JP2000245499A - 改良された化学発光試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ペルオキシダーゼ酵素量に依存して過酸
化物により化学発光し、且つ長期間に亘ってその性能を
保持することができる改良された化学発光試薬を提供す
る。 【解決手段】 Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアク
リジニウム塩類の電荷移動錯体及びＮ，Ｎ−ジ置換カル
ボン酸アミド化合物からなる化学発光系、又はＮ，Ｎ’
−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移
動錯体、Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物及び特
定アミノアルコール化合物からなる化学発光系に糖類及
び／又は糖アルコール類を添加し凍結乾燥してなること
を特徴とする改良された化学発光試薬。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ペルオキシダーゼ
酵素量に依存して過酸化物等の水素受容体により化学発
光し、ペルオキシダーゼ酵素活性を長期間に亘り高感度
に測定することができる改良された化学発光試薬に関
し、更に詳しくは、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビス
アクリジニウム塩類の電荷移動錯体及びＮ，Ｎ−ジ置換
カルボン酸アミド化合物からなる化学発光系、又はＮ，
Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電
荷移動錯体、Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物及
び特定のアミノアルコール化合物からなる化学発光系に
糖類及び／又は糖アルコール類を添加し凍結乾燥してな
る、ペルオキシダーゼ酵素活性を長期間に亘り高感度に
測定することができ、化学発光分析による種々の物質の
検出及び定量等に用いられる改良された化学発光試薬に
関する。

【０００２】

【従来の技術】ペルオキシダーゼ酵素量に依存して過酸
化物等の水素受容体により化学発光する化学発光性物質
としては、ルミノール類がよく知られているが、化学発
光量がそれ程大きくないために発光量を増幅させる目的
で種々の発光促進剤が検討されており、その一つとして
フェノールインドフェノール誘導体を発光促進剤として
ペルオキシダーゼ酵素活性を測定する試みが為されてお
り、化学発光量の増幅効果が認められている。しかしな
がら、この発光促進剤は不安定で長期保存には耐えられ
ないと云う欠点を有している。この欠点を補う目的でサ
イクロデキストリン誘導体などの安定化剤をもちいる方
法等が行われている。しかしながら、ペルオキシダーゼ
酵素活性の測定を酵素免疫測定法に応用する場合には、
酵素の低濃度領域での定量性を更に高める必要性が生じ
るケースが多く、ペルオキシダーゼ酵素活性を長期間に
亘り更に高感度に測定することができる改良された化学
発光試薬の開発が望まれていた。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、過酸
化水素等の過酸化物を基質とするペルオキシダーゼのモ
ル数に依存して化学発光し、長期間に亘りペルオキシダ
ーゼ酵素活性をより高感度に測定することができる改良
された化学発光試薬を提供することにある。

【０００４】

【課題を解決するための手段】そこで、本発明者らは、
上記課題を達成するために鋭意検討を行なった結果、特
定のＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスジアクリジニウ
ム塩類の電荷移動錯体及びＮ，Ｎ−ジ置換カルボンアミ
ド化合物を含む混合物又はこれに特定のアミノアルコー
ル化合物を添加した混合物に糖類及び／又は糖アルコー
ル類を添加し凍結乾燥してなる化学発光試薬が、特定ｐ
Ｈ条件下において、過酸化水素とは反応せず、長期間の
保存の後にも過酸化水素とペルオキシダーゼの存在下
に、ペルオキシダーゼのモル数に依存して化学発光する
ことを見い出し、これらの知見に基いて本発明に到達し
たものである。

【０００５】従って、本発明は、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−
９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体及び
Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物からなる化学発
光系、又はＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジ
ニウム塩類の電荷移動錯体、Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸
アミド化合物及び特定アミノアルコール化合物からなる
化学発光系に糖類及び／又は糖アルコール類を添加し凍
結乾燥してなることを特徴とする化学発光試薬に関する
ものである。

