CN110672853A - 集成式免疫层析试纸、其制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种集成式免疫层析试纸，所述试纸基于固相化学发光体系，所述试纸包括底物垫和层析试纸；其中所述底物包括固态过氧化物，优选地，所述固态过氧化物为过硼酸钠。还提供了试纸的制备方法和应用。本发明试纸采用化学发光信号作为层析试纸的读出方式，可以同时满足高灵敏度和定量分析的要求；采用了过硼酸钠作为氧化剂，底物混合物在混合冻干之后仍然保持了强的化学发光活性；采用了冷冻干燥的方法将底物混合物负载在玻璃纤维上作为底物垫，与层析试纸集成，避开了传统基于化学发光信号读出系统需要额外分别储存化学发光底物，使用前进行混合的步骤，简化了操作步骤；制备方法简单，易于推广，有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于即时检测领域，具体涉及一种集成式免疫层析试纸，及其制备方法和应用。
背景技术
即时检测(Point-of-care testing，POCT)在近年来受到了广泛关注。即时检测是指利用便携式诊断工具和试剂在采样现场快速得到检测结果的一种检测方式。即时检验装置的推广和使用使得人们可以不依赖于昂贵的仪器或者复杂的操作便可以很快得到自己所关心的测试结果。层析试纸条(Lateral Flow Assay，LFA)是一种常见的即时检测装置。相比于其他即时检测设备，层析试纸条具有稳定性高，选择性高，操作简单，反应速度快等诸多优点。基于胶体金的层析试纸条已经被制备为早孕试纸等产品进行商业化生产。然而传统的胶体金试纸条灵敏度不高，且只能进行定性和半定量分析，因此在很多情况下不能满足实际检测的需求。目前已经有很多改进的层析试纸条被研究和报道，比如利用酶或者具有类酶活性的其他物质催化放大信号以增加检测灵敏度，通过标记荧光量子点或者上转换纳米颗粒进而利用荧光信号读出对靶标分子进行定量分析。然而，这些研究工作需要多步操作，使得层析试纸条丧失了原本具有的操作简便的优势。也有报道对层析试纸自身的结构进行调整，使得在保持易于操作的基础上提升其检测性能。但这样又会增加层析试纸条的制备难度和成本。
发明内容
因此，本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种集成式免疫层析试纸、其制备方法及应用。
为实现上述目的，本发明的第一方面提供了一种集成式免疫层析试纸，所述试纸基于固相化学发光体系，所述试纸包括底物垫和层析试纸；其中所述底物包括固态过氧化物，优选地，所述固态过氧化物为过硼酸钠。
根据本发明第一方面的试纸，其中，所述底物还包括鲁米诺和对碘苯酚。
本发明的第二方面提供了第一方面所述的试纸的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(1)制备底物垫：配制底物混合物，用冷冻干燥方法将底物混合物溶液负载在玻璃纤维上；冻干之后，将负载有底物的玻璃纤维被裁成底物垫贴敷于聚氯乙烯垫板上；
(2)负载抗体：用硝基纤维素膜负载捕获抗体和第二抗体；
(3)标记抗体和酶：用金纳米颗粒标记检测抗体和辣根过氧化物酶；
(4)制备层析试纸：用冷冻干燥方法将金标抗体负载在玻璃纤维上作为金标抗体垫；冻干之后，将样品垫、金标抗体垫、硝基纤维素膜和吸水垫贴敷于聚氯乙烯垫板上，并裁成层析试纸；
(5)底物垫与层析试纸集成：将底物垫和层析试纸同时固定于聚碳酸酯定位器具上。
