CN201429618Y - 一种检测磺胺类药物的检测卡 - Google Patents

Abstract

本实用新型公开了一种检测磺胺类药物的检测卡。本实用新型包括底板、反应膜、样品垫、复合垫和吸水垫；复合垫由活化垫、放热垫和结合物释放垫依次连接而成；结合物释放垫上包被有胶体金标记的磺胺类药物－载体蛋白偶联物；反应膜(2)设于底板(1)上，分为样品吸收区、反应区和吸水垫设置区；样品吸收区上，远离反应区处设有样品垫I(3)；复合垫设于样品垫I上，结合物释放垫(6)靠近反应区；活化垫上设有样品垫II(7)；吸水垫设置区上设有吸水垫(8)；反应区上设有T线(9)和C线(10)，T线包被有磺胺类药物的特异性抗体，C线包被有载体蛋白抗体。本实用新型具有以下的特点：10分钟内即有结果显示；能同时检测大批样品；结果判定简单；制备工艺简单，成本低。本实用新型具有较高的应用价值和经济社会效益。

Description

一种检测磺胺类药物的检测卡

技术领域

本实用新型涉及一种检测磺胺类药物的检测卡。

背景技术

磺胺类药物(Sulfonamides，SAs)都是以对氨基苯磺酰胺为基本结构的衍生物，为具有式(I)所示官能团的化合物，是一类人工合成的可有效预防和治疗细菌性感染的动物常用抗菌药。

磺胺类药物其抗菌谱广，毒性小、口服易吸收、生产量大，价格低廉，供应充足，抑菌效果强，被广泛应用于畜牧业和兽医临床。但由于不合理使用甚至滥用，造成磺胺类药物于动物性食品中残留现象较为严重，磺胺药在体内作用时间和代谢时间较长，通过任何途径摄入的磺胺药都可能在人体中蓄积，当蓄积浓度达到一定量时会影响到人类健康。近年来发现，长期使用该类药物可引起甲状腺肿大、诱发肿瘤等，极大地影响了人们的健康，也影响我国畜产品的正常出口贸易，因此监控动物源食品中该类药物残留十分必要。

磺胺类药物的化学检测方法包括薄层色谱法(TLC)、气相色谱法(GC)、气谱-质谱联机(GC/MS)、高压液相色谱法(HPLC)、高压液相色谱-质谱联机(HPLC/MS)等。这些方法的前处理利用液-液分配，常规的SPE柱净化和分离，都在不同程度地存在着处理过程繁琐、净化效果差、有机溶剂浪费多、所需时间长且需专业人员操作等缺点，严重阻碍了这种检测方法的普及推广，更无法实现现场检测。本发明所涉及的磺胺类药物总残留检测卡操作简单，人人可以操作，可以判定结果阴阳性，具有较高的应用价值和较大的经济社会效益。

实用新型内容

本实用新型的目的是提供一种检测磺胺类药物的检测卡。

为实现上述目的，本实用新型的技术方案如下：本实用新型提供的检测磺胺类药物残留的检测卡，其特征在于：它包括底板、反应膜、样品垫、复合垫和吸水垫。

所述复合垫由活化垫4、放热垫5和结合物释放垫6依次连接而成；所述结合物释放垫上包被有胶体金标记的磺胺类药物-载体蛋白偶联物；

沿样品液流动方向底板1分为三个区域：加样区、反应膜设置区和吸水垫设置区；反应膜2设于所述反应膜设置区上；样品垫I(3)设于所述加样区上；所述复合垫设于所述样品垫I上，所述结合物释放垫靠近所述反应膜；所述活化垫上设有样品垫II(7)；所述吸水垫设置区上设有吸水垫8；所述反应区上设有T线9和C线10，T线包被有磺胺类药物的特异性抗体，C线包被有载体蛋白抗体。

所述T线和所述C线可互相平行且与样品液流动方向垂直。

所述T线可靠近所述结合物释放垫，所述C线可靠近所述吸水垫。

所述检测卡还可包括固定膜11。所述样品垫II和所述结合物释放垫上可覆盖有所述固定膜，固定膜上与所述样品垫II对应的区域设有样品孔12。所述吸水垫上可覆盖有所述固定膜。所述固定膜为防水材质的，用于固定检测卡的各个组件，避免样品或试剂与外界环境中的物质发生反应，影响检测卡的检测效果。

