CN200986548Y - 链霉素快速半定量检测试纸 - Google Patents

Abstract

本实用新型涉及一种检测试纸，特别是一种半定量快速检测试纸。本试纸的背衬上依次粘贴有样液吸收部分、胶体金标记部分、检测反应部分及吸水部分。检测反应部分上包被有链霉素抗体1－3条或检测用抗原1－3条作为检测线，同时包被有抗第二种属动物蛋白的IgG 1－3条作为参考线，组合时检测线和参考线不能同时多于1条，组合线条数为2－4条。该快速检测试纸条特异性强，能够实现半定量检测，4－40℃都可使用，3min以后便可观察结果，适合于卫生、质监、海关、家畜养殖场等单位或个人对牛奶、肉类等样品中的链霉素进行快速检测。

Description

链霉素快速半定量检测试纸

技术领域

本实用新型涉及动物性食品中一种抗生素残留检测试纸，特别涉及一种链霉素检测试纸。

背景技术

抗生素残留是全世界畜禽养殖中普遍存在的问题，其中链霉素是一种比较常见的残留抗生素。链霉素是一种氨基糖苷类抗生素，其在治疗家畜革兰氏阴性菌和结核杆菌感染性疾病中发挥了重要作用，但其残留物毒副作用比较大，欧美国家多年前即以法规禁止抗生素残留超限量的牛奶上市，发现有抗生素的奶场必须停产，甚至要收回产品销毁。但据专家判断，“有抗奶”目前仍流通于我国部分城市。为了加强兽药残留管理工作，保证畜产品质量安全，我国农业部于2002年修订了《动物性食品中兽药最高残留限量》，其中规定牛奶中链霉素的最高残留限量为200μg/kg，对羊、猪、鸡等其他动物肌肉、脂肪、肾脏中链霉素残留也有相应限量规定。

对链霉素残留的检测目前主要采用高效液相色谱法(HPLC)。然而，由于氨基糖苷类抗生素缺少发色基团，应用到HPLC时常要对其衍生化，样品前处理繁琐，测定方法相当复杂，需受过专门训练的人员才能操作，检测通量很小。在我国目前动物养殖分散经营的情况下，很难统一管理，因此造成动物源性食品的质量很难一致，单纯采用大型仪器检测监控产品质量，很不现实，而且仪器检测费用高，很难普及使用。国外对链霉素残留的检测普遍采用快速筛选检测结合仪器确证的方法，我国在大量样品快速筛选检测技术方面上研究不多。微生物抑制法是一种较为常用的抗生素筛选检测方法，其主要原理是根据抗微生物药对特异微生物的抑制作用来检测受检样品中残留的抗微生物药，主要包括杯碟法、纸片法、琼脂扩散法和氯化三苯基四氮唑法，虽然目前仍在使用，但这些方法特异性差，耗时费力，测定结果误差很大。ELISA法是另一种目前研究较多的抗生素筛选检测方法，具有灵敏度高、检测量大、成本低等优点，但该方法也需酶标仪等部分实验室设备，分析时间一般1-4小时，仍有一定局限性。因此，目前我国相应的链霉素检测技术并不很完备，很有必要研制更加简单快捷方便的检测产品。

发明内容

本实用新型的目的即在于研制出简便、灵敏、价格低廉的链霉素快速半定量检测试纸。

本实用新型所述的链霉素快速半定量检测试纸包括样液吸收部分、胶体金标记部分、检测反应部分、吸水部分、背衬。样液吸收部分、胶体金标记部分、检测反应部分、吸水部分依次序贴在背衬上。

其中，胶体金标记部分为玻璃纤维或醋酸纤维或尼龙膜，其上标记的物质为第二种属动物蛋白和链霉素抗体的混合物，或第二种属动物蛋白与链霉素检测用抗原的混合物。

检测反应部分上面包被有链霉素检测用抗原1-3条作为检测线，或包被有链霉素抗体1-3条作为检测线，同时还包被有抗第二种属动物蛋白的IgG1-3条作为参考线。

检测线和参考线组合时不能同时多于1条，组合线条数为2-4条，组合方式为1条检测线+1条参考线、1条检测线+2条参考线、1条检测线+3条参考线、2条检测线+1条参考线、3条检测线+1条参考线五种形式。根据半定量检测的准确度要求，组合线数越多，半定量越准确。