【０００６】

【発明の実施の形態】以下、本発明につき更に詳しく説
明する。本発明の化学発光試薬の成分の一つであるＮ，
Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電
荷移動錯体は、次の一般式（１）

【０００７】

【化４】 で表される。上記一般式（１）において、Ｒ¹ 及びＲ²
は、アルキル基、アリール基及びハロゲン化アリール基
からなる群より選択され、互いに同一でも又は異なるも
のでもよい。アルキル基、アリール基及びハロゲン化ア
リール基は、炭素数１〜２０を有するものであり、好ま
しいアルキル基は炭素数１〜１０のものである。例えば
メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル
基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基及
びデシル基等の直鎖状アルキル基又はこれらの分岐状ア
ルキル基を挙げることができる。また、アリール基は炭
素数６〜２０のものが好ましく、例えばフェニル基、ト
リール基、キシリル基等を挙げることができ、さらにア
ルキル基で置換されたものでもよい。アリール基として
は、特にフェニル基が好ましい。ハロゲン化アリール基
としてはハロゲン化フェニル基、ハロゲン化トリル基、
ハロゲン化キシリル基等を挙げることができ、特にクロ
ロフェニル基が好ましい。

【０００８】一般式（１）において、Ｒ³ 、Ｒ⁴ 、Ｒ⁵
及びＲ⁶ は、それぞれ水素原子、アルキル基、アリール
基、アルコキシ基、アリーロキシ基及びハロゲン基から
なる群より選択され、互いに同一でも又は異なるもので
もよい。これらの炭化水素基としては、炭素数１〜２
０、好ましくは１〜１０のものを挙げることができる。
例えば、炭素数１〜２０の直鎖状又は分岐状アルキル
基、アルコキシ基、炭素数６〜２０のアリール基、アリ
ーロキシ基を挙げることができ、アリール基、アリーロ
キシ基はアルキル基が置換されたものでもよい。また、
一般式（１）において、Ｘ・は前駆体ビスアクリジニウ
ム塩の対アニオンから電子が移動した残基である酸ラジ
カルを示す。

【０００９】Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリ
ジニウム塩類の電荷移動錯体は、紫外吸収スペクトルに
おける５５０ｎｍ付近に出現する極大を有する巾広い吸
収帯を分光光度計を用いて測定することができる。

【００１０】上記Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスア
クリジニウム塩類の電荷移動錯体の具体的な例として
は、Ｎ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウ
ム塩、Ｎ，Ｎ’−ジエチル−９，９’−ビスアクリジニ
ウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジプロピル−９，９’−ビスアクリ
ジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−９，９’−ビ
スアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジブチル−９，９’−
ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジイソブチル−９，
９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジフェニル−
９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジ−ｍ−
クロロフェニル−９，９’−ビスアクリジニウム塩等の
電荷移動錯体が挙げられるが、これらのなかで、特に、
Ｎ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジ
ナイトレート（ルシゲニン）の電荷移動錯体が好適に用
いられる。

【００１１】Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリ
ジニウム塩類の電荷移動錯体の前駆体であるＮ，Ｎ’−
ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の対イオン
としては、塩素イオン、臭素イオン、沃素イオン、硝酸
イオン、炭酸イオン、硫酸イオン、リン酸イオン及びカ
ルボン酸イオン等が非限定的に挙げられる。上記化学発
光試薬の成分の一つであるＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸ア
ミド化合物は、下記一般式（２）

【００１２】

【化５】 で表わすことができる。一般式（２）において、Ｒ₁ は
水素原子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１
０のアルケニル基及び炭素数６〜２０のアリール基から
なる群より選択され、該アリール基はアルキル基、ニト
ロ基、水酸基、アミノ基又はハロゲン原子等で置換され
ていてもよい。Ｒ₂ はメチル基及びエチル基からなる群
より選択される。Ｒ₃ は炭素数１〜１０のアルキル基、
炭素数２〜１０のアルケニル基及び炭素数６〜２０のア
リール基からなる群より選択され、該アリール基はアル
キル基、ニトロ基、水酸基、アミノ基又はハロゲン原子
等で置換されていてもよい。また、Ｒ₁ 及びＲ₃ は、互
いに結合して、それぞれが結合しているカルボニル基の
炭素原子及びアミド基の窒素原子と共に環を形成してい
てもよい。