为了保证样品液流动的连续性，所述结合物释放垫和所述反应膜可设有2mm的重叠区，所述吸水垫和所述反应膜可设有5mm的重叠区。

所述复合垫与所述样品垫II重叠长度可为8mm以上，所述复合垫与所述样品垫I的重叠长度可为15mm以上。

沿样品液流动方向，所述样品垫I的长度可为16mm，所述活化垫的长度可为6mm，所述放热垫的长度可为6mm，所述结合物释放垫的长度可为6mm，所述样品垫II的长度可为8mm，所述反应膜的长度可为20mm，所述吸水垫的长度可为20mm。

所述T线距离所述结合物释放垫的垂直距离可为6mm；所述C线距离所述吸水垫的垂直距离可为6mm；所述T线和所述C线的垂直距离可为5mm。

所述反应膜、所述样品垫I、所述吸水垫可通过双面胶固定在所述底板上，在反应膜与底板之间可设有高分子材料制成的背衬膜(隔离膜)，用以阻止粘合剂中的有机溶剂对包被蛋白和包被抗体的破坏。

所述检测卡具体可为长80mm，宽5mm的条状。

活化垫主要是接收样品液体，在碱性物质与表面活性剂参与下，短时间内免疫反应更有利于进行。样品垫I控制整个过程中的液体流速，使参与反应的物质需缓慢释放，从而达到预期目的。

所述载体蛋白可为牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、卵清蛋白(OVA)、血兰蛋白(KLH)等。

所述具有磺胺母环结构的化合物的特异性抗体可为单克隆抗体或多克隆抗体。所述载体蛋白抗体可为牛血清白蛋白(BSA)多克隆抗体。

对于一个检测卡来说，具体可用15-20nm的胶体金标记具有磺胺母环结构的化合物-载体蛋白偶联物。

所述底板可由不吸水的韧性材料制成，如硬质塑料、不吸水硬纸，具体可为PVC板材。所述样品吸收垫可由玻璃纤维棉或玻璃棉制成。所述结合物释放垫可由玻璃纤维或玻璃棉制成。所述吸水垫可为厚滤纸、无纺布或其他吸水性材料。所述反应膜可为硝酸纤维素膜(NC膜)。所述保护膜可为PE材质的保护膜。

所述磺胺类药物具体可为磺胺二甲嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺甲氧哒嗪、磺胺间二甲氧嘧啶或磺胺间甲氧嘧啶。

本实用新型的检测原理：当样品溶液中含有磺胺类药物时，在扩散过程中，样品中的磺胺类药物通过竞争结合抑制了胶体金-具有磺胺母环结构的化合物-载体蛋白偶联物同T线上的具有磺胺母环结构的化合物的特异性抗体结合，T线无法显色，而C线的载体蛋白抗体可与胶体金-具有磺胺母环结构的化合物-载体蛋白偶联物中的载体蛋白特异结合，C线即显示红棕色(紫红色)印迹。当样品中不含磺胺类药物或其含量低于检测卡检测限时，胶体金-具有磺胺母环结构的化合物-载体蛋白偶联物可与T线上的具有磺胺母环结构的化合物的特异性抗体结合，T线显示红棕色(紫红色)印迹，液体渗透到C线时，C线上的抗载体蛋白抗体可与胶体金-具有磺胺母环结构的化合物-载体蛋白偶联物特异结合，C线显示红棕色(紫红色)印迹。

本实用新型的检测磺胺类药物的检测卡具有以下的特点：

(1)交叉反应广泛。在实际检测中，可以检测出以下磺胺药物。其检测药物的检测限见表1。

表1磺胺药物的检测限

药物名称	检测限μg/L(kg)	结果判定时间
			磺胺二甲嘧啶	20	10分钟
磺胺甲基嘧啶	20	10分钟

磺胺嘧啶	60	10分钟
			磺胺噻唑	60	10分钟
磺胺甲氧哒嗪	60	10分钟
			磺胺间二甲氧嘧啶	80	10分钟
磺胺间甲氧嘧啶	80	10分钟

(2)操作简便，结果显示快速。检测过程中无需其他试剂，将检测卡平放水平位置，在10分钟内即有结果显示。

(3)对样品的前处理要求低，样品前处理过程简单，能同时快速检测大批样品。

(4)结果判定简单明了。SAs检测卡以肉眼可见的红棕色检测印迹作为判定标准。一条印迹表示被检样品中含有SAs，两条印迹表示被检样品中不含SAs。

(5)制备工艺简单，成本低。

(6)应用价值高。检测卡操作简单，人人可以操作，可以判定结果阴阳性。

本实用新型具有较高的应用价值和较大的经济社会效益，将在食品和饲料中SAs的检测中发挥重要作用。

附图说明

图1为本实用新型的结构示意图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本实用新型，但并不限定本实用新型。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