本实用新型中检测用抗原是指链霉素与载体物质形成的偶合物，其中载体物质包括蛋白质、蛋白质片段、合成多肽、半合成多肽、多糖，如血清白蛋白、球蛋白、脂蛋白、多聚氨基酸、葡聚糖，示例性的载体物质包括牛血清白蛋白、卵清白蛋白、匙孔血蓝蛋白、甲状腺球蛋白、L-多聚赖氨酸等。另外，载体物质也可以是具有活性基团的其他合成或天然聚合物，如白喉毒素、破伤风毒素、酵母、尼龙、右旋葡聚糖、纤维素等，同样也可以用来制备检测用抗原。第二种属动物蛋白指非抗体来源属动物的蛋白，例如，抗体为鼠源性，则第二种属动物蛋白可以是卵清白蛋白、兔血清白蛋白等鸡、兔或其他非鼠源性动物蛋白。

本实用新型所描述的试纸的各部分处理与功能如下：

背衬：为一面涂有不干胶的不吸水的韧性材料，如PVC板，起固定支持试纸其他组成部分的作用。

样液吸收部分制备：将滤纸或玻璃纤维纸浸入pH7.0-8.4的PBS中2min，取出，80℃烘干或其他方式干燥，即作为样液吸收部分，检测时起吸收样品溶液的作用，便于样品溶液向上移动。

胶体金标记部分的制备：该部分起固定胶体金标记的抗原或抗体的作用。制备步骤包括胶体金溶胶的制备、胶体金标记链霉素抗体或链霉素抗原、胶体金标记部分处理。

(1)胶体金溶胶的制备：将氯金酸(HAuCL₄)用超纯水配置成1％的母液，取1mL的母液，用超纯水定容到100mL，配成0.01％的溶液，加热至沸腾，加入1-5mL的1％柠檬酸三钠水溶液，继续加热到出现透明的橙红色为止，即为胶体金溶胶。

(2)胶体金标记链霉素抗体：将链霉素单克隆抗体或多克隆抗体和第二种属动物蛋白分别用PBS(0.01mol/L，pH7.0-7.5)溶解稀释至2-4mg/mL，每100mL胶体金溶胶加入1-3mL 2-4mg/mL的链霉素抗体和1-1.5mL 2-4mg/mL第二种属动物蛋白，震荡2min，用0.2mol/L的K₂CO₃调节pH至8.4，振荡5min，加入11％PEG-10000 2mL，振荡5min，8000-15000r/min离心15min，除去上清，用PBS(0.01mol/L，pH7.0-7.5)复溶，以6000-13000r/min离心15min，除去上清，将沉淀用PBS(0.01mol/L，pH7.0-7.5)稀释500-2000倍，产物作为金标链霉素抗体(GAb)。

(3)胶体金标记链霉素抗原：将链霉素检测用抗原和第二种属动物蛋白分别用PBS(0.01mol/L，pH7.0-8.4)溶解稀释至2-4mg/mL，每100mL胶体金溶胶加入1-3mL 2-4mg/mL的检测用抗原和1-1.5mL 2-4mg/mL第二种属动物蛋白，震荡2min，用0.2mol/L的K₂CO₃调节pH至8.4，振荡5min，加入11％PEG-10000 2mL，振荡5min，8000-15000r/min离心15min，除去上清，用PBS(0.01mol/L，pH7.0-7.5)复溶，以6000-13000r/min离心15min，除去上清，将沉淀用PBS(0.01mol/L，pH7.0-7.5)稀释500-2000倍，产物作为金标记的链霉素抗原(GAg)。

(4)胶体金标记部分处理：将GAb或GAg倒入一槽中，将玻璃纤维纸或滤纸浸入1min，取出，室温干燥后，即作为胶体金标记部分。

检测反应部分制备：用0.8％的戊二醛溶液或0.2％的碳二亚胺溶液浸泡硝酸纤维膜或醋酸纤维膜或尼龙膜30min，取出，37℃烘干，上边包被1-3条不同浓度的链霉素检测用抗原线或链霉素抗体线作为检测线，同时包被1-3条不同浓度的抗第二种属动物蛋白的IgG线作为参考线。当胶体金标记部分标记对象为链霉素抗体和第二种属动物蛋白时，检测线则包被链霉素检测用抗原；当胶体金标记部分标记对象为链霉素检测用抗原和第二种属动物蛋白时，检测线则包被链霉素抗体；检测线和参考线不能同时多于1条，组合线数2-4条。此即为检测反应部分，该部分主要作用是将反应结果以肉眼可见的颜色表征出来。

吸水部分制备：将玻璃纤维纸或滤纸或吸水纸室温干燥后，即作为吸水部分。该部分主要作用在于将移动上来的多余的样品溶液吸收。

试纸组装：在背衬上依次粘贴样液吸收部分、胶体金标记部分、检测反应部分和吸水部分，即成链霉素半定量检测试纸。

检测原理：检测原理因胶体金标记的对象不同，而稍有差异。

当胶体金标记部分的标记对象为链霉素抗体和第二种属动物蛋白时，如果样品中含有链霉素，样品溶液被试纸的样液吸收部分吸收并通过毛细作用上移到达胶体金标记部分，样品溶液中的链霉素与胶体金标记的链霉素抗体反应形成结合物，结合物继续上移到检测线，因胶体金标记的链霉素抗体只有一个结合位点，样品溶液中的链霉素与之结合后，检测线上的检测用抗原就不能再与胶体金标记的链霉素抗体结合，于是检测线无色；当样品中没有链霉素时，胶体金标记的链霉素抗体到达检测线时被检测用抗原捕获，则形成肉眼可见红色，此即为阴性。无论样品中是否含有链霉素，胶体金标记的第二种属动物蛋白上移到达参考线时都可被参考线上包被的抗第二种属动物蛋白的IgG捕获形成肉眼可见的红色，此即为参考线。

当胶体金标记部分的标记对象为链霉素检测用抗原和第二种属动物蛋白时，如果样品中含有链霉素，样品溶液被试纸的样液吸收部分吸收并通过毛细作用上移，样品中的游离链霉素分子量小移动速度快，先到达检测线，先与检测线上包被的链霉素抗体结合，因检测线上包被的链霉素抗体只有一个结合位点，而且样品中游离的链霉素结合能力比偶合态的链霉素检测用抗原强，于是胶体金标记的检测用抗原不能再被检测线上的链霉素抗体捕获，于是检测线无色，此即为阳性；如果样品中无链霉素，则胶体金标记的链霉素检测用抗原到达检测线后就被检测线上包被的链霉素抗体捕获，形成肉眼可见的红色，此即为阴性。无论样品中是否含有链霉素，胶体金标记的第二种属动物蛋白上移到达参考线时都可被参考线上包被的抗第二种属动物蛋白的IgG捕获形成肉眼可见的红色，此即为参考线。

以上两种方式的试纸，可以通过调节检测线和参考线包被物浓度，调节显色深浅，通过设置多条组合线，并将组合线颜色或显色条数与标准物质浓度对应起来，即可达到半定量检测目的。

附图说明

图1是本实用新型的俯视的结构示意图，其中1为样液吸收部分、2为胶体金标记部分、3为检测反应部分、4为检测线、5为参考线、6为吸水部分。

具体实施方式

(1)1条检测线+1条参考线形式的试纸

检测线包被有浓度为0.1-30μg/mL的链霉素单克隆抗体或链霉素检测用抗原1条，宽1mm；参考线包被有浓度为0.01-30μg/mL的抗第二种属动物蛋白的IgG 1条，宽1mm；两条线之间间隔2-6mm。当检测线颜色与参考线颜色相同时，则样品为阴性；当检测线比参考线颜色浅时，则样品为阳性，浓度大于Aμg/kg，A为设定的检测限，可以是大于或等于10μg/kg的某一浓度。参考线始终显色，若参考线不显色，表明试纸失效。

(2)2条检测线+1条参考线形式的试纸

2条检测线包被有0.01-30μg/mL链霉素单克隆抗体或链霉素检测用抗原，第2条检测线上包被物的浓度小于第1条检测线参考线包被物浓度；参考线包被有浓度为0.01-30μg/mL的抗第二种属动物蛋白的IgG，宽1mm；各条线之间间隔2-6mm。当两条检测线都呈现颜色时，则样品为阴性；当检测线第1条检测线呈色，第2条检测线不呈色时，则样品中链霉素浓度大于Aμg/kg，小于Bμg/kg；当两条检测线都不呈色时，样品中链霉素浓度大于Bμg/kg。A、B为设定的检测限，可以是大于或等于10μg/kg的某一浓度。参考线始终显色，若参考线不显色，表明试纸失效。

(3)3条检测线+1条参考线形式的试纸

3条检测线包被有0.01-30μg/mL链霉素单克隆抗体或链霉素检测用抗原，三条检测线上包被物的浓度依次递减；参考线包被有浓度为0.01-30μg/mL的抗第二种属动物蛋白的IgG；各条线之间间隔2-6mm。当3条检测线都呈现颜色时，则样品为阴性；当检测线第1，2条检测线呈色，第3条检测线不呈色时，则样品中链霉素浓度大于Aμg/kg，小于Bμg/kg；当第1条检测线呈色，第2，3条检测线都不呈色时，样品中链霉素浓度大于Bμg/kg，小于Cμg/kg；当3条检测线都不呈色时，样瓶中链霉素含量大于Cμg/kg；A、B、C为设定的检测限，可以是大于或等于10μg/kg的某一浓度。参考线始终显色，若参考线不显色，表明试纸失效。

(4)1条检测线+3条参考线形式的试纸

检测线上包被有0.01-30μg/mL链霉素单克隆抗体或链霉素检测用抗原，检测线之后包被有3条参考线，参考线包被有浓度为0.01-30μg/mL的抗第二种属动物蛋白的IgG，调节参考线包被物浓度和胶体金标记的第2种属动物蛋白的标记浓度，使3条参考线的颜色分别与标准样品中链霉素含量为C、B、Aμg/kg时检测线的颜色相同，依此确定参考线包被物浓度；各条线之间间隔2-6mm当检测线颜色深于第3条参考线颜色时，表明样品为阴性；当检测线颜色深于第3条参考线颜色浅于第2条检测时，表明样品中链霉素浓度大于Aμg/kg，小于Bμg/kg；当检测线颜色深于第2条参考线颜色浅于第1条参考线时，表明样品中链霉素浓度大于Bμg/kg，小于Cμg/kg；当检测线不呈色时，表明样品中链霉素浓度大于Cμg/kg。

(5)1条检测线+2条参考线形式的试纸

检测线上包被有0.01-30μg/mL链霉素单克隆抗体或链霉素检测用抗原，检测线之后包被有2条参考线，参考线包被有浓度为0.01-30μg/mL的抗第二种属动物蛋白的IgG，调节参考线包被物浓度和胶体金标记的第2种属动物蛋白的标记浓度，使2条参考线的颜色分别与标准样品中链霉素含量为B、Aμg/kg时检测线的颜色相同，依此确定参考线包被物浓度；各条线之间间隔2-6mm；当检测线颜色深于第2条参考线颜色时，表明样品为阴性；当检测线颜色深于第2条参考线颜色浅于第1条检测时，表明样品中链霉素浓度大于Aμg/kg，小于Bμg/kg；当检测线颜色深于第1条参考线颜色浅于第1条参考线时，表明样品中链霉素浓度大于Bμg/kg。

下边以1条检测线+2条参考线结合方式为例进一步说明：

链霉素偶合抗原合成

链霉素偶合抗原分为免疫用抗原和检测用抗原，前者用于免疫动物，后者用于抗体制备中抗体的检测筛选和试纸制备中的胶体金标记或检测线包被。

免疫用抗原制备：将500mg牛血清白蛋白溶解在10mL碳酸盐缓冲液中，(pH11.2，0.5mol/L)，加入100mg 1，4-丁二醇双缩水甘油醚，室温搅拌过夜，将反应液离心(1500r/min，15min)，弃上清，加入PBS(0.1mol/L，pH7.8)10mL，再离心一次，补充PBS(0.1mol/L，pH7.8)10mL，精确称取硫酸链霉素22mg，加入，混合，室温搅拌反应过夜，反应液用PBS(0.1mol/L，pH7.8)透析48h，离心(10000r/min，15min)mL，上清调整浓度至2mg/mL，分装，即得链霉素免疫用抗原。

检测用抗原：用卵清白蛋白OVA取代牛血清白蛋白BSA，其余步骤同免疫用抗原制备。

链霉素单克隆抗体制备

取健康5周龄雌性二级Balb/c小鼠6只进行免疫。第一次基础免疫将0.1mL链霉素免疫用抗原与等量完全弗氏佐剂用搅拌器充分混匀乳化，进行腹腔注射，注射量0.2mL/只。四周后开始进行加强免疫，佐剂换为不完全弗氏佐剂，每隔两周加强免疫一次，末次免疫3d后取脾脏融合。

先将HAT培养液、IMDM不完全培养液、IMDM完全培养液和50％PEG-6000溶液于37℃水浴中预温，同时将另一盛水的烧杯放入37℃水浴中预温。将上述制备好的脾细胞和骨髓瘤细胞和脾细胞按1∶5的比例混合，在50mL塑料离心管内用不完全培养液洗1次，1200r/min离心8min，弃上清，用滴管吸净残留液体。置37℃水浴中，将吸管插入管底，在90s内边搅拌边加入预热的1mL、50％PEG-6000。静置90s后，于37℃水浴中60s内加入10mL预热的完全培养液。轻轻悬浮一次，以1000r/min离心6min，弃去上清，先用6mL左右完全培养液轻轻悬浮。根据所用96孔培养板的数量，补加HAT培养液到76.8mL，轻轻混匀，将混匀悬液接种于有饲养细胞的96孔板中，每孔0.1mL，一次接种8块板。将培养板置于37℃、5％CO₂培养箱中培养。融合后7d，用HT培养液半量换液1次，在13d后根据增殖情况改用20％NBS的完全培养液。约7d后出现杂交瘤细胞集落，细胞大、圆且透亮。待集落长至孔底1/3时，在培养板的盖板上画上克隆生长的标记，此时即可取上清检测相应的特异性抗体。细胞完全克隆化后，将细胞注入小鼠腹腔，间隔一段时间等腹水足够多时，取腹水，将腹水用蛋白A免疫亲和层析纯化后，即得到链霉素单克隆抗体。

样液吸收部分处理

将滤纸或玻璃纤维纸等浸入0.1mol/L pH7.4的PBS中2min，取出，80℃烘干或其他方式干燥，即成样液吸收部分。

胶体金标记部分的制备和处理

胶体金标记部分的制备和处理包括胶体金溶胶制备、胶体金标链霉素抗体、胶体金标记部分处理。

胶体金溶胶制备：将氯金酸(HAuCL₄)用超纯水配置成1％的母液，取1mL的母液，用超纯水定容到100mL，配成0.01％的溶液，加热至沸腾，加入一定量的1％柠檬酸三钠水溶液，继续加热到出现透明的橙红色为止，即为胶体金溶胶。

胶体金标记链霉素单克隆抗体制备：将链霉素单克隆抗体和猪血清白蛋白分别用PBS(0.01mol/L，pH7.0～7.5)溶解稀释至3mg/mL，每100mL胶体金溶胶加入1mL 4mg/mL的链霉素单克隆抗体和1mL 2mg/mL猪血清白蛋白，震荡2min，用0.2mol/L的K₂CO₃调节pH至8.4，振荡5min，加入11％PEG-100002mL，振荡5min，15000r/min离心15min，除去上清，用PBS(0.01mol/L，pH7.4)复溶，以6000～13000r/min离心15min，除去上清，将沉淀用PBS(0.01mol/L，pH7.5)稀释1000倍，产物作为金标链霉素单克隆抗体。

胶体金标记部分处理：将金标链霉素单克隆抗体倒入一槽中，将玻璃纤维纸或滤纸浸入1min，取出，室温干燥或真空冷冻干燥，即成为胶体金标记部分。

1条检测线+2条参考线组合形式的试纸检测反应部分处理

用0.8％的戊二醛溶液或0.2％的碳二亚胺溶液浸泡硝酸纤维膜30min，取出，37℃烘干，上边用喷涂机喷涂包被1条链霉素检测用抗原线作为检测线，浓度为3μg/mL；包被2条羊抗猪血清白蛋白的IgG线作为参考线，靠近下端的浓度为2μg/mL，另一条为1μg/mL。此即为检测反应部分，检测线和参考线组合形式为1条检测线+2条参考线。

吸水部分处理及试纸组装

将吸水纸室温干燥后，即作为吸水部分。

在背衬上依次粘贴样液吸收部分、胶体金标记部分、检测反应部分和吸水部分，即成组合形式为1条检测线+2条参考线的链霉素快速半定量检测试纸。

检测

牛奶样：给试纸检测部分直接滴2滴牛奶，约100μL，2min后，观察颜色。若2条检测线都呈现颜色，表明样品为阴性；若第1条检测线呈色，第2条不呈色，则表明样品中链霉素含量为80μg/kg以上；若第1条检测线与第2条检测线都不显色，则表明样品中链霉素含量为190μg/kg以上。无论样品中链霉素含量如何，参考线应该显色，若参考线不显色，表明试纸失效。

动物肝脏、肾脏、肌肉等组织样品：移去脂肪的10g组织样捣碎，加入30mL PBS(0.01mol/L pH7.4)中，在80℃孵育30min，然后置于冰浴10min，离心，小心去除表面的脂肪层，上清作为检测液。余下操作同牛奶样。

其他组合形式的试纸制备、检测与前基本类似，不再赘述。

本实用新型的积极效果：

①特异性强。该试纸特异性极强，与青霉素、卡那霉素、链霉素、土霉素、金霉素、磺胺二甲嘧啶、氯霉素、红霉素等药物基本没有交叉反应，避免了其它药物对检测的干扰，但与双氢链霉素交叉反应率达到98％以上，这使得该试纸可以同时检测链霉素和双氢链霉素单一药物或混合药物，符合了农业部同时检测链霉素和二氢链霉素混合药物的要求。

②灵敏度高。尽管欧盟以及我国农业部规定的牛奶中链霉素、二氢链霉素最大残留量为200μg/kg，但如果需要，也可根据检测要求在制备试纸时提高检测下限，本试纸最低检测下限为10ug/kg。

③能够实现半定量检测。本试纸不但能够定性检测，更重要的的是根据检测线颜色与参考线颜色对比或根据检测线呈色条数达到半定量检测目的。

④操作简单方便。对牛奶、动物尿液可直接检测，肉类等组织样品简单处理后即可检测。本试纸不需任何专业培训，不需任何仪器设备，普通非专业人员都可操作，只要将试纸插入检测液中，用肉眼判读。因此，本试纸适用面宽，卫生检验监督部门、动物养殖单位、屠宰场以及消费者个人均可使用。

⑤速度快，通量大，颜色稳定。试纸插入样液中，3min以后便可观察结果，一个人可以同时、连续检测，检测通量远远高于HPLC法，比链霉素ELISA试剂盒检测速度则快40-160倍以上，并且其颜色可永久保存，而不会象ELISA底物那样很快就变色。

⑥检测温度适宜范围宽。在4-40℃均可使用，结果正常，不需在低温下进行，不需采取保温措施，室内野外均可使用。

⑦试纸保质期长。据加速老化试验结果，干燥条件下试纸保质期可达2年。

⑧成本低廉。本试纸法检测成本远远低于链霉素ELISA试剂盒检测法，随着规模化生产后，其成本还会大幅度降低。

Claims (6)

1.链霉素快速半定量检测试纸含有背衬、样液吸收部分、胶体金标记部分、检测反应部分，样液吸收部分、胶体金标记部分、检测反应部分及吸水部分，依次粘贴在背衬上，其特征在于：胶体金标记部分被标记的物质为第二种属动物蛋白与链霉素抗体的混合物，或第二种属动物蛋白与链霉素检测用抗原的混合物，检测反应部分上面包被有链霉素检测用抗原1-3条作为检测线，或包被有链霉素抗体1-3条作为检测线，同时包被有抗第二种属动物蛋白的IgG1-3条作为参考线，检测线和参考线不能同时多于1条，组合线数为2-4条。

2、根据权利要求1所说的试纸，其特征在于链霉素检测用抗原为链霉素与载体物质形成的偶合物。

3、根据权利要求2所说的试纸，其特征在于所述载体物质为蛋白质或蛋白质片段或合成多肽或半合成多肽或多糖。

4、根据权利要求1所说的试纸，其特征在于第二种属动物蛋白质为非抗体来源属动物的蛋白。

5、根据权利要求1所说的试纸，其特征在于所说的抗体为可以识别链霉素和二氢链霉素的免疫球蛋白或其片断。

6、根据权利要求1所说的试纸，其特征在于检测线和参考线的组合方式为1条检测线和1条参考线、1条检测线和2条参考线、1条检测线和3条参考线、2条检测线和1条参考线、3条检测线和1条参考线5种形式。