CN102183641B - 一种莱克多巴胺免疫层析检测试纸条 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种莱克多巴胺免疫层析检测试纸条，所述试纸条由样品垫、玻璃纤维膜标记垫、硝酸纤维素包被膜、吸水纸顺次搭接粘贴在底板上构成，所述玻璃纤维膜标记垫上涂覆有彩色胶乳颗粒标记的莱克多巴胺多克隆抗体，硝酸纤维素包被膜包括检测区和控制区，所述检测区包被莱克多巴胺全抗原，所述控制区包被抗鼠抗体IgG；所述彩色乳胶颗粒为粒径为100-500nm的聚苯乙烯颗粒，所述聚苯乙烯颗粒表面修饰有-COOH、-NH2或-SH基团。采用本发明的试纸条进行定性检测不需要任何辅助仪器，操作简便，一步完成，可以检测动物饲料、肌肉组织等处理检材，检测灵敏度达到5ng/mL，准确率大于97％。
Description
技术领域
本发明属于医学检验领域，具体地说，本发明涉及一种莱克多巴胺免疫层析检测试纸条。
背景技术
常见的兴奋剂有克仑特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇等，克仑特罗俗称“瘦肉精”。随着中国对克仑特罗监管力度的加大，克伦特罗的使用逐渐减少，其他β-兴奋剂的使用逐渐增加。莱克多巴胺(ractopamine，RAC)是美国最新研制出的一种β-兴奋剂，1999年12月美国食品与药品管理局(FDA)批准莱克多巴胺可以使用在猪养殖，莱克多巴胺也是欧盟惟一允许使用的β-兴奋剂。中国也有研制专利报道，莱克多巴胺正作为克仑特罗的替代品被广泛使用。但中国农业部、卫生部、国家药品监督管理局明文禁止莱克多巴胺用于动物养殖，因此开发莱克多巴胺的快速、准确的测定试剂盒是当务之急，而研制出高质量的检测原材料(抗原及抗体)是重中之重。
莱克多巴胺是一类结构和功能类似肾上腺素的苯乙醇胺类衍生物，是小分子物质(分子量＜1000)，本身不具有诱导产生抗体的能力，因此，为了建立此类物质的免疫分析方法，首先必须制备出效价高特异性强的抗体，设法将莱克多巴胺小分子与大分子(载体蛋白质)偶联制备出人工完全抗原，从而开始研制相关产品快速检测研究的基础。以此制备多种高特异性单克隆抗体，研制胶体金/胶乳快速一步检测方法，能实现对各种检测简单快速的一步检测，检测结果直观易读。此快速检测法将推动莱克多巴胺残留量分析检测的扩大使用，符合莱克多巴胺危害现状，方便现场检测。
在现有技术中，张漫、罗晓琴等(《动物保健》2006年09期，《莱克多巴胺残留检测方法》)认为在莱克多巴胺的残留检测方法中，抗酶联免疫方法是目前最理想的检测方法，具有快速、简便、操作简单以及一次检测样品量大的特点，可以直接对尿液、饲料样品进行检测。
申请号为200510071059.0的发明专利，涉及一种莱克多巴胺RCT检测方法，是利用免疫亲和层析柱及酶联免疫吸附的方法来检测食品中的莱克多巴胺残留，首先通过合成抗原、包被抗原、动物免疫、抗体纯化等步骤制备多克隆抗体，再将此抗体交联到琼脂糖凝胶上，制备免疫亲和层析柱。被检样品处理后，通过亲和柱以富集其中的莱克多巴胺，收集亲和柱的洗脱液进行酶联免疫吸附检测，以确定其中的莱克多巴胺的含量，莱克多巴胺酶联免疫检测试剂盒。
但是上述两种方法均是液相检测，溶液操作，以吸光度来定量检测莱克多巴胺，不便于在现场大规模筛查和地域偏远不发达的地区使用。
申请号为200520136528.8，发明名称为莱克多巴胺胶体金免疫层析检测试纸的实用新型专利，是由样液吸收层、胶体金标记层、检测反应层以及吸水层依次设置在背衬上组成。但是以胶体金法检测，缺点是灵敏性较差，检测限较难控制。另有申请号为200910027587.4，发明名称为一种快速检测莱克多巴胺的免疫磁珠层析试纸条及制备方法，该发明采用磁胶乳颗粒为标记物，利用磁信号检测仪，进一步将电信号输出实现定量检测，其缺点是需要仪器操作，且利用磁微粒标记，造价成本较高，对于应急性大面积筛查，性价比较低。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的缺陷，提供一种成本低廉、操作简便、灵敏性高的莱克多巴胺免疫层析检测试纸条。
为实现上述目的，本发明采取了以下技术方案：
一种莱克多巴胺免疫层析检测试纸条，所述试纸条由样品垫、玻璃纤维膜标记垫、硝酸纤维素包被膜、吸水纸顺次搭接粘贴在底板上构成，所述玻璃纤维膜标记垫上涂覆有彩色胶乳颗粒标记的莱克多巴胺多克隆抗体，硝酸纤维素包被膜包括检测区和控制区，所述检测区包被有莱克多巴胺全抗原，所述控制区包被抗鼠抗体IgG；所述彩色乳胶颗粒为粒径100-500nm的聚苯乙烯颗粒，所述聚苯乙烯颗粒表面修饰有-COOH、-NH2或-SH基团。
优选地，所述莱克多巴胺多克隆抗体由与牛血清蛋白偶联的莱克多巴胺免疫制得；所述莱克多巴胺全抗原由莱克多巴胺与卵清蛋白偶联制得。
优选地，所述莱克多巴胺多克隆抗体与彩色胶乳颗粒的比例为75～150μg/100μg，所述彩色胶乳颗粒标记的莱克多巴胺多克隆抗体涂敷在玻璃纤维膜上的稀释参数为25cm2/ml～35cm2/ml。
优选地，所述莱克多巴胺全抗原在所述检测区的用量为15-20μl/35cm；所述抗鼠抗体IgG的浓度为18～30μg/ml，在所述控制区的用量为25μl/35cm。
莱克多巴胺为小分子化合物，抗原性弱，不能够刺激机体产生免疫应答，必须把其连接到大分子物质(如载体蛋白质)上，才能形成较为理想的免疫原。常用的蛋白质偶联方法主要有碳二亚胺(EDC)法、混合酸酐法(MA)、戊二醛法、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)法、琥珀酸酐法和重氮法等。
本发明的莱克多巴胺免疫层析试剂条是建立在免疫层析的竞争抑制性原理上，利用化学合成的方法将莱克多巴胺小分子由不同位点连接到大分子载体蛋白上合成莱克多巴胺人工全抗原；采用与BSA偶联的莱克多巴胺全抗原制备高灵敏度的莱克多巴胺多克隆抗体；利用彩色胶乳标记技术标记莱克多巴胺多克隆抗体，与OVA偶联的莱克多巴胺全抗原组成层析装置，对样本中的莱克多巴胺小分子进行定性检测。
针对现有莱克多巴胺检测技术的不足和缺陷，提供采用竞争抑制性固相免疫层析原理的试剂条，即样品中的莱克多巴胺小分子和固定在包被膜上的莱克多巴胺全抗原竞争结合彩色胶乳标记的莱克多巴胺多克隆抗体的固相检测免疫层析检测试纸条，且优化了工艺流程和参数，提高了检测的灵敏度，使用更加便捷。
当试纸条以样品垫末端浸入样本后，样品溶液沿着试纸条通过毛细作用从下向上流动，溶解标记垫上涂覆的彩色胶乳颗粒标记的抗体。如果待测的样品中不含有莱克多巴胺时，彩色胶乳颗粒标记的抗体会和包被在硝酸纤维素包被膜检测区T线处的莱克多巴胺全抗原发生反应，从而聚集彩色胶乳颗粒，在检测区T线处显色，未与莱克多巴胺全抗原反应的彩色胶乳颗粒标记的抗体继续向前，与控制区C线上的抗鼠抗体发生反应，在C线处显色，因此在硝酸纤维素包被膜上呈现两条色带，表示样品为莱克多巴胺阴性；若待测样品中含有莱克多巴胺，则彩色胶乳颗粒标记的莱克多巴胺抗体首先与样品中的小分子发生反应，检测区T线处不显色，当反应后的彩色胶乳颗粒标记的抗体和抗原复合物流动到控制区C线处时，与C线处包被的抗鼠抗体反应，C线处显色，硝酸纤维素包被膜上只呈现一条色带，说明检测样品为阳性。由此可见，无论检测样品中是否含有莱克多巴胺小分子，控制区C线处均显色，如果C线无色带产生，则说明试纸条失效或者操作有误。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
采用本发明的试纸条进行定性检测不需要任何辅助仪器，操作简便，一步完成，检测时间为5～15min；可以检测动物饲料、肌肉组织等处理检材，检测灵敏度达到5ng/mL；准确率大于97％。
具体实施方式
以下结合具体实施例来详细说明本发明。
实施例1
本发明的一种莱克多巴胺免疫层析检测试纸条，是由样品垫、玻璃纤维膜标记垫、硝酸纤维素包被膜、吸水纸顺次搭接粘贴在底板上构成，所述玻璃纤维膜标记垫上涂覆有彩色胶乳颗粒标记的莱克多巴胺多克隆抗体，硝酸纤维素包被膜包括检测区和控制区，所述检测区包被莱克多巴胺全抗原，所述控制区包被抗鼠抗体IgG；所述彩色乳胶颗粒为粒径100-500nm的聚苯乙烯颗粒，所述聚苯乙烯颗粒表面修饰有-COOH、-NH2或-SH基团。
在该实施例中，免疫用莱克多巴胺全抗原的载体蛋白为牛血清蛋白BSA，包被用莱克多巴胺全抗原的载体蛋白为卵清蛋白OVA。莱克多巴胺全抗原在所述检测区的用量为15μl/35cm；所述抗鼠抗体IgG的浓度为18μg/ml，在所述控制区的用量为25μl/35cm。
在该实施例中，所述莱克多巴胺多克隆抗体与彩色胶乳颗粒的比例为100μg/100μg，所述彩色胶乳颗粒标记的莱克多巴胺多克隆抗体涂敷在玻璃纤维膜标记垫上的稀释参数为30cm2/ml。
该实施例的试纸条是由以下方法制备而得：
A.合成莱克多巴胺人工全抗原(免疫抗原RAC-BSA和包被抗原RAC-OVA)
1)合成半抗原；
将莱克多巴胺首先引入活性基团羧基(引入羧基的方法有很多种)，合成含羧基的RAC半抗原；在该实施例中，称取莱克多巴胺30mg溶在2ml吡啶中，加入9mg丁二酸酐，室温下搅拌12小时，此反应产物为莱克多巴胺-半丁二酸酐。
2)半抗原与载体蛋白偶联
采用混合酸酐法(MA)将RAC半抗原分别与牛血清蛋白(BSA)和卵清蛋白(Ovalbumin，OVA)偶联合成人工免疫原BSA-RAC和包被抗原OVA-RAC。
在该实施例中，将步骤1)的莱克多巴胺-半丁二酸酐溶解于2ml N，N-二甲基甲酰胺和2ml 1，4-二氧六环混合物中，加入25ul的三正丁胺，在冰浴中搅拌10min，再加氯甲酸异丁酯15ul室温搅拌反应1小时，逐滴加入预冷的蛋白溶液(溶解于0.1M，pH 8的硼酸钠溶液中的100mgOVA)室温反应过夜，在PBS中透析72小时以上，测定全抗原RAC-OVA的浓度和紫外吸收光谱的变化。
采取同样的方法合成全抗原RAC-BSA。用紫外(UV)和蛋白凝胶电泳(SDS-PAGE)进行鉴定，计算分子结合比，以确定莱克多巴胺小分子是否与载体蛋白偶联成功。
B.制备莱克多巴胺多克隆抗体
以步骤A生产的人工全抗原RAC-BSA免疫小鼠，选择高效价小鼠，取血清，然后通过饱和硫胺沉淀和proteinA-Sepharose 4B的方法对抗体进行纯化，所得的抗体需对RAC有较高的特异性和灵敏性。
C.筛选直径为100-500nm的、表面修饰有-COOH，-NH2，-SH等基团的彩色乳胶颗粒，将彩色胶乳颗粒与步骤B制得的RAC多克隆抗体相偶联，并涂覆到玻璃纤维膜标记垫上。
D.将全抗原RAC-OVA喷膜于硝酸纤维素包被膜的检测区，将抗鼠抗体包被于包被膜的控制区，并在35-40℃烘箱干燥15分钟。
E.将涂覆有彩色胶乳颗粒标记的RAC多克隆抗体的玻璃纤维素膜标记垫、包被有RAC-OVA和抗鼠抗体的包被膜、吸水纸依次搭接在底板上，即得。
使用方法及结果判断：
加样后，反应5分钟内即可看到检测区(T线)和控制区(C线)相应的位置上呈色情况，如果C线和T线均出现颜色条带，结果为阴性，说明样品中不含有莱克多巴胺小分子；T线不出现颜色条带，C线出现颜色条带，结果为阳性，说明样品中含有莱克多巴胺小分子；C线不出现颜色条带，说明试纸条失效。
实施例2
该实施例中的试纸条结构均与实施例1相同。
在该实施例中，免疫用莱克多巴胺全抗原的载体蛋白为卵清蛋白OVA，包被用莱克多巴胺全抗原的载体蛋白为牛血清蛋白BSA。莱克多巴胺全抗原在所述检测区的用量为18μl/35cm；所述抗鼠抗体IgG的浓度为25μg/ml，在所述控制区的用量为25μl/35cm。所述莱克多巴胺多克隆抗体与彩色胶乳颗粒的比例为75μg/100μg，所述彩色胶乳颗粒标记的莱克多巴胺多克隆抗体涂敷在玻璃纤维膜标记垫上的稀释参数为25cm2/ml。
其余均与实施例1相同，使用方法也与实施例1相同。
实施例3
该实施例中的试纸条结构均与实施例1相同。
在该实施例中，莱克多巴胺全抗原在所述检测区的用量为20μl/35cm；所述抗鼠抗体IgG的浓度为30μg/ml，在所述控制区的用量为25μl/35cm。在该实施例中，所述莱克多巴胺多克隆抗体与彩色胶乳颗粒的比例为150μg/100μg，所述彩色胶乳颗粒标记的莱克多巴胺多克隆抗体涂敷在玻璃纤维膜标记垫上的稀释参数为35cm2/ml。
其余均与实施例1相同，使用方法也与实施例1相同。
Claims (2)
1.一种莱克多巴胺免疫层析检测试纸条，其特征在于，所述试纸条由样品垫、玻璃纤维膜标记垫、硝酸纤维素包被膜、吸水纸顺次搭接粘贴在底板上构成，所述玻璃纤维膜标记垫上涂覆有彩色胶乳颗粒标记的莱克多巴胺多克隆抗体，硝酸纤维素包被膜包括检测区和控制区，所述检测区包被有莱克多巴胺全抗原，所述控制区包被抗鼠抗体IgG；所述彩色乳胶颗粒为粒径100-500nm的聚苯乙烯颗粒，所述聚苯乙烯颗粒表面修饰有-COOH、-NH2或-SH基团；所述莱克多巴胺多克隆抗体与彩色胶乳颗粒的比例为75～150μg/100μg，所述彩色胶乳颗粒标记的莱克多巴胺多克隆抗体涂敷在玻璃纤维膜上的稀释参数为25cm2/ml～35cm2/ml；所述莱克多巴胺全抗原在所述检测区的用量为15-20μl/35cm；所述抗鼠抗体IgG的浓度为18～30μg/ml，在所述控制区的用量为25μl/35cm。
2.根据权利要求1所述的莱克多巴胺免疫层析检测试纸条，其特征在于，所述莱克多巴胺多克隆抗体由与牛血清蛋白偶联的莱克多巴胺免疫制得；所述莱克多巴胺全抗原由莱克多巴胺与卵清蛋白偶联制得。
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