CN110596396B - 一种检测蛋白的方法以及试纸条和试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明属于大分子检测领域，涉及一种检测蛋白的方法以及试纸条和试剂盒。该方法包括以下步骤：(1)将待检测物、标记抗体和复合物孵育，得到混合物；所述标记抗体为目标蛋白的特异性抗体且标记有信号物质；所述复合物为目标蛋白的特异性抗体与识别元件形成的复合物；(2)使所述混合物依次经过检测区和质控区；所述检测区固定设置有所述识别元件的特异性抗体；所述质控区固定设置有所述目标蛋白的二抗；(3)根据检测区与质控区的信号强度判断所述待检测物中目标蛋白的含量。本发明中，夹心反应在预孵育步骤进行，时间可控性强，并且更充分地暴露抗原表位，使反应灵敏度更高。同时，相同的试纸可以实现不同目标蛋白的检测，具有通用性。

Description

一种检测蛋白的方法以及试纸条和试剂盒

技术领域

本发明属于大分子检测领域，更具体地，涉及一种检测蛋白的方法、一种蛋白质检测试纸条，以及一种蛋白质检测试剂盒。

背景技术

在蛋白检测领域，基于色谱分离原理的免疫层析试纸的测定原理是将待测物特异性抗体预先固定到试纸测定区。在毛细管力作用下，样品中的待测蛋白与释放垫上的标记抗体流动到测定区位置，固定化抗体与溶液中标记抗体与溶液中待测蛋白形成“夹心”免疫复合物。测定区显色强度或者信号强度与待测蛋白含量呈正比。

由于测定迅速、成本低廉、信号响应直观，易于现场使用，层析检测法在食品安全、临床医疗等多个领域已经得到越来越广泛的应用。但是，该类试纸技术上存在一定的不足：1、待测物抗体固定化不利于竞争结合反应充分进行，限制了检测灵敏度。2、在层析试纸检测区发生的竞争结合反应影响条件多，不利于检测灵敏度的发挥。3、高灵敏与通用性相结合检测蛋白的免疫层析技术还未见相关报道。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的是针对现有免疫层析产品的不足，提供一种通用性蛋白质检测方法以及高灵敏免疫层析试纸和试剂盒，实现信号响应灵敏度的提高。

为了实现上述目的，本发明的第一方面提供一种检测蛋白的方法，该方法包括以下步骤：

(1)将待检测物、标记抗体和复合物孵育，得到混合物；其中，所述标记抗体为目标蛋白的特异性抗体且标记有信号物质；所述复合物为目标蛋白的特异性抗体与识别元件形成的复合物；

(2)使步骤(1)得到的混合物依次经过检测区和质控区；其中，所述检测区固定设置有所述识别元件的特异性抗体；所述质控区固定设置有所述目标蛋白的二抗；

(3)根据所述检测区与所述质控区的信号强度判断所述待检测物中目标蛋白的含量。

现有蛋白质的检测方法有多种，其中，免疫层析检测试纸条一般在加样区设置待测蛋白的识别结合元件，然后再经过后续的检测区和质控区，实现蛋白质的检测。而在实际应用中，存在检测灵敏度以及通用性的问题，经研究发现，由于待检测物质在试纸条上预设的上样区反应不够充分，使得待检测物质中的蛋白不能与上样区设置的识别结合元件反应充分，进而影响其检测灵敏度。

相对于现有的检测方法，本发明将待检测物、标记抗体和复合物孵育，采用孵育的方式进行“夹心”结合反应，使得免疫识别反应进行得更充分，测定灵敏度更高。并且，本发明中孵育条件可根据相应的物质反应做出，提高反应的可控性，检测应用范围更广。

本发明中，若待检测物中含有目标蛋白，则得到的混合物为标记抗体-目标蛋白-复合物；若待检测中不含有目标蛋白，则不会形成免疫复合物。本发明步骤(3)中根据所述检测区与所述质控区的信号强度判断所述待检测物中目标蛋白的含量。具体地，可通过检测区和质控区的相对信号强度判断待检测物中目标蛋白的含量，更准确、更灵敏。当含量低于可检测值时，可认定待检测物中不含目标蛋白。因此，本发明的方法既可为定性检测方法，亦可为定量检测方法。

根据本发明的方法，所述标记抗体所用的信号物质可采用本领域常规的各种信号物质，包括但不限于荧光染料、磷光材料、磁性纳米材料、碳纳米材料、荧光量子点、生物素、放射性同位素、电子致密物质、胶体金和酶中的至少一种；优选地，所述荧光染料包括Alexa系列染料、氨基吖啶、BODIPY荧光染料、荧光素及其衍生物和邻苯二酚类荧光染料中的至少一种。

根据本发明的方法，所述识别元件可以为具有与目标蛋白结合的属性的通用性识别元件，采用通用性识别元件物质作为识别目标蛋白的结合物质，可扩展应用范围。优选地，所述识别元件为卵清蛋白(OVA)、血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(THY)和鸡卵白蛋白(HAS)中的至少一种。

本发明的方法可用于检测各种满足本发明原理的目标蛋白，具体地，所述目标蛋白包括但不限于犬冠状病毒(CCV)、C反应蛋白(CRP)、牛β-酪蛋白、骨骼肌肌钙蛋白、β伴大豆球蛋白、对称性二甲基精氨酸(CDMA)和非对称性二甲基精氨酸(ADMA)中的至少一种；优选为C反应蛋白和/或对称性二甲基精氨酸。

本发明对具体的孵育方法没有特别限定，优选地，步骤(1)中，所述孵育的温度为25-40℃，优选为35-37℃；所述孵育的时间为5-20min；所述孵育在缓冲液中进行，所述缓冲液的组成包括：以0.04-0.06mol/L磷酸盐缓冲液为基准，添加有以下重量百分数的物质：蔗糖1.5-2.5％，果糖4-6％，PEG 0.8-1.2％，Tween-20 2.5-3.5％。

根据本发明的方法，孵育体系中各物质的浓度和用量可根据需要调整，本发明对此并无特别限定。例如，所述标记抗体的浓度为0.1-5ng/mL，所述复合物的浓度为80-120ng/mL。

本发明的第二方面提供一种蛋白质检测试纸条，该试纸条包括样品垫、吸水垫和固定有硝酸纤维膜的底板，所述样品垫和所述吸水垫设置于所述底板上且位于所述底板上相对的两侧；其中，

所述样品垫用于承载待检测物、标记抗体和复合物的孵育物。

所述标记抗体为目标蛋白的特异性抗体且标记有信号物质，所述复合物为目标蛋白的特异性抗体与识别元件形成的复合物；

所述硝酸纤维膜设置有检测区和质控区；所述检测区固定设置有所述识别元件的特异性抗体；所述质控区固定设置有所述目标蛋白的二抗。

本发明提供的通用性免疫层析试纸，通过引入预孵育步骤实现“夹心”结合反应，检测区与质控区位于硝酸纤维膜垫上，与试纸长轴垂直分布，检测区包被可识别预孵育步骤中形成的免疫复合物的识别元件抗体，质控区包被对应标记抗体的二抗，如羊抗鼠二抗。即，若目标蛋白为CDMA，则质控区包被对应CDMA抗体的二抗。

在对待检测物进行检测时，待检测物、标记抗体和复合物进行孵育，得到的混合物加入样品垫，经吸水垫的吸水力，混合物进入反应区，若待检测物中含有待测蛋白质(目标蛋白)，得到的混合物为标记抗体-目标蛋白-复合物构成的免疫复合物，该免疫复合物与检测区的抗识别元件的抗体结合，而标记抗体和复合物与质控区的对应目标蛋白抗体的二抗结合，通过检测区和质控区的信号强度判断待检测物中目标蛋白的含量；而若待检测物中不含有目标蛋白，则不形成免疫复合物。本发明提供的蛋白质检测试纸条，为蛋白质的检测提供便利。

本发明中，所述底板可以为不吸水材料，PVC或其它硬质材料；样品垫可以为吸滤纸或玻璃纤维膜；吸水垫可以为吸水纸。

另外，本发明中，检测区和质控区仅是用于功能性区分，所述“区”的形式可以为“线”或具有一定几何形状的“区域”。根据本发明一种具体实施方式，所述检测区和质控区以检测线和质控线的形式存在。

根据本发明，所述蛋白质检测试纸条中涉及的所述标记抗体、识别元件、目标蛋白、复合物与前述相同，在此不再赘述。本发明对试纸条上各组分的量并无特别限定，本领域技术人员可基于本发明的原理并根据实际需要确定。

本发明的第三方面提供一种蛋白质检测试剂盒，该蛋白质检测试剂盒包括：

上述蛋白质检测试纸条；

孵育液，所述孵育液的组成如下：以0.04-0.06mol/L磷酸盐缓冲液为基准，添加有以下重量百分数的物质：蔗糖1.5-2.5％，果糖4-6％，PEG 0.8-1.2％，Tween-20 2.5-3.5％；以及，

任选的目标蛋白的标准曲线图卡片。

本发明中，“目标蛋白”亦可称为“待测蛋白”，其含义为本领域技术人员公知，即指想要检测的蛋白。

本发明提供的试剂盒可以根据试验情况，制备标准曲线图，以最后根据信号强度判断蛋白质的含量，也可以试剂盒携带标准曲线图，便于参照标准曲线图得到蛋白质的含量。

根据本发明一种具体实施方式，以识别元件为BSA为例，在实际检测中，随着层析过程的进行，发生下列反应：

溶液中一定含量的标记抗体与目标蛋白抗体-BSA复合物“夹心”结合目标蛋白；目标蛋白抗体-BSA复合物与标记抗体及目标蛋白“夹心”形成的免疫复合物与检测区的BSA抗体相结合；质控区的羊抗鼠二抗与未与目标蛋白结合形成免疫复合物的标记抗体及目标蛋白抗体-BSA复合物结合；由于标记抗体含量的多少决定信号响应的强度，而检测区信号的强度与目标蛋白含量呈正比，质控区信号的强度与目标蛋白含量呈反比，因此通过对比检测区信号的相对强度判断目标蛋白的含量。

与现有技术相比，本发明的有益效果包括：

(1)本发明中，“夹心”反应在预孵育步骤进行，时间可控性强，并且更充分地暴露抗原表位，由于具有更充足的反应时间与更充分的表位暴露，反应可以更充分地进行，使得该“夹心”反应灵敏度更高。

(2)本发明中，检测区固定的是通用性识别元件，不因待测物的改变而改变，因此，本发明提供的检测方法及其试纸条和试剂盒的适用范围更广。

(3)本发明实现了免疫反应的灵敏度、特异性与通用性的有机融合，实现待检测物的高灵敏度定量检测。

(4)本发明的方法和产品可用于食品安全、临床诊断、检验检疫等诸多领域，具有广阔的市场前景。

本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

通过结合附图对本发明示例性实施方式进行更详细的描述，本发明的上述以及其它目的、特征和优势将变得更加明显。

图1为本发明实施例1涉及的蛋白质检测试纸条的原理示意图；

图2为本发明实施例2中的标准曲线图。

具体实施方式

下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。

实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下实施例中，孵育液的组成如下：以0.05mol/L磷酸盐缓冲液为基准，添加有以下重量百分数的物质：蔗糖2％，果糖5％，PEG 1％，Tween-203％。

实施例1

本实施例以检测SDMA为例，说明本发明试纸条的制备。

通用性识别元件选用BSA，信号物质选用荧光量子点微球(QB)，试纸条的制备方法包括以下步骤：

1)NC膜检测区包被BSA抗体，包被过程：用孵育液将BSA抗体稀释到0.25mg/ml，用Isoflow喷金划膜仪将其包被于硝酸纤维膜上的检测区，包被量为1.0μl/cm；将包被好的反应膜置于37℃条件下干燥2h，备用。

2)NC膜质控区包被SDMA的二抗，用孵育液将SDMA的二抗稀释到浓度为0.5mg/mL，用Isoflow喷金划膜仪将其包被于硝酸纤维膜上的检测区，包被量为1.0μl/cm；将包被好的反应膜置于37℃条件下干燥2h，备用。

3)采用商品化试剂盒制备标记抗体，使用羧基化修饰的量子点微球(QB)，制得QB标记的SDMA抗体。商购SDMA抗体-BSA复合物。

4)在底板上依次组装玻璃纤维垫、NC膜、吸水纸垫制备成试纸条；在2～8℃的环境中储存，有效期12个月。

实施例2

本实施例以犬尿液中SDMA的检测为例进行说明：以实施例1制得的试纸条进行试验，制备标准曲线：

(1)用孵育液制备不同浓度的SDMA标准品溶液：1.28ng/mL、0.64ng/mL、0.32ng/mL、0.16ng/mL、0.08ng/mL、0.04ng/mL、0.02ng/mL、0.01ng/mL；

(2)终浓度为0.1μg/100μL的SDMA抗体-BSA复合物溶液、终浓度为1ng/mL的QB-SDMA抗体(QB-mAb，购自北京纳晶生物科技有限公司，产品型号：QBB12117，H07187M)分别与不同浓度的SDMA标准品混合，在37℃条件下孵育10min，形成免疫复合物QB-SDMA抗体-SDMA-SDMA抗体-BSA；

(3)孵育后溶液加入玻璃纤维垫，经吸水垫的吸力作用，依次经过反应膜(NC膜)检测区和质控区，经过检测区时，QB-SDMA抗体-SDMA-SDMA抗体-BSA免疫复合物与检测区BSA抗体相结合；经过质控区时，QB-SDMA抗体及SDMA抗体-BSA与羊抗鼠二抗相结合；

(4)孵育后溶液加入免疫层析试纸层析反应进行15min后用读数仪读取数据，在365nm紫外光激发下，通过检测器测定区与质控区显色条带的相对信号强度进行结果定量判读，分析记录结果。

(5)得到的数据制得的标准曲线如图2所示。得到的拟合方程如下：y＝110.17-110.74×(x/0.18)^{^1.09}。

从图2可以看出，最低检测浓度低于0.7ng/mL。

实施例3

本实施例用于说明对待检测样本(犬尿液加入SDMA)进行检测，步骤如下：

(1)将实施例1制得的试纸平衡至室温；

(2)SDMA加标的犬尿液用孵育液进行等体积稀释，所得稀释液进行免疫层析过程；

(3)犬加标尿样经稀释后所获稀释液在37℃条件下与标记抗体(QB-anti-SDMA-mAb)及SDMA抗体-BSA(anti-SDMA-mAb-BSA)孵育11min，各组分浓度、孵育条件均与实施例2相同，形成免疫复合物QB-anti-SDMA-mAb-SDMA-anti-SDMA-mAb-BSA；

(4)孵育后溶液加入玻璃纤维垫，经吸水垫的吸力作用，依次经过反应膜(NC膜)检测区和质控区，经过检测区时，QB-anti-SDMA-mAb-SDMA-anti-SDMA-mAb-BSA免疫复合物与检测区BSA抗体相结合；经过质控区时，QB-anti-SDMA-mAb及anti-SDMA-mAb-BSA与羊抗鼠二抗相结合；

(5)在365nm紫外光激发下，通过检测器测定区与质控区显色条带的相对信号强度进行结果定量判读。根据实施例2中的标准曲线，检测结果如表1所示。

表1样品检测结果

^a均数±标准差。

从该检测结果可以看出，本发明提供的试剂盒检测准确度高。

以上实施例对本发明所提供的通用性免疫层析试纸、试剂盒和一种检测SDMA的方法进行了详细介绍。本发明所述通用性免疫层析试纸可针对各种目标蛋白，包括但不限于CCV、CRP、SDMA、ADMA等大分子，可用于食品安全、临床诊断等领域。

以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。

Claims (11)

1.一种检测蛋白的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

（1）将待检测物、标记抗体和复合物孵育，得到混合物；其中，所述标记抗体为目标蛋白的特异性抗体且标记有信号物质；所述复合物为目标蛋白的特异性抗体与识别元件形成的复合物；

（2）使步骤（1）得到的混合物依次经过检测区和质控区；其中，所述检测区固定设置有所述识别元件的特异性抗体；所述质控区固定设置有所述目标蛋白的二抗；

（3）根据所述检测区与所述质控区的信号强度判断所述待检测物中目标蛋白的含量；

所述识别元件为卵清蛋白、血蓝蛋白、牛血清白蛋白、人血清白蛋白和鸡卵白蛋白中的至少一种；

所述目标蛋白为犬冠状病毒、C反应蛋白、牛β-酪蛋白、骨骼肌肌钙蛋白、β伴大豆球蛋白、对称性二甲基精氨酸和非对称性二甲基精氨酸中的至少一种。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述信号物质包括荧光染料、磷光材料、磁性纳米材料、碳纳米材料、荧光量子点、生物素、放射性同位素、电子致密物质、胶体金和酶中的至少一种。

3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述荧光染料包括Alexa系列染料、氨基吖啶、BODIPY荧光染料、荧光素及其衍生物和邻苯二酚类荧光染料中的至少一种。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述目标蛋白为C反应蛋白和/或对称性二甲基精氨酸。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤（1）中，所述孵育的温度为25-40℃；所述孵育的时间为5-20min；所述孵育在缓冲液中进行，所述缓冲液的组成包括：以0.04-0.06mol/L磷酸盐缓冲液为基准，添加有以下重量百分数的物质：蔗糖1.5-2.5%，果糖4-6%，PEG 0.8-1.2%，Tween-20 2.5-3.5%；

孵育体系中，所述标记抗体的浓度为0.1-5 ng/mL，所述复合物的浓度为80-120 ng/mL。

6.根据权利要求5所述的方法，其中，步骤（1）中，所述孵育的温度为35-37℃。

7.一种蛋白质检测试纸条，其特征在于，该试纸条包括样品垫、吸水垫和固定有硝酸纤维膜的底板，所述样品垫和所述吸水垫设置于所述底板上且位于所述底板上相对的两侧；其中，

所述样品垫用于承载待检测物、标记抗体和复合物的孵育物；

所述标记抗体为目标蛋白的特异性抗体且标记有信号物质，所述复合物为目标蛋白的特异性抗体与识别元件形成的复合物；

所述硝酸纤维膜设置有检测区和质控区；所述检测区固定设置有所述识别元件的特异性抗体；所述质控区固定设置有所述目标蛋白的二抗；

所述识别元件为卵清蛋白、血蓝蛋白、牛血清白蛋白、人血清白蛋白和鸡卵白蛋白中的至少一种；

所述目标蛋白为犬冠状病毒、C反应蛋白、牛β-酪蛋白、骨骼肌肌钙蛋白、β伴大豆球蛋白、对称性二甲基精氨酸和非对称性二甲基精氨酸中的至少一种。

8.根据权利要求7所述的蛋白质检测试纸条，其中，所述信号物质包括荧光染料、磷光材料、磁性纳米材料、碳纳米材料、荧光量子点、生物素、放射性同位素、电子致密物质、胶体金和酶中的至少一种。

9.根据权利要求8所述的蛋白质检测试纸条，其中，所述荧光染料包括Alexa系列染料、氨基吖啶、BODIPY荧光染料、荧光素及其衍生物和邻苯二酚类荧光染料中的至少一种。

10.根据权利要求7所述的蛋白质检测试纸条，其中，所述目标蛋白为C反应蛋白和/或对称性二甲基精氨酸。

11.一种蛋白质检测试剂盒，其特征在于，该蛋白质检测试剂盒包括：

权利要求7-10中任意一项所述的蛋白质检测试纸条；

孵育液，所述孵育液的组成如下：以0.04-0.06mol/L磷酸盐缓冲液为基准，添加有以下重量百分数的物质：蔗糖1.5-2.5%，果糖4-6%，PEG 0.8-1.2%，Tween-20 2.5-3.5%；以及，

任选的标准曲线图卡片。

Images