【００１３】上記Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合
物の具体例としては、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、
Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアク
リルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルプロピオンアミド、Ｎ，
Ｎ−ジメチルベンズアミド、Ｎ−メチル−２−ピロリド
ン等が非限定的に挙げられる。更に、上記化学発光試薬
の成分の一つであるアミノアルコール化合物は、下記一
般式（３）

【００１４】

【化６】 で表わされる化合物である。一般式（３）において、Ｒ
は炭素数１〜５の二価の脂肪族炭化水素を表わし、ｍは
１〜３の整数を表わす。

【００１５】上記アミノアルコール化合物の具体的な例
としては、モノエタノールアミン、ジエタノールアミ
ン、トリエタノールアミン、モノイソプロパノールアミ
ン、ジイソプロパノールアミン、トリイソプロパノール
アミン等を非限定的に挙げることができる。

【００１６】更に、本発明の化学発光試薬の成分である
糖類の具体例としては、メチルセルロース、エチルセル
ロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロ
ピルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロース、
カルボキシメチルセルロースからなる群より選択される
少なくとも一種のセルロース誘導体を挙げることができ
る。また、糖アルコール類の具体例としては、ソルビト
ール、マンニトール、エリスリトール、リビトールから
なる群より選択される少なくとも一種の化合物を非限定
的に挙げることができる。

【００１７】本発明の化学発光試薬を構成する成分であ
るＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩
類の電荷移動錯体の前駆体であるＮ，Ｎ’−ジ置換−
９，９’−ビスアクリジニウム塩類は、他の成分である
Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物の存在により自
然光等により容易に電荷移動錯体に転化する現象が認め
られる。また、このＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化
合物は、生成した電荷移動錯体のラジカルの安定性にも
寄与していると考えられ、求核性の弱い酸からなるＮ，
Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電
荷移動錯体の形成及び安定化の必須成分として作用して
いる。また、この化学発光系へ特定のアミノアルコール
化合物を添加した化学発光系において、アミノアルコー
ル化合物の添加は、発光反応のブランク値を低下させる
と共に、より広いペルオキシダーゼ濃度範囲において安
定した化学発光反応を実現することが可能になる。この
アミノアルコール化合物の添加効果については必ずしも
明確ではないが、対イオンからアクリジン環への電荷移
動に関与してその反応を促進すると共に、生成する電荷
移動錯体の有するラジカルを一層安定化して発光反応時
における溶存酵素との反応を阻止してブランク値を高め
る要因を排除することにより、ブランク値の低い安定し
た高感度測定を可能にしているものと考えられる。

【００１８】本発明の化学発光試薬の構成成分である
Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類
の電荷移動錯体及びＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化
合物を含む混合物からなる発光系、又はＮ，Ｎ’−ジ置
換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯
体、Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物及びアミノ
アルコール化合物を含む混合物からなる発光系は、多く
の場合、Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物の溶液
として調製されるが、こられの発光系は不活性ガス雰囲
気下、冷暗所での保存において１２０日経過時点よりそ
の発光量が徐々に低下する傾向が見られるが、これらの
系に糖類及び／又は糖アルコール類を添加して凍結乾燥
することにより不活性ガス雰囲気下、冷暗所での保存に
おいて３６０日経過後もその発光量に変化は認められ
ず、良好な長期保存安定性を有することが認められた。

