CN116482372A - 基于时间分辨荧光干式免疫层析法定量检测同型半胱氨酸浓度的试剂盒及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于时间分辨荧光干式免疫层析法定量检测同型半胱氨酸浓度的试剂盒及其检测方法，该试剂盒包含样本稀释液、荧光免疫层析检测卡及检测芯片；样本稀释液为pH＝7.2的PBS溶液；荧光免疫层析检测卡包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸及PVC板，且结合垫、吸水纸固定在PVC板上并与硝酸纤维素膜相接触；检测芯片内包含有所述荧光免疫层析检测卡的标准曲线数据。该试剂盒，利用免疫和层析技术相结合发展出的一种定量检测，无需大型生化仪器，通过便携干式荧光免疫分析仪即可实现检测，具有成本低廉、操作简便、检测快速、便携性强、灵敏度高和能够准确定量的优点，克服了上述HCY传统快速检测方法中检测试剂对温度要求高。

Description

基于时间分辨荧光干式免疫层析法定量检测同型半胱氨酸浓 度的试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明涉及免疫诊断技术领域，尤其涉及一种基于时间分辨荧光干式免疫层析法定量检测同型半胱氨酸浓度的试剂盒及其检测方法。

背景技术

同型半胱氨酸(homocysteine，HCY)又称高半胱氨酸，是蛋氨酸去甲基后形成的一种含硫氨基酸，属于蛋氨酸循环的中间产物。通过检测HCY水平，可以反映心血管病患者的病情发展情况以及病变严重程度。HCY水平升高是叶酸和维生素B12缺乏的敏感指标，同时还与动脉粥样硬化和冠心病的危险性成正比，是动脉粥样硬化所致心血管疾病最广泛、最强的独立危险因素。因此，检测HCY水平有助于为心血管病的临床诊断、治疗及预后等提供重要参考依据。

目前，同型半胱氨酸常用的检测方法有同位素法、高效液相色谱法、串联质谱法、酶联免疫法、酶循环法、化学发光法等。其中，同位素法、色谱法和质谱法虽然灵敏度高和准确性好，但是均需要大型仪器且由专业人员操作，而酶联免疫法、酶循环法和化学发光法则作为常用的快速检测方法。

相应地，同型半胱氨酸的检测，目前也是采用酶联免疫法、酶循环法和化学发光法，各种检测方法的优劣势如下。

(1)酶联免疫法在快速检测同型半胱氨酸中较为常用，该方法是将抗体固定在微孔板中，制成固相载体。当样本中含有特异抗原时，与其形成抗原－抗体复合物，往固相抗体中加入酶标后的抗体，经过彻底洗涤后用底物溶液显色，底物在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色，颜色的深浅和样本中的HCY成正相关，利用酶标仪测定其吸光度可计算出样本浓度。该方法的配套试剂需要保存在－20℃或者2－8℃，对贮存温度要求高，且检测所需时间较长，精密度差，容易受到污染。

(2)酶循环法是基于小分子捕获技术的S－腺苷同型半胱氨酸水解酶，HCY被转化为游离型以后，其与共价底物产生化学反应，然后循环放大，该过程同时产生腺苷，然后立即水解成次黄嘌呤氨和氨，在谷氨酸脱氢酶的作用下，氨可以使烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)转化为NAD+，样本中的HCY的浓度与NADH的变化成正比。该方法在检测过程中需要严格控制反应温度，操作繁琐。

(3)化学发光法，是将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合。该方法需要借助全自动化学发光免疫分析仪，在临床应用中尤为广泛，但其仪器设备的成本较高，且该方法所需试剂需要2－8℃中保存，不利于保存和运输成本大，对于基层的推广性不强。