根据本发明第二方面的制备方法，其中，所述步骤(1)中，所述底物混合物中，鲁米诺的浓度为50～200毫摩每升，优选为80～150毫摩每升，最优选为100毫摩每升；
对碘苯酚的浓度为50～200毫摩每升，优选为80～150毫摩每升，最优选为100毫摩每升；
过硼酸钠的浓度为10～100毫摩每升，优选为30～80毫摩每升，最优选为50毫摩每升。
根据本发明第二方面的制备方法，其中，所述步骤(1)中，每条底物垫的长度为3～5毫米，优选为4毫米；每条底物垫的宽度为0.5～2毫米，优选为1毫米。
根据本发明第二方面的制备方法，其中，所述步骤(2)中，所述抗体浓度为1.5～2毫克每毫升，优选为捕获抗体1.7毫克每毫升，第二抗体2.0毫克每毫升。
根据本发明第二方面的制备方法，其中，所述步骤(3)中：
所述金纳米颗粒的粒径为30～80纳米，优选为50～70纳米，最优选为60纳米；
标记时的抗体浓度为25～100微克每毫升，优选为30～80微克每毫升，最优选为50微克每毫升；和/或
抗体和酶的摩尔比为1：10～20，优选为1：20。
根据本发明第二方面的制备方法，其中，所述步骤(4)中，每条层析试纸的宽度为3～5毫米，优选为4毫米。
本发明的第三方面提供了一种试剂盒所述试剂盒包括：
第一方面所述的集成式免疫层析试纸。
优选地，所述试剂盒进一步包括：
铝箔袋以及密封在所述铝箔袋中的干燥剂，和/或滴管。
为了在提升免疫层析试纸分析性能的同时不增加其制备难度和操作的复杂度，本发明设计提供一种基于固态化学发光底物的集成式免疫层析试纸用于靶标分子的高灵敏定量分析。
为了达到目的，本发明采用了以下技术路线：
本发明中采用了固态的过氧化物代替了传统的过氧化氢作为氧化剂用于化学发光发应。优选地，所述过氧化物为过硼酸钠。
本发明中采用了冷冻干燥方法将底物混合物溶液负载在玻璃纤维上。优选地，底物混合物成分为鲁米诺100毫摩每升，对碘苯酚100毫摩每升，过硼酸钠50毫摩每升。冻干之后，负载有底物的玻璃纤维被裁成底物垫贴敷于聚氯乙烯(PVC)垫板上用于后续检测。优选的，每条底物垫的面积为1毫米*4毫米，检测时所需要的水量为10微升。
此外，本发明中利用了硝化纤维素(NC)膜负载捕获抗体和第二抗体，抗体浓度为1.5-2毫克每毫升，本发明中利用了金纳米颗粒标记检测抗体和辣根过氧化物(HRP)酶，标记时的抗体浓度为50微克每毫升，抗体和酶的摩尔比为1：10到1：20。
本发明中所选用的化学发光底物体系信号强且稳定性好，在溶液状态下可以产生比同浓度的过氧化氢/鲁米诺体系更强的化学发光信号，在冻干并复溶之后，该底物仍然可以产生很强的化学发光信号，而相同条件下的过氧化氢/鲁米诺体系化学发光信号衰减明显。另外，该化学发光体系在4摄氏度保存15天之后，化学发光信号强度无明显衰减。在此基础上所制备的集成式化学发光层析试纸条灵敏度高，并可用于定量分析，但规避了之前方法中所需要的复杂加工步骤或者多步检测操作，是一种优良的即时检测设备。
本发明已被用于血清中甲胎蛋白(AFP)和牛奶中叶酸(FA)的定量检测，得到了很好的检测结果。
为了拓宽层析试纸的应用范围，本发明提供了一种制备简单并且操作简单的基于化学发光信号读出的集成式免疫层析试纸，所述试纸在使用时，仅需添加10微升水，便可以完成底物转移用于基于化学发光强度的靶标分子定量分析，制备及操作简单，灵敏度高，并且可以与三明治法(以甲胎蛋白为模型分子)和竞争法(以叶酸为模型分子)等不同酶联免疫分析类型相结合，是一种性能优良的即时检测设备，具有很好的应用前景。
本发明的试纸可以具有但不限于以下有益效果：
1、采用化学发光信号作为层析试纸的读出方式，可以同时满足高灵敏度和定量分析的要求；
2、采用了过硼酸钠而非过氧化氢作为氧化剂，底物混合物在混合冻干之后仍然保持了强的化学发光活性；
3、采用了冷冻干燥的方法将底物混合物负载在玻璃纤维上作为底物垫，与层析试纸集成，避开了传统基于化学发光信号读出系统需要额外分别储存化学发光底物，使用前进行混合的步骤，简化了操作步骤；
4、制备方法简单，易于推广，有很好的应用前景。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1示出了试验例1中不同过氧化物与鲁米诺、对碘苯酚进行化学发光反应的反应活性结果。
图2示出了试验例1中过硼酸钠、过碳酸钠、过氧化氢分别与鲁米诺、对碘苯酚混合、冻干、复溶后的化学发光活性结果。
图3示出了试验例1中本发明化学发光体系的稳定性测试结果。
图4示出了试验例2中本发明试纸对肿瘤标志物甲胎蛋白的检测结果。
图5示出了试验例2中甲胎蛋白浓度和化学发光信号之间的关系。
图6示出了试验例2中利用本发明试纸和罗氏电化学发光方法对血清中甲胎蛋白浓度检测结果的比较。
图7示出了试验例3中本发明所述试纸对叶酸标准品的检测结果。
图8示出了试验例3中叶酸标准品浓度和化学发光信号之间的关系。
具体实施方式
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
本部分对本发明试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。本领域技术人员清楚，在上下文中，如果未特别说明，本发明所用材料和操作方法是本领域公知的。
以下实施例中使用的试剂和仪器如下：
试剂：
鲁米诺，对碘苯酚，过硼酸钠，购自购自上海麦克林生化科技有限公司。
甲胎蛋白标准品，甲胎蛋白捕获抗体，甲胎蛋白检测抗体，羊抗鼠第二抗体，购自北京沫之东生物科技有限公司
叶酸标准品，叶酸-牛血清白蛋白抗原，叶酸检测抗体，购自北京泽扬生物技术有限公司。
仪器：
生物芯片点样仪，购自美国Biodot公司，型号XYZ3060，
冷冻干燥机，购自北京博医康公司，型号Lab-1A-50E。
切条机，购自美国Biodot公司，型号CM4000。
多功能酶标仪，购自美国PerkinElmer公司，型号Enspire。
化学发光分析仪，购自北京纳迅科技股份有限公司，型号NanoAce 1010P。
实施例1
本实施例用于说明本发明试纸的制备方法。
采用冷冻干燥方法将底物混合物溶液负载在玻璃纤维上。底物混合物成分为将鲁米诺、对碘苯酚、过硼酸钠按照体积比1：1：2混合，其中鲁米诺原浓度为100毫摩每升，溶剂为0.1摩每升的氢氧化钠溶液，对碘苯酚原浓度为100毫摩每升，溶剂为0.1摩每升的氢氧化钠溶液，过硼酸钠浓度为50毫摩每升，溶剂为水。利用底物混合物将玻璃纤维饱和后，将玻璃纤维置于-20摄氏度冰箱内2小时，使其充分冷冻，随即将玻璃纤维取出，置于冷冻干燥机内3小时，进行冷冻干燥。冻干之后，负载有底物的玻璃纤维被贴敷于聚氯乙烯(PVC)垫板并裁成底物垫由于后续检测。每条底物垫的面积为1毫米*4毫米，检测时所需要的水量为10微升。
通过生物芯片点样仪将捕获抗体和羊抗鼠第二抗体喷涂至硝基纤维素膜上，随即将硝基纤维素膜置于37摄氏度下干燥1小时，从而将捕获抗体和第二抗体负载在硝基纤维素膜上。喷涂时，捕获抗体浓度为1.7毫克每毫升，第二抗体浓度为2毫克每毫升。利用0.025摩每升的碳酸钾溶液将金纳米颗粒溶液的pH值调节至8.5后，将金纳米颗粒溶液和检测抗体与辣根过氧化物酶(HRP)的混合物混合，室温下孵育半小时，将检测抗体和辣根过氧化物酶同时标记在金纳米颗粒上。标记时的检测抗体浓度为50微克每毫升，抗体和酶的摩尔比为1：20，金纳米颗粒溶液和抗体酶混合物溶液的体积比为10：1。
用标记好的金纳米颗粒将玻璃纤维饱和，置于-20摄氏度冰箱内2小时，使其充分冷冻，随即将玻璃纤维取出，置于冷冻干燥机内3小时，进行冷冻干燥，制备为金标抗体垫。将样品垫、金标抗体垫、硝基纤维素膜和吸水垫贴敷于聚氯乙烯垫板上并裁成层析试纸用于后续检测。每条层析试纸的宽度为4毫米。
将底物垫和层析试纸分别用双面胶固定在带有定位点的聚碳酸酯固定装置上，并将两部分固定装置通过双面胶和带折痕的聚对苯二甲酸乙二醇酯薄片连接，用于后续检测。
试验例1
本试验例用于说明本发明中所述化学发光底物的效果。
比较几种过氧化物与鲁米诺进行化学发光反应的反应活性，结果图1所示，其中过氧化物浓度均为5毫摩每升，溶剂为水，鲁米诺和对碘苯酚的浓度均为10毫摩每升，溶剂为pH值为12的氢氧化钠溶液。过氧化物、鲁米诺、对碘苯酚的体积比为2：1：1。可以看到与常规的氧化剂过氧化氢相比，过碳酸钠、过硼酸钠均可以产生强的化学发光信号，而过硫酸钠、过硫酸钾的反应活性较弱。
比较过硼酸钠、过碳酸钠、过氧化氢分别与鲁米诺、对碘苯酚混合、按照实施例1的方法冻干、复溶后的化学发光活性。混合时过氧化物浓度均为50毫摩每升，溶剂为水，鲁米诺和对碘苯酚的浓度均为100毫摩每升，溶剂为pH值为13的氢氧化钠溶液。过氧化物、鲁米诺、对碘苯酚的体积比为2：1：1。结果图2所示。可以看到冻干并复溶之后，过碳酸钠、过氧化氢体系的化学发光信号均出现明显衰减，但本发明所选的过硼酸钠体系依然产生很强的化学发光信号。
之后将冻干的底物垫储存在4摄氏度，密闭干燥的环境中以测试其稳定性。结果图3所示。经过十五天的储存，化学发光信号并未差生明显衰减。本发明中所选取的化学发光体系具有很强的稳定性。
试验例2
本试验例用于说明本发明试纸对于甲胎蛋白(AFP)检测。
首先，利用本发明试纸对肿瘤标志物甲胎蛋白进行了检测。检测时，先取100微升待测样品，滴加至样品垫上，并等候15分钟。在此期间，由于毛细作用，样品依次流过金标抗体垫和硝基纤维素膜，并最终到达吸水垫。金标抗体随待检样品一起流动，并由于免疫识别作用在硝基纤维素膜检测区聚集并产生红线。15分钟后，向底物垫滴加10微升去离子水，并翻折聚碳酸酯固定装置，使底物垫与硝基纤维素膜检测区接触10秒，使得被溶解底物转移至硝基纤维素膜上。随即打开固定装置，并用化学发光分析仪读取检测区的化学发光信号强度，曝光时间为60秒。结果如图4所示。基于可视化方法，最低检测浓度为2纳克每毫升，基于化学发光方法，最低检测浓度为0.5纳克每毫升。
在此基础上，本发明人对甲胎蛋白浓度和化学发光信号之间的关系进行了进一步分析，并进一步构建了标准曲线用于定量分析，如图5所示。
在此基础上，利用本发明所述试纸对27份血清样本中甲胎蛋白进行测试，并将检测结果与商品化方法罗氏电化学发光法得到的结果进行了比较，结果如图6所示。可以看出，两种方法得到的结果具有很强的相关性，相关系数R2达到0.98。
试验例3
本试验例用于说明本发明试纸对于叶酸(FA)检测。
利用本发明所述试纸按照试验例2的方法对叶酸标准品进行了检测，如图7所示。利用可视化方法，叶酸检测浓度范围为0.1-2纳克每毫升。基于化学发光方法，叶酸的检测范围为0.5-50纳克每毫升。
在此基础上，本发明人对叶酸浓度和化学发光信号之间的关系进行了进一步分析，并进一步构建了标准曲线用于定量分析，如图8所示。
