CN103255109A - 杂交瘤细胞株afg1g6、其单克隆抗体及黄曲霉毒素g1免疫层析试纸条 - Google Patents

Abstract

本发明涉及杂交瘤细胞株AFG1G6、其产生的抗黄曲霉毒素G1单克隆抗体及黄曲霉毒素G1免疫层析试纸条。杂交瘤细胞株AFG1G6，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO.C201021。其分泌产生的抗黄曲霉毒素G1单克隆抗体灵敏度高、特异性好，对黄曲霉毒素G1的50％抑制浓度IC₅₀为1.8ng/mL，与黄曲霉毒素G2交叉反应率为7.6％，与黄曲霉毒素B1和黄曲霉毒素B2的交叉反应率均小于2％。由其获得的黄曲霉毒素G1免疫层析试纸条，用于黄曲霉毒素G1含量的测定，操作简单，灵敏度高，对检测溶液中黄曲霉毒素G1含量的最低检测限可达1ng/mL。

Description

杂交瘤细胞株AFG1G6、其单克隆抗体及黄曲霉毒素G1免疫层析试纸条

技术领域

本发明涉及杂交瘤细胞株AFG1G6、其产生的抗黄曲霉毒素G1单克隆抗体及黄曲霉毒素G1免疫层析试纸条。 

背景技术

黄曲霉毒素主要是由黄曲霉和寄生曲霉分泌产生的次生代谢产物，是能引起人畜各种损害的天然有毒化合物。黄曲霉毒素目前已发现20余种，其中黄曲霉毒素G1(AFG1)的毒性极强，强于氰化钾和砒霜。历史上发生过很多AFG1污染食物链引发的人类中毒事件。另外，AFG1还能污染多种原料，包括水果、干果、蔬菜、调味品、油料作物、烟草及中草药等，由此可见：AFG1对食物链的污染极其广泛，几乎在食物链的每个环节都能发现存在。除此，在热带和亚热带地区农产品和食品中AFG1的检出率更高，污染更严重，花生、玉米和花生油等粮油食品污染最为严重，同时，AFG1超标而导致的农产品国际贸易纠纷事件也时常发生，1999年、2000年、2001年我国出口欧盟的花生到岸后，40％以上被欧盟检出黄曲霉毒素总量和AFG1分量超标，遭到退货或被迫转口贸易，致使我国农产品进出口贸易蒙受巨大损失，影响了我国农产品国际市场声誉。因此，加强花生等农产品及制品中AFG1的检测、特别是速测，及时了解和掌握农产品中AFG1的污染情况对保障我国食品消费安全具有重要意义。 

现有的黄曲霉毒素检测方法主要包括薄层层析法、精密仪器分析法和免疫学分析法。其中薄层层析法是黄曲霉毒素检测最常用的检测方法，该方法不需要特殊的仪器设备，一般实验室都可开展，但存在试剂消耗量大、操作繁琐、结果易受干扰、准确性差，不能准确定量，且对实验人员和周围环境污染危害较大等不足，不适于现场快速检测。精密仪器分析法包括荧光分光光度法和高效液相色谱法等，这些方法灵敏度高，检测结果准确，但所需的仪器设备昂贵，样品前处理过程繁琐，要求黄曲霉毒素样品纯化程度高，检测过程耗时，对实验环境要求高，难以实现快速检测。近年来发展起来的用于黄曲霉毒素检测的免疫分析技术克服了前两者的一些缺点，具有特异性强、灵敏度高、样品前处理简单、检测成本低、对实验人员和周围环境的污染危害小等优点，适于现场批量检测等。免疫分析是利用抗原和抗体的特异性结合反应和抗体、抗原上的标记物的生物、物理或化学放大作用来对超微量残留物进行定性、定量检测，所以要研究建立针对黄曲霉毒素G1的任何一种免疫学检测技 术，都必须先获得高质量的抗黄曲霉毒素G1抗体。 

发明内容

本发明所要解决的问题是提供杂交瘤细胞株AFG1G6、其产生的抗黄曲霉毒素G1单克隆抗体及黄曲霉毒素G1免疫层析试纸条。 

本发明提供了杂交瘤细胞株AFG1G6，该细胞株已于2010年7月13日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是，中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO.C201021。其具有序列表中SEQ ID NO.1所示的抗黄曲霉毒素G1单克隆抗体重链可变区编码基因序列和序列表中SEQ ID NO.2所示的抗黄曲霉毒素G1单克隆抗体轻链可变区编码基因序列。 

抗黄曲霉毒素G1单克隆抗体，它由保藏编号为CCTCC NO.C201021的杂交瘤细胞株AFG1G6分泌产生。其重链可变区具有序列表中SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列；轻链可变区具有序列表中SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。该抗黄曲霉毒素G1单克隆抗体可以识别黄曲霉毒素G1，对黄曲霉毒素G1的50％抑制浓度IC₅₀为1.8ng/mL。 

