培养基为含1%（质量百分数）甲基纤维素的细胞完全培养基；RPMI-1640基础培养液、HEPES、双抗和L-谷氨酰胺购于Hyclone公司；1%次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶核苷即HAT和甲基纤维素购于Sigma-Aldrich公司。

（3）细胞株的筛选及克隆

待细胞融合后2-3周，细胞集落长到人肉眼可见时，用微量移液器将克隆从该培养基中吸取，移至96孔细胞培养板采用液体放大培养，每孔移入1个克隆，待细胞长至满孔底1/2～2/3时，吸取培养上清进行阳性检测，即进行抗体检测。采用ELISA方法对有杂交瘤细胞生长的培养孔进行筛选，筛选分两步进行，第一步采用间接ELISA法筛选出抗赭曲霉毒素A而不抗载体蛋白BSA的阳性孔；第二步采用间接竞争ELISA法对第一步筛选出的阳性孔进行检测，用赭曲霉毒素A作为竞争原，选择吸光值和灵敏度均较高的孔（吸光值较高指竞争原为0的孔即阳性对照孔的最终测定值较高，灵敏度较高指抑制率为50%时的竞争原浓度亦即IC50值较小），采用有限稀释法进行亚克隆，亚克隆后采用同样的两步法进行检测，如此重复亚克隆2-3次后，获得杂交瘤细胞株1H2。

杂交瘤细胞株1H2抗体可变区序列测定

（1）提取总RNA：采用天根公司的总RNA提取试剂盒并按照说明书提取可产生杂交瘤细胞株1H2的总RNA；

（2）合成cDNA：以步骤1获得的总RNA为模板，oligo(dT)₁₅为引物，按照SuperScript^TM-2Ⅱ反转录酶说明书进行反转录，合成cDNA第一链；引物oligo(dT)₁₅由Invitrogen购得；

（3）PCR法克隆可变区基因：根据GENEBANK中小鼠抗体基因序列的保守位点设计引物，以cDNA为模版扩增抗体轻、重链可变区基因。PCR程序为：94℃30s、58℃1min、72℃1min，扩增30个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物经过1％（重量百分数）的琼脂糖凝胶电泳分离后，用试剂盒纯化回收DNA片段，连接到载体pMD18-T中，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆，送至上海桑尼生物科技有限公司进行测序。其中引物的序列分别为：重链可变区引物为5，-AGG TSM ARC TGC AGS AGT CWG G-3’（22mer）和5’-TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGT CCC TTG GCC CC-3’（32mer）其中S、M、R和W为兼并碱基，M=A/C，R=A/G，S=C/G，W=A/T，轻链可变区引物为5’-GAC ATT GAG CTC ACC CAG CTT GGT GCC-3’（24mer）和5’-CCG TTT CAG CTC CAGCTT GGT CCC-3’（24mer）。

得到的基因序列结果：重链可变区编码基因序列长353bp，序列如SEQ ID NO:1所示，根据所获得的基因序列推导出该基因序列所编码的重链可变区由117个氨基酸组成，序列如SEQ ID NO:3所示。轻链可变区编码基因序列长329bp，序列如SEQ ID NO:2所示，根据所获得的基因序列推导出该基因序列所编码的轻链可变区由109个氨基酸组成，序列如SEQ ID NO:4所示。

c.抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体由保藏编号为CCTCC NO.C201328的杂交瘤细胞株2D3分泌产生，其具体制备方法为：

将杂交瘤细胞株2D3注射预先用福氏不完全佐剂处理过的BALB/c小鼠，收集该小鼠的腹水，采用辛酸-硫酸铵法纯化抗体，具体操作步骤为：用双层滤纸过滤小鼠腹水，4℃，12000r/min离心15min，吸取上清，将所得腹水上清与4倍体积的醋酸盐缓冲液混合，搅拌下缓慢加入正辛酸，每毫升腹水所需的正辛酸体积为33μL，室温混合30min，4℃静置2h，然后4℃，12000r/min离心30min，弃沉淀，将得到的上清液用双层滤纸过滤后，加入1/10滤液体积的摩尔浓度为0.1mol/L和pH值为7.4的磷酸盐缓冲液，用2mol/L的氢氧化钠溶液调节该混合液的pH值至7.4，4℃预冷，缓慢加入硫酸铵至硫酸铵终浓度为0.277g/mL，4℃静置2h，然后4℃，12000r/min离心30min，弃上清，将所得沉淀用原腹水体积1/10的0.01mol/L、pH值为7.4的磷酸盐缓冲液重悬，装入透析袋，对纯水透析，将充分透析好的蛋白溶液置-70℃冰箱冷冻，之后用冷冻干燥机冻干，收集冻干粉，即得纯化好的抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体，将抗体置于-20℃冰箱中备用；

所述的醋酸盐缓冲液为0.29g醋酸钠，0.141mL醋酸加水定容至100mL所得；所述的0.1mol/L的磷酸盐缓冲液为8g氯化钠，2.9g十二水磷酸氢二钠，0.2g氯化钾，磷酸二氢钾0.2g，加水定容到100mL所得；所述的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液为0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，磷酸二氢钾0.02g，加水定容至100mL所得。

用市售亚型鉴定试剂盒鉴定杂交瘤细胞株2D3分泌的抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体的亚型为IgG2b。

用常规非竞争酶联免疫吸附分析（ELISA）法测得注射杂交瘤细胞株2D3的BALB/c小鼠腹水纯化获得的抗体的效价可达1.5×10⁵，即抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体稀释1.5×10⁵倍时的溶液测定结果为阳性。用常规间接竞争ELISA法鉴定其对玉米赤霉烯酮的灵敏度为20pg/mL，与β-玉米赤霉烯醇，α-玉米赤霉烯醇，β-玉米赤霉醇的交叉反应分别为84.9%，3.3%，3.2%。

其中：上述杂交瘤细胞株2D3是根据以下方法筛选得到的：

（1）动物免疫

购买6周龄BALB/c小鼠6只，免疫市售的玉米赤霉烯酮完全抗原ZEA-BSA。第一次免疫将玉米赤霉烯酮完全抗原与等体积的福氏完全佐剂乳化后，于小鼠颈背部皮下多点注射。第二次免疫于4周后进行，采用福氏不完全佐剂与等体积的玉米赤霉烯酮完全抗原乳化，于小鼠腹腔注射。第三次免疫与第二次免疫间隔4周，免疫方式与其相同，第四次免疫于第三次免疫3周后进行，免疫方式与第二次免疫相同，同样为腹腔注射。4次免疫剂量相同，均为每鼠100μg。前3次每次免疫后8天，尾静脉采血，分离血清，采用间接ELISA法监测小鼠血清效价。第4次免疫后8天，尾静脉采血，分离血清，采用间接ELISA法监测小鼠血清效价，并用间接竞争ELISA法测定小鼠血清灵敏度，选择效价、灵敏度均相对较高的血清对应的小鼠进行最后一次加强免疫，免疫剂量为前面的2倍。玉米赤霉烯酮完全抗原ZEA-BSA购于德国aokin公司。

[0018]（2）细胞融合

于最后一次加强免疫3天后，采用50%（重量百分数）的聚乙二醇即PEG（分子量为1450）作融合剂，按常规方法进行细胞融合，具体步骤：无菌条件下杀死免疫小鼠，分离脾细胞，与鼠源骨髓瘤细胞SP2/0以5～8︰1的个数比混合，用RPMI-1640基础培养液洗混合细胞，用50%PEG融合，融合1分钟，然后缓慢加入RPMI-1640基础培养液，离心，移去上清，小鼠脾细胞和鼠源骨髓瘤细胞SP2/0形成的融合细胞用20mL含1%HAT的细胞完全培养基重悬，将悬起的细胞加入到80mL半固体培养基中，混匀后加到6孔细胞培养板上，1.5mL/孔，置于37℃二氧化碳培养箱培养。所述的含1%HAT的细胞完全培养基含有20%（体积百分数）胎牛血清，75%（体积百分数）RPMI-1640基础培养液，1%（重量百分数）L-谷氨酰胺，1%（体积百分数）HEPES，1%（体积百分数）双抗（10000单位每毫升青霉素和10000微克每毫升链霉素），2%（重量百分数）生长因子（HFCS）和1%（重量百分数）次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶核苷即HAT；半固体培养基为含1%（质量百分数）甲基纤维素的细胞完全培养基；RPMI-1640基础培养液、HEPES、双抗和L-谷氨酰胺购于Hyclone公司；1%次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶核苷即HAT及甲基纤维素购于Sigma-Aldrich公司。

（3）细胞株的筛选及克隆

待细胞融合后2-3周，细胞集落长到人肉眼可见时，用微量移液器将克隆从该培养基中吸取，移至96孔细胞培养板采用液体放大培养，每孔移入1个克隆，待细胞长至满孔底1/2～2/3时，吸取培养上清进行阳性检测，即进行抗体检测。采用ELISA方法对有杂交瘤细胞生长的培养孔进行筛选，筛选分两步进行，第一步采用间接ELISA法筛选出抗玉米赤霉烯酮而不抗载体蛋白BSA的阳性孔；第二步采用间接竞争ELISA法对第一步筛选出的阳性孔进行检测，用玉米赤霉烯酮作为竞争原，选择吸光值和灵敏度均较高的孔（吸光值较高指竞争原为0的孔即阳性对照孔的最终测定值较高，灵敏度较高指抑制率为50%时的竞争原浓度亦即IC₅₀值较小），采用有限稀释法进行亚克隆，亚克隆后采用同样的两步法进行检测，如此重复亚克隆2-3次后，获得杂交瘤细胞株2D3。