发明内容

有鉴于此，本发明旨在开发一种简单、快速、低成本，且基于时间分辨荧光干式免疫层析法定量检测同型半胱氨酸浓度的试剂盒及其检测方法。

本发明通过两方面的技术方案来实现。

本发明的技术方案一如下：

一种检测同型半胱氨酸浓度的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括检测卡；所述检测卡包括试纸条和用于适配收纳所述试纸条的卡壳；所述试纸条包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸及PVC板；所述荧光免疫层析检测卡包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸及PVC板，所述PVC板为长条形构造，且所述样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸依次排列沿长度方向固定设置在所述PVC板上并；在所述结合垫上设置有浓度为3－6μL/cm的同型半胱氨酸抗体和羊抗鸡IgY抗体；硝酸纤维素膜上设有相互间隔排列的检测线和质控线；所述检测线设置有0.8－1.2μL/cm同型半胱氨酸－牛血清白蛋白结合物；所述质控线上设有0.8－1.2μL/cm鸡IgY抗体。

一实施例，所述试剂盒中，所述样品垫与结合垫的接触部分采用层叠扣压搭接；所述结合垫与所述硝酸纤维素膜一端接触部分采用层叠扣压搭接，所述吸水纸与所述硝酸纤维素膜另一端接触部分采用层叠扣压搭接。

一实施例，所述试剂盒中，所述试剂盒还包括检测芯片，该检测芯片内含有所述检测卡的标准曲线数据。

一实施例，所述试剂盒中，所述试剂盒还包括pH为7.2的PBS样本稀释液。

一实施例，所述试剂盒中，每升所述样本稀释液中各组分的含量是：10mmol/L的PBS缓冲液及0.01－0.10％PC300。

一实施例，所述试剂盒中，所述结合垫采用如下方法制得：

首先，取固含量为1％的时间分辨荧光微球加入标记缓冲液MES，涡旋混匀离心处理，留取沉淀，加入同型半胱氨酸抗体并再次离心，留取沉淀，加入标记保存液，制得标记好的同型半胱氨酸抗体溶液；

随后，取固含量为1％的时间分辨荧光微球加入标记缓冲液MES，涡旋混匀离心处理，留取沉淀，加入羊抗鸡IgY抗体并再次离心，留取沉淀，加入标记保存液，制得标记好的羊抗鸡IgY抗体溶液；

接着，将所述标记好的羊抗鸡IgY抗体溶液与标记好的同型半胱氨酸抗体溶液混溶后，制得荧光荧光微球标记抗体溶液；

最后，将制备好的荧光微球标记抗体溶液喷涂在玻璃纤维素膜上，经干燥处理，制得含同型半胱氨酸抗体的结合垫。

一实施例，所述试剂盒中，所述样品垫采用如下方法制得：

首先，将玻璃纤维制得玻璃纤维膜材质构造的样品垫样品；

将0.1M PB溶液、0.5－1％BSA(牛血清白蛋白)及0.05％－0.1％吐温20配制样品垫处理液；

将所述样品垫处理液均匀涂抹在样品垫样品上，在18－28℃干燥16－24h，获得样品垫；

一实施例，所述试剂盒中，所述硝酸纤维素膜需要包被处理，步骤如下：

取0.05M三羟甲基氨基甲烷及1％蔗糖混合，配制包被液；将硝酸纤维素膜贴在PVC板上，用所述包被液包被，37℃干燥24－28h，制得包被的硝酸纤维素膜。

一实施例，所述试剂盒中，所述卡壳的外形构造为长条状，该卡壳与试纸条相适配；在所述卡壳上设有加样孔。

本发明提供的技术方案二如下：

一种使用上述试剂盒进行同型半胱氨酸浓度的检测方法，包括步骤：

将血清、血浆或全血样本与检测试剂混合，得到混合样本；

取所述混合样本加样到检测卡的加样孔上，15分钟后在已识别检测芯片信息的干式荧光免疫分析仪上读取检测线和质控线的荧光信号值，根据比值，得到对应的同型半胱氨酸样本浓度含量。

本发明提供的基于时间分辨荧光干式免疫层析法定量检测同型半胱氨酸浓度的试剂盒，利用免疫和层析技术相结合发展出的一种定量检测，无需大型生化仪器，通过便携干式荧光免疫分析仪即可实现检测，具有成本低廉、操作简便、检测快速、便携性强、灵敏度高和能够准确定量的优点，克服了上述HCY传统快速检测方法中检测试剂对温度要求高，或者需借助大型仪器设备的不足，便于在临床及社区家庭推广，易于广泛使用；同时，该试剂盒的检测方法，可以反映心血管病患者的病情发展情况以及病变严重程度，便于同型半胱氨酸的临床辅助快速检测。

附图说明

图1为本发明提供的检测卡结构示意图；其中，外面的卡壳中内置有试纸条；

图2为本发明提供的试纸条结构示意图；

图3为实施例2中，同型半胱氨酸荧光免疫层析定量检测曲线图；

图4为实施例5中，基于竞争法荧光免疫层析的同型半胱氨酸测定试剂盒及工艺条件下的检测曲线图。

具体实施方式

下面结合附图，对本发明的较佳实施例作进一步详细说明。

本发明实现原理如下：

本发明采用基于时间分辨荧光干式免疫层析法技术，利用稀土－澜系元素(即标记抗体时使用的时间分辨荧光微球)标记同型半胱氨酸(HCY)抗体，检测同型半胱氨酸浓度。

镧系元素与普通的荧光团比较，具体体现在以下几个方面优势：

①镧系元素离子螯合物荧光的衰变时间长；

②具有较宽的激发光谱带和较窄的发射光谱带，很容易分辨激发光和发射光，从而排除激发光干扰；

③Stokes位移大，可达200nm，而普通荧光物质Stokes位移只有几十纳米，激发光谱和发射光谱通常有部分重叠，互相干扰严重。

以上特点可以有效排除激发光和非特异性荧光的干扰，提高信噪比和灵敏度，且标记物稳定，抗干扰强，检测结果重复性好。

因此，检测卡加样反应结束后，用紫外光源对检测区扫描检测，检测线和质控线上荧光微球发出高强度的荧光，且衰变时间也较长。利用延缓测量时间，待样本中自然发生的短寿命荧光(1－10ns)全部衰变后，再测量稀土元素的特异性荧光，这样就可以完全排除特异本底荧光的干扰。通过检测线和质控线荧光强度的强弱及其比值，即可分析出样本中同型半胱氨酸的浓度。

本发明中提供了一种基于时间分辨荧光干式免疫层析法定量检测同型半胱氨酸浓度的方法，也是采用同型半胱氨酸荧光免疫层析定量检测方法，即将同型半胱氨酸与时间分辨荧光微球混合固定到试纸条上，通过竞争法荧光免疫层析试纸条，并采用便携干式荧光免疫分析仪检测试纸条上检测线和质控线的荧光信号值，根据比值，定量同型半胱氨酸的浓度水平。

一种检测同型半胱氨酸浓度的试剂盒，也称为同型半胱氨酸荧光免疫层析测定试剂盒，其包含样本稀释液、检测卡(又称荧光免疫层析检测卡)和检测芯片三个部分；其中，样本稀释液为pH＝7.2的PBS溶液，检测芯片上内置有与本次检测相同的标准曲线信息数据。

如图1和2所示，荧光免疫层析检测卡包括试纸条10和用于纳置试纸条的卡壳20。其中，卡壳20为长条状构造，其设有加样孔21及检测结果显示区22；加样孔21与试纸条10的样品垫11相对应，该检测结果显示区22与硝酸纤维素膜13相对应，用于显示硝酸纤维素膜13的质控线32和检测线31的检测结果。试纸条10包括样品垫11、结合垫12、硝酸纤维素膜13、吸水纸14及PVC板14，PVC板14为条状构造，与卡壳20相适配纳置。所述样品垫11、结合垫12、硝酸纤维素膜13及吸水纸14依序固定在PVC板15上。样品垫11与结合垫12的接触部分采用层叠扣压搭接；结合垫12与硝酸纤维素膜13一端接触部分采用层叠扣压搭接，吸水纸14与硝酸纤维素膜13另一端接触部分采用层叠扣压搭接。硝酸纤维素膜13上设有相互间隔排列的检测线31和质控线32；检测芯片内包含有所述荧光免疫层析检测卡的标准曲线数据。同型半胱氨酸抗体和羊抗鸡IgY抗体设置在结合垫上，硝酸纤维素膜上设有同型半胱氨酸－牛血清白蛋白结合物作为检测线和鸡IgY抗体作为质控线，通过竞争法定量检测同型半胱氨酸；检测芯片内包含有该试剂盒检测卡的曲线数据等信息。

同型半胱氨酸荧光免疫层析测定试剂盒中，每升样本稀释液中各组分的含量是：10mmol/L的PBS缓冲液中，添加0.01－0.10％PC300。

同型半胱氨酸荧光免疫层析测定试剂盒中，在所述结合垫上设置有浓度为3－6μL/cm的同型半胱氨酸抗体和羊抗鸡IgY抗体；所述检测线设置有0.8－1.2μL/cm同型半胱氨酸－牛血清白蛋白结合物；所述质控线上设有0.8－1.2μL/cm鸡IgY抗体。

本发明提供一种检测同型半胱氨酸浓度的试剂盒，该试剂盒基于免疫和层析技术，使得检测体系可以直接对血清、血浆和全血样本进行检测。具体实施步骤如下：

步骤一、结合垫的制备

HCY抗体标记：取固含量为1％的时间分辨荧光微球100uL加入标记缓冲液MES1mL，涡旋混匀后加入100uL标记活化液，混匀后旋转反应20－40分钟，待反应完成后，进行10000rpm、4℃离心20－40min，离心结束去除上清，留取沉淀，加入标记缓冲液MES 1mL，超声混匀，加入50－80μg HCY抗体，旋转反应20－40分钟，反应完成后加入封闭液100uL，旋转反应2h，封闭完成后10000rpm、4℃离心20－40min，离心结束去除上清，留取沉淀，加入标记保存液5mL，超声混匀，制得标记好的同型半胱氨酸抗体溶液，2～8℃保存备用。

羊抗鸡IgY抗体标记：取固含量为1％的时间分辨荧光微球100uL加入标记缓冲液MES 1mL，涡旋混匀后加入100uL标记活化液，混匀后旋转反应20－40分钟，待反应完成后，进行10000rpm、4℃离心20－40min，离心结束去除上清，留取沉淀，加入标记缓冲液MES1mL，超声混匀，加入50－80μg羊抗鸡IgY抗体，旋转反应20－40分钟，反应完成后加入封闭液100uL，旋转反应2h，封闭完成后10000rpm、4℃离心20－40min，离心结束去除上清，留取沉淀，加入标记保存液5mL，超声混匀，制得标记好的羊抗鸡IgY抗体溶液，2～8℃保存备用。

将上述标记好的羊抗鸡IgY抗体溶液和标记好的同型半胱氨酸抗体溶液等体积混合，超声混匀，2－8℃保存。

将制备好的荧光微球标记抗体溶液以3－6μL/cm的喷量均匀喷在玻璃纤维素膜上，在37℃下干燥(16～20)h，制得含同型半胱氨酸抗体的结合垫。

步骤二、样品垫的制备

将玻璃纤维制得玻璃纤维膜材质构造的样品垫样品；

样品垫处理液的配制：0.1M PB溶液，0.5－1％BSA(牛血清白蛋白)，0.05％－0.1％吐温20。

样品垫处理：将上述处理液按50mL/张(宽：25cm，长：30cm)的处理量均匀涂抹在样品垫上，在18－28℃干燥16－24h，即可。将干燥后的样品垫上下两条长边各裁去5mm，然后裁为(23±1)mm×(300±10)mm大小，备用。

步骤三、硝酸纤维素膜的处理

包被液配制：0.05M Tris(三羟甲基氨基甲烷)，1％蔗糖。

喷垫：将硝酸纤维素膜贴在PVC板上，用上述包被液包被抗体，HCY－BSA偶联抗原包被浓度为0.8－1.2mg/mL，质控线上抗体的包被浓度为0.8－1.2mg/mL，划膜量为0.8－1.2μL/cm，37℃干燥24－28h。其中，划膜量优选为0.9－1.1μL/cm。

步骤四、组装

将处理好的样品垫、结合垫、吸水纸依次贴在PVC板上，经切条机将组装好的PVC板切割成3.85－4.00mm宽度的免疫层析试纸条。所述样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜及吸水纸依序固定在PVC板上，所述结合垫、吸水纸与PVC板上的硝酸纤维素膜相接触，用裁条机将组装好的PVC板切割成3.80－4.00mm宽度的免疫层析试纸条。将每一试纸条装入荧光卡壳下盖中，装好后，盖上上盖，置于压卡机上，调整压壳机高度为3.5mm，使荧光卡壳上下盖紧密结合，即为检测卡。

步骤五、芯片数据

在干式荧光免疫实验管理工具上，将准备的曲线数据填入表格中，利用MMF Model四参数增长曲线拟合，完成曲线的制备，将上述芯片数据于编程器中烧制芯片。

步骤六、样本稀释液

在1L 10mmol/L的PBS缓冲液中，添加0.01－0.10％PC300，搅拌均匀即检测试剂。

步骤七、结果读取及分析

在干式荧光免疫分析仪中读取芯片数据。取血清、血浆或全血样本100uL加入300uL样本稀释液中，混合均匀，取100μL该混合样本加样到检测卡加样孔上，15分钟后在已读取芯片数据的干式荧光免疫分析仪上读取检测线和质控线的荧光信号值，根据比值，得到对应的同型半胱氨酸样本含量。

本发明提供的检测同型半胱氨酸浓度的检测方法，采用上述同型半胱氨酸荧光免疫层析测定试剂盒，其检测方法为：

1、将血清、血浆或全血样本(100μL)与检测试剂(300μL)混合，得到混合样本；

2、取100μL该混合样本加样到检测卡加样孔上，15分钟后在已识别芯片信息的干式荧光免疫分析仪上读取检测线和质控线的荧光信号值，根据比值，得到对应的同型半胱氨酸样本含量。

下面通过几个实施例进一步详细说明

实施例1一种同型半胱氨酸测定试剂盒的组成成分、包装及数量(25人份/盒)，如表1所示。

表1试剂盒的组成成分、包装及数量

实施例2试剂盒的样本检测范围及灵敏度检测实验

用处理过的阴性血清配制浓度梯度的同型半胱氨酸(3，6，15，30，50μmol/L)标准液，每个样本检测三次，取其平均值，将测定浓度的平均值与理论浓度用最小二乘法进行直线拟合，得到线性回归方程：y＝1.0091x－0.501，r 2＝0.9972，P＜0.05，该方法在3－50μmol/L浓度范围内线性较好，如附图1所示。

本试剂盒的检出限为3μmol/L，线性范围为3－50μmol/L。

实施例3试剂盒的准确度检测

配制中值和高值的同型半胱氨酸标准液15和30μmol/L，每个样本检测3次，计算其相对偏差。结果表明本发明检测准确度较好，水平1(15μmol/L)的相对偏差(Bi)分别为－5.33％、－6.93％、4.60％，水平2(30μmol/L)的Bi值分别为－2.20％、－8.80％、4.13％，试剂盒准确度的检测结果不超过±10％，符合检测要求。本试剂盒准确度检测结果如表2所示。

表2准确度检测结果

实施例4试剂盒的精密性检测

配制中值和高值的同型半胱氨酸标准液15和30μmol/L，每个样本检测10次，计算其变异系数。结果表明本发明检测精密性较好，水平1(15μmol/L)的变异系数(CV)为5.80％，水平2(30μmol/L)的CV值为4.98％，试剂盒精密性的检测结果不超过10％，符合检测要求。本试剂盒精密性度检测结果如表3所示。

表3精密性检测结果

实施例5试剂盒的稳定性检测

制备一批同型半胱氨酸荧光免疫层析测定试剂盒，常温(2－30℃)贮存一年，每间隔一个月检测同一浓度同型半胱氨酸样本，观察其检测结果的变化，如附图2所示。可以看出，本发明试剂盒在一年的贮存过程中检测结果基本保持不变，性能稳定，为实际应用奠定基础。

应当理解的是，上述针对本发明较佳实施例的表述较为详细，并不能因此而认为是对本发明专利保护范围的限制，本发明的专利保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种基于时间分辨荧光干式免疫层析法定量检测同型半胱氨酸浓度的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括检测卡；所述检测卡包括试纸条和用于适配收纳所述试纸条的卡壳；所述试纸条包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸及PVC板；所述荧光免疫层析检测卡包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸及PVC板，所述PVC板为长条形构造，且所述样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸依次排列沿长度方向固定设置在所述PVC板上并；在所述结合垫上设置有浓度为3－6μL/cm的同型半胱氨酸抗体和羊抗鸡IgY抗体；硝酸纤维素膜上设有相互间隔排列的检测线和质控线；所述检测线设置有0.8－1.2μL/cm同型半胱氨酸－牛血清白蛋白结合物；所述质控线上设有0.8－1.2μL/cm鸡IgY抗体。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述样品垫与结合垫的接触部分采用层叠扣压搭接；所述结合垫与所述硝酸纤维素膜一端接触部分采用层叠扣压搭接，所述吸水纸与所述硝酸纤维素膜另一端接触部分采用层叠扣压搭接。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括pH为7.2的PBS样本稀释液。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，每升所述样本稀释液中，各组分的含量是：10mmol/L的PBS缓冲液及0.01－0.10％PC300。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括检测芯片，该检测芯片内含有所述检测卡的标准曲线数据。

6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述结合垫采用如下方法制得：

首先，取固含量为1％的时间分辨荧光微球加入标记缓冲液MES，涡旋混匀离心处理，留取沉淀，加入同型半胱氨酸抗体并再次离心，留取沉淀，加入标记保存液，制得标记好的同型半胱氨酸抗体溶液；

随后，取固含量为1％的时间分辨荧光微球加入标记缓冲液MES，涡旋混匀离心处理，留取沉淀，加入羊抗鸡IgY抗体并再次离心，留取沉淀，加入标记保存液，制得标记好的羊抗鸡IgY抗体溶液；

接着，将所述标记好的羊抗鸡IgY抗体溶液与标记好的同型半胱氨酸抗体溶液混溶后，制得荧光微球标记抗体溶液；

最后，将制备好的荧光微球标记抗体溶液喷涂在玻璃纤维素膜上，经干燥处理，制得含同型半胱氨酸抗体的结合垫。

7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述样品垫采用如下方法制得：

首先，将玻璃纤维制得玻璃纤维膜材质构造的样品垫样品；

将0.1M PB溶液、0.5－1％BSA(牛血清白蛋白)及0.05％－0.1％吐温20配制样品垫处理液；

将所述样品垫处理液均匀涂抹在样品垫样品上，在18－28℃干燥16－24h，获得样品垫。

8.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述硝酸纤维素膜需要包被处理，步骤如下：

取0.05M三羟甲基氨基甲烷及1％蔗糖混合，配制包被液；将硝酸纤维素膜贴在PVC板上，用所述包被液包被，37℃干燥24－28h，制得包被的硝酸纤维素膜。

9.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述卡壳的外形构造为长条状，该卡壳与试纸条相适配；在所述卡壳上设有加样孔。

10.一种使用权利要求1至9任一所述试剂盒进行同型半胱氨酸浓度的检测方法，其特征在于，包括步骤：

将血清、血浆或全血样本与检测试剂混合，得到混合样本；

取所述混合样本加样到检测卡的加样孔上，15分钟后在已识别检测芯片信息的干式荧光免疫分析仪上读取检测线和质控线的荧光信号值，根据比值，得到对应的同型半胱氨酸样本浓度含量。