抗黄曲霉毒素G1单克隆抗体在黄曲霉毒素G1含量测定中的应用。 

本发明提供的杂交瘤细胞株AFG1G6是采用两步筛选法获得的，其具体筛选过程为：将黄曲霉毒素G1在H₂SO₄作用下转化为其半缩醛形式AFG_2a，然后与BSA氨基发生醛胺缩合反应，在NaBH₄还原作用下C＝N被还原为C-N，生成AFG_2a-BSA复合物完全抗原，然后用其免疫BALB/c小鼠4-6次，最后一次加强免疫用2倍于前一次免疫剂量的AFG_2a-BSA，免疫3天后进行细胞融合，然后采用ELISA方法分两步筛选融合细胞：第一步采用间接ELISA法筛选出仅能抗黄曲霉毒素G1而不抗载体蛋白BSA的阳性克隆；第二步采用间接竞争ELISA法对第一步筛选出的阳性克隆培养液进行检测，采用AFG1作为竞争原，选择吸光值低、灵敏度较高的阳性克隆，采用有限稀释法进行克隆，克隆后10天左右采用同样的两步筛选法进行抗体检测，如此重复克隆2-3次后，最终筛选获得杂交瘤细胞株AFG1G6。 

本发明提供的抗黄曲霉毒素G1单克隆抗体的制备方法，步骤如下：将上述获得的杂交瘤细胞株AFG1G6注射预先用福氏不完全佐剂处理过的BALB/c小鼠，收集该小鼠的腹水，纯化处理后获得抗黄曲霉毒素G1单克隆抗体。 

按上述方案，所述的纯化方法为辛酸-硫酸铵法，具体操作为：用双层滤纸过滤小鼠腹水，过滤后的腹水于4℃，12000r/min离心15min以上，吸取上清，将上清与4倍体积的醋酸盐缓冲液混合，边搅拌边缓慢加入正辛酸，每毫升腹水所需的正辛酸体积为30～35μ L，室温混合30～60min，4℃静置2h以上，然后4℃，12000r/min离心30min以上，弃沉淀，将得到的上清液用双层滤纸过滤后，加入1/10滤液体积的摩尔浓度为0.1mol/L、pH为7.4的磷酸盐缓冲液，用2mol/L的氢氧化钠溶液调节该混合液的pH至7.4，4℃预冷，缓慢加入硫酸铵至硫酸铵终浓度为0.277g/mL，4℃静置2h以上，然后4℃，12000r/min离心30min以上，弃上清，将所得沉淀用原腹水体积1/10的0.01mol/L、pH为7.4的磷酸盐缓冲液重悬，装入透析袋，用纯水透析，将充分透析好的蛋白溶液置-70℃冰箱冷冻，然后用冷冻真空干燥机冻干，收集冻干粉，即得纯化好的抗黄曲霉毒素G1单克隆抗体，将抗体置-20℃冰箱中备用； 

醋酸盐缓冲液：0.29g醋酸钠加入0.141mL醋酸，纯水定容至100mL； 

0.01mol/L磷酸盐缓冲液：0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，磷酸二氢钾0.02g，加水定容至100mL； 

0.1mol/L的磷酸盐缓冲液：8g氯化钠，2.9g十二水磷酸氢二钠，0.2g氯化钾，磷酸二氢钾0.2g，加水定容到100mL所得。 

黄曲霉毒素G1免疫层析试纸条，它包括纸板，纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫、金标垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，所述检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜上自上而下设置横向质控线和检测线，所述检测线包被有黄曲霉毒素人工合成完全抗原AFG_2a-BSA，所述的黄曲霉毒素人工合成完全抗原AFG_2a-BSA是将黄曲霉毒素G1在H₂SO₄作用下转化为其半缩醛形式AFG_2a，然后与BSA氨基发生醛胺缩合反应，再在NaBH₄还原作用下C＝N被还原为C-N得到的，所述质控线包被有兔抗鼠多克隆抗体；所述金标垫横向喷涂有纳米金标记的抗黄曲霉毒素G1单克隆抗体，所述抗黄曲霉毒素G1单克隆抗体是由权利要求1所述的杂交瘤细胞株AFG1G6分泌产生的。 

按上述方案，所述的吸水垫长16～18mm，宽2～4mm；检测垫长25～30mm，宽2～4mm；金标垫长6～9mm，宽2～4mm；样品垫长12～18mm，宽2～4mm，相邻各垫的交叠长度为1～3mm。 

按上述方案，所述的吸水垫为吸水纸。 

按上述方案，所述检测垫上的检测线与硝酸纤维素膜上沿的间距为15～20mm，质控线和检测线的间距为5～10mm。 

按上述方案，所述检测垫上每厘米检测线所需的黄曲霉毒素人工合成完全抗原AFG_2a-BSA的包被量为50-150ng；每厘米质控线所需的兔抗鼠多克隆抗体的包被量为100-300ng。 

按上述方案，所述金标垫中所用的纳米金的粒径为15～20nm；所述金标垫上每厘米喷涂长度所需的纳米金标记的抗黄曲霉毒素G1单克隆抗体的用量为200-400ng。 

如上所述的黄曲霉毒素G1免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于：它包括以下步骤： 

(1)吸水垫的制备 

将吸水纸剪裁即得吸水垫； 

(2)检测垫的制备 

检测线的包被： 

将黄曲霉毒素人工合成完全抗原AFG_2a-BSA用包被缓冲液配制成0.2-0.6mg/mL的包被液，于距硝酸纤维素膜上沿15-20mm的位置，用点喷方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上，得到检测线，每厘米检测线所需黄曲霉毒素人工合成完全抗原完全抗原AFG_2a-BSA的包被量为50-150ng，然后37～40℃条件下干燥8～20分钟； 

质控线的包被： 

将兔抗鼠多克隆抗体用包被缓冲液配成0.2-0.5mg/mL的包被液，于距检测线5-10mm的位置，用点喷方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上，得质控线，每厘米质控线所需的兔抗鼠多克隆抗体的包被量为100-300ng，然后于37～40℃条件下干燥8～20分钟； 

(3)样品垫的制备： 

将玻璃纤维膜放入封闭液中浸湿，取出，于37-40℃条件下干燥6-10小时，得样品垫，然后置干燥器中室温保存； 

(4)金标垫的制备： 

将玻璃纤维膜放入封闭液中浸湿，取出，于37-40℃条件下干燥10-16小时，于干燥好的玻璃纤维膜上，用点喷方式将纳米金标记的抗黄曲霉毒素G1单克隆抗体溶液横向喷涂，每厘米喷涂长度所需纳米金标记的抗黄曲霉毒素G1单克隆抗体为200-400ng，然后真空冷冻干燥2-6h，置干燥器中室温保存； 

(5)试纸条的组装：在纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫、金标垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，交叠长度为1-3mm，即得黄曲霉毒素G1免疫层析试纸条。 

按上述方案，所述步骤(2)中的包被缓冲液为：每100mL中含有牛血清白蛋白1g，氯化钠0.8g，十二水磷酸氢二钠0.29g，氯化钾0.02g，磷酸二氢钾0.02g； 

所述步骤(3)中使用的封闭液为：每100mL含有牛血清白蛋白2g，蔗糖2.5g，叠氮化钠0.02g，氯化钠0.8g，十二水磷酸氢二钠0.29g，氯化钾0.02g，磷酸二氢钾0.02g； 

所述步骤(4)中使用的封闭液为：每100mL含有2g牛血清白蛋白，0.1mL曲拉通X-100，0.3g聚乙烯吡咯烷酮，2.5g蔗糖，0.02g叠氮化钠，0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，0.02g磷酸二氢钾。 

按上述方案，所述纳米金标记的抗黄曲霉毒素G1单克隆抗体溶液的具体标记方法为：量取50.0mL质量浓度为0.01％的纳米金溶液，用0.1mol/L碳酸钾水溶液调节溶液pH值为8.2；在搅拌的状态下缓慢加入3mL0.1mg/mL的抗黄曲霉毒素G1单克隆抗体水溶液，继续搅拌30min；加入质量浓度为10％牛血清白蛋白水溶液至牛血清白蛋白的终质量浓度为1％，继续搅拌30min；于4℃放置2h后，1500r/min离心15min，取上清液，弃沉淀；将上清液12000r/min离心30min，弃去上清液，加入50.0mL标记洗涤保存液；再以12000r/min离心30min，弃去上清液，将沉淀用标记洗涤保存液重悬，得到5.0mL浓缩物，置4℃冰箱备用； 

所述0.1mol/L碳酸钾水溶液为：13.8g碳酸钾溶于纯水定容至1000mL，0.22μm滤膜过滤所得；所述0.1mg/mL抗黄曲霉毒素G1单克隆抗体水溶液为1mg抗黄曲霉毒素G1单克隆抗体溶解在10mL纯水中制成；所述10％牛血清白蛋白水溶液为10g牛血清白蛋白溶解在100mL纯水中，0.22μm滤膜过滤所得；所述标记洗涤保存液为：2.0g聚乙二醇-20000，0.2g叠氮钠，0.1235克硼酸，纯水定容至1000mL，0.22μm滤膜过滤所得。 

如上述所述的黄曲霉毒素G1免疫层析试纸条的应用，其方法如下：称取已磨细待测样品，加入体积浓度为60～80％的甲醇水溶液，混匀，在50～60℃水浴下超声提取5～10分钟，静置5～10分钟，将上层清液即提取液用水稀释，使稀释液中甲醇的终体积浓度为20～30％，得到待测样品溶液，再取80-150μL该待测样品溶液作为检测液逐滴加入到黄曲霉毒素G1免疫层析试纸条的样品垫上进行检测，其作为检测试纸条，另取等体积的甲醇浓度一致的甲醇水溶液做为阴性对照液，逐滴加入另一黄曲霉毒素G1免疫层析试纸条的样品垫上，其作为对照试纸条，15-20分钟后将检测试纸条和对照试纸条进行显色对照，获得检测结果： 

(1)阳性：当检测试纸条的质控线显示出红色线条，而检测线不显色时，表明待测样品溶液中黄曲霉毒素G1的含量等于或高于10ng/mL；当检测试纸条的质控线显示出红色线条，检测线颜色比对照试纸条检测线颜色浅时，表明待测样品溶液中黄曲霉毒素G1的含量等于或高于1ng/mL，并低于10ng/mL；(2)阴性：当检测试纸条的质控线显示出红色线条，并且检测线颜色与对照试纸条检测线颜色接近时，判为阴性结果，表明待测样品中的黄曲霉毒素G1含量低于1ng/mL；(3)无效：当质控线不显色时，无论检测试纸条的检测线显示或不 显示红色线条，该试纸条判为无效。 

本发明的有益效果： 

(1)本发明提供的杂交瘤细胞株AFG1G6可以用于制备高效价抗黄曲霉毒素G1单克隆抗体，抗黄曲霉毒素G1小鼠腹水抗体酶联免疫吸附分析(ELISA)法测得的效价可达7.10×10⁶。 