杂交瘤细胞株2D3抗体可变区序列测定

（1）提取总RNA：采用天根公司的总RNA提取试剂盒并按照说明书提取可产生杂交瘤细胞株2D3的总RNA；

（2）合成cDNA：以步骤1获得的总RNA为模板，oligo(dT)₁₅为引物，按照SuperScript^TM-2Ⅱ反转录酶说明书进行反转录，合成cDNA第一链；引物oligo(dT)₁₅由Invitrogen购得；

（3）PCR法克隆可变区基因：根据GENEBANK中小鼠抗体基因序列的保守位点设计引物，以cDNA为模版扩增抗体轻、重链可变区基因。PCR程序为：94℃30s、58℃1min、72℃1min，扩增30个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物经过1％（重量百分数）的琼脂糖凝胶电泳分离后，用试剂盒纯化回收DNA片段，连接到载体pMD18-T中，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆，送至上海桑尼生物科技有限公司进行测序。其中引物的序列分别为：重链可变区引物为5’-AGG TSM ARC TGC AGS AGT CWG G-3’（22mer）和5’-TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGT CCC TTG GCC CC-3’（32mer）其中S、M、R和W为兼并碱基，M=A/C，R=A/G，S=C/G，W=A/T，轻链可变区引物为5’-GAC ATT GAG CTC ACC CAG CTT GGT GCC-3’（24mer）和5’-CCG TTT CAG CTC CAGCTT GGT CCC-3’（24mer）。

得到的基因序列结果：重链可变区编码基因序列长315bp，序列如SEQ ID NO:5所示，根据所获得的基因序列推导出该基因序列所编码的重链可变区由105个氨基酸组成，序列如SEQ ID NO:7所示。轻链可变区编码基因序列长329bp，序列如SEQ ID NO:6所示，根据所获得的基因序列推导出该基因序列所编码的轻链可变区由109个氨基酸组成，序列如SEQ ID NO:8所示。

实施例2

同步检测黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮混合污染的免疫层析试纸条的制备方法，步骤如下：

（1）吸水垫的制备

将吸水纸剪裁成长16mm，宽4mm的规格，即得吸水垫；

（2）检测垫的制备

检测线的包被：

将赭曲霉毒素A-牛血清白蛋白偶联物（OTA-BSA）用包被缓冲液配制成0.4mg/mL的包被液，于距硝酸纤维素膜上沿15mm的位置，用点喷方式将其包被于硝酸纤维素膜上得到检测线Ⅰ，每厘米检测线Ⅰ上所需赭曲霉毒素A-牛血清白蛋白偶联物（OTA-BSA的包被量为160ng；将玉米赤霉烯酮-牛血清白蛋白偶联物（ZEA-BSA）用包被缓冲液配制成0.4mg/mL的包被液，于距检测线Ⅰ2mm的位置，用点喷方式将其包被于硝酸纤维素膜上得到检测线Ⅱ，每厘米检测线Ⅱ上所需玉米赤霉烯酮-牛血清白蛋白偶联物（ZEA-BSA）的包被量为200ng；将黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶联物（AFB1-BSA）用包被缓冲液配制成0.25mg/mL的溶液，于距检测线Ⅱ2mm的位置用点喷方式将其包被于硝酸纤维素膜上得到检测线Ⅱ，每厘米检测线Ⅱ上所需黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶联物（AFB1-BSA）的包被量为100ng，然后于37℃条件下干燥30分钟；

质控线的包被：

将兔抗鼠多克隆抗体用包被缓冲液配制成0.25mg/mL的包被液，于距检测线Ⅰ6mm的位置，用点喷方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上，得到质控线，每厘米质控线上所需兔抗鼠多克隆抗体的包被量为80ng，然后于37℃条件下干燥1小时；

所述的包被缓冲液为：0.1g牛血清白蛋白，0.08g氯化钠，0.029g十二水磷酸氢二钠，0.002g氯化钾，0.002g磷酸二氢钾，加水定容到10mL所得。

所述的硝酸纤维素膜长24mm，宽4mm。

（3）样品垫的制备

将玻璃纤维膜剪裁成长12mm，宽4mm的规格，放入封闭液中浸湿，取出，于37℃条件下干燥8小时，得样品垫，然后置干燥器中室温保存。

所述的封闭液为：将1g卵清白蛋白，2g蔗糖，0.02g叠氮化钠，0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，0.02g磷酸二氢钾，加水定容至100mL所得。