在此基础上，利用本发明试纸对三种奶粉样本中叶酸含量进行了检测，并与传统酶联免疫方法结果进行对比，结果如表1所示。可以看到，三份样本的回收率均在95％-110％之间，变异系数小于15％。
表1本发明试纸对三种奶粉样本中叶酸含量检测结果
尽管本发明已进行了一定程度的描述，明显地，在不脱离本发明的精神和范围的条件下，可进行各个条件的适当变化。可以理解，本发明不限于所述实施方案，而归于权利要求的范围，其包括所述每个因素的等同替换。
Claims (10)
1.一种集成式免疫层析试纸，其特征在于，所述试纸基于固相化学发光体系，所述试纸包括底物垫和层析试纸；其中所述底物包括固态过氧化物，优选地，所述固态过氧化物为过硼酸钠。
2.根据权利要求1所述的试纸，其特征在于，所述底物还包括鲁米诺和对碘苯酚。
3.根据权利要求1或2所述的试纸的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)制备底物垫：配制底物混合物，用冷冻干燥方法将底物混合物溶液负载在玻璃纤维上；冻干之后，将负载有底物的玻璃纤维被裁成底物垫贴敷于聚氯乙烯垫板上；
(2)负载抗体：用硝化纤维素膜负载捕获抗体和第二抗体；
(3)标记抗体和酶：用金纳米颗粒标记检测抗体和辣根过氧化物酶；
(4)制备层析试纸：用冷冻干燥方法将金标抗体负载在玻璃纤维上作为金标抗体垫；冻干之后，将样品垫、金标抗体垫、硝基纤维素膜和吸水垫贴敷于聚氯乙烯垫板上，并裁成层析试纸；
(5)底物垫与层析试纸集成：将底物垫和层析试纸同时固定于聚碳酸酯定位器具上。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述底物混合物中，鲁米诺的浓度为50～200毫摩每升，优选为80～150毫摩每升，最优选为100毫摩每升；
对碘苯酚的浓度为50～200毫摩每升，优选为80～150毫摩每升，最优选为100毫摩每升；
过硼酸钠的浓度为10～100毫摩每升，优选为30～80毫摩每升，最优选为50毫摩每升。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，每条底物垫的长度为3～5毫米，优选为4毫米；每条底物垫的宽度为0.5～2毫米，优选为1毫米。
6.根据权利要求3至5中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述抗体浓度为1.5～2毫克每毫升，优选为捕获抗体1.7毫克每毫升，第二抗体2.0毫克每毫升。
7.根据权利要求3至6中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中：
所述金纳米颗粒的粒径为30～80纳米，优选为50～70纳米，最优选为60纳米；
标记时的抗体浓度为25～100微克每毫升，优选为30～80微克每毫升，最优选为50微克每毫升；和/或
抗体和酶的摩尔比为1：10～20，优选为1:20。
8.根据权利要求3至7中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，每条层析试纸的宽度为3～5毫米，优选为4毫米。
9.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
权利要求1或2所述的集成式免疫层析试纸。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒进一步包括：
铝箔袋以及密封在所述铝箔袋中的干燥剂，和/或滴管。
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