(2)本发明提供的抗黄曲霉毒素G1单克隆抗体灵敏度高、特异性好，对黄曲霉毒素G1的50％抑制浓度IC₅₀为1.8ng/mL，与黄曲霉毒素G2交叉反应率为7.6％，与黄曲霉毒素B1和黄曲霉毒素B2的交叉反应率均小于2％。 

(3)本发明提供的抗黄曲霉毒素G1单克隆抗体制备的黄曲霉毒素G1免疫层析试纸条用于黄曲霉毒素G1含量的测定，操作简单，灵敏度高，其对检测溶液中黄曲霉毒素G1含量的最低检测限可达到1ng/mL。 

附图说明

图1为本发明实施例4的黄曲霉毒素G1免疫层析试纸条的正视图； 

图2为本发明实施例4的黄曲霉毒素G1免疫层析试纸条的侧视图； 

图3为应用本发明实施例4提供的黄曲霉毒素G1免疫层析试纸条检测样品的结果判定图； 

图中：1纸板；2吸水垫；3检测垫；4金标垫；5样品垫；6质控线；7检测线；8对照试纸条；9检测试纸条。 

具体实施方式

实施例1：杂交瘤细胞株AFG1G6的筛选 

1.抗原合成及动物免疫 

购买市售黄曲霉毒素G1标准品进行完全抗原合成，具体合成步骤如下：将4mg AFG1溶于2mL丙酮，加入40μL10％H₂SO₄，混合物在56℃搅拌反应4h；产物蒸干后，加入5mL的H₂O，用25mL氯仿提取两次，然后用20mL H₂O洗涤有机层，保留有机层；蒸去有机溶剂，得黄色固体产物。取1.1mg产物，向其中加入2mL0.5％BSA溶液(4mL PBS(磷酸盐缓冲液，pH7.4)溶解20mg BSA)37℃反应30min；加入100μL6.5mM NaBH₄，4℃反应30min；加入50μL0.1mol/L HCl，除去过量的NaBH₄。在4℃条件下，PBS溶液(磷酸盐缓冲液，pH7.4)透析3d，除去AFG1及AFG_2a，最后进行常规紫外扫描法鉴定，鉴定结果表明制备得到了黄曲霉毒素G1完全抗原AFG_2a-BSA。 

购买6周龄雌性BALB/c小鼠6只，免疫自行合成的黄曲霉毒素G1完全抗原AFG_2a-BSA。第一次免疫将完全抗原AFG_2a-BSA与等体积福氏完全佐剂混合乳化，然后小鼠颈背部皮下多点注射。第二次免疫于首免4周后进行，采用福氏不完全佐剂与等体积完全抗原 AFG_2a-BSA乳化，小鼠腹腔注射。第三次免疫与第二次免疫间隔时间4周，免疫方式及剂量与第二次相同，第四次免疫于第三次免疫3周后进行，免疫方式及免疫剂量与第二次免疫相同，每次免疫剂量为每鼠50μg。前3次每次免疫后一周，尾静脉采血，分离血清，采用间接ELISA法监测小鼠血清抗体效价。第4次免疫后一周，尾静脉采血，分离血清，采用间接ELISA法监测小鼠血清抗体效价，并用间接竞争ELISA法测定小鼠血清灵敏度，选择效价、灵敏度均相对较高的血清对应的小鼠进行最后一次加强免疫，免疫剂量为之前的2倍。AFG1购于Sigma-Aldrich公司。 

2.细胞融合 

最后一次加强免疫3天后，采用50％(重量百分数)的聚乙二醇即PEG(分子量为1450)作融合剂，按常规方法进行细胞融合，具体步骤如下：颈椎脱臼法处死免疫小鼠，在无菌条件下取脾脏，分离脾细胞，与鼠源骨髓瘤细胞SP2/0以5∶1的个数比混合，用RPMI-1640基础培养液洗混合细胞，然后用50％PEG融合，融合时间1分钟，然后加满RPMI-1640基础培养液，离心，移去上清，小鼠脾细胞和鼠源骨髓瘤细胞SP2/0形成的融合细胞用72mLRPMI-1640基础培养液重悬，将重悬起来的细胞滴加到96孔细胞培养板内，2滴/孔，置37℃二氧化碳培养箱培养，所述的RPMI-1640基础培养液为含有20％(体积百分数)胎牛血清，2％(重量百分数)，生长因子(HFCS)和1％(重量百分数)次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶核苷。上述SP2/0购于上海泛柯生物科技有限公司；RPMI-1640基础培养液购于Hyclone公司；1％次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶核苷(HAT)购于Sigma-Aldrich公司。 

3.细胞株的筛选及克隆 

待细胞融合后第12天左右，细胞集落长到占孔底1/2面积大小，培养液变黄，即可进行抗体检测。采用ELISA方法对有杂交瘤细胞生长的培养孔进行筛选，筛选分两步进行，第一步采用间接ELISA法筛选出抗黄曲霉毒素G1而不抗载体蛋白BSA的阳性孔；第二步采用间接竞争ELISA法对第一步筛选出的阳性孔进行检测，用黄曲霉毒素G1作为竞争原，选择吸光值和灵敏度均较高的孔(吸光值较高指竞争原为0的孔即阴性对照孔的最终测定值较高，灵敏度较高指抑制率为50％时的竞争原浓度亦即IC₅₀值较小)，采用有限稀释法进行克隆，克隆后10天左右采用同样的两步法进行检测，如此重复克隆2-3次后，获得杂交瘤细胞株AFG1G6。 

实施例2：抗黄曲霉毒素G1单克隆抗体杂交瘤细胞株AFG1G6抗体可变区序列测定(1)提取总RNA：采用天根公司的总RNA提取试剂盒并按照说明书提取可产生杂交瘤细胞株AFG1G6的总RNA； 

(2)合成cDNA：以步骤1获得的总RNA为模板，oligo(dT)₁₅为引物，按照SuperScript^TM-2II反转录酶说明书进行反转录，合成cDNA第一链；引物oligo(dT)₁₅由Invitrogen购得； 

(3)PCR法克隆可变区基因：根据GENEBANK中小鼠抗体基因序列的保守位点设计引物，以cDNA为模版扩增抗体轻、重链可变区基因。PCR程序为：94℃30s、55℃1min、72℃1min，扩增30个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物经过1％(重量百分数)的琼脂糖凝胶电泳分离后，用试剂盒纯化回收DNA片段，连接到载体pMD18-T中，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆，送至上海桑尼生物科技有限公司进行测序。其中引物的序列分别为：重链可变区引物为5’-AGG TSM ARC TGC AGS AGT CWG G-3’(22mer)和5’-TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGT CCC TTG GCC CC-3’(32mer)其中S、M、R和W为兼并碱基，M＝A/C，R＝A/G，S＝C/G，W＝A/T，轻链可变区引物为5’-GAC ATT GAG CTC ACC CAG CTT GGT GCC-3’(24mer)和5’-CCG TTT CAG CTC CAG CTT GGT CCC-3’(24mer)。 

得到的基因序列结果：重链可变区编码基因序列长347bp，序列如SEQ ID NO：1所示，根据所获得的基因序列推导出该基因序列所编码的重链可变区由115个氨基酸组成，序列如SEQ ID NO：3所示。轻链可变区编码基因序列长338bp，序列如SEQ ID NO：2所示，根据所获得的基因序列推导出该基因序列所编码的轻链可变区由110个氨基酸组成，序列如SEQ IDNO：4所示。 

实施例3：抗黄曲霉毒素G1单克隆抗体的制备纯化、亚型和特性鉴定 

将实施例2获得的抗黄曲霉毒素G1单克隆抗体杂交瘤细胞株AFG1G6注射预先用福氏不完全佐剂处理过的BALB/c小鼠，收集该小鼠的腹水，采用辛酸-硫酸铵法纯化抗体，具体操作步骤为：用双层滤纸过滤小鼠腹水，4℃，12000r/min离心15min，吸取上清，将所得腹水上清与4倍体积的醋酸盐缓冲液混合，搅拌下缓慢加入正辛酸，每毫升腹水所需的正辛酸体积为33μL，室温混合30min，4℃静置2h，然后4℃，12000r/min离心30min，弃沉淀，将得到的上清液用双层滤纸过滤后，加入1/10滤液体积的摩尔浓度为0.1mol/L和pH值为7.4的磷酸盐缓冲液，用2mol/L的氢氧化钠溶液调节该混合液的pH值至7.4，4℃预冷，缓慢加入硫酸铵至硫酸铵终浓度为0.277g/mL，4℃静置2h，然后4℃，12000r/min离心30min，弃上清，将所得沉淀用原腹水体积1/10的0.01mol/L、pH为7.4的磷酸盐缓冲液重悬，装入透析袋，对纯水透析，将充分透析好的蛋白溶液置-70℃冰箱冷冻，之后用冷冻干燥机冻干，收集冻干粉，即得纯化好的抗黄曲霉毒素G1单克隆抗体，将抗体置-20℃冰箱中 备用； 

所述的醋酸盐缓冲液为0.29g醋酸钠，0.141mL醋酸加水定容至100mL所得；所述的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液为0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，磷酸二氢钾0.02g，加水定容至100mL所得；所述0.1mol/L的磷酸盐缓冲液为8g氯化钠，2.9g十二水磷酸氢二钠，0.2g氯化钾，磷酸二氢钾0.2g，加水定容到100mL所得。 

用市售亚型鉴定试剂盒鉴定杂交瘤细胞株AFG1G6分泌的抗黄曲霉毒素G1单克隆抗体的亚型为IgG_2a。 

用常规非竞争酶联免疫吸附分析(ELISA)法测得AFG1G6的鼠腹水抗体效价可达7.1×10⁶，即鼠腹水抗体稀释7.1×10⁶倍时的溶液测定结果为阳性。用常规间接竞争ELISA法鉴定其对黄曲霉毒素G1的灵敏度为1.8ng/mL，与黄曲霉毒素B1和黄曲霉毒素B2交叉反应率小于2％，与黄曲霉毒素G2的交叉反应率均小于7.6％；可应用于测定黄曲霉毒素G1含量。 