如图1所示，本实用新型的检测磺胺类药物的检测卡，包括底板1、反应膜2、样品垫、复合垫和吸水垫8。所述复合垫由活化垫4、放热垫5和结合物释放垫6依次连接而成。所述结合物释放垫上包被有胶体金标记的磺胺类药物-载体蛋白偶联物。沿样品液流动方向底板1分为加样区、反应膜设置区和吸水垫设置区。反应膜2设于所述反应膜设置区上。样品垫I(3)设于所述加样区上。所述复合垫设于所述样品垫I(3)上，所述结合物释放垫6靠近所述反应膜2。活化垫4上设有样品垫II(7)。所述吸水垫设置区上设有吸水垫8。所述反应区上设有T线9和C线10，T线包被有磺胺类药物的特异性抗体，C线包被有载体蛋白抗体，T线9和C线10互相平行且与样品液流动方向垂直，T线9靠近结合物释放垫6，C线10靠近所述吸水垫8。反应膜2、样品垫I、吸水垫通过双面胶固定在底板1上，它们与底板1之间设有高分子材料制成的背衬膜(隔离膜)，用以阻止粘合剂中的有机溶剂对包被蛋白和包被抗体的破坏。沿样品液流动方向，样品垫I的长度为16mm，活化垫的长度为6mm，所放热垫的长度为6mm，结合物释放垫的长度为6mm，样品垫II的长度为8mm，反应区的长度为20mm，吸水垫的长度为20mm。所述复合垫与所述样品垫II的重叠长度为8mm，与所述样品垫1的重叠长度为15mm；所述结合物释放垫和所述反应膜设有2mm的重叠区，所述吸水垫和所述反应膜设有5mm的重叠区。T线距离样品吸收区的垂直距离为6mm，C线距离所述吸水垫设置区的垂直距离为6mm，T线和C线的垂直距离为5mm。

使用时，将磺胺类药物检测检测卡平放水平位置，用滴管滴加3-5滴待测溶液到检测卡样品端，水平放置约10分钟，观察判定结果(判定标准：阳性样品，卡中C线位置显示一条紫红色印迹；阴性样品，卡中T/C线显示两条紫红色印迹，没有紫红色印迹显示表明检测卡已经失效)。

检测卡中用到的材料均可采用常规方法制备，举例如下：

一、具有磺胺母环结构的化合物-载体蛋白偶联物

可通过戊二醛法或重氮化法将具有磺胺母环结构的化合物和载体蛋白偶联，得到具有磺胺母环结构的化合物-载体蛋白偶联物。

二、具有磺胺母环结构的化合物的特异性抗体

具有磺胺母环结构的化合物的特异性抗体可为单克隆抗体或多克隆抗体。

1、可采用如下方法制备具有磺胺母环结构的化合物的鼠单克隆抗体

(1)动物免疫程序

采用BALB/c小鼠作为免疫动物，以具有磺胺母环结构的化合物-载体蛋白为免疫原，免疫剂量为50-100μg/只。首次免疫时将免疫原与等量的弗氏完全佐剂混合制成乳化剂，颈背部皮下多点注射；间隔2周取相同剂量免疫原加等量弗氏不完全佐剂混合乳化，加强免疫一次；第四次免疫后腹腔加强免疫一次，腹腔加强免疫3天后取脾细胞。

(2)细胞融合与克隆化

步骤(1)得到的小鼠脾细胞，按(4-8)∶1比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

(3)细胞冻存和复苏

取处于对数生长期的杂交瘤细胞，用冻存液制成1×10⁶-5×10⁶个/mL的细胞悬液，分装于冻存管，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。

(4)单克隆抗体的制备与纯化

采用体内诱生法，将BALB/c小鼠(8周龄)腹腔注入灭菌石蜡油0.5ml/只，7-14天后腹腔注射步骤(3)的杂交瘤细胞5×10⁵-10⁶个/只，7-10天后采集腹水。经辛酸-饱和硫酸铵法进行腹水纯化，得到具有磺胺母环结构的化合物-载体蛋白的单克隆抗体。小瓶分装，-20℃保存。