【００１９】更に、この糖類及び／又は糖アルコール類
の添加により、本発明の構成成分である上記発光系は安
定化され、これらの安定化剤の非存在下での凍結乾燥処
理において上記発光系は失活してその化学発光性能の大
部分を失うのに較べ、驚くべきことに、これらの安定化
剤の添加により凍結乾燥処理後もその化学発光性能には
全く変化がなく、その活性を保持することが可能であ
る。

【００２０】本発明の化学発光試薬の製造方法は任意で
あるが、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニ
ウム塩類を等モル以上のＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミ
ド化合物と混合して自然光の下に放置することにより得
られるが、電荷移動錯体の生成は光により触媒されるの
で、光照射下に反応を行なうのが好ましい。この光照射
に用いる光源としては、波長領域が約２９０〜８００ｎ
ｍの範囲の紫外可視部が用いられ、特に約４００〜８０
０ｎｍの範囲の可視光が望ましい。これらの光源として
は、高圧水銀灯、低圧水銀灯、殺菌灯、蛍光灯及び白熱
電灯等を非限定的に用いることができるが、白熱電灯が
好ましく用いられる。

【００２１】また、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビス
アクリジニウム塩類の電荷移動錯体とＮ，Ｎ−ジ置換カ
ルボン酸アミド化合物との混合比は、Ｎ，Ｎ’−ジ置換
−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体に
対してＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物を１〜１
万倍モル、好ましくは１〜５千倍モルの割合で用いるこ
とができる。Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物は
溶媒としての機能を兼用させて大過剰に用いるのが好適
である。

【００２２】また、この化学発光系への特定のアミノア
ルコール化合物の添加は、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’
−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動反応時及び／又は
反応後に行なうことができるが、電荷移動反応後に添加
するのが好ましい。アミノアルコール化合物の添加量
は、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム
塩類の電荷移動錯体に対してアミノアルコール化合物を
１〜１万倍モル、好ましくは１〜２千倍モルの量で用い
ることができる。

【００２３】これらの発光系への糖類及び／又は糖アル
コール類の添加方法は任意であるが、これらの発光系溶
液に糖類及び／又は糖アルコール類を直接添加して溶解
させるか、或いは糖類及び／又は糖アルコール類を溶媒
に溶解させた溶液を添加して混合する方法等が挙げられ
る。これらの糖類及び／又は糖アルコール類の添加量は
それらの化合物の種類によって異なるが、概して、発光
系の溶液に対して０．０１〜５重量％、好ましくは０．
２〜２重量％の範囲の量で用いることができる。

【００２４】本発明の化学発光試薬の調製は、これらの
成分を含有する溶液を凍結乾燥させることによって完結
するが、その凍結乾燥を行なう方法は任意であり、市販
の凍結乾燥機を使用することによって行なうことができ
る。その場合、減圧度は５ｍＴｏｒｒ以下の高真空下に
行なうのが望ましい。この凍結乾燥処理により、溶媒と
しての機能を果たしていたＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸ア
ミド化合物は凍結後に大部分は昇華して系外に排出され
るが、一部は凍結乾燥後にも残存して固体化したＮ，
Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電
荷移動錯体の安定化に寄与していることがそのＮＭＲス
ペクトル等から推察される。

【００２５】本発明の化学発光試薬は、その凍結乾燥品
を適当な緩衝液で溶解させて使用する。緩衝液として
は、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ほう酸緩衝液、炭酸
緩衝液、グリシン緩衝液等を任意に用いることができ
る。

【００２６】また、本発明の化学発光試薬は、ｐＨ７．
５〜１３の塩基性条件下において、過剰の水素受容体の
存在下、ペルオキシダーゼの濃度に依存した量で発光す
る。この発光は、フェノール性化合物等の発光促進剤に
よって増強することが認められる。このようなフェノー
ル性化合物としては、ｐ−ヒドロキシ桂皮酸、ｐ−フェ
ニルフェノール、ｐ−（４−クロロフェニル）フェノー
ル、ｐ−（４−ブロモフェニル）フェノール、ｐ−（４
−ヨードフェニル）フェノール、ｐ−ヨードフェノー
ル、ｐ−ブロモフェノール、ｐ−クロロフェノール、
２，４−ジクロロフェノール、ｐ−クマル酸、６−ヒド
ロキシベンゾチアゾール、２−ナフトール、ホタルルシ
フェリン等が非限定的に挙げられる。