实施例4黄曲霉毒素G1免疫层析试纸条及其应用 

黄曲霉毒素G1免疫层析试纸条的制备方法，包括以下步骤： 

(1)吸水垫的制备 

将吸水纸剪裁成长16mm宽3mm的规格，即得吸水垫； 

(2)检测垫的制备 

检测线的包被： 

将黄曲霉毒素人工合成完全抗原AFG_2a-BSA用包被缓冲液配成0.4mg/mL的包被液；于距硝酸纤维素膜上沿15mm的位置，用点喷方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上，得到检测线，每厘米检测线所需完全抗原AFG_2a-BSA的包被量为75ng，然后于37℃条件下干燥15分钟； 

质控线的包被： 

将兔抗鼠多克隆抗体用包被缓冲液配成0.4mg/mL的包被液；于距检测线5mm的位置，用点喷方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上，得质控线，每厘米质控线所需的兔抗鼠多克隆抗体的包被量为200ng，然后于37℃条件下干燥15分钟； 

所述的包被缓冲液为1g牛血清白蛋白，0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，0.02g磷酸二氢钾，加水定容至100mL所得； 

所述的硝酸纤维素膜长25mm，宽3mm； 

(3)样品垫的制备： 

将玻璃纤维膜剪裁成长13mm宽3mm的规格，放入封闭液A中浸湿，取出，于37℃条件下干燥6小时，得样品垫，然后置干燥器中室温保存； 

所述的封闭液A为2g牛血清白蛋白，2.5g蔗糖，0.02g叠氮化钠，0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，0.02g磷酸二氢钾，加水定容至100mL所得； 

(4)金标垫的制备： 

将玻璃纤维膜剪裁成长9mm宽3mm的规格，放入封闭液B中浸湿，取出，于37℃条件下干燥16小时，于干燥好的玻璃纤维膜上，用点喷方式将纳米金标记的抗黄曲霉毒素G1单克隆抗体溶液横向喷涂，每厘米喷涂长度所需纳米金标记的抗黄曲霉毒素G1单克隆抗体为360ng，然后真空冷冻干燥6h，置干燥器中室温保存； 

所述的封闭液B为2g牛血清白蛋白，0.1mL曲拉通X-100，0.3g聚乙烯吡咯烷酮，2.5g蔗糖，0.02g叠氮化钠，0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，0.02g磷酸二氢钾，加水定容至100mL所得； 

所述纳米金标记的抗黄曲霉毒素G1单克隆抗体溶液的具体标记方法为：量取50.0mL质量浓度为0.01％的纳米金溶液，用0.1mol/L碳酸钾水溶液调节溶液pH值为8.2；在搅拌的状态下缓慢加入3mL0.1mg/mL的抗黄曲霉毒素G1单克隆抗体水溶液，继续搅拌30min；加入质量浓度为10％牛血清白蛋白水溶液至牛血清白蛋白的终质量浓度为1％，继续搅拌30min；于4℃放置2h后，1500r/min离心15min，取上清液，弃沉淀；将上清液12000r/min离心30min，弃去上清液，加入50.0mL标记洗涤保存液；再以12000r/min离心30min，弃去上清液，将沉淀用标记洗涤保存液重悬，得到5.0mL浓缩物，置4℃冰箱备用，其中纳米金标记的抗黄曲霉毒素G1单克隆抗体溶液的质量浓度为0.06mg/mL； 

所述纳米金溶液中纳米金的粒径为15nm； 

所述0.1mol/L碳酸钾水溶液为：13.8g碳酸钾溶于纯水定容至1000mL，0.22μm滤膜过滤所得；所述0.1mg/mL抗黄曲霉毒素G1单克隆抗体水溶液为1mg抗黄曲霉毒素G1单克隆抗体溶解在10mL纯水中制成；所述10％牛血清白蛋白水溶液为10g牛血清白蛋白溶解在100mL纯水中，0.22μm滤膜过滤所得；所述标记洗涤保存液为：2.0g聚乙二醇-20000，0.2g叠氮钠，0.1235克硼酸，纯水定容至1000mL，0.22μm滤膜过滤所得； 

(5)试纸条的组装：在纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫、金标垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，交叠长度为1mm，即得黄曲霉毒素G1免疫层析试纸条，见图1和图2。 

上述黄曲霉毒素G1免疫层析试纸条的应用： 

称取已磨细1#和2#待测花生样品，加入体积浓度为70％的甲醇水溶液，待测样品和甲醇水溶液的质量体积比为3g/mL，混匀，在50℃水浴下超声提取10分钟，静置10分钟，将上层清液即提取液用水稀释3倍，使稀释液中甲醇的终体积浓度为23.3％，得到样品溶液，再取100μL稀释好的样品溶液做为检测液逐滴加入一同步检测黄曲霉毒素和玉米赤霉烯酮混合污染的免疫层析试纸条的样品垫，其作为检测试纸条，同时取100μL甲醇浓度为23.3％的甲醇水溶液做为阴性对照液，逐滴加入另一同步检测黄曲霉毒素和玉米赤霉烯酮混合污染的免疫层析试纸条的样品垫，其作为对照试纸条，15分钟后读取结果： 

1#样品检测试纸条的质控线显示出红色线条，而检测线不显色，见图3-1，由此判定：待测样品溶液中黄曲霉毒素G1的含量高于或等于10ng/mL，经换算得：1#待测样品中黄曲霉毒素G1的含量高于或等于90ng/g；2#样品检测试纸条的质控线显示出红色线条，而检测线颜色比对照试纸条检测线颜色浅，见图3-2，由此判断：待测样品溶液中黄曲霉毒素G1的含量高于或等于1ng/mL，并小于10ng/mL，经换算得：2#待测花生样品中黄曲霉毒素G1的含量高于或等于9ng/g，并小于90ng/g。 

实施例5黄曲霉毒素G1免疫层析试纸条及其应用 

黄曲霉毒素G1免疫层析试纸条的制备方法，包括以下步骤： 

(1)吸水垫的制备 

将吸水纸剪裁成长16mm宽3mm的规格，即得吸水垫； 

(2)检测垫的制备 

检测线的包被： 

将黄曲霉毒素人工合成完全抗原AFG_2a-BSA用包被缓冲液配成0.2mg/mL的包被液A；于距硝酸纤维素膜上沿18mm的位置，用点喷方式将包被液A横向包被于硝酸纤维素膜上，得到检测线，每厘米检测线所需完全抗原AFG_2a-BSA的包被量为150ng，然后于40℃条件下干燥8分钟； 

质控线的包被： 

将兔抗鼠多克隆抗体用包被缓冲液配成0.2mg/mL的包被液B；于距检测线10mm的位置，用点喷方式将包被液横向包被于硝酸纤维素膜上，得质控线，每厘米质控线所需的兔抗鼠多克隆抗体的包被量为100ng，然后于40℃条件下干燥6分钟； 

所述的包被缓冲液为1g牛血清白蛋白，0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，0.02g磷酸二氢钾，加水定容至100mL所得； 

所述的硝酸纤维素膜长28mm，宽3mm； 

(3)样品垫的制备： 

将玻璃纤维膜剪裁成长13mm宽3mm的规格，放入封闭液A中浸湿，取出，于37℃条件下干燥6小时，得样品垫，然后置干燥器中室温保存； 

所述的封闭液A为2g牛血清白蛋白，2.5g蔗糖，0.02g叠氮化钠，0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，0.02g磷酸二氢钾，加水定容至100mL所得； 

(4)金标垫的制备： 

将玻璃纤维膜剪裁成长9mm宽3mm的规格，放入封闭液B中浸湿，取出，于37℃条件下干燥16小时，于干燥好的玻璃纤维膜上，用点喷方式将纳米金标记的抗黄曲霉毒素G1单克隆抗体溶液横向喷涂，每厘米喷涂长度所需纳米金标记的抗黄曲霉毒素G1单克隆抗体为200ng，然后真空冷冻干燥6h，置干燥器中室温保存； 

所述的封闭液B为2g牛血清白蛋白，0.1mL曲拉通X-100，0.3g聚乙烯吡咯烷酮，2.5g蔗糖，0.02g叠氮化钠，0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，0.02g磷酸二氢钾，加水定容至100mL所得； 

所述纳米金标记的抗黄曲霉毒素G1单克隆抗体溶液的具体标记方法同实施例3，其中 

所述纳米金溶液中纳米金的粒径为20nm； 

(5)试纸条的组装：在纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫、金标垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，交叠长度为2mm，即得黄曲霉毒素G1免疫层析试纸条。 

上述黄曲霉毒素G1免疫层析试纸条的应用： 

称取已磨细待测花生样品，加入体积浓度为60％的甲醇水溶液，待测样品和甲醇水溶液的质量体积比为3g/mL，混匀，在50℃水浴下超声提取10分钟，静置10分钟，将上层清液即提取液用水稀释3倍，使稀释液中甲醇的终体积浓度为20％，得到样品溶液，再取100μL稀释好的样品溶液做为检测液逐滴加入一黄曲霉毒素G1免疫层析试纸条的样品垫，其作为检测试纸条，同时取100μL甲醇浓度为20％的甲醇水溶液做为阴性对照液，逐滴加入另一黄曲霉毒素G1免疫层析试纸条的样品垫，其作为对照试纸条，20分钟后读取结果，结果如下：检测试纸条的质控线显示出红色线条，检测线的颜色与对照试纸条检测线颜色接近，由此判定：待测样品溶液中黄曲霉毒素G1低于1ng/mL，即待测样品中黄曲霉毒素G1的含量低于9ng/g。 

Claims (10)

1.杂交瘤细胞株AFG1G6，其特征在于：它保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO.C201021。

2.抗黄曲霉毒素G1单克隆抗体，其特征在于：它由保藏编号为CCTCC NO.C201021的杂交瘤细胞株AFG1G6分泌产生。

3.权利要求2所述的抗黄曲霉毒素G1单克隆抗体在黄曲霉毒素G1含量测定中的应用。

4.黄曲霉毒素G1免疫层析试纸条，其特征在于：它包括纸板，纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫、金标垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，所述检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜上自上而下设置横向质控线和检测线，所述检测线包被有黄曲霉毒素人工合成完全抗原AFG_2a-BSA，所述的黄曲霉毒素人工合成完全抗原AFG_2a-BSA是将黄曲霉毒素G1在H₂SO₄作用下转化为其半缩醛形式AFG_2a，然后与BSA氨基发生醛胺缩合反应，再在NaBH₄还原作用下C＝N被还原为C-N得到的，所述质控线包被有兔抗鼠多克隆抗体；所述金标垫横向喷涂有纳米金标记的抗黄曲霉毒素G1单克隆抗体，所述抗黄曲霉毒素G1单克隆抗体是由权利要求1所述的杂交瘤细胞株AFG1G6分泌产生的。