（4）金标垫的制备

将玻璃纤维膜剪裁成长10mm宽4mm的规格，放入步骤（3）所述的封闭液中浸湿，取出，于37℃条件下干燥8小时，于已干燥的玻璃纤维膜上，用点喷方式向已干燥的玻璃纤维膜上横向喷涂纳米金标记的抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体溶液、纳米金标记的抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体溶液和纳米金标记的抗赭曲霉毒素A单克隆抗体溶液的混合溶液，其中：每厘米喷涂长度所需的纳米金标记的抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体的用量为133ng，所需的纳米金标记的抗赭曲霉毒素A单克隆抗体的用量为140ng，所需的抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体的用量为300ng，然后真空冷冻干燥2小时，置干燥器中室温保存；

所述纳米金标记的抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体溶液是采用不饱和标记法制备的，其具体方法为：取50.0mL市售质量浓度为0.01%的纳米金溶液，用0.4mL0.1mol/L碳酸钾水溶液调节pH值，在搅拌的状态下缓慢加入2mL0.1mg/mL的抗黄曲霉毒素单克隆抗体水溶液，继续搅拌30min；加入质量浓度为10%牛血清白蛋白水溶液至牛血清白蛋白的终质量浓度为1%，继续搅拌30min；于4℃放置2h后，1500r/min离心15min，取上清液，弃沉淀；将上清液12000r/min离心30min，弃去上清液，加入40.0mL标记洗涤保存液；再以12000r/min离心30min，弃去上清液，将沉淀用标记洗涤保存液重悬，得到5.0mL浓缩物，置4℃冰箱备用，其中纳米金标记的抗黄曲霉毒素单克隆抗体溶液的质量浓度为0.04mg/mL；

所述纳米金标记的抗赭曲霉毒素A单克隆抗体是采用不饱和标记法制备的，其具体方法为：取50.0mL市售质量浓度为0.01%的纳米金溶液，用0.4mL0.1mol/L碳酸钾水溶液调节pH值，在搅拌的状态下缓慢加入1.5mL0.1mg/mL的抗赭曲霉毒素A单克隆抗体水溶液，继续搅拌30min；加入质量浓度为10%牛血清白蛋白水溶液至牛血清白蛋白的终质量浓度为1%，继续搅拌30min；于4℃放置2h后，1500r/min离心15min，取上清液，弃沉淀；将上清液12000r/min离心30min，弃去上清液，加入40.0mL标记洗涤保存液；再以12000r/min离心30min，弃去上清液，将沉淀用标记洗涤保存液重悬，得到5.0mL浓缩物，置4℃冰箱备用，其中纳米金标记的抗赭曲霉毒素A单克隆抗体溶液的质量浓度为0.03mg/mL；

所述纳米金标记的抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体溶液是采用不饱和标记法制备的，其具体方法为：取50.0mL市售质量浓度为0.01%的纳米金溶液，用0.425mL0.1mol/L碳酸钾水溶液调节pH值，在搅拌的状态下缓慢加入2.5mL0.1mg/mL的抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体水溶液，继续搅拌30min；加入质量浓度为10%牛血清白蛋白水溶液至牛血清白蛋白的终质量浓度为1%，继续搅拌30min；于4℃放置2h后，1500r/min离心15min，取上清液，弃沉淀；将上清液12000r/min离心30min，弃去上清液，加入40.0mL标记洗涤保存液；再以12000r/min离心30min，弃去上清液，将沉淀用标记洗涤保存液重悬，得到5.0mL浓缩物，置4℃冰箱备用，其中纳米金标记的抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体溶液的质量浓度为0.05mg/mL；

所述纳米金溶液中纳米金的粒径为15nm；

所述的0.1mol/L碳酸钾水溶液为：13.8g碳酸钾溶于纯水定容至1000mL，0.22μm滤膜过滤所得；所述的标记洗涤保存液为：2.0g聚乙二醇-20000，0.2g叠氮钠，0.1235g硼酸，纯水定容至1000mL，0.22μm滤膜过滤所得。

（5）试纸条的组装

在纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫、金标垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，交叠长度为1～3mm，即得同步检测黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮混合污染的免疫层析试纸条，见图1和图2。

上述同步检测黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮混合污染的免疫层析试纸条在玉米样品检测中的应用：