【００２７】水素受容体としては、ペルオキシダーゼ酵
素の基質となり得るものであれば特に限定されるもので
はなく、無機過酸化物、有機過酸化物等を任意に用いる
ことができるが、特に過酸化水素が好ましい。

【００２８】本発明の化学発光試薬を用いて化学発光分
析を行なう場合には、化学発光試薬は１０^-8〜１Ｍ、好
ましくは１０^-6〜１０^-2Ｍの範囲の濃度で用いられ、そ
の使用量としては、１０〜５００μｌ、好ましくは５０
〜３００μｌの範囲が望ましい。また、発光促進剤の使
用量は、化学発光試薬の０．０１〜１００倍モル、好ま
しくは０．１〜１０倍モルの範囲であり、その濃度とし
ては、１０^-6〜１Ｍ、好ましくは１０^-4〜１０^-2Ｍの範
囲が望ましい。

【００２９】また、化学発光反応に用いる過酸化水素の
量は、化学発光試薬に対して充分に過剰な量で用いるこ
とが必要であり、その使用量は化学発光試薬に対して３
〜１万倍モル、好ましくは１０〜１０００倍モルの範囲
で用いるのが望ましい。

【００３０】また、ペルオキシダーゼを標識物質として
抗体、核酸等を標識して種々の物質を定量する場合に
は、特に限定されるものではないが、ペルオキシダーゼ
として、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）が好ま
しく用いられる。

【００３１】化学発光反応に用いる緩衝液としては、ト
リス緩衝液、リン酸緩衝液、ほう酸緩衝液、炭酸緩衝
液、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液等を任意に挙げ
ることができる。これらの緩衝液の濃度は１ｍＭ〜１Ｍ
の範囲が望ましい。また、反応時に界面活性剤、キレー
ト剤等の添加剤を任意に用いることができる。

【００３２】

【実施例】以下、参考例及び実施例を示し、本発明を具
体的に説明する。もっとも、本発明は実施例等により限
定されるものではない。

【００３３】［参考例１］Ｎ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジ
硝酸塩の電荷移動錯体、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド
及びメチルセルロースを含む化学発光試薬の調製 ルシゲニン１．５ｍｇを試験管に採り、これにＮ，Ｎ−
ジメチルアセトアミド１ｍｌを加えて溶解させた後、３
０℃の温度の水浴中で２５０Ｗのコピーランプを７時間
照射することによりＮ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビ
スアクリジニウム硝酸塩の電荷移動錯体及びＮ，Ｎ−ジ
メチルアセトアミドを含有する化学発光系を得る。尚、
電荷移動錯体の生成は、紫外吸収スペクトルにおける５
５０ｎｍ付近に極大をもつ幅広い吸収帯の出現を分光光
度計を用いる方法により測定して確認する。次いで、こ
れにメチルセルロース０．５重量％、Ｎ，Ｎ−ジメチル
アセトアミド１ｍｌを添加して混合した後、凍結乾燥機
（レイタントライフサイエンス（株）製ＬＦＤ−６００
ＤＮＡ）を用い、１ｍＴｏｒｒ以下の真空度、トラップ
温度−８０℃で１５時間凍結乾燥させることにより化学
発光試薬を得る。この化学発光試薬は、４℃の冷蔵庫に
遮光して保存する。