2、可采用如下方法制备具有磺胺母环结构的化合物的兔多克隆抗体

采用新西兰大白兔作为免疫动物，以具有磺胺母环结构的化合物-载体蛋白为免疫原，免疫剂量为1mg/kg·b.w.。首次免疫时将免疫原与等量的弗氏完全佐剂混合制成乳化剂，颈背部皮下多点注射；间隔3-4周取相同剂量免疫原加等量弗氏不完全佐剂混合乳化，加强免疫一次，共免疫5次，最后一次不加佐剂。最后一次免疫7-10d后采血，测定血清抗体效价，颈动脉放血，经硫酸铵分级沉淀得到纯化的多克隆抗体。

三、载体蛋白抗体

载体蛋白抗体可为载体蛋白单克隆抗体或载体蛋白多克隆抗体。如可以BSA作为免疫抗原免疫动物，得到BSA的多克隆抗体。

四、金标蛋白

(1)用柠檬酸三钠法制备胶体金

在沸腾的100ml的1％氯金酸水溶液中加入2-4ml的0.5-5％柠檬酸三钠溶液，获得直径15-20nm的胶体金。

(2)金标蛋白的制备

用0.1mol/L的K₂CO₃调胶体金pH至8.5，测得最佳蛋白标记浓度后，将待标记的具有磺胺母环结构的化合物-载体蛋白加入胶体金溶液中，搅拌30分钟，加入1％BSA，继续搅拌15分钟，加入0.5％PEG8000，接着搅拌15分钟。4℃4000g离心15min，除去未结合的金颗粒。然后4℃12000g离心20分钟，去上清，沉淀用PBS溶解，再次离心20分钟，获得纯化的金标蛋白。

Claims (8)

1、一种检测磺胺类药物残留的检测卡，其特征在于：它包括底板、反应膜、样品垫、复合垫和吸水垫；

所述复合垫由活化垫(4)、放热垫(5)和结合物释放垫(6)依次连接而成；所述结合物释放垫上包被有胶体金标记的磺胺类药物-载体蛋白偶联物；

沿样品液流动方向底板(1)分为三个区域：加样区、反应膜设置区和吸水垫设置区；反应膜(2)设于所述反应膜设置区上；样品垫I(3)设于所述加样区上；所述复合垫设于所述样品垫I上，所述结合物释放垫靠近所述反应膜；所述活化垫上设有样品垫II(7)；所述吸水垫设置区上设有吸水垫(8)；所述反应区上设有T线(9)和C线(10)，T线包被有磺胺类药物的特异性抗体，C线包被有载体蛋白抗体。

2、如权利要求1所述的检测卡，其特征在于：所述T线和所述C线互相平行且与样品液流动方向垂直；所述T线靠近所述结合物释放垫，所述C线靠近所述吸水垫。

3、如权利要求2所述的检测卡，其特征在于：所述检测卡还包括固定膜(11)；所述样品垫II和所述结合物释放垫上覆盖有所述固定膜，固定膜上与所述样品垫II对应的区域设有样品孔(12)；所述吸水垫上覆盖有所述固定膜。

4、如权利要求3所述的检测卡，其特征在于：所述复合垫与所述样品垫II的重叠长度为8mm以上；所述复合垫与所述样品垫I的重叠长度为15mm以上；所述结合物释放垫和所述反应膜有2mm的重叠区，所述吸水垫和所述反应膜有5mm的重叠区。

5、如权利要求4所述的检测卡，其特征在于：沿样品液流动方向，所述样品垫I的长度为16mm，所述活化垫的长度为6mm，所述放热垫的长度为6mm，所述结合物释放垫的长度为6mm，所述样品垫II的长度为8mm，所述反应膜的长度为20mm，所述吸水垫的长度为20mm。

6、如权利要求5所述的检测卡，其特征在于：所述T线距离所述结合物释放垫的垂直距离为6mm；所述C线距离所述吸水垫的垂直距离为6mm；所述T线和所述C线的垂直距离为5mm。

7、如权利要求6所述的检测卡，其特征在于：所述反应膜、所述样品垫I、所述吸水垫和所述底板之间设有隔离膜。

8、如权利要求1至7中任一所述的检测卡，其特征在于：所述载体蛋白为牛血清白蛋白、人血清白蛋白、卵清蛋白或血兰蛋白。

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