CN111458525A - 一种检测人体生理物质浓度的试纸条、试剂盒以及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种检测人体生理物质浓度的试纸条、试剂盒以及制备方法,属于生物医药和医学检验技术领域,所述试纸条顺次包括加样区、固相标记区、层析区和吸水区;所述层析区包括多条定标线和检测线。所述多条标定线分别喷涂不同浓度第二配对试剂;所述检测线上喷涂第一配对试剂;所述固相标记区包被有待检测人体生理物质的特异抗体标记物。所述试剂盒包括试纸条、人体生理物质释放液和人体生理物质微量取样器。所述试纸条能够确定样品中待检测的人体生理物质的浓度范围,操作方便,结果准确,适于家庭和个人使用。
Description
技术领域
本发明属于生物医药和医学检验技术领域,尤其涉及一种检测人体生理物质浓度的试纸条、试剂盒以及制备方法。
背景技术
维生素D(25羟基维生素D)在人体内具有广泛功能,能够调节钙代谢,维持肌肉骨骼系统,参于免疫反应,调节细胞凋亡,调节多种内分泌,调节造血功能。联合国卫生组织统计数据显示,全球约90%人口,患有维生素不足之症,但如摄入外来维生素D过量,则又导致中毒。
叶酸(维生素B9),维生素B的重要成员。叶酸缺少会造成贫血,也会造成妇女妊娠期可能引发的婴儿神经管缺失症(NTD)的风险。几乎50%NTD是由于叶酸不足而引发的。孕期常规性的叶酸补充对婴儿健康十分重要。叶酸不足也可能与脑中风以及心血管疾病,癌症的发生有一定联系。缺少叶酸增加直肠癌,乳房癌,卵巢癌,胰腺癌,脑癌,肺癌,宫颈癌,前列腺癌的风险。叶酸是身体细胞分裂式合成DNA,RNA和氨基酸的必须原料。叶酸缺少会造成人体红细胞数量不足,而致使贫血。有鉴于上述原因,家庭和个人经常检测血液中叶酸含量便显得十分重要。
现有的维生素D、叶酸等人体生理物质的检测方法主要包括高效液相色谱法、液质联用法、放射免疫法、酶联免疫法、化学发光免疫法、电化学发光免疫法、全自动生化法等,操作复杂,不适于基层组织、家庭和个人检测。
发明内容
有鉴于此,本发明的目的在于提供一种检测人体生理物质浓度的试纸条、试剂盒以及制备方法;检测操作简单、便捷、耗时短,更适于家庭和个人检测。
为了实现上述发明目的,本发明提供了以下技术方案:
本发明提供了一种检测人体生理物质浓度的试纸条,顺次包括加样区、固相标记区、层析区和吸水区;所述层析区顺次包括多条定标线和检测线;
所述多条定标线上分别喷涂不同浓度第二配对试剂;所述第二配对试剂为与待检测人体生理物质无反应的物质,所述多条定标线分别代表和显示待测物质不同浓度在检测线上于指定读数时间所出现的颜色强度;
所述检测线上喷涂第一配对试剂包被物质,所述第一配对试剂包被物质与待检测人体生理物质有特异反应;所述第一配对试剂固相标记区与第一配对包被物特异配对试剂为特有配对试剂。
优选的,所述人体生理物质包括维生素D、叶酸和维生素B12。
优选的,所述第二配对试剂为鸡IgY与抗鸡IgY抗体。
本发明提供了所述试纸条的制备方法,包括以下步骤:
1)用待检测人体生理物质的特异抗体标记物溶液浸泡玻璃纤维素膜后,干燥获得固相标记垫;
2)在硝酸纤维素膜上顺次喷涂定标线、检测,干燥获得层析垫;
3)将所述样品垫、固相标记垫、层析垫和吸水垫顺次搭接获得试纸条。
优选的,步骤1)中所述干燥为真空干燥,所述真空干燥的温度为25~38℃,所述真空干燥的时间为2~4h;
优选的,步骤2)中所述的干燥为烘干,所述烘干的温度为35~40℃,所述烘干的时间为20~30min。
本发明提供了一种检测人体生理物质浓度的试剂盒,包括所述的试纸条、人体生理物质释放液和人体生理物质微量取样器。