【００３４】〔実施例１〕参考例１で調製した化学発光
試薬に１０ｍｌの７５ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．
８）を加えて溶解させた後、その５０μｌを採り、７５
ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）２．９５ｍｌと混
合する。次に、この溶液に１０ｍＭのｐ−ヨードフェノ
ールを含む０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）溶
液１００μｌを添加し混合して化学発光試薬溶液を調製
する。また、化学発光測定用マイクロプレートの複数の
ウェルに西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の種々
の濃度水準の７５ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）
溶液１００μｌずつを充填し、これに溶液注入装置から
前記化学発光試薬溶液及び０．００１７重量％過酸化水
素水溶液１００μｌを順次注入して発光反応させ、この
発光量をルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナス
ＣＴ−９０００Ｄ）で１〜５秒間積算した結果、表１に
示すような発光強度が得られ、ペルオキシダーゼ活性を
１×１０^-13 ｍｏｌ／ｌの濃度まで測定できることが認
められた。更に、この化学発光試薬を、４℃の冷蔵庫に
遮光して１年間保存した後、上記と同様の方法で西洋ワ
サビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の活性を測定した結
果、表１に示すような発光強度が得られ、本発明の化学
発光試薬の性能に大きな変化は認められなかった。

【００３５】

【表１】

【００３６】［参考例２］Ｎ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジ
硝酸塩の電荷移動錯体、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミ
ド、トリエタノールアミン及びマンニトールを含有する
化学発光試薬の調製 ルシゲニン１．５ｍｇを試験管に採り、これにＮ，Ｎ−
ジメチルアセトアミド１ｍｌを加えて溶解させた後、３
０℃の温度の水浴中で２５０Ｗのコピーランプを７時間
照射してから、トリエタノールアミン０．５ｍｌを添加
し混合することにより化学発光系を得る。尚、電荷移動
錯体の生成は参考例１と同様の方法で確認する。次い
で、これにマンニトールの０．５重量％Ｎ，Ｎ−ジメチ
ルアセトアミド１ｍｌを添加して混合した後、凍結乾燥
機（レイタントライフサイエンス（株）製ＬＦＤ−６０
０ＤＮＡ）を用い、１ｍＴｏｒｒ以下の真空度、トラッ
プ温度−８０℃で１５時間凍結乾燥させることにより化
学発光試薬を得る。この化学発光試薬は、４℃の冷蔵庫
に遮光して保存する。

【００３７】〔実施例２〕参考例２で調製した化学発光
試薬に１０ｍｌの７５ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．
８）を加えて溶解させた後、その５０μｌを採り、７５
ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）２．９５ｍｌと混
合する。次に、この溶液に１０ｍＭのｐ−ヨードフェノ
ールを含む０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）溶
液１００μｌを添加し混合して化学発光試薬溶液を調製
する。また、化学発光測定用マイクロプレートの複数の
ウェルに西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の種々
の濃度水準の７５ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）
溶液１００μｌずつを充填し、これに溶液注入装置から
前記化学発光試薬溶液及び０．００１７重量％過酸化水
素水溶液１００μｌを順次注入して発光反応させ、この
発光量をルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナス
ＣＴ−９０００Ｄ）で１〜５秒間積算した結果、表２に
示すような発光強度が得られ、ペルオキシダーゼ活性を
１×１０^-13 ｍｏｌ／ｌの濃度まで測定できることが認
められた。更に、この化学発光試薬を、４℃の冷蔵庫に
遮光して１年間保存した後、上記と同様の方法で西洋ワ
サビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の活性を測定した結
果、表２に示すような発光強度が得られ、本発明の化学
発光試薬の性能に大きな変化は認められなかった。

【００３８】

【表２】

【００３９】［参考例３］Ｎ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジ
沃化水素酸塩の電荷移動錯体、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセト
アミド、トリエタノールアミン及びソルビトールを含有
する化学発光試薬の調製 ルシゲニンの１×１０^-2ｍｏｌ／ｌの水溶液に、２倍モ
ルの固体の沃化カリウムを添加し、室温で１時間攪拌す
ることにより赤色沈殿が生成する。この赤色沈殿を含む
反応液をナス型フラスコに入れ、ロータリーエバポレー
ターを用いて減圧下に６０℃で溶媒の水を蒸発して乾固
させ、赤色沈殿からなる残渣をベンゼンで洗浄して副生
物を除去し、ベンゼン不溶分を濾別し乾燥して粗生成物
を得る。次に、この粗生成物に少量の水を加え、遮光下
に９５℃の湯浴上で加熱して溶解した後、室温に戻して
から、更に、４℃に冷却放置し、生成する沈殿を濾別、
乾燥して未反応物を除去してＮ，Ｎ’−ジメチル−９，
９’−ビスアクリジニウム沃化水素酸塩を約７０％の収
率で得る。次に、この化合物１．５ｍｇを試験管に採
り、これにＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド１ｍｌを加え
て溶解させた後、３０℃の温度の水浴中で２５０Ｗのコ
ピーランプを７時間照射してから、トリエタノールアミ
ン０．５ｍｌを添加し混合することによりＮ，Ｎ’−ジ
メチル−９，９’−ビスアクリジニウム沃化水素酸塩の
電荷移動錯体及びトリエタノールアミンを含有する化学
発光系を得る。尚、電荷移動錯体の生成は、参考例１と
同様の方法で確認する。次いで、これにソルビトールの
０．５重量％Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド１ｍｌを添
加して混合した後、凍結乾燥機（レイタントライフサイ
エンス（株）製ＬＦＤ−６００ＤＮＡ）を用い、１ｍＴ
ｏｒｒ以下の真空度、トラップ温度−８０℃で１５時間
凍結乾燥させることにより化学発光試薬を得る。この化
学発光試薬は、４℃の冷蔵庫に遮光して保存する。

【００４０】〔実施例３〕参考例３で調製した化学発光
試薬に１０ｍｌの７５ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．
８）を加えて溶解させた後、その５０μｌを採り、７５
ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）２．９５ｍｌと混
合する。次に、この溶液に１０ｍＭのｐ−ヨードフェノ
ールを含む０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）溶
液１００μｌを添加し混合して化学発光試薬溶液を調製
する。また、化学発光測定用マイクロプレートの複数の
ウェルに西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の種々
の濃度水準の０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）
溶液１００μｌずつを充填し、これに溶液注入装置から
前記化学発光試薬溶液及び０．００１７重量％過酸化水
素水溶液１００μｌを順次注入して発光反応させ、この
発光量をルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナス
ＣＴ−９０００Ｄ）で１〜５秒間積算した結果、表３に
示すような発光強度が得られ、ペルオキシダーゼ活性を
１×１０^-13 ｍｏｌ／ｌの濃度まで測定できることが認
められた。更に、この化学発光試薬を、４℃の冷蔵庫に
遮光して１年間保存した後、上記と同様の方法で西洋ワ
サビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の活性を測定した結
果、表３に示すような発光強度が得られ、本発明の化学
発光試薬の性能の大きな変化は認められなかった。

【００４１】

【表３】

【００４２】

【発明の効果】本発明により提供される新規化学発光試
薬は、安価な製造原料を用いて比較的短時間で容易に製
造でき、且つ長期間に亘ってその活性を保持することが
可能であり、過酸化水素とペルオキシダーゼの存在下
に、ペルオキシダーゼの濃度に依存して化学発光する性
質を利用して、ペルオキシダーゼ酵素を高感度で検出す
ることができる。更に、ペルオキシダーゼを標識物質と
して抗原、抗体、核酸等を標識した酵素標識物を用い
て、酵素免疫測定法により抗原、抗体等を、ウェスタン
ブロット法により蛋白質を、サザーン及びノーザンブロ
ット法によりＤＮＡ及びＲＮＡを、そして酵素標識核酸
プローブを用いて核酸をそれぞれ特異的に且つ高感度で
測定することができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 荒谷 弦一郎 東京都足立区堀之内一丁目９番４号 大日 精化工業株式会社技術研究センター内 (72)発明者 葛城 寿史 東京都足立区堀之内一丁目９番４号 大日 精化工業株式会社技術研究センター内 (72)発明者 細越 未央 東京都足立区堀之内一丁目９番４号 大日 精化工業株式会社技術研究センター内 Ｆターム(参考） 2G054 AA02 AB10 CE01 CE10 EA01 GB01 4B063 QA01 QQ22 QR41 QR43 QR44 QR50 QR57 QR66 QS02 QX02

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記一般式（１） 【化１】 （上記一般式（１）において、Ｒ¹ 及びＲ² は、アルキ
   ル基、アリール基及びハロゲン化アリール基からなる群
   より選択され、互いに同一でも又は異なるものでもよ
   く、Ｒ³ 、Ｒ⁴ 、Ｒ⁵ 及びＲ⁶ は、水素原子、アルキル
   基、アリール基、アルコキシ基、アリーロキシ基及びハ
   ロゲン基からなる群より選択され、互いに同一でも又は
   異なるものでもよく、Ｘ・は前駆体ビスアクリジニウム
   塩の対アニオンから電子が移動した残基である酸ラジカ
   ルを示す。）で表わされるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’
   −ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体、及び下記一
   般式（２） 【化２】 （上記一般式（２）において、Ｒ₁ は水素原子、炭素数
   １〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のアルケニル基
   及び炭素数６〜２０のアリール基からなる群より選択さ
   れ、該アリール基はアルキル基、ハロゲン基、ニトロ
   基、水酸基及びアミノ基等で置換されていてもよく、Ｒ
   ₂ はメチル基及びエチル基からなる群より選択され、Ｒ
   ₃ は炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のア
   ルケニル基及び炭素数６〜２０のアリール基からなる群
   より選択され、アリール基はアルキル基、ハロゲン基、
   ニトロ基、水酸基及びアミノ基等で置換されていてもよ
   く、Ｒ ₁ 及びＲ₃ は、互いに結合して、それぞれが結合
   しているカルボニル基の炭素原子及びアミド基の窒素原
   子と共に環を形成していてもよい。）で表わされるＮ，
   Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物を主成分とする化学
   発光系、又はこの化学発光系に、下記一般式（３） 【化３】 （上記一般式（３）において、Ｒは炭素数１〜５の二価
   の脂肪族炭化水素を表わし、ｍは１〜３の整数を表わ
   す。）で表わされるアミノアルコール化合物を添加して
   なる化学発光系に、糖類及び／又は糖アルコール類を添
   加し凍結乾燥してなることを特徴とする化学発光試薬。
2. 【請求項２】 前記Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビ
   スアクリジニウム塩類の電荷移動錯体がＮ，Ｎ’−ジメ
   チル−９，９’−ビスアクリジニウムジナイトレートの
   電荷移動錯体である請求項１に記載の化学発光試薬。
3. 【請求項３】 前記Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド
   化合物がＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメ
   チルアセトアミド及びＮ−メチル−２−ピロリドンから
   なる群より選択される少なくとも一種の化合物である請
   求項１又は２に記載の化学発光試薬。
4. 【請求項４】 前記アミノアルコール化合物がモノエ
   タノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノール
   アミンからなる群より選択される少なくとも一種の化合
   物である請求項１〜３のいずれかの請求項に記載の化学
   発光試薬。
5. 【請求項５】 前記糖類がアルキルセルロース、ヒド
   ロキシアルキルセルロース、アルキルヒドロキシアルキ
   ルセルロース及びカルボキシアルキルセルロースからな
   る群より選択される少なくとも一種の化合物である請求
   項１〜４のいずれかの項に記載の化学発光試薬。
6. 【請求項６】 前記糖アルコール類がソルビトール、マ
   ンニトール、エリスリトール及びリビトールからなる群
   より選択される少なくとも一種の化合物である請求項１
   〜４のいずれかの請求項に記載の化学発光試薬。