称取已磨细的1#、2#和3#待测花生样品，加入体积浓度为70%的甲醇水溶液，待测样品和甲醇水溶液的质量体积比为4g/mL，混匀，在50℃水浴下超声提取10分钟，静置10分钟，将上层清液即提取液用水稀释3倍，使稀释液中甲醇的终体积浓度为23.3%，得到样品溶液，再取100μL稀释好的样品溶液做为检测液逐滴加入一同步检测黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮混合污染的免疫层析试纸条的样品垫，其作为检测试纸条，同时取100μL甲醇浓度为23.3%的水溶液做为阴性对照液，逐滴加入另一同步检测黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮混合污染的免疫层析试纸条的样品垫，其作为对照试纸条，15分钟后读取结果。

检测结果：1#检测试纸条的质控线显示出红色条带，检测线Ⅰ和检测线Ⅱ颜色与对照试纸条中的检测线Ⅰ和检测线Ⅱ颜色接近，检测线Ⅲ未显色，见图3-1，由此判定：1#待测样品溶液中赭曲霉毒素A的含量低于0.5ng/mL；玉米赤霉烯酮的含量低于1ng/mL；黄曲霉毒素的含量等于或高于1ng/mL；经换算可得1#待测样品中赭曲霉毒素A的含量低于6ng/g，玉米赤霉烯酮的含量低于12ng/g；黄曲霉毒素的含量等于或高于12ng/g。

2#检测试纸条的质控线显示出红色条带，检测线Ⅰ颜色与对照试纸条中的检测线Ⅰ颜色接近，检测线Ⅱ未显色，检测线Ⅲ颜色比对照试纸条检测线Ⅲ浅，见图3-2，由此判定：1#待测样品溶液中赭曲霉毒素A的含量低于0.5ng/mL，玉米赤霉烯酮的含量高于4ng/mL，黄曲霉毒素的含量等于或高于0.25ng/mL并低于1ng/mL，经换算可得2#待测样品中赭曲霉毒素A的含量低于6ng/g，玉米赤霉烯酮的含量高于48ng/g；黄曲霉毒素的含量等于或高于3ng/g，并低于12ng/g。

3#检测试纸条的质控线显示出红色条带，检测线Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ时均不显色，见图3-3，表明：待测样品溶液中赭曲霉毒素A的含量等于或高于2ng/mL；玉米赤霉烯酮的含量等于或高于4ng/mL；黄曲霉毒素的含量等于或高于1ng/mL；经换算可得待测样品中中赭曲霉毒素A的含量等于或高于24ng/g；玉米赤霉烯酮的含量等于或高于48ng/g；黄曲霉毒素的含量等于或高于12ng/g。

实施例3

同步检测黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮混合污染的免疫层析试纸条的制备方法，步骤如下：

（1）吸水垫的制备

将吸水纸剪裁成长18mm，宽3mm的规格，即得吸水垫；

（2）检测垫的制备

检测线的包被：

将赭曲霉毒素A-牛血清白蛋白偶联物（OTA-BSA）用包被缓冲液配制成0.5mg/mL的包被液，于距硝酸纤维素膜上沿18mm的位置，用点喷方式将其包被于硝酸纤维素膜上得到检测线Ⅰ，每厘米检测线Ⅰ上所需赭曲霉毒素A-牛血清白蛋白偶联物（OTA-BSA的包被量为300ng；将玉米赤霉烯酮-牛血清白蛋白偶联物（ZEA-BSA）用包被缓冲液配制成0.4mg/mL的包被液，于距检测线Ⅰ3mm的位置，用点喷方式将其包被于硝酸纤维素膜上得到检测线Ⅱ，每厘米检测线Ⅱ上所需玉米赤霉烯酮-牛血清白蛋白偶联物（ZEA-BSA）的包被量为200ng；将黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶联物（AFB1-BSA）用包被液配制成0.25mg/mL的溶液，于距检测线Ⅱ3mm的位置用点喷方式将其包被于硝酸纤维素膜上得到检测线Ⅱ，每厘米检测线Ⅱ上所需黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶联物（AFB1-BSA）的包被量为300ng，然后于40℃条件下干燥30分钟；

质控线的包被：

将兔抗鼠多克隆抗体用包被缓冲液配制成0.25mg/mL的包被液，于距检测线Ⅰ6mm的位置，用点喷方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上，得到质控线，每厘米质控线上所需兔抗鼠多克隆抗体的包被量为80ng，然后于37℃条件下干燥1小时；

所述的包被缓冲液为：0.2g牛血清白蛋白，0.08g氯化钠，0.029g十二水磷酸氢二钠，0.002g氯化钾，0.002g磷酸二氢钾，加水定容到10mL所得。

所述的硝酸纤维素膜长30mm，宽3mm。

（3）样品垫的制备

将玻璃纤维膜剪裁成长15mm，宽3mm的规格，放入封闭液中浸湿，取出，于40℃条件下干燥6小时，得样品垫，然后置干燥器中室温保存。

所述的封闭液为：将2g卵清白蛋白，4g蔗糖，0.05g叠氮化钠，0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，0.02g磷酸二氢钾，加水定容至100mL所得。

（4）金标垫的制备

将玻璃纤维膜剪裁成长12mm，宽3mm的规格，放入步骤（3）所述的封闭液中浸湿，取出，于40℃条件下干燥6小时，于已干燥的玻璃纤维膜上，用点喷方式向已干燥的玻璃纤维膜上横向喷涂纳米金标记的抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体溶液、纳米金标记的抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体溶液和纳米金标记的抗赭曲霉毒素A单克隆抗体溶液的混合溶液，其中：每厘米喷涂长度所需的纳米金标记的抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体的用量为200ng，所需的纳米金标记的抗赭曲霉毒素A单克隆抗体的用量为200ng，所需的抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体的用量为400ng，然后真空冷冻干燥2小时，置干燥器中室温保存；

所述纳米金标记的抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体溶液、纳米金标记的抗赭曲霉毒素A单克隆抗体溶液和纳米金标记的抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体溶液是的制备方法如实施例2，不同之处在于；其所使用的纳米金溶液中纳米金的粒径为20nm；

（5）试纸条的组装

在纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫、金标垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，交叠长度为3mm，即得同步检测黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮混合污染的免疫层析试纸条。

称取已磨细的待测花生样品，加入体积浓度为60%的甲醇水溶液，待测样品和甲醇水溶液的质量体积比为4g/mL，混匀，在50℃水浴下超声提取10分钟，静置10分钟，将上层清液即提取液用水稀释3倍，使稀释液中甲醇的终体积浓度为20%，得到样品溶液，再取100μL稀释好的样品溶液做为检测液逐滴加入一同步检测黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮混合污染的免疫层析试纸条的样品垫，其作为检测试纸条，同时取100μL甲醇浓度为23.3%的水溶液做为阴性对照液，逐滴加入另一同步检测黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮混合污染的免疫层析试纸条的样品垫，其作为对照试纸条，20分钟后读取结果。

检测结果：检测试纸条的质控线显示出红色条带，检测线Ⅰ、检测线Ⅱ和检测线Ⅲ的颜色分别与对照试纸条中检测线Ⅰ、检测线Ⅱ和检测线Ⅲ的颜色接近，见图4，由此判定：待测样品溶液中玉米赤霉烯酮的含量低于1ng/mL；赭曲霉毒素A的含量低于0.5ng/mL，黄曲霉毒素的含量低于0.25ng/mL；经换算可得1#待测样品中玉米赤霉烯酮的含量低于12ng/g；赭曲霉毒素A的含量低于6ng/g，黄曲霉毒素的含量低于1ng/g。

Claims (10)

1.同步检测黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮混合污染的免疫层析试纸条，其特征在于：它包括纸板，纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫、金标垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，所述检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜上设有横向质控线和检测线，所述检测线位于质控线的下方，个数为三条，呈间隔分布，所述三条检测线上分别包被有赭曲霉毒素A-牛血清白蛋白偶联物、玉米赤霉烯酮-牛血清白蛋白偶联物和黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶联物，所述质控线包被有兔抗鼠多克隆抗体；所述金标垫横向喷涂有纳米金标记的抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体、纳米金标记的抗赭曲霉毒素A单克隆抗体和纳米金标记的抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体；所述抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体由保藏编号为CCTCC NO.C201013的杂交瘤细胞株1C11分泌产生，抗赭曲霉毒素A单克隆抗体由保藏编号为CCTCC NO.C201329的杂交瘤细胞株1H2分泌产生，抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体由保藏编号为CCTCC NO.C201328的杂交瘤细胞株2D3分泌产生。

2.根据权利要求1所述的同步检测黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮混合污染的免疫层析试纸条，其特征在于：所述的吸水垫长16～18mm，宽3～4mm，检测垫长18～30mm，宽3～4mm；金标垫长10～12mm，宽3～4mm；样品垫长12～15mm，宽3～4mm，相邻各垫的交叠长度为1～3mm。

3.根据权利要求1所述的同步检测黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮混合污染的免疫层析试纸条，其特征在于：所述检测垫上每相邻两条检测线之间的间距为2-3mm，靠近质控线的检测线与硝酸纤维素膜上沿的间距为15～20mm，所述靠近质控线的检测线与质控线的间距为5～7mm。

4.根据权利要求1所述的同步检测黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮混合污染的免疫层析试纸条，其特征在于：所述检测垫包被黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶联物的检测线上每厘米所需要的黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶联物的包被量为100～300ng；包被玉米赤霉烯酮-牛血清白蛋白偶联物的检测线上每厘米所需要的玉米赤霉烯酮-牛血清白蛋白偶联物的包被量为100～300ng；包被黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶联物的检测线上每厘米所需要的黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶联物的包被量为100～300ng；质控线上每厘米所需要的兔抗鼠多克隆抗体的包被量为50～200ng。

5.根据权利要求1所述的同步检测黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮混合污染的免疫层析试纸条，其特征在于：所述金标垫中所用的纳米金的粒径为15～20nm；所述金标垫上每厘米喷涂长度所需的纳米金标记的抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体的用量为100～200ng，所需的纳米金标记的抗赭曲霉毒素A单克隆抗体的用量为100～200ng，所需的抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体的用量为200～400ng。

6.同步检测黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮混合污染的免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于：它包括以下步骤：

（1）吸水垫的制备

将吸水纸剪裁即得吸水垫；

（2）检测垫的制备

检测线的包被：

将黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶联物、玉米赤霉烯酮-牛血清白蛋白偶联物和黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白的偶联物用包被缓冲液分别配制成0.25～0.5mg/mL的包被液，用点喷方式将其于硝酸纤维素膜上进行分别包被，得到两条检测线，然后于37～40℃条件下干燥30～60分钟；所述包被黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶联物的检测线上每厘米所需要的黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶联物的包被量为100～300ng；包被玉米赤霉烯酮-牛血清白蛋白偶联物的检测线上每厘米所需要的玉米赤霉烯酮-牛血清白蛋白偶联物的包被量为100～300ng；包被黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶联物的检测线上所需要的黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶联物的包被量为100～300ng，所述每相邻两条检测线之间的间距为2-3mm，靠近质控线的检测线与硝酸纤维素膜上沿的间距为15～20mm；

质控线的包被：

将兔抗鼠多克隆抗体用包被缓冲液液配制成0.2～0.4mg/mL的包被液，于距靠近质控线的检测线5～7mm的位置，用点喷方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上，得到质控线，每厘米质控线上所需兔抗鼠多克隆抗体的包被量为50～200ng，然后于37～40℃条件下干燥1～2小时；

(3)样品垫的制备

将玻璃纤维膜放入封闭液中浸湿，取出，于37～40℃条件下干燥6～10小时，得样品垫，然后置干燥器中室温保存；

(4)金标垫的制备

将玻璃纤维膜放入封闭液中浸湿，取出，于37～40℃条件下干燥6～10小时，于已干燥的玻璃纤维膜上，用点喷方式向已干燥的玻璃纤维膜上横向喷涂纳米金标记的抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体溶液、纳米金标记的抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体溶液和纳米金标记的抗赭曲霉毒素A单克隆抗体溶液的混合溶液，其中：每厘米喷涂长度所需的纳米金标记的抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体的用量为100～200ng，所需的纳米金标记的抗赭曲霉毒素A单克隆抗体的用量为100～200ng，所需的抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体的用量为200～400ng，然后真空冷冻干燥2～4小时，置干燥器中室温保存；所述的抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体由保藏编号为CCTCC NO.C201013的杂交瘤细胞株1C11分泌产生，抗赭曲霉毒素A单克隆抗体由保藏编号为CCTCC NO.C201329的杂交瘤细胞株1H2分泌产生，抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体由保藏编号为CCTCC NO.C201328的杂交瘤细胞株2D3分泌产生；

(5)试纸条的组装

在纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫、金标垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，交叠长度为1～3mm，即得同步检测黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮混合污染的免疫层析试纸条。

7.根据权利要求6所述的同步检测黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮混合污染的免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于：它包括以下步骤：所述的包被缓冲液每10mL中含有：牛血清白蛋白0.1～0.2g，氯化钠0.08g，十二水磷酸氢二钠0.029g，氯化钾0.002g，磷酸二氢钾0.002g。

8.根据权利要求6所述的同步检测黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮混合污染的免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）和步骤（4）中的封闭液每100mL中含有：卵清白蛋白1～2g，蔗糖2～5g，叠氮化钠0.02～0.05g，氯化钠0.8g，十二水磷酸氢二钠0.29g，氯化钾0.02g，磷酸二氢钾0.02g。

9.根据权利要求6所述的同步检测黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮混合污染的免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于：所述纳米金标记的抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体溶液是采用不饱和标记法制备的，其具体方法为：取50.0mL市售质量浓度为0.01%的纳米金溶液，用0.4mL0.1mol/L碳酸钾水溶液调节pH值，在搅拌的状态下缓慢加入2mL0.1mg/mL的抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体水溶液，继续搅拌30min；加入质量浓度为10%牛血清白蛋白水溶液至牛血清白蛋白的终质量浓度为1%，继续搅拌30min；于4℃放置2h后，1500r/min离心15min，取上清液，弃沉淀；将上清液12000r/min离心30min，弃去上清液，加入40.0mL标记洗涤保存液；再以12000r/min离心30min，弃去上清液，将沉淀用标记洗涤保存液重悬，得到5.0mL浓缩物，置4℃冰箱备用；

所述纳米金标记的抗赭曲霉毒素A单克隆抗体是采用不饱和标记法制备的，其具体方法为：取50.0mL市售质量浓度为0.01%的纳米金溶液，用0.4mL0.1mol/L碳酸钾水溶液调节pH值，在搅拌的状态下缓慢加入1.5mL0.1mg/mL的抗赭曲霉毒素A单克隆抗体水溶液，继续搅拌30min；加入质量浓度为10%牛血清白蛋白水溶液至牛血清白蛋白的终质量浓度为1%，继续搅拌30min；于4℃放置2h后，1500r/min离心15min，取上清液，弃沉淀；将上清液12000r/min离心30min，弃去上清液，加入40.0mL标记洗涤保存液；再以12000r/min离心30min，弃去上清液，将沉淀用标记洗涤保存液重悬，得到5.0mL浓缩物，置4℃冰箱备用；

所述纳米金标记的抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体溶液是采用不饱和标记法制备的，其具体方法为：取50.0mL市售质量浓度为0.01%的纳米金溶液，用0.425mL0.1mol/L碳酸钾水溶液调节pH值，在搅拌的状态下缓慢加入2.5mL0.1mg/mL的抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体水溶液，继续搅拌30min；加入质量浓度为10%牛血清白蛋白水溶液至牛血清白蛋白的终质量浓度为1%，继续搅拌30min；于4℃放置2h后，1500r/min离心15min，取上清液，弃沉淀；将上清液12000r/min离心30min，弃去上清液，加入40.0mL标记洗涤保存液；再以12000r/min离心30min，弃去上清液，将沉淀用标记洗涤保存液重悬，得到5.0mL浓缩物，置4℃冰箱备用；

所述的0.1mol/L碳酸钾水溶液为：13.8g碳酸钾溶于纯水定容至1000mL，0.22μm滤膜过滤所得；所述的标记洗涤保存液为：2.0g聚乙二醇-20000，0.2g叠氮钠，0.1235g硼酸，纯水定容至1000mL，0.22μm滤膜过滤所得。

10.根据权利要求1-5中任一项所述的同步检测黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮混合污染的免疫层析试纸条的应用，其特征在于：它的应用方法为：称取已磨细待测样品，加入体积浓度为60～80%的甲醇水溶液，混匀，在50～60℃水浴下超声提取5～10分钟，静置5～10分钟，将上层清液即提取液用水稀释，使稀释液中甲醇的终体积浓度为20～30%，得到待测样品溶液，再取80-150μL该待测样品溶液作为检测液逐滴加入到同步检测黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮混合污染的免疫层析试纸条的样品垫上进行检测，其作为检测试纸条，另取等体积的甲醇浓度一致的甲醇水溶液做为阴性对照液，逐滴加入另一同步检测黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮混合污染的免疫层析试纸条的样品垫上，其作为对照试纸条，15-20分钟后将检测试纸条和对照试纸条进行显色对照：

当检测试纸条上包被黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白的偶联物的检测线颜色与对照试纸条上对应检测线的颜色接近时，表明待测样品溶液中黄曲霉毒素含量低于0.25ng/mL；比对应检测线的颜色浅时，表明待测样品溶液中黄曲霉毒素含量等于或高于0.25ng/mL并低于1ng/mL；不显色时，表明待测样品溶液中黄曲霉毒素的含量等于或高于1ng/mL；

当检测试纸条上包被赭曲霉毒素A-牛血清白蛋白的偶联物的检测线颜色与对照试纸条上对应检测线的颜色接近时，表明待测样品溶液中赭曲霉毒素A含量低于0.5ng/mL；比对应检测线的颜色浅时，表明待测样品溶液中赭曲霉毒素A含量等于或高于0.5ng/mL并低于2ng/mL；不显色时，表明待测样品溶液中赭曲霉毒素A的含量等于或高于2ng/mL；

当检测试纸条上包被玉米赤霉烯酮-牛血清白蛋白偶联物的检测线颜色与对照试纸条上对应检测线的颜色接近时，表明待测样品溶液中玉米赤霉烯酮含量低于1ng/mL；比对应检测线的颜色浅时，表明待测样品溶液中玉米赤霉烯酮含量等于或高于1ng/mL并低于4ng/mL；不显色时，表明待测样品溶液中玉米赤霉烯酮的含量等于或高于4ng/mL；

当质控线不显色时，无论检测试纸条的检测线是否显色，该试纸条判为无效；

最后经换算即得待测样品中黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮的含量。

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