5.根据权利要求4所述的黄曲霉毒素G1免疫层析试纸条，其特征在于：所述的吸水垫长16～18mm，宽2～4mm；检测垫长25～30mm，宽2～4mm；金标垫长6～9mm，宽2～4mm；样品垫长12～18mm，宽2～4mm，相邻各垫的交叠长度为1～3mm。

6.根据权利要求4或5所述的黄曲霉毒素G1免疫层析试纸条，其特征在于：按上述方案，所述检测垫上的检测线与硝酸纤维素膜上沿的间距为15～20mm，质控线和检测线的间距为5～10mm。

7.根据权利要求4或5所述的黄曲霉毒素G1免疫层析试纸条，其特征在于：所述检测垫上每厘米检测线所需的黄曲霉毒素人工合成完全抗原AFG_2a-BSA的包被量为50-150ng；每厘米质控线所需的兔抗鼠多克隆抗体的包被量为100-300ng；所述金标垫中所用的纳米金的粒径为15～20nm；所述金标垫上每厘米喷涂长度所需的纳米金标记的抗黄曲霉毒素G1单克隆抗体的用量为200～400ng。

8.黄曲霉毒素G1免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于：它包括以下步骤：

(1)吸水垫的制备

将吸水纸剪裁即得吸水垫；

(2)检测垫的制备

检测线的包被：

将黄曲霉毒素人工合成完全抗原AFG_2a-BSA配制成0.2-0.6mg/mL的包被液，于距硝酸纤维素膜上沿15-20mm的位置，用点喷方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上，得到检测线，每厘米检测线所需黄曲霉毒素人工合成完全抗原完全抗原AFG_2a-BSA的包被量为50-150ng，然后37～40℃条件下干燥8～20分钟；

质控线的包被：

将兔抗鼠多克隆抗体配成0.2-0.5mg/mL的包被液，于距检测线5-10mm的位置，用点喷方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上，得质控线，每厘米质控线所需的兔抗鼠多克隆抗体的包被量为100-300ng，然后于37～40℃条件下干燥8～20分钟；

(3)样品垫的制备：

将玻璃纤维膜放入封闭液中浸湿，取出，于37-40℃条件下干燥6-10小时，得样品垫，然后置干燥器中室温保存；

(4)金标垫的制备：

将玻璃纤维膜放入封闭液中浸湿，取出，于37-40℃条件下干燥10-16小时，于干燥好的玻璃纤维膜上，用点喷方式将纳米金标记的抗黄曲霉毒素G1单克隆抗体溶液横向喷涂，每厘米喷涂长度所需纳米金标记的抗黄曲霉毒素G1单克隆抗体为200-400ng，然后真空冷冻干燥2-6h，置干燥器中室温保存；

(5)试纸条的组装：在纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫、金标垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，交叠长度为1-3mm，即得黄曲霉毒素G1免疫层析试纸条。

9.根据权利要求8所述的黄曲霉毒素G1免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中的包被缓冲液为：每100mL中含有牛血清白蛋白1g，氯化钠0.8g，十二水磷酸氢二钠0.29g，氯化钾0.02g，磷酸二氢钾0.02g；

所述步骤(3)中使用的封闭液为：每100mL含有牛血清白蛋白2g，蔗糖2.5g，叠氮化钠0.02g，氯化钠0.8g，十二水磷酸氢二钠0.29g，氯化钾0.02g，磷酸二氢钾0.02g；

所述步骤(4)中使用的封闭液为：每100mL含有2g牛血清白蛋白，0.1mL曲拉通X-100，0.3g聚乙烯吡咯烷酮，2.5g蔗糖，0.02g叠氮化钠，0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，0.02g磷酸二氢钾。

10.根据权利要求8所述的黄曲霉毒素G1免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于：所述纳米金标记的抗黄曲霉毒素G1单克隆抗体溶液的具体标记方法为：量取50.0mL质量浓度为0.01％的纳米金溶液，用0.1mol/L碳酸钾水溶液调节溶液pH值为8.2；在搅拌的状态下缓慢加入3mL0.1mg/mL的抗黄曲霉毒素G1单克隆抗体水溶液，继续搅拌30min；加入质量浓度为10％牛血清白蛋白水溶液至牛血清白蛋白的终质量浓度为1％，继续搅拌30min；于4℃放置2h后，1500r/min离心15min，取上清液，弃沉淀；将上清液12000r/min离心30min，弃去上清液，加入50.0mL标记洗涤保存液；再以12000r/min离心30min，弃去上清液，将沉淀用标记洗涤保存液重悬，得到5.0mL浓缩物，置4℃冰箱备用；

所述0.1mol/L碳酸钾水溶液为：13.8g碳酸钾溶于纯水定容至1000mL，0.22μm滤膜过滤所得；所述0.1mg/mL抗黄曲霉毒素G1单克隆抗体水溶液为1mg抗黄曲霉毒素G1单克隆抗体溶解在10mL纯水中制成；所述10％牛血清白蛋白水溶液为10g牛血清白蛋白溶解在100mL纯水中，0.22μm滤膜过滤所得；所述标记洗涤保存液为：2.0g聚乙二醇-20000，0.2g叠氮钠，0.1235克硼酸，纯水定容至1000mL，0.22μm滤膜过滤所得。

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