JPWO2007055364A1 - パーオキシナイトライト蛍光プローブ - Google Patents
パーオキシナイトライト蛍光プローブ Download PDFInfo
- Publication number
- JPWO2007055364A1 JPWO2007055364A1 JP2007544228A JP2007544228A JPWO2007055364A1 JP WO2007055364 A1 JPWO2007055364 A1 JP WO2007055364A1 JP 2007544228 A JP2007544228 A JP 2007544228A JP 2007544228 A JP2007544228 A JP 2007544228A JP WO2007055364 A1 JPWO2007055364 A1 JP WO2007055364A1
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- group
- substituent
- formula
- compound
- salt
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- CMFNMSMUKZHDEY-UHFFFAOYSA-N peroxynitrous acid Chemical compound OON=O CMFNMSMUKZHDEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 75
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 title abstract description 15
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 claims abstract description 97
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 91
- 125000003545 alkoxy group Chemical group 0.000 claims abstract description 53
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims abstract description 51
- 125000004093 cyano group Chemical group *C#N 0.000 claims abstract description 30
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims abstract description 29
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 25
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 claims abstract description 18
- 125000001153 fluoro group Chemical group F* 0.000 claims abstract description 17
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 claims abstract description 15
- 125000004209 (C1-C8) alkyl group Chemical group 0.000 claims description 38
- -1 R 42 Chemical compound 0.000 claims description 37
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims description 30
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 22
- 125000002327 selenol group Chemical group [H][Se]* 0.000 claims description 15
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 claims description 15
- 125000004453 alkoxycarbonyl group Chemical group 0.000 claims description 13
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 13
- 125000006575 electron-withdrawing group Chemical group 0.000 claims description 11
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 claims description 11
- 125000005843 halogen group Chemical group 0.000 claims description 10
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N Benzene Chemical compound C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 6
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 claims description 6
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 claims description 5
- 125000000168 pyrrolyl group Chemical group 0.000 claims description 5
- 125000001544 thienyl group Chemical group 0.000 claims description 5
- 125000000391 vinyl group Chemical group [H]C([*])=C([H])[H] 0.000 claims description 5
- 125000001301 ethoxy group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])O* 0.000 claims description 4
- 125000004178 (C1-C4) alkyl group Chemical group 0.000 claims description 2
- 125000003427 indacenyl group Chemical group 0.000 claims 1
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 abstract description 6
- MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N Nitric oxide Chemical compound O=[N] MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 30
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 19
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 15
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 13
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 9
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- WQYVRQLZKVEZGA-UHFFFAOYSA-N hypochlorite Inorganic materials Cl[O-] WQYVRQLZKVEZGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N luminol Chemical compound O=C1NNC(=O)C2=C1C(N)=CC=C2 HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- OUUQCZGPVNCOIJ-UHFFFAOYSA-M Superoxide Chemical compound [O-][O] OUUQCZGPVNCOIJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 6
- 239000007845 reactive nitrogen species Substances 0.000 description 6
- 239000003642 reactive oxygen metabolite Substances 0.000 description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N Dioxygen Chemical compound O=O MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 5
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 5
- 238000002189 fluorescence spectrum Methods 0.000 description 5
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 5
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 4
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 4
- 125000005907 alkyl ester group Chemical group 0.000 description 4
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 4
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 4
- 238000006396 nitration reaction Methods 0.000 description 4
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 4
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 4
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- XDFNWJDGWJVGGN-UHFFFAOYSA-N 2-(2,7-dichloro-3,6-dihydroxy-9h-xanthen-9-yl)benzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1C1C2=CC(Cl)=C(O)C=C2OC2=CC(O)=C(Cl)C=C21 XDFNWJDGWJVGGN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 125000005227 alkyl sulfonate group Chemical group 0.000 description 3
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 3
- 229940125904 compound 1 Drugs 0.000 description 3
- 229940126214 compound 3 Drugs 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- IJKVHSBPTUYDLN-UHFFFAOYSA-N dihydroxy(oxo)silane Chemical compound O[Si](O)=O IJKVHSBPTUYDLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical class O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002073 fluorescence micrograph Methods 0.000 description 3
- TUJKJAMUKRIRHC-UHFFFAOYSA-N hydroxyl Chemical compound [OH] TUJKJAMUKRIRHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 150000002467 indacenes Chemical class 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000000449 nitro group Chemical group [O-][N+](*)=O 0.000 description 3
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical class O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000012453 solvate Substances 0.000 description 3
- HZNVUJQVZSTENZ-UHFFFAOYSA-N 2,3-dichloro-5,6-dicyano-1,4-benzoquinone Chemical compound ClC1=C(Cl)C(=O)C(C#N)=C(C#N)C1=O HZNVUJQVZSTENZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KPKAHQLZSNDNLV-UHFFFAOYSA-N 2,4-dimethyl-1h-pyrrole-3-carbonitrile Chemical compound CC1=CNC(C)=C1C#N KPKAHQLZSNDNLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000008299 Nitric Oxide Synthase Human genes 0.000 description 2
- 108010021487 Nitric Oxide Synthase Proteins 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WTEOIRVLGSZEPR-UHFFFAOYSA-N boron trifluoride Chemical compound FB(F)F WTEOIRVLGSZEPR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 229940125782 compound 2 Drugs 0.000 description 2
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000002828 nitro derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 2
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- GIANIJCPTPUNBA-QMMMGPOBSA-N (2s)-3-(4-hydroxyphenyl)-2-nitramidopropanoic acid Chemical compound [O-][N+](=O)N[C@H](C(=O)O)CC1=CC=C(O)C=C1 GIANIJCPTPUNBA-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 102000010400 1-phosphatidylinositol-3-kinase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 125000000389 2-pyrrolyl group Chemical group [H]N1C([*])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 125000000175 2-thienyl group Chemical group S1C([*])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JIYCDDMFWVSYDW-UHFFFAOYSA-N 5,7-dihydrodipyrrolo[1,2-d:1',2'-h]pyrimidine Chemical compound C1N2CC=CC2=CC2=CC=CN21 JIYCDDMFWVSYDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IYHJRKNFFYAOGE-UHFFFAOYSA-N 8-Nitroguanine Chemical compound N1C(N)=NC(=O)C2=C1N=C([N+]([O-])=O)N2 IYHJRKNFFYAOGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910015900 BF3 Inorganic materials 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000005778 DNA damage Effects 0.000 description 1
- 231100000277 DNA damage Toxicity 0.000 description 1
- 108090000371 Esterases Proteins 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000043136 MAP kinase family Human genes 0.000 description 1
- 108091054455 MAP kinase family Proteins 0.000 description 1
- AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N Methanesulfonic acid Chemical compound CS(O)(=O)=O AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004722 NADPH Oxidases Human genes 0.000 description 1
- 108010002998 NADPH Oxidases Proteins 0.000 description 1
- 229910002651 NO3 Inorganic materials 0.000 description 1
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N Nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N Oxalic acid Chemical compound OC(=O)C(O)=O MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091007960 PI3Ks Proteins 0.000 description 1
- KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N Palladium on carbon Substances [Pd] KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002685 Polyoxyl 35CastorOil Polymers 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical class CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 229940045714 alkyl sulfonate alkylating agent Drugs 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000012300 argon atmosphere Substances 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- JHVLLYQQQYIWKX-UHFFFAOYSA-N benzyl 2-bromoacetate Chemical compound BrCC(=O)OCC1=CC=CC=C1 JHVLLYQQQYIWKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- FJDQFPXHSGXQBY-UHFFFAOYSA-L caesium carbonate Chemical compound [Cs+].[Cs+].[O-]C([O-])=O FJDQFPXHSGXQBY-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000024 caesium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 159000000007 calcium salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 125000002057 carboxymethyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])[*] 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 208000037887 cell injury Diseases 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 229940125810 compound 20 Drugs 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 150000002333 glycines Chemical class 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- JAXFJECJQZDFJS-XHEPKHHKSA-N gtpl8555 Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)N[C@H](B1O[C@@]2(C)[C@H]3C[C@H](C3(C)C)C[C@H]2O1)CCC1=CC=C(F)C=C1 JAXFJECJQZDFJS-XHEPKHHKSA-N 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000359 iron(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 159000000003 magnesium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 150000002780 morpholines Chemical class 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000012044 organic layer Substances 0.000 description 1
- QUANRIQJNFHVEU-UHFFFAOYSA-N oxirane;propane-1,2,3-triol Chemical compound C1CO1.OCC(O)CO QUANRIQJNFHVEU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TWNQGVIAIRXVLR-UHFFFAOYSA-N oxo(oxoalumanyloxy)alumane Chemical compound O=[Al]O[Al]=O TWNQGVIAIRXVLR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 150000003053 piperidines Chemical class 0.000 description 1
- 239000008389 polyethoxylated castor oil Substances 0.000 description 1
- XAEFZNCEHLXOMS-UHFFFAOYSA-M potassium benzoate Chemical compound [K+].[O-]C(=O)C1=CC=CC=C1 XAEFZNCEHLXOMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000009145 protein modification Effects 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 125000001273 sulfonato group Chemical group [O-]S(*)(=O)=O 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N tetrahydropyridine hydrochloride Natural products C1CCNCC1 NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JOXIMZWYDAKGHI-UHFFFAOYSA-M toluene-4-sulfonate Chemical compound CC1=CC=C(S([O-])(=O)=O)C=C1 JOXIMZWYDAKGHI-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 150000003613 toluenes Chemical class 0.000 description 1
- 230000002883 vasorelaxation effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
- C07F5/00—Compounds containing elements of Groups 3 or 13 of the Periodic Table
- C07F5/02—Boron compounds
- C07F5/022—Boron compounds without C-boron linkages
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
- C07F5/00—Compounds containing elements of Groups 3 or 13 of the Periodic Table
- C07F5/003—Compounds containing elements of Groups 3 or 13 of the Periodic Table without C-Metal linkages
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N31/00—Investigating or analysing non-biological materials by the use of the chemical methods specified in the subgroup; Apparatus specially adapted for such methods
- G01N31/22—Investigating or analysing non-biological materials by the use of the chemical methods specified in the subgroup; Apparatus specially adapted for such methods using chemical indicators
- G01N31/228—Investigating or analysing non-biological materials by the use of the chemical methods specified in the subgroup; Apparatus specially adapted for such methods using chemical indicators for peroxides
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Abstract
パーオキシナイトライト測定用の蛍光プローブとして有用な下記の一般式(I)：｛R1、R3、R6、及びR8はメチル基等であり、R2及びR7はシアノ基等であり、R4及びR5はフッ素原子等であり、Xは式(A)〔R11はモノカルボキシ置換C1-8アルコキシ基等であり、R12、R14及びR15は水素原子等であり、R13は水酸基等である〕で表される基を示し、ただし、上記各置換基の組み合わせは、パーオキシナイトライトとの反応前には式(I)で表される化合物は実質的に非蛍光性であり、パーオキシナイトライトとの反応後には式(I)で表される化合物において式(A)で表される基がニトロ化された化合物は実質的に高い蛍光性となる組み合わせである｝で表される化合物又はその塩。
Description
本発明はパーオキシナイトライト蛍光プローブに関するものである。より具体的には、それ自体は実質的に非蛍光性であり、パーオキシナイトライトと反応してニトロ化された後に、強い蛍光を発する新規化合物、及びそれを用いたパーオキシナイトライトの測定法に関するものである。
一酸化窒素(NO)は、血管弛緩因子、神経情報伝達の調節、細胞死の制御、発ガンなど、様々な機能をもつ内在性生理活性物質であることが近年明らかになってきた。一方、一酸化窒素は、それ自身の反応性は比較的弱く、生体内で同時に発生する種々の活性酸素種、金属イオンなどとの反応により、高い反応性を持つ種々の活性窒素種(RNS)に変換されて細胞障害を引き起こすと考えられている。さらに最近では、RNSによるタンパクの修飾により、様々な情報伝達経路の制御が行われているとの報告も多く、また、パーオキシナイトライトをはじめとするRNSがDNA損傷を与えることで、様々な疾患に関与することが示されつつあり、一酸化窒素ばかりでなくRNSにも大きな注目が集まっている。
パーオキシナイトライト(ONOO-)はRNSの代表的存在であり、一酸化窒素とスーパーオキサイドが反応することにより生成する。この生成反応速度はほぼ拡散律速であり、NADPH オキシダーゼなどにより生成するスーパーオキサイドと一酸化窒素合成酵素(NOS)により生成する一酸化窒素が共存すると、速やかにパーオキシナイトライトが生成する。パーオキシナイトライトは、芳香環の水酸化も可能であるなど高い酸化能を有し、またチロシンのニトロ化を効率よく行うなど、特徴的な反応性を有する。最近の報告によれば、チロシンがニトロ化されることにより、チロシンのリン酸化が阻害され、MAPK、PI3K/Aktカスケードなどの情報伝達に重要な影響を及ぼすことが指摘されている。
これまでに開発されたパーオキシナイトライトの検出方法は、(1) DNA塩基であるグアニンがニトロ化されて生成する8-ニトログアニン、又はチロシンがニトロ化されて生成するニトロチロシンをHPLC や抗体を用いた免疫染色により検出する方法 (2)パーオキシナイトライトが過酸化水素と反応することで生成する一重項酸素を1.3μｍの発光で検出する方法が挙げられる。(1)の方法は特異性が高く汎用されているが、HPLC分析や抗体染色を行うため生細胞系に適用してリアルタイムにパーオキシナイトライトを検出することはできないという問題がある。上記２法に加え、(3)ルミノールを用いた化学発光法、(4)2',7'-ジクロロジヒドロフルオレセイン(DCFH)など活性酸素種全般を検出する蛍光プローブを用いた蛍光検出法も用いられる。しかしながら、これらの方法は特異性が全くなく、各種阻害剤を用いたとしても信頼性ある検出は望めない。例えば、(4)の方法ではDCFHが一酸化窒素及びスーパーオキサイドとも反応して蛍光の増大が観測されるため、パーオキシナイトライトを検出しているのか、一酸化窒素又はスーパーオキサイドを検出しているのかを区別することは不可能である。
一方、アリール化されたフルオレセイン誘導体が活性酸素測定用蛍光プローブとして有用であることが知られている（国際公開WO 01/64664号パンフレット）。また、該フルオレセイン誘導体がパーオキシナイトライトのプリカーサーである一酸化窒素及びスーパーオキサイドとは反応せず、これらのプリカーサーと区別してパーオキシナイトライトを測定できる蛍光プローブとして有用であることが知られている（国際公開WO 2004/40296号パンフレット）。しかし、該フルオレセイン誘導体は次亜塩素酸イオンやヒドロキシルラジカルのような活性酸素種（ROS）とも反応し、他のROSと区別してパーオキシナイトライトのみを特異的に検出することはできないという問題がある。そこで、パーオキシナイトライトを生きている状態の細胞や組織において高選択的に可視化することが可能な蛍光プローブの開発が望まれていた。
本発明の課題は、パーオキシナイトライトを高選択的に測定可能な蛍光プローブを提供することにある。特に、バイオイメージング法に適応可能なパーオキシナイトライト高選択的蛍光プローブを提供することが本発明の課題である。
本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意研究を行なった結果、インダセン誘導体(特開平10-338695号公報及び特開平11-5796号公報)の蛍光発色団を有する下記一般式(I)で表される実質的に非蛍光性の化合物がパーオキシナイトライトによる代表的な化学反応であるフェノールのニトロ化によってのみ高い蛍光性を有するニトロ化合物を与える一方、該化合物は生理的条件下ではヒドロキシラジカルや次亜塩素酸イオンなどの高い活性を持つ活性酸素種、あるいは過酸化水素や一酸化窒素などの弱い活性を持つ活性酸素種又はパーオキシナイトライト以外の活性窒素種と反応して蛍光性の化合物を与えないことより、パーオキシナイトライトを高選択的に測定するためのプローブとして有用であることを見出した。本発明は上記の知見に基づいて完成された。
すなわち、本発明により、下記の一般式(I)：
｛式中R1、R2、R3、R6、R7及びR8はそれぞれ独立に水素原子、置換基を有していてもよいC1-8アルキル基、置換基を有していてもよいアリール基、置換基を有していてもよいビニル基、置換基を有していてもよいチエニル基、又は置換基を有していてもよいピロリル基を示すか、あるいはシアノ基、カルボキシル基、及び置換基を有していてもよいアルキルオキシカルボニル基からなる群から選ばれる電子吸引基を示し、ただし、R1、R2、R3、R6、R7及びR8のうち2ないし6個の基はシアノ基、カルボキシル基、及び置換基を有していてもよいC1-8アルキルオキシカルボニル基の電子吸引基を示し、R4及びR5はそれぞれ独立にハロゲン原子、置換基を有していてもよいC1-8アルキル基、又は置換基を有していてもよいC1-8アルコキシ基を示し、Xは下記の式(A)：
〔式中R11、R12、R13、R14及びR15はそれぞれ独立に水素原子、置換基を有していてもよいC1-8アルキル基、置換基を有していてもよいC1-8アルコキシ基、水酸基、アミノ基（該アミノ基は一級、二級、又は三級のいずれでもよい）、チオール基、又はセレノール基を示し、ただしR11、R12、R13、R14及びR15のうち2ないし3個の基は置換基を有していてもよいC1-8アルコキシ基、水酸基、アミノ基（該アミノ基は一級、二級、又は三級のいずれでもよい）、チオール基、又はセレノール基を示すが、全ての基が置換基を有していてもよいC1-8アルコキシ基であることはない〕で表される基を示し、
ただし、上記の各置換基の組み合わせは、パーオキシナイトライトとの反応前には式(I)で表される化合物は実質的に非蛍光性であり、パーオキシナイトライトとの反応後には式(I)で表される化合物において式(A)で表される基がニトロ化された化合物は実質的に高い蛍光性となる組み合わせである｝で表される化合物又はその塩が提供される。
ただし、上記の各置換基の組み合わせは、パーオキシナイトライトとの反応前には式(I)で表される化合物は実質的に非蛍光性であり、パーオキシナイトライトとの反応後には式(I)で表される化合物において式(A)で表される基がニトロ化された化合物は実質的に高い蛍光性となる組み合わせである｝で表される化合物又はその塩が提供される。
上記の発明の好ましい態様によれば、一般式(I)で表される化合物において、
R1、R2、R3、R6、R7及びR8の置換基の組み合わせが、パーオキシナイトライトとの反応前には式(I)で表される化合物が実質的に非蛍光となるように上記インダセン環部分に実質的に低い電子密度を与える組み合わせであり、かつR11、R12、R13、R14及びR15の置換基の組み合わせは式(A)で表されるベンゼン環に実質的に高い電子密度を与える組み合わせであり、さらに、
式（A）のR11、R12、R13、R14及びR15の置換基の組み合わせが、式(I)で表される化合物とパーオキシナイトライトとの反応後には、式(I)で表される化合物において式(A)で表される基がニトロ化された化合物が実質的に高い蛍光性となるように上記ベンゼン環の電子密度を十分に高く保つ組み合わせである
化合物又はその塩が提供される。
R1、R2、R3、R6、R7及びR8の置換基の組み合わせが、パーオキシナイトライトとの反応前には式(I)で表される化合物が実質的に非蛍光となるように上記インダセン環部分に実質的に低い電子密度を与える組み合わせであり、かつR11、R12、R13、R14及びR15の置換基の組み合わせは式(A)で表されるベンゼン環に実質的に高い電子密度を与える組み合わせであり、さらに、
式（A）のR11、R12、R13、R14及びR15の置換基の組み合わせが、式(I)で表される化合物とパーオキシナイトライトとの反応後には、式(I)で表される化合物において式(A)で表される基がニトロ化された化合物が実質的に高い蛍光性となるように上記ベンゼン環の電子密度を十分に高く保つ組み合わせである
化合物又はその塩が提供される。
この発明の好ましい様態によれば、上記一般式(I)において、R1、R3、R6及びR8がメチル基であり、R2及びR7がシアノ基であり、R4及びR5がフッ素原子であり、Xが上記の式(A)で表される基（式中の置換基は上記定義と同義である）である化合物；並びに上記一般式(I)において、R1、R3、R6及びR8がメチル基であり、R2及びR7がシアノ基であり、R4及びR5がフッ素原子であり、Xが上記の式(A)で表される基（式中、R11が置換基を有していてもよいC1-8アルコキシ基であり、R12、R14及びR15が水素原子であり、R13が水酸基である）である化合物又はその塩が提供される。R11が示す置換基を有していてもよいC1-8アルコキシ基としてはメトキシ基、エトキシ基又はカルボキシメトキシ基が好ましい。特に、カルボキシメトキシ基が好ましい。
また、上記発明の別の好ましい様態によれば、下記一般式（II）：
（式中、R21及びR22はそれぞれ独立に置換基を有していてもよいC1-8アルコキシ基、水酸基、アミノ基（該アミノ基は一級、二級、又は三級のいずれでもよい）、チオール基、又はセレノール基を示すが、R21及びR22が共に置換基を有していてもよいC1-8アルコキシ基であることはなく、R23、R25、R28及びR30は置換基を有していてもよいC1-8アルキル基を示し、R24及びR29はシアノ基、カルボキシル基、及び置換基を有していてもよいアルキルオキシカルボニル基からなる群から選ばれる電子吸引基を示し、R26及びR27はそれぞれ独立にハロゲン原子、置換基を有していてもよいC1-8アルキル基、又は置換基を有していてもよいC1-8アルコキシ基を示す）
で表される化合物又はその塩が提供される。
で表される化合物又はその塩が提供される。
この発明の好ましい態様によれば、上記一般式(II)において、R21及びR22が水酸基及び置換基を有していてもよいC1-8アルコキシ基の組み合わせであり、R23、R25、R28及びR30が置換基を有していてもよいC1-8アルキル基であり、R24及びR29がシアノ基であり、R26及びR27がフッ素原子である化合物又はその塩が提供される。さらに好ましい態様によれば、上記一般式(II)において、R21及びR22が水酸基及びC1-4アルコキシ基またはモノカルボキシル基置換C1-4アルコキシ基の組み合わせであり、R23、R25、R28及びR30がC1-4アルキル基であり、R24及びR29がシアノ基であり、R26及びR27がフッ素原子である化合物又はその塩が提供される。
別の観点からは、下記一般式（III）：
｛式中R41、R42、R43、R46、R47及びR48はそれぞれ独立に水素原子、置換基を有していてもよいC1-8アルキル基、置換基を有していてもよいアリール基、置換基を有していてもよいビニル基、置換基を有していてもよいチエニル基、又は置換基を有していてもよいピロリル基を示すか、あるいはシアノ基、カルボキシル基、及び置換基を有していてもよいアルキルオキシカルボニル基からなる群から選ばれる電子吸引基を示し、ただし、R41、R42、R43、R46、R47及びR48のうち2ないし6個の基はシアノ基、カルボキシル基、及び置換基を有していてもよいC1-8アルキルオキシカルボニル基の電子吸引基を示し、R44及びR45はそれぞれ独立にハロゲン原子、置換基を有していてもよいC1-8アルキル基、又は置換基を有していてもよいC1-8アルコキシ基を示し、Yは下記の式（B)：
〔式中、R51、R52、R53及びR54はそれぞれ独立に水素原子、置換基を有していてもよいC1-8アルキル基、置換基を有していてもよいC1-8アルコキシ基、水酸基、アミノ基（該アミノ基は一級、二級、又は三級のいずれでもよい）、チオール基、又はセレノール基を示すが、R51、R52、R53及びR54のうち2ないし3個は置換基を有していてもよいC1-8アルコキシ基、水酸基、アミノ基（該アミノ基は一級、二級、又は三級のいずれでもよい）、チオール基、又はセレノール基を示すが、全ての基が置換基を有していてもよいC1-8アルコキシ基であることはない〕で表される基を示し、ただし、上記の各置換基の組み合わせは、上記一般式(III)で表される化合物又はその塩が実質的に高い蛍光性となる組み合わせである｝で表される化合物又はその塩が提供される。
この発明の好ましい態様によれば、R51、R52、R53及びR54の置換基の組み合わせが一般式(III)で表される化合物が実質的に高い蛍光性となるように式(B)におけるベンゼン環の電子密度を十分に高く保つ組み合わせである上記化合物又はその塩が提供される。
この発明の好ましい様態によれば、上記一般式(III)において、R41、R43、R46及びR48がメチル基であり、R42及びR47がシアノ基であり、R44及びR45がフッ素原子であり、Yが上記の式(B)で表される基（式(B)中、R51が置換基を有していてもよいC1-8アルコキシ基であり、R52及びR53が水素原子であり、R54が水酸基である）である化合物又はその塩が提供される。R51が示す置換基を有していてもよいC1-8アルコキシ基としては、メトキシ基、エトキシ基又はカルボキシメトキシ基が好ましい。特に、カルボキシメトキシ基が好ましい。
さらに別の好ましい様態によれば、下記一般式（IV）：
（式中、R61及びR62はそれぞれ独立に置換基を有していてもよいC1-8アルコキシ基、水酸基、アミノ基（該アミノ基は一級、二級、又は三級のいずれでもよい）、チオール基、又はセレノール基を示すが、R61及びR62が共に置換基を有していてもよいC1-8アルコキシ基であることはなく、R63、R65、R68及びR70は置換基を有していてもよいC1-8アルキル基を示し、R64及びR69はシアノ基、カルボキシル基、及び置換基を有していてもよいアルキルオキシカルボニル基からなる群から選ばれる電子吸引基を示し、R66及びR67はそれぞれ独立にハロゲン原子、置換基を有していてもよいC1-8アルキル基、又は置換基を有していてもよいC1-8アルコキシ基を示す）
で表される化合物又はその塩が提供される。
で表される化合物又はその塩が提供される。
さらに、この発明の好ましい様態によれば、上記一般式(IV)において、R63、R65、R68及びR70がメチル基であり、R64及びR69がシアノ基であり、R66及びR67がフッ素原子であり、R61が水酸基であり、R62が置換基を有していてもよいC1-8アルコキシ基である化合物又はその塩；並びに上記一般式(IV)において、R63、R65、R68及びR70がメチル基であり、R64及びR69がシアノ基であり、R66及びR67がフッ素原子であり、R61が水酸基であり、R62がメトキシ基、エトキシ基又はカルボキシメトキシ基である化合物又はその塩が提供される。
また、本発明により、パーオキシナイトライトの測定法であって、下記の工程：
(a)上記一般式(I)、好ましくは上記一般式(II)で表される化合物又はその塩とパーオキシナイトとを反応させる工程、及び
(b)上記工程(a)で生成した上記一般式(III)、好ましくは上記一般式(IV)で表される化合物の蛍光強度を測定する工程
を含む方法が本発明により提供される。
さらに別の観点からは、上記のパーオキシナイトライトの測定用試薬の製造のための上記一般式(I)で表される化合物の使用が本発明により提供される。
(a)上記一般式(I)、好ましくは上記一般式(II)で表される化合物又はその塩とパーオキシナイトとを反応させる工程、及び
(b)上記工程(a)で生成した上記一般式(III)、好ましくは上記一般式(IV)で表される化合物の蛍光強度を測定する工程
を含む方法が本発明により提供される。
さらに別の観点からは、上記のパーオキシナイトライトの測定用試薬の製造のための上記一般式(I)で表される化合物の使用が本発明により提供される。
上記一般式(I)において、R1、R2、R3、R6、R7及びR8が示す置換基を有していてもよいC1-8アルキル基としてはメチル基又はエチル基などが好ましく、置換基を有していてもよいアリール基としてはフェニル基が好ましい。R1、R2、R3、R6、R7及びR8が示す置換基を有していてもよいビニル基に存在する置換基としてはフェニル基、モノアミノフェニル基、又はジアミノフェニル基（例えば3,4-ジアミノフェニル基）などを挙げることができる。R1、R2、R3、R6、R7及びR8が示す置換基を有していてもよいチエニル基及び置換基を有していてもよいピロリル基としては、それぞれ2-チエニル基及び2-ピロリル基が好ましい。R1、R2、R3、R6、R7及びR8が示す置換基がアルキル基以外の基である場合には、化合物の蛍光波長が長波長にシフトすることがある。
上記一般式(I)において、R1、R2、R3、R6、R7及びR8の組み合わせとしては、これらのうちの4個が置換基を有していてもよいC1-8アルキル基であり、かつ2個がシアノ基、カルボキシル基、及び置換基を有していてもよいC1-8アルキルオキシカルボニル基からなる群から選ばれる電子吸引基であることが好ましい。電子吸引基としてはシアノ基が好ましい。2個の電子吸引基が置換する位置としてはR2及びR7が好ましい。R1、R3、R6、及びR8がメチル基であり、かつR2及びR7がシアノ基の組み合わせであることが特に好ましい。
上記一般式(I)においてR4及びR5が示すハロゲン原子としてはフッ素原子が好ましく、置換基を有していてもよいC1-8アルキル基としてはメチル基が好ましく、置換基を有していてもよいC1-8アルコキシ基としてはメトキシ基が好ましい。R4及びR5が示す置換基としてはフッ素原子であることが特に好ましい。
式(A)で表される基において、R11、R12、R13、R14及びR15が示す置換基を有していてもよいC1-8アルキル基としては、例えば、カルボキシ置換C1-8アルキル基、アルコキシカルボニル置換C1-8アルキル基、スルホン酸置換C1-8アルキル基、又はアルキルスルホネート置換C1-8アルキル基などを例示することができる。カルボキシ置換C1-8アルキル基としては、モノカルボキシ置換C1-8アルキル基であることが好ましく、カルボキシメチル基などが好ましい。アルコキシカルボニル置換C1-8アルキル基としては上記のモノカルボキシ置換C1-8アルキル基のC1-8アルキルエステルを例示することができる。好ましくはエトキシカルボニル置換C1-8アルキル基などである。スルホン酸置換C1-8アルキル基としてはモノスルホン酸置換C1-8アルキル基であることが好ましい。アルキルスルホネート置換C1-8アルキル基としてはモノアルキルスルホネート置換C1-8アルキル基が好ましい。アルキルスルホネート置換C1-8アルキル基のアルキルスルホネート基としてはC1-8アルキルスルホネート基（C1-8アルキル-O-SO2-）が好ましい。
R11、R12、R13、R14及びR15が示す置換基を有していてもよいC1-8アルコキシ基としてはモノカルボキシ置換C1-8アルコキシ基及びモノカルボキシ置換C1-8アルコキシ基のC1-8アルキルエステル基であることが好ましい。それぞれカルボキシメトキシ基及びメトキシカルボニルメトキシ基などを例示することができる。置換基を有していてもよいC1-8アルコキシ基がモノカルボキシ置換C1-8アルコキシ基である場合には水溶性が著しく高まり、優れた効果が得られることがある。また、置換基を有していてもよいC1-8アルコキシ基がモノカルボキシ置換C1-8アルコキシ基のC1-8アルキルエステル基（メトキシカルボニルメトキシ基やアセトキシメトキシカルボニルメトキシ基など）である場合には細胞膜透過性が高まり、かつ細胞内に取り込まれた後に細胞内のエステラーゼによりC1-8アルキルエステル基が加水分解されると水溶性の高いモノカルボキシ置換C1-8アルコキシ基に変換され細胞内に留まる性質を付与できるなど優れた効果が得られることがある。
R11、R12、R13、R14及びR15の置換基の組み合わせとしては、これらのうちの2ないし3個が水素原子であり、かつ2ないし3個が置換基を有していてもよいC1-8アルコキシ基、水酸基、アミノ基（該アミノ基は一級、二級、又は三級のいずれでもよい）、チオール基、又はセレノール基であることが好ましい。これらのうち3個が水素原子であり、かつ2個が置換基を有していてもよいC1-8アルコキシ基、水酸基、アミノ基（該アミノ基は一級、二級、又は三級のいずれでもよい）、チオール基、又はセレノール基であることが特に好ましい。特に好ましいR11、R12、R13、R14及びR15の置換基の組み合わせとしては、これらのうちの3個が水素原子であり、1個が水酸基、アミノ基（該アミノ基は一級、二級、又は三級のいずれでもよい）、チオール基、又はセレノール基であり、１個が置換基を有していてもよいC1-8アルコキシ基である組み合わせである。最も好ましいR11、R12、R13、R14及びR15の置換基の組み合わせとしては、R11がカルボキシメトキシ基であり、R12、R14及びR15が水素原子であり、かつR13が水酸基である組み合わせである。
上記一般式(II)において、R21及びR22はそれぞれ独立に置換基を有していてもよいC1-8アルコキシ基又は水酸基であることが好ましく（ただしR21及びR22が共に置換基を有していてもよいC1-8アルコキシ基であることはない）、R23、R25、R28及びR30は置換基を有していてもよいC1-8アルキル基、好ましくはメチル基又はエチル基、さらに好ましくはメチル基であり、R24及びR29はシアノ基であることが好ましく、R26及びR27はフッ素原子であることが好ましい。
上記一般式(I)又は上記一般式(II)で表される化合物の塩の種類は特に限定されないが、例えば塩基付加塩、酸付加塩、アミノ酸塩などを挙げることができる。塩基付加塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などの金属塩、アンモニウム塩、又はトリエチルアミン塩、ピペリジン塩、モルホリン塩などの有機アミン塩を挙げることができ、酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩などの鉱酸塩、メタンスルホン酸塩、パラトルエンスルホン酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩などの有機酸塩を挙げることができる。アミノ酸塩としてはグリシン塩などを例示することができる。これらのうち、生理学的に許容される水溶性の塩は、本発明の測定用試薬及び測定方法に好適に使用できる。また、遊離形態の一般式(I)で表される化合物又はその塩は、水和物又は溶媒和物として存在する場合もあるが、水和物又は溶媒和物を本発明の測定用試薬として用いてもよい。溶媒和物を形成する溶媒の種類は特に限定されないが、例えば、エタノール、アセトン、イソプロパノールなどの溶媒を例示することができる。
一般式(I)で表される化合物は、その置換基の種類に応じて１個又は２個以上の不斉炭素を有する場合があり、光学異性体又はジアステレオ異性体などの立体異性体が存在する場合がある。純粋な形態の立体異性体、立体異性体の任意の混合物、ラセミ体などを本発明の測定用試薬として用いてもよい。
上記一般式(I)で表される化合物又はその塩は、緩和な条件下、例えば生理的条件下でパーオキシナイトライトと反応して、式(A)におけるベンゼン環の一つの水素原子がニトロ化された一般式(III)で表される化合物又はその塩を与える性質を有している。一般式(I)で表される化合物又はその塩は実質的に非蛍光性であり、一方、ニトロ化された一般式(III)で表される化合物又はその塩は高強度の蛍光を発する性質を有している。従って、上記式(I)で表される化合物又はその塩をパーオキシナイトライトと反応させた後、ニトロ化された一般式(III)で表される化合物又はその塩の蛍光を測定することによって、パーオキシナイトライトを高感度に測定することが可能である。
また、上記一般式(I)で表される化合物又はその塩は、上記の条件下では他の活性酸素種であるヒドロキシラジカル、一重項酸素、次亜塩素酸イオン、パーオキシナイトライトのプリカーサーである一酸化窒素又はスーパーオキサイドと反応して蛍光性の化合物を与えないという特徴がある。従って、上記一般式(I)で表される化合物又はその塩を用いることにより、生理的条件下で他の活性酸素種の影響なしにパーオキシナイトライトのみを特異的に測定することが可能である。例えば、一般式(I)で表される化合物又はその塩を測定用試薬として用いることにより、個々の細胞や特定の組織中に局在するパーオキシナイトライトを正確にかつ簡便に測定できる。
上記一般式(III)及び上記一般式(IV)におけるそれぞれの置換基は、上記一般式(I)及び上記一般式(II)について説明した対応位置における置換基と同様である。また、上記一般式(III)及び上記一般式(IV)の塩、並びにそれらの異性体などについても上記一般式(I)及び上記一般式(II)について説明したものと同様である。一般式(III)で表される化合物の(B)で表される基においてニトロ基の位置並びにR51、R52、R53、及びR54の位置はそれぞれ特に限定されず、ベンゼン環上の任意の位置に置換することができる。また、一般式(IV)で表される化合物においてベンゼン環上に置換するニトロ基の位置、並びにR61及びR62の位置は特に限定されず、ベンゼン環上の任意の位置に置換することができる。
本明細書において用いられる「測定」という用語は、定量、定性、又は診断などの目的で行われる測定、検査、検出などを含めて、最も広義に解釈しなければならない。本発明のパーオキシナイトライトの測定方法は、一般的には、(A)上記一般式(I)で表される化合物又はその塩とパーオキシナイトライトとを反応させる工程、及び(B)上記工程(A)で生成した一般式(III)で表されるニトロ化合物又はその塩の蛍光を測定する工程を含んでいる。
一般式(III)で表されるニトロ化された化合物又はその塩の蛍光の測定は通常の方法で行うことができ、インビトロで蛍光スペクトルを測定する方法や、バイオイメージングの手法を用いてインビボで蛍光スペクトルを測定する方法などを採用することができる。例えば、定量を行う場合には、常法に従って予め検量線を作成しておくことが望ましい。本発明の測定用試薬は細胞内に容易に取り込まれる性質を有しており、個々の細胞内に局在するパーオキシナイトライトをバイオイメージング手法により高感度に測定できる。
本発明の測定用試薬としては、上記一般式(I)で表される化合物又はその塩をそのまま用いてもよいが、必要に応じて、試薬の調製に通常用いられる添加剤を配合して組成物として用いてもよい。例えば、生理的環境で試薬を用いるための添加剤として、溶解補助剤、pH調節剤、緩衝剤、等張化剤などの添加剤を用いることができ、これらの配合量は当業者に適宜選択可能である。これらの組成物は、粉末形態の混合物、凍結乾燥物、顆粒剤、錠剤、液剤など適宜の形態の組成物として提供される。
本発明の化合物の代表的化合物の製造方法を本明細書の実施例に具体的に示した。従って、当業者は、これらの説明を基にして反応原料、反応条件、及び反応剤などを適宜選択し、必要に応じてこれらの方法に修飾や改変を加えることによって、上記一般式（I）で表される本発明の化合物をいずれも製造することができる。インダセン骨格については、例えば、特開平10-338695号公報及び特開平11-5796号公報のほか、New J. Chem., 25, pp.289-292, 2001; Tetrahedron Letters, 42, pp.6711-6713, 2001; Angew. Chem. Int. Ed., 40, pp.385-387, 2001；及び特開2003-277385号明細書などに合成方法が示されているので、これらの刊行物を参照することにより当業者は本発明の化合物をさらに容易に製造可能である。上記の刊行物の開示のすべてを参照として本明細書の開示に含める。
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
例１：パーオキシナイトライト蛍光プローブの合成
化合物4の合成スキームを以下に示した。
例１：パーオキシナイトライト蛍光プローブの合成
化合物4の合成スキームを以下に示した。
(a) 3-シアノ-2,4-ジメチルピロールの合成
既知文献（Australian Journal of Chemistry, 17, pp.1013-1021, 1965)に記載の方法で合成した。
既知文献（Australian Journal of Chemistry, 17, pp.1013-1021, 1965)に記載の方法で合成した。
(b) 化合物1（4-ベンジルオキシ-2-ベンジルオキシカルボニルメトキシベンズアルデヒド）の合成
4-ベンジルオキシ-2-ヒドロキシベンズアルデヒド (1 g, 4.39 mmol) を 蒸留した ジメチルホルムアミド（DMF） 8 mL に溶解し、ブロモ酢酸ベンジル (1.1 g, 4.82 mmol)、炭酸セシウム(1.57 g, 4.83 mmol) を加え、アルゴン雰気下、終夜室温で撹拌した。反応溶液に水 150 mL を加え，酢酸エチル 100 mL で 3 回抽出した。抽出した有機層を水 50 mL で 5 回、飽和食塩水 100 mL で 1 回洗い、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下溶媒を留去し、得られた固体をカラムクロマトグラフィー（担体：シリカゲル 60 N, 溶媒：ジクロロメタン）により精製し、ヘキサンより再結晶を行い、93 % の収率で白色固体の目的化合物１を得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 4.73 (s, 2H), 5.03 (s, 2H) , 5.23 (s, 2H) , 6.35 (d, J = 2.0 Hz, 1H) , 6.66 (dd, J = 2.0, 8.8 Hz, 1H) , 7.33-7.40 (m, 10H) , 7.94 (d, J = 8.8 Hz, 1H) , 10.38 (s, 1H). 13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ65.4, 67.1, 70.3, 99.6, 107.6, 119.4, 127.5, 128.3, 128.4, 128.6, 128.7, 130.7, 134.8, 135.6, 161.6, 164.9, 167.8, 188.0. MS (ESI+): 399 [M+Na]+.
Anal. Calcd for C23H20O5: N, 0; C, 73.39; H, 5.36. Found: N, 0; C; 73.18; H, 5.62. Mp: 84.4 - 85.7 °C.
4-ベンジルオキシ-2-ヒドロキシベンズアルデヒド (1 g, 4.39 mmol) を 蒸留した ジメチルホルムアミド（DMF） 8 mL に溶解し、ブロモ酢酸ベンジル (1.1 g, 4.82 mmol)、炭酸セシウム(1.57 g, 4.83 mmol) を加え、アルゴン雰気下、終夜室温で撹拌した。反応溶液に水 150 mL を加え，酢酸エチル 100 mL で 3 回抽出した。抽出した有機層を水 50 mL で 5 回、飽和食塩水 100 mL で 1 回洗い、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下溶媒を留去し、得られた固体をカラムクロマトグラフィー（担体：シリカゲル 60 N, 溶媒：ジクロロメタン）により精製し、ヘキサンより再結晶を行い、93 % の収率で白色固体の目的化合物１を得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 4.73 (s, 2H), 5.03 (s, 2H) , 5.23 (s, 2H) , 6.35 (d, J = 2.0 Hz, 1H) , 6.66 (dd, J = 2.0, 8.8 Hz, 1H) , 7.33-7.40 (m, 10H) , 7.94 (d, J = 8.8 Hz, 1H) , 10.38 (s, 1H). 13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ65.4, 67.1, 70.3, 99.6, 107.6, 119.4, 127.5, 128.3, 128.4, 128.6, 128.7, 130.7, 134.8, 135.6, 161.6, 164.9, 167.8, 188.0. MS (ESI+): 399 [M+Na]+.
Anal. Calcd for C23H20O5: N, 0; C, 73.39; H, 5.36. Found: N, 0; C; 73.18; H, 5.62. Mp: 84.4 - 85.7 °C.
(c) 化合物３〔8-(4-ベンジルオキシ-2-ベンジルオキシカルボニルメトキシフェニル)-2,6-ジシアノ-1,3,5,7-テトラメチル-4,4-ジフルオロ-4-ボラ-3a,4a-ジアザ-s-インダセン〕の合成
化合物１ (400 mg, 1.06 mmol) と 3-シアノ-2,4-ジメチルピロール(262 mg, 2.18 mmol) をジクロロメタン 200 mL に溶解させ、トリフルオロ酢酸 2 mL を滴下し加えた。終夜室温で撹拌した後、2,3-ジクロロ5,6-ジシアノ-p-ベンゾキノン(314 mg, 1.38 mmol) を加え、30 分室温で撹拌した。反応液を水 100 mL で 2 回、飽和食塩水 100 mL で 1 回洗浄した後、溶媒を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下溶媒を濃縮した。得られた固体をジクロロメタンを溶媒としアルミニウムオキサイドを通して濾過した。減圧下溶媒を留去し固体として粗製の化合物２を得た。得られた固体の化合物２を脱水トルエン 120 mL に溶解させた。この溶液に ジイソプロピルエチルアミン 3 mL を加え、三フッ化ホウ素・ジエチルエーテル錯体 2.5 mL を滴下し、室温で 5 分間撹拌した。反応液を水 100 mL で 2 回、飽和食塩水 50 mL で 1 回洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで溶媒を乾燥した。溶媒を減圧下留去し、カラムクロマトグラフィー（担体：シリカゲル 60 N, 溶媒：ジクロロメタン）で精製し、目的化合物３を 245 mg、36 %収率で得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3)： 1.54 (s, 6H), 2.70 (s, 6H) , 4.61 (s, 2H) , 5.05 (s, 2H) , 5.17 (s, 2H) , 6.42 (d, J = 2.0 Hz, 1H) , 6.78 (dd, J = 2.0, 8.4 Hz, 1H) , 7.00 (d, J = 8.4 Hz, 1H) , 7.31-7.43 (m, 10H). 13C NMR (75 MHz, CDCl3)： d 13.4, 13.8, 64.7, 67.4, 70.4, 100.6, 106.0, 108.0, 113.8, 113.9, 127.7, 128.5, 128.6, 128.7, 128.8, 129.4, 132.1, 134.6, 135.7, 144.1, 149.4, 155.0, 159.1, 161.8, 167.7. HRMS (ESI-): calcd for [M-H]-, 643.2328; Found, 643.2334. Anