CN103172525B - 一种乙基香兰素抗原和抗体的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种乙基香兰素抗原和抗体的制备方法及其应用，属于免疫分析测试领域。乙基香兰素半抗原是在乙基香兰素的羟基上连接上一连接臂，其结构如式（Ⅰ）所示，R为碳链长度为C₁～C₆的亚烷基，X是羧基、巯基或氨基。乙基香兰素完全抗原在乙基香兰素半抗原的基础上偶联了载体物质而得到。再利用完全抗原制备杂交瘤细胞，通过特异性筛选、体外培养、纯化而获得其抗体。本发明通过抗原抗体高效特异性竞争结合特性，制备乙基香兰素检测用胶体金免疫层析分析试纸，具有灵敏度高、特异性强、简单快捷、易于操作等优点。

Description

一种乙基香兰素抗原和抗体的制备方法及其应用

技术领域

本发明属于免疫分析测试领域，涉及一种乙基香兰素抗原和抗体的制备方法及其应用。

背景技术

香兰素，3-甲氧基-4-羟基苯甲醛，又称香草醛；甲基香兰素（Vanillin）3,4-二甲氧基苯甲醛，又称藜芦醛、绿藜芦醛、香草醛甲醚；乙基香兰素（EthylVanillin），3-乙氧基-4-羟基苯甲醛，又称乙基香草醛、乙基凡尼林，三者均为白色或微黄色结晶性粉末，微溶于水，溶于乙醇、甘油、乙醚、氯仿及香料中；皆具有香荚兰香气及浓郁的奶香，是重要的食品添加剂，广泛用作食品、饮料以及日化用品等领域。但是，大剂量使用香兰素等香料将有害健康。目前，给婴儿添加配方奶粉成为世界各地普遍采用的做法，而婴幼儿是对有害物质最敏感的群体。近年来由于婴幼儿食品特别是配方奶粉的质量优劣或真假问题而引发的重大食品安全事件屡见不鲜。

目前关于乙基香兰素的测定方法主要有分光光度法、电化学法、高效液相色谱法、气相色谱和气质联用法。这些分析方法具有高灵敏度和特异性的特点，但操作繁琐，需要精密仪器和受过专业培训的操作人员，且耗时长。而特异性的结合反应，例如抗原-抗体反应，已经广泛用于检测生物样品中存在的各种物质的免疫测试中。其中，胶体金免疫层析技术发展迅速，已被人们所熟知，与仪器分析法比较，胶体金层析技术具有高灵敏度、高特异性、简单快捷、易于操作等优点。

在胶体金免疫层析分析试纸的制备上，最为重要的环节是被测物的免疫源性物质，即被测物的免疫抗原和免疫抗体的制备，而制备高特异性的抗体首先是要有纯度较高，结构合理的免疫原。因此，研究和筛选特异性更强、灵敏度更高的乙基香兰素免疫分析抗原抗体和对于提高和完善本领域检测手段具有重要意义。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种乙基香兰素半抗原及其制备方法。

本发明的目的之二提供一种乙基香兰素完全抗原及其制备方法，乙基香兰素完全抗原是在乙基香兰素半抗原的基础上进一步制备得到。

本发明的目的之三提供一种乙基香兰素抗体及其制备方法。

本发明的目的之四在于提供一种乙基香兰素检测用胶体金免疫层析分析试纸及其制备方法。

本发明的目的还在于利用上述乙基香兰素半抗原、乙基香兰素完全抗原及乙基香兰素抗体在应用胶体金免疫层析分析技术检测乙基香兰素中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种乙基香兰素半抗原，具有如式（Ⅰ）所示的结构：

其中，R为碳链长度为C₁～C₆的亚烷基；X是羧基、巯基或氨基。

上述乙基香兰素半抗原的制备方法，包括如下步骤：

（1）将乙基香兰素和4-溴丁酸乙酯或5-溴戊酸乙酯溶解于强极性有机溶剂中，加入碳酸钾和四丁基碘化铵，15～25℃反应12～16h；反应结束后加入冰水溶解反应液，用乙酸乙酯萃取，水洗涤后收集有机相，干燥得到粗品。

（2）将步骤（1）所得粗品溶于无水乙醇中，加入氢氧化锂15～25℃反应2～4h，加水稀释，乙醚萃取，取下层，再加入酸调pH至4～6.0，有固体析出，经氯仿洗涤、抽滤、蒸干得到乙基香兰素半抗原。

步骤（1）中所述的强极性有机溶剂优选为N,N-二甲基甲酰胺或乙腈。

步骤（1）中所述的乙基香兰素、4-溴丁酸乙酯或5-溴戊酸乙酯、碳酸钾的摩尔比优选为1:1～2:3～5；

步骤（1）中所述的四丁基碘化铵的投料量优选为乙基香兰素质量的10～20%。

步骤（1）中所述的干燥优选为通过30～40℃旋转蒸干20分钟干燥。

步骤（2）中所述的氢氧化锂的用量优选为乙基香兰素质量的20～40%。

一种乙基香兰素完全抗原，具有如式（Ⅱ）所示的结构：

其中，R为碳链长度为C₁～C₆的亚烷基；P为载体物质；载体物质为蛋白质、利用具有足够数目氨基酸的合成聚氨基酸或其它具有反应官能团的合成或天然多聚体物质；优选的载体物质为牛血清蛋白（BSA）、鸡蛋白蛋白（OVA）或钥孔戚血蓝蛋白（KLH）。

上述乙基香兰素完全抗原的制备方法，包括如下步骤：将上述乙基香兰素半抗原溶解于N,N-二甲基甲酰胺中，加入DEC盐酸盐（1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），15～25℃反应12～16小时，加入到由PBS（磷酸盐缓冲液）溶解的载体物质溶液中，15～25℃下搅拌反应4～8小时，反应液用PBS在4～20℃下透析2～3天，离心收集上清液，冷冻干燥得乙基香兰素完全抗原。

所述的乙基香兰素半抗原、DEC盐酸盐、NHS与载体物质的摩尔比优选为1:1～2:1～2:0.05。

所述的载体物质优选为牛血清蛋白（BSA）、鸡蛋白蛋白（OVA）或钥孔戚血蓝蛋白（KLH）。

所述的PBS优选为10mM、pH7.2～7.4的PBS。

所述的离心优选为4℃、8000r/min离心10分钟。

一种乙基香兰素抗体，利用上述乙基香兰素完全抗原制备杂交瘤细胞，通过特异性筛选、体外培养、纯化而获得。

上述乙基香兰素抗体的制备方法，包括如下步骤：体外通过次黄嘌呤H、氨基蝶呤A和胸腺嘧啶核苷T选择性培养基筛选乙基香兰素杂交瘤细胞；通过ELISA方法检测杂交瘤细胞上清液中抗体效价，选择高效价高特异性的孔扩大培养；将抗体阳性细胞进行有限稀释克隆筛选；选出只有一个克隆生长的孔，扩大培养，同样方法筛选三次以上，得到稳定分泌抗体的阳性细胞株，即得到乙基香兰素抗体（乙基香兰素单克隆抗体）。

一种乙基香兰素检测用胶体金免疫层析分析试纸（如图7所示），包括垫衬和垫衬上依次搭接的样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜（NC膜）、吸水垫。所述的垫衬、样品垫、金标垫、吸水垫的材料分别为吸水纸、玻璃纤维素纸、玻璃纤维素纸、吸水纸。所述的金标垫包被有胶体金标记的乙基香兰素抗体，所述的乙基香兰素抗体优选为胶体金标记的乙基香兰素单克隆抗体。所述的硝酸纤维素膜上有检测线和质控线，检测线区（检测线所在的区域为检测线区）包被有乙基香兰素完全抗原，质控线区（质控线所在的区域为质控线区）包被有羊抗鼠IgG多抗（购自杭州格朗瑞生物科技有限公司）。

上述乙基香兰素检测用胶体金免疫层析分析试纸的制备方法，包括如下步骤：

（1）金标垫的制备

用PBS将胶体金标记的乙基香兰素抗体配制成浓度0.5～1.0mg/mL的溶液，均匀地涂布在玻璃纤维素纸上，涂布量为30～80μL/cm²，25～37℃真空干燥12h。

（2）检测线和质控线的制备

检测线：用PBS将乙基香兰素完全抗原配制成浓度0.5～1.0mg/mL的溶液，喷在硝酸纤维素膜的检测区域上；

质控线：用PBS将羊抗鼠IgG多抗配制成浓度0.5～1.0mg/mL的溶液，喷在硝酸纤维素膜的质控区域上；

硝酸纤维素膜在50℃干燥12h。

（3）胶体金免疫层析分析试纸的组装

将样品垫、包被有胶体金标记的乙基香兰素抗体的金标垫、包被有乙基香兰素完全抗原（检测线）和羊抗鼠IgG多抗（质控线）的硝酸纤维素膜、吸水垫依次搭接组装成测试条，将测试条置于垫衬上固定得到乙基香兰素检测用胶体金免疫层析分析试纸。

步骤（1）和（2）中所述的PBS优选为10mM、pH7.2～7.4的PBS。

上述乙基香兰素半抗原、乙基香兰素完全抗原、乙基香兰素抗体在应用胶体金免疫层析分析技术检测乙基香兰素中的应用。

乙基香兰素检测用胶体金免疫层析分析试纸采用竞争抑制法检测乙基香兰素。通过将乙基香兰素完全抗原固定于硝酸纤维素膜上的检测区域，待检样品溶液中的乙基香兰素小分子与乙基香兰素完全抗原竞争结合胶体金标记的抗乙基香兰素单抗，最后待检样品中的乙基香兰素小分子将抑制抗乙基香兰素单抗与乙基香兰素完全抗原的结合，从而抑制其在硝酸纤维素膜上的检测区域形成色带（或者荧光带）。检测后如果检测区域形成色带（或者荧光带），则结果为阴性，表明待测样品中不含有乙基香兰素或者含量极低；相反，如果不形成色带（或者荧光带），则结果为阳性，表明检测样品中含有乙基香兰素。

通常，在检测中设置内质控带。在硝酸纤维素膜上临近检测区域设置质控区域，将羊抗鼠IgG多抗固定在质控区域。检测过程中，无论待检样品中是否含有乙基香兰素，层析载体玻璃纤维上预包被的胶体金标记的乙基香兰素单克隆抗体总能与质控区域羊抗鼠IgG多抗结合形成一条有色（或荧光）质控带，该条带是判定层析过程是否正常和检测试纸是否变质的标准。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

（1）本发明提供的乙基香兰素半抗原具有与常用的载体蛋白偶联的活性基团。

（2）本发明提供的乙基香兰素完全抗原偶联了载体蛋白，能够对宿主动物免疫，引发免疫原性应答并产生抗体，也可以利用偶联物与抗体组合，进行免疫层析分析。

（3）本发明提供的乙基香兰素检测用胶体金免疫层析分析试纸，具有灵敏度高、特异性强、简单快捷、易于操作等优点。

附图说明

图1是乙基香兰素半抗原的制备路线图。

图2是乙基香兰素完全抗原的制备路线图。

图3是乙基香兰素完全抗原1的紫外扫描图谱。

图4是乙基香兰素完全抗原2的紫外扫描图谱。

图5是乙基香兰素完全抗原3的紫外扫描图谱。

图6是乙基香兰素完全抗原4的紫外扫描图谱。

图7是乙基香兰素检测用胶体金免疫层析分析试纸示意图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1乙基香兰素半抗原1的制备

（1）将3mmol乙基香兰素（500mg）和4.62mmol 4-溴丁酸乙酯（900mg）置于圆底烧瓶中，加入8mL N，N-二甲基甲酰胺（DMF）搅拌溶解，再依次加入9mmol K₂CO₃（1250mg）、50mg四丁基碘化铵，25℃反应16h，TLC（薄层层析法）跟踪检测反应；反应完毕，加入冰水10mL搅拌溶解，用10mL乙酸乙酯萃取有机相，重复萃取2次，水洗后收集有机相，30～40℃旋转蒸干20分钟得到粗品。

（2）将上述粗品溶于5mL无水乙醇中，滴加20wt%氢氧化锂约750mg，室温反应4h，加水10mL稀释，加入8mL乙醚萃取，取下层，用盐酸调pH至4，有固体析出，用氯仿洗三次、抽滤、蒸干，得到700mg乙基香兰素半抗原1。

实施例2乙基香兰素半抗原2的制备

（1）将3mmol乙基香兰素（500mg）和4.31mmol 5-溴戊酸乙酯（900mg）置于圆底烧瓶中，加入10mL乙腈搅拌溶解，再依次加入9mmol K₂CO₃（1250mg）、50mg四丁基碘化铵，25℃反应16h，TLC（薄层层析法）跟踪检测反应；反应完毕，加入冰水10mL搅拌溶解，用10mL乙酸乙酯萃取有机相，重复萃取2次，水洗后收集有机相，30～40℃旋转蒸干20分钟得到粗品。

（2）将上述粗品溶于5mL无水乙醇中，滴加20wt%氢氧化锂约750mg，室温反应4h，加水10mL稀释，加入8mL乙醚萃取，取下层，用盐酸调pH至4，有固体析出，用氯仿洗三次、抽滤、蒸干，得到700mg乙基香兰素半抗原2。

实施例1和2的乙基香兰素半抗原的制备路线如图1所示。

实施例3乙基香兰素完全抗原1的制备（其制备路线如图2所示）

将9mg实施例1制备的乙基香兰素半抗原1溶于0.5mL DMF中，边搅拌边加入9mg EDC盐酸盐和6mg NHS，室温反应过夜，逐滴加入到10mL溶有100mg BSA的PBS（0.01mol/L，pH7.2）的溶液中，室温下搅拌反应4h。然后用PBS（0.01mol/L，pH7.4）于4℃透析3天（换液3次），离心，收集上清液，冷冻干燥得乙基香兰素完全抗原1。

乙基香兰素完全抗原1紫外扫描图谱如图3所示，波长范围200～300nm，BSA在波长278nm处有最大吸收峰，OD值为0.38，乙基香兰素半抗原1在波长278.4nm处有最大吸收峰，OD值为2.21，而乙基香兰素完全抗原1在波长约228.6nm处有最大吸收峰，OD值大于0.38小于2.21，根据文献Chen XJ,Zhao HJ.Application of immunological technic in plant science[M].Beijing:Agriculture Pree,1998,30-38的报道，可知乙基香兰素半抗原1与载体蛋白BSA偶联成功得到乙基香兰素完全抗原1。

实施例4乙基香兰素完全抗原2的制备

制备方法与实施例3相同，所用乙基香兰素半抗原和载体蛋白分别为乙基香兰素半抗原2和BSA。

制备得到的乙基香兰素完全抗原2紫外扫描图谱如图4所示。

实施例5乙基香兰素完全抗原3的制备

制备方法与实施例3相同，所用乙基香兰素半抗原和载体蛋白分别为乙基香兰素半抗原1和OVA。

制备得到的乙基香兰素完全抗原3紫外扫描图谱如图5所示。

实施例6乙基香兰素完全抗原4的制备

制备方法与实施例3相同，所用乙基香兰素半抗原和载体蛋白分别为乙基香兰素半抗原2和OVA。

制备得到的乙基香兰素完全抗原4紫外扫描图谱如图6所示。

实施例7乙基香兰素抗体的制备

将实施例5得到的乙基香兰素完全抗原与弗氏完全佐剂（CFA，CompleteFreund’s Adjuvant）1:1等体积混合；取5只6周龄以上的雌性Balb/c小鼠，做背部皮下多点免疫注射（0.05mg/0.1mL/只～0.1mg/0.1mL/只）免疫复合物（乙基香兰素完全抗原）与佐剂混合液；每隔两周加强免疫同等剂量免疫复合物与弗氏不完全佐剂（IFA，Incomplete Freund’s Adjuvant）混合液；第三次免疫后断尾取血，测定小鼠血清效价，选取效价最高者小鼠做细胞融合实验；细胞融合前3天，腹腔注射免疫复合物生理盐水溶液，做融合前加强免疫。

取小鼠脾细胞悬液，在50mL离心管中，移取10⁸个脾细胞与10⁷个处于对数生长期的SP2/0骨髓瘤细胞混合均匀，1000rmp离心10分钟，去掉上清液。向所得的细胞沉淀中逐滴滴加1mL经过37℃预热的50%（W/V）聚乙二醇（PEG，分子量1500），2分钟内加完，同时一边加入一边轻轻敲打离心管，使细胞均匀融合。逐滴加入20mL1640基础培养基终止融合反应。1000r/min离心5min，弃上清液。将沉淀的细胞轻轻悬浮于10mL胎牛血清中，然后再加入4mL饲养细胞、0.8～1mL的HAT（50×），轻轻吹打后向离心管中加入25mL灭菌甲基纤维素半固体培养基，定容至40mL，并将其放在旋转混匀仪上充分混匀。将融合后的细胞倒入培养皿中培养，每个培养皿中倒2mL，将培养皿放入湿盒中，放入37℃，5%CO₂培养箱中培养。融合7天后挑选杂交瘤细胞于96孔细胞培养板中，三天后通过ELISA方法检测杂交瘤细胞上清液中抗体效价，选择效价高的孔进行扩大培养。

将阳性孔杂交瘤细胞计数后用有限稀释法稀释到1.2个/孔，接种于96孔培养板中，在37℃，5%CO₂培养箱中培养，选出只有一个克隆生长的孔，扩大培养，同样方法筛选三次以上，得到稳定分泌抗体的阳性细胞株。

用含15%（V/V）小牛血清培养基（1640）体外扩大培养筛选得的细胞株，改换无血清培养基（1640）培养，收集上清液，分管冷冻干燥，-20℃冷冻保存，即得到乙基香兰素单克隆抗体。

实施例8乙基香兰素检测用胶体金免疫层析分析试纸的制备

乙基香兰素检测用胶体金免疫层析分析试纸如图7所示，包括垫衬和垫衬上依次搭接的样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜（NC膜）、吸水垫。金标垫包被有胶体金标记的乙基香兰素单克隆抗体。硝酸纤维素膜上有检测线和质控线，检测线区（检测线所在的区域为检测线区）包被有乙基香兰素完全抗原，质控线区（质控线所在的区域为质控线区）包被有羊抗鼠IgG多抗（购自杭州格朗瑞生物科技有限公司）。其制备如下：

（1）金标垫的制备

将胶体金标记的乙基香兰素单克隆抗体与pH为7.4的10mM磷酸盐缓冲溶液混合，配制成浓度0.5mg/mL的溶液，均匀地涂布在玻璃纤维素纸上，涂布量为50μL/cm²，25℃真空干燥12h。

（2）检测线和质控线的制备

检测线：将乙基香兰素完全抗原1与pH为7.4的10mM PBS混合，配制成浓度0.5mg/mL的溶液，喷在硝酸纤维素膜的检测区域上。

质控线：将羊抗鼠IgG多抗与pH为7.4的10mM PBS混合，配制成浓度0.6mg/mL的溶液，喷在硝酸纤维素膜的质控区域上。

硝酸纤维素膜在50℃干燥12h。

（3）胶体金免疫层析分析试纸的组装

将样品垫、包被有胶体金标记的乙基香兰素抗体的金标垫、包被有乙基香兰素完全抗原（检测线）和羊抗鼠IgG多抗（质控线）的硝酸纤维素膜、吸水垫依次搭接组装成测试条，将测试条置于垫衬上，用胶带固定得到乙基香兰素检测用胶体金免疫层析分析试纸。

实施例9乙基香兰素检测用胶体金免疫层析分析试纸的灵敏度测试

（1）样本配制

在空白奶样中分别添加乙基香兰素标准品，分别配制成含乙基香兰素的样本，浓度分别为0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、3ng/mL、4ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、15ng/mL、。

（2）检测与结果

使用实施例7制备的胶体金免疫层析分析试纸对上述系列浓度梯度的样本进行测试，滴加约150～200微升的样品，在5～8分钟观察结果，灵敏度实验结果见表1。

表1胶体金免疫层析分析试纸的灵敏度实验结果

注：“＋”表示阳性；“－”表示阴性。

实施例9乙基香兰素检测用胶体金免疫层析分析试纸的药物交叉试验

取8种奶粉及婴幼儿食品中常用的增香剂，分别用阴性奶样配成增香剂浓度为100ng/mL的样本，使用实施例7制备的胶体金免疫层析分析试纸对这些样本进行检测，试纸条显两条明显条带，判为阴性结果，用“－”表示；只显一条明显条带，判为阳性结果，用“+”表示。检测结果见表2。

表2胶体金免疫层析分析试纸的药物交叉试验结果

增香剂名称	实验结果
		乙基香兰素（3-乙氧基-4-羟基苯甲醛）	+
香兰素（3-甲氧基-4-羟基苯甲醛）	-
		甲基香兰素（3,4-二甲氧基苯甲醛）	-
4-羟基-3-甲氧基苄胺盐酸盐	-
		3-羟基-4-甲氧基苯甲醛	-
2-羟基-3-甲氧基苯甲醛	-
		4-乙酰氧基-3-甲氧基苯甲醛	-
4-甲酰基-2-甲氧基苯基异丁酸酯	-

试验结果表明，本发明的胶体金免疫层析分析试纸可用于乙基香兰素的检测，与其它品种的增香剂无交叉反应。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种乙基香兰素半抗原，其特征在于具有如式(Ⅰ)所示的结构：

其中，R为碳链长度为C₁～C₆的亚烷基，X是羧基；但不包括如下化合物：4-甲基酰-2-乙氧基苯氧乙酸、

2.权利要求1所述的乙基香兰素半抗原的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)将乙基香兰素和4-溴丁酸乙酯或5-溴戊酸乙酯溶解于强极性有机溶剂中，加入碳酸钾和四丁基碘化铵，15～25℃反应12～16h；反应结束后加入冰水溶解反应液，用乙酸乙酯萃取，水洗涤后收集有机相，干燥得到粗品；

(2)将步骤(1)所得粗品溶于无水乙醇中，加入氢氧化锂15～25℃反应2～4h，加水稀释，乙醚萃取，取下层，再加入酸调pH至4～6.0，有固体析出，经氯仿洗涤、抽滤、蒸干得到乙基香兰素半抗原。

3.根据权利要求2所述的乙基香兰素半抗原的制备方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的强极性有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺或乙腈；

步骤(1)中所述的乙基香兰素、4-溴丁酸乙酯或5-溴戊酸乙酯、碳酸钾的摩尔比为1:1～2:3～5；

步骤(1)中所述的四丁基碘化铵的投料量为乙基香兰素质量的10～20％；

步骤(1)中所述的干燥为通过30～40℃旋转蒸干20分钟干燥；

步骤(2)中所述的氢氧化锂的用量为乙基香兰素质量的20～40％。

4.一种乙基香兰素完全抗原，其特征在于具有如式(Ⅱ)所示的结构：

其中，R为碳链长度为C1～C6的亚烷基；P为载体物质，载体物质为蛋白质、利用具有足够数目氨基酸的合成聚氨基酸或其它具有反应官能团的合成或天然多聚体物质。

5.权利要求4所述的乙基香兰素完全抗原的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

将权利要求1所述的乙基香兰素半抗原溶解于N,N-二甲基甲酰胺中，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，15～25℃反应12～16小时，加入到由磷酸盐缓冲液溶解的载体物质溶液中，15～25℃下反应4～8小时，反应液用磷酸盐缓冲液在4～20℃下透析2～3天，离心收集上清液，冷冻干燥得乙基香兰素完全抗原；

所述的乙基香兰素半抗原、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺与载体物质的摩尔比为1:1～2:1～2:0.05；

所述的载体物质为牛血清蛋白、鸡蛋白蛋白或钥孔戚血蓝蛋白；

所述的磷酸盐缓冲液为10mM、pH 7.2～7.4的磷酸盐缓冲液；

所述的离心为4℃、8000r/min离心10分钟。

6.一种乙基香兰素抗体，其特征在于：所述的乙基香兰素抗体利用权利要求4所述的乙基香兰素完全抗原制备杂交瘤细胞，通过特异性筛选、体外培养、纯化而获得。

7.权利要求6所述的乙基香兰素抗体的制备方法，其特征在于包括如下步骤：体外通过次黄嘌呤H、氨基蝶呤A和胸腺嘧啶核苷T选择性培养基筛选乙基香兰素杂交瘤细胞；通过ELISA方法检测杂交瘤细胞上清液中抗体效价，选择高效价高特异性的孔扩大培养；将抗体阳性细胞进行有限稀释克隆筛选；选出只有一个克隆生长的孔，扩大培养，同样方法筛选三次以上，得到稳定分泌抗体的阳性细胞株，即得到乙基香兰素抗体。

8.一种乙基香兰素检测用胶体金免疫层析分析试纸，其特征在于包括垫衬和垫衬上依次搭接的样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫；所述的金标垫包被有胶体金标记的权利要求6所述的乙基香兰素抗体；所述的硝酸纤维素膜上有检测线和质控线，检测线区包被有权利要求4所述的乙基香兰素完全抗原，质控线区包被有羊抗鼠IgG多抗。

9.权利要求8所述的乙基香兰素检测用胶体金免疫层析分析试纸的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)金标垫的制备

用磷酸盐缓冲液将胶体金标记的乙基香兰素抗体配制成浓度0.5～1.0mg/mL的溶液，均匀地涂布在玻璃纤维素纸上，涂布量为30～80μL/cm²，25～37℃真空干燥12h；

(2)检测线和质控线的制备

检测线：用磷酸盐缓冲液将乙基香兰素完全抗原配制成浓度0.5～1.0mg/mL的溶液，喷在硝酸纤维素膜的检测区域上；

质控线：用磷酸盐缓冲液将羊抗鼠IgG多抗配制成浓度0.5～1.0mg/mL的溶液，喷在硝酸纤维素膜的质控区域上；

硝酸纤维素膜在50℃干燥12h；

(3)胶体金免疫层析分析试纸的组装

将样品垫、包被有胶体金标记的乙基香兰素抗体的金标垫、包被有乙基香兰素完全抗原和羊抗鼠IgG多抗的硝酸纤维素膜、吸水垫依次搭接组装成测试条，将测试条置于垫衬上固定得到乙基香兰素检测用胶体金免疫层析分析试纸；

步骤(1)和(2)中所述的磷酸盐缓冲液为10mM、pH 7.2～7.4的磷酸盐缓冲液。

10.权利要求1所述的乙基香兰素半抗原、权利要求4所述的乙基香兰素完全抗原、权利要求6所述乙基香兰素抗体或权利要求8所述的乙基香兰素检测用胶体金免疫层析分析试纸在检测乙基香兰素中的应用。