优选的,所述人体生理物质释放液以pH值为7.0~7.5的磷酸缓冲液为溶剂,包括以下浓度的组分:0.8wt%的氯化钠、1.6g/L的8-苯胺基-1-萘磺酸铵盐,160mL/L的3-(α-丙酮基苄基)-4-羟基香豆素和160mL/L的甲醇;
或者包括以下体积浓度的组分:5%的二甲基亚砜和0.7%的乙醇
本发明的有益效果:本发明提供的检测人体生理物质浓度的试纸条,所述试纸条的层析区顺次包括多条定标线和检测线;通过将检测线的颜色强度与定标线上的颜色强度的比较,能够确定样品中待检测的人体生理物质的浓度范围,操作方便,耗时短,结果准确,适于基层卫生组织、家庭和个人使用,方便随时检测相应的人体生理物质浓度,利用健康监测。
附图说明
图1为本发明提供的试纸条的结构示意图;
图2为本发明提供的人体生理物质微量取样器的结构示意图;
图3成年人使用的叶酸检测试纸条检测结果示意图;
图4为儿童使用的叶酸检测试纸条检测结果示意图;
图5为维生素D检测过层中颜色密度与维生素D值对应关系;
图6为叶酸检测过层中颜色密度与维生素D值对应关系。
具体实施方式
本发明提供了一种检测人体生理物质浓度的试纸条,顺次包括加样区、固相标记区、层析区和吸水区;所述层析区顺次包括多条定标线和检测线;所述多条定标线上分别喷涂不同浓度第二配对试剂;所述检测线上喷涂第一配对试剂;所述第一配对试剂为待检测人体生理物质特异反应;所述固相标记区与包被试剂配对。
在本发明中,所述试纸条包括加样区,所述加样区设置样品垫,本发明对所述样品垫的材质和制备方法没有特殊要求,采用本领域常规样品垫的材质和制备方法即可。在本发明中,如果检测全血,在所述加样区上优选的还设置过滤区,本发明中所述过滤区的作用为过滤样品中的红血球,本发明对所述过滤区的材质没有特殊要求,采用本领域常规的过滤材质即可。
在本发明中,所述试纸条包括固相标记区,所述固相标记区包被有待检测人体生理物质的特异抗体标记物。在本发明中,所述人体生理物质包括维生素D、叶酸和维生素B12中的一种;所述待检测人体生理物质的特异抗体标记物包括对待检测人体生理物质的特异物质抗体和胶体金标记颗粒。
在本发明中,所述层析区顺次优选的第一定标线、检测线和第二定标线;所述第一定标线与第二定标线上分别喷涂不同浓度第二配对试剂;在本发明中,所述第二配对试剂优选为鸡IgY和兔抗鸡IgY,本发明中,所述第二配对试剂优选的采用市售产品。在本发明中,所述检测线上喷涂待检测人体生理物质特异反应;当所述检测线上喷涂待检测人体生理物质特异反应时,浓度优选:0.5-1.5mg/ml;所述喷涂的速度优选为60~100μL/s,更优选为80μL/s。
所述第一定标线上喷涂的第二配对试剂的浓度如选用第二条定标线,则第一条定标线,优选0.05~0.15mg/mL,更优选为0.08~0.12mg/mL,最优选为0.1mg/mL,所述第二定标线上喷涂的第二配对试剂的浓度优选为0.15~0.5mg/mL,更优选为0.4mg/mL;所述第一定标线、第二定标线上第二配对试剂的喷涂速度优选为60~100μL/s,更优选为80μL/s。
在本发明中,当所述待检测人体生理物质为维生素D时,所述第一定标线上喷涂的第二配对试剂的浓度优选为0.1mg/mL,所述第二定标线上喷涂的第二配对试剂的浓度优选为0.4mg/mL;当所述待检测人体生理物质为叶酸时,优选的区分成人使用试纸条和儿童使用试纸条;成人使用试纸条第一定标线上喷涂的第二配对试剂的浓度优选为0.1mg/mL,所述第二定标线上喷涂的第二配对试剂的浓度优选为0.4mg/mL;儿童使用试纸条第一定标线上喷涂的第二配对试剂的浓度优选为0.15mg/mL,所述第二定标线上喷涂的第二配对试剂的浓度优选为0.42mg/mL。
在本发明中,所述吸水区优选的设置吸水垫。本发明对所述吸水垫的材质和来源没有特殊要求,采用本领域常规的吸水垫即可。
本发明提供了所述试纸条的制备方法,包括以下步骤:1)用待检测人体生理物质的特异抗体标记物溶液浸泡玻璃纤维素膜后,干燥获得固相标记垫;2)在硝酸纤维素膜上顺次喷涂定标线、检测线后,干燥获得层析垫;3)将所述样品垫、固相标记垫、层析垫和吸水垫顺次搭接获得试纸条。
在本发明中,所述待检测人体生理物质的特异标记物优选的通过以下方法制备获得:将所述待检测人体生理物质的特异反应的物质、胶体金溶液和非特异蛋白鸡IgY混合搅拌后,加入小牛血清蛋白液进行封闭;封闭后固液分离,收集固相组分即为待检测人体生理物质的特异抗体标记物。在本发明中,所述待检测人体生理物质的特异反应物质、胶体金溶液优选的采用市售产品;所述待检测人体生理物质的特异反应与胶体金溶液的质量体积比优选为50μg:(8~12)mL,更优选为50μg:10mL。在本发明中,所述小牛血清蛋白液的质量浓度优选为0.8%~1.2%,更优选为1%;所述小牛血清蛋白液与胶体金标记溶液体积比优选为1:(7~7.5),更优选为1:7.15。在本发明中,所述混合搅拌的时间优选为10~15min;所述固液分离的方法优选为离心,所述离心的转速优选为11000~13000rpm,更优选为12000rpm;所述离心的时间优选为8~12min,更优选为10min。
本发明在获得所述待检测人体生理物质的特异特异反应标记物和标记线对应的标记物后,将所述待检测人体生理物质的特异抗体标记物溶解于磷酸缓冲液中获得待检测人体生理物质的特异抗体标记物溶液,用所述待检测人体生理物质的特异抗体标记物溶液浸泡玻璃纤维素膜后,干燥获得固相标记垫。在本发明中,所述浸泡的时间优选为5min;所述干燥为优选真空干燥,所述真空干燥的温度优选为25~38℃,所述真空干燥的时间优选为7~9h,更优选为8h。
如选用二条定标线,本发明在所述硝酸纤维素膜上顺次喷涂第一定标线、检测线和第二定标线后,干燥获得层析垫。在本发明中,所述第一定标线、检测线和第二定标线的喷涂浓度以及喷涂速度参见上述试纸条中的限定,在此不再赘述。在本发明中,所述的干燥优选为烘干,所述烘干的温度优选为35~40℃,更优选为37℃,所述烘干的时间优选为20~30min,更优选为25min。
将所述样品垫、固相标记垫、层析垫和吸水垫顺次搭接获得试纸条。在本发明具体实施过程中,所述试纸条还包括底板,优选的将所述样品垫、固相标记垫、层析垫和吸水垫顺次搭接底板上。在本发明中,优选的还包括试纸条的裁切步骤,本发明对所述裁切的方法没有特殊限定,采用本领域常规的裁切方法即可。本发明在获得所述裁切的试纸条后,优选的将所述裁切后的试纸条装入试剂卡中,加入干燥剂及铝箔袋封口,得到检测试纸条成品。
本发明提供了一种检测人体生理物质浓度的试剂盒,包括所述的试纸条、人体生理物质释放液和人体生理物质微量取样器。在本发明中,当检测维生素D时,所述人体生理物质释放液优选的以pH值为7.0~7.5的磷酸缓冲液为溶剂,包括以下浓度的组分:0.8wt%的氯化钠、1.6g/L的8-苯胺基-1-萘磺酸铵盐,160mL/L的3-(α-丙酮基苄基)-4-羟基香豆素和160mL/L的甲醇;或者包括以下体积浓度的组分:5%的二甲基亚砜和0.7%的乙醇。在本发明中,所述人体生理物质释放液能够将待测样本中的维生素D与蛋白分离,得到待测维生素D样品。在本发明中,所述人体生理物质微量取样器的结构示意图如图2所示。
在本发明中,所述试剂盒在使用过程中,优选的利用人体生理物质微量取样器进行取样,将取得的样品置于试纸条的加样区进行检测,根据检测线的颜色强度,确定待检测人体生理物质的浓度范围。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明,但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
维生素D基于免疫竞争原理的免疫层析试纸条的制备和应用
维生素D特异抗体标记物的制备:按维生素抗体VD-020(JAJ International,Inc.San Diego,CA,USA)50μg/10mL胶体金溶液和非特异蛋白鸡IgY 50μg(JAJInternational,Inc.San Diego,CA,USA)加入胶体金标记溶液,搅拌10~15min后,加入质量浓度为1%的小牛血清蛋白液,所述小牛血清蛋白液与胶体金标记溶液体积比为1:7.15,经高速4℃离心(12000rpm)10min后,得到有色沉淀物,所述有色沉淀物为维生素D特异抗体标记物。去掉上清液,沉淀物溶解于磷酸缓冲液中。将稀释后的标记抗体标记浸泡在玻璃纤维膜上,将浸泡后的纤维膜在真空干燥器下,35℃进行真空干燥8h制得固相标记抗体膜。
层析膜上检测区包被液为维生素D-BSA,编号VD-124(JAJ International,Inc.San Diego,CA,USA)浓度为0.8mg/mL;所述包被液喷涂量为30cm硝基纤维膜喷涂80μL/s。定标线为羊抗鸡IgY溶液(型号#125-3401)3毫克/毫升,速度同前,划线于层析区上制作质控线C线(C2区0.4mg/mL,C1区0.1mg/mL),得到划线的对照区。划线采用划线仪进行划线,所述划线仪的型号为Biojet,Biodot CA,USA。划线后,本发明将硝基纤维膜放在37℃环境下烘干25min,得到标记抗体层析膜。
将样品吸收条,过滤条,标记层析条和吸水条粘贴在粘胶底板上,切割后得到层析条,或置于塑料检测盒内。
维生素D检测操作程序和测试结果检测:
取样程序:用弹簧针于手指穿小口子。用微量取样器滴入待测10μL全血液,或5μL血浆或5μL血清于含200μL维生素D释放液中,室温培育10min后,加样80μL于层析条或塑盒加样孔10min,目测结果。
维生素D释放液为pH值为7.0的磷酸缓冲液包括0.8wt%的氯化钠、1.6g/L的8-苯胺基-1-萘磺酸铵盐,160mL/L的3-(α-丙酮基苄基)-4-羟基香豆素和160mL/L的甲醇。
结果示意图如图3所示,C2出现的定标线颜色强度相当于检测线(T)维生素D200ng/mL所显示的颜色强度。C1出现的定标线颜色强度相当于维生素D于检测线(T)20ng/mL所显示颜色强度。如检测线颜色强度小于C1,为待测样品中维生素D含量过高;如检测线颜色强度高于C2,为待测样品中维生素D含量过低;如检测线颜色强度介于C1和C2之间,为正常水平。检测线颜色深度与样品中维生素D的含量成正比关系。
实施例2
维生素D基于免疫竞争原理的免疫层析盒(条)的制备和应用
维生素D特异抗体标记物的制备:同实施例1。
层析膜上检测区包被抗体为维生素D-BSA螯合物,包被浓度为1.0mg/mL。定标线为羊抗鸡IgY溶液(同实施例1),划线于层析区制作控制线C线,C2区包被浓度为0.2mg/mL,C1线为0.08mg/mL。
操作程序和检测结果同实施例1。
实施例3
成人叶酸免疫层析条的制备
按实施例1的方法制备成人叶酸层析条,标体特异抗体为叶酸特异抗体FA-002(JAJ International,Inc.San Diego,CA,USA),检测线为叶酸-BSA(JAJ International,Inc.San Diego,CA,USA)0.8mg/mL。
定标线为兔抗鸡IgY,包被浓度C1浓度为0.1mg/mL,C2浓度为0.4mg/mL。
操作程序和检测结果
滴加20μL全血或10μL血清/血浆于检测条(盒)加样垫上,再加2滴展开液磷酸缓冲液。10min时阅读结果。
C2出现的定标线颜色强度相当于检测线(T)维生素D 20ng/mL所显示的颜色强度。C1出现的定标线颜色强度相当于维生素D于检测线(T)2ng/mL所显示颜色强度。
检测线颜色深度(T)小于定标线C1,表示叶酸水平偏低;检测线颜色深度大于定标线C2为叶酸水平偏高;如检测线颜色深度在定标线C1和C2之间,则叶酸水平处于正常。检测颜色深度与样品中叶酸含量成正比。
实施例4
儿童叶酸免疫层析条的制备
按实施例1的方法制备儿童叶酸层析条,标体特异抗体为叶酸特异抗体FA-002(JAJ International,Inc.San Diego,CA,USA),检测线为叶酸-BSA(JAJ International,Inc.San Diego,CA,USA)0.8mg/mL。
定标线为兔抗鸡IgY,包被浓度C1为0.15mg/mL,C2为0.42mg/mL。
操作程序和检测结果
滴加20μL全血或10μL血清/血浆于检测条(盒)加样垫上,再加2滴展开液磷酸缓冲液。10min时阅读结果。
C2出现的定标线颜色强度相当于检测线(T)维生素D 21ng/mL所显示的颜色强度。C1出现的定标线颜色强度相当于维生素D于检测线(T)5ng/mL所显示颜色强度。
检测线颜色深度(T)小于定标线C1,表示叶酸水平偏低;检测线颜色深度大于定标线C2为叶酸水平偏高;如检测线颜色深度在定标线C1和C2之间,则叶酸水平处于正常。
实施例5
操作程序与目测结果相同,加样后于十分钟时,将检测盒检入家用型定量读数仪QikTech5000,直接读数,其检测结果如下:
表1维生素D检测过层中颜色密度与维生素D值对应关系
实施例6
操作程序与目测结果相同,加样后于十分钟时,将检测盒检入家用型定量读数仪QikTech5000,直接读数,其检测结果如下:
表2叶酸检测过层中颜色密度与维生素D值对应关系
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (5)
1.一种检测人体生理物质浓度的试纸条,其特征在于,顺次包括加样区、固相标记区、层析区和吸水区;所述层析区顺次包括多条定标线和检测线;
所述多条定标线上分别喷涂不同浓度第二配对试剂;所述第二配对试剂为与待检测人体生理物质无反应的物质,所述多条定标线分别代表和显示待测物质不同浓度在检测线上于指定读数时间所出现的颜色强度;
所述检测线上喷涂第一配对试剂包被物质,所述第一配对试剂包被物质与待检测人体生理物质有特异反应。
2.根据权利要求1所述的试纸条,其特征在于,所述人体生理物质包括维生素D、叶酸和维生素B12。
3.根据权利要求1或2所述的试纸条,其特征在于,所述第二配对试剂为鸡IgY与抗鸡IgY抗体。
4.权利要求1所述试纸条的制备方法,包括以下步骤:
1)用待检测人体生理物质的特异第一配对物质标记物和第二配对标记物混合溶液浸泡玻璃纤维素膜后,干燥获得固相标记垫;
2)在硝酸纤维素膜上顺次喷涂一条或多条定标线、检测线后,干燥获得层析垫;
3)将所述样品垫、固相标记垫、层析垫和吸水垫顺次搭接获得试纸条。
5.一种检测人体生理物质浓度的试剂盒,其特征在于,包括权利要求1~4任意一项所述的试纸条、人体生理物质释放液和人体生理物质微量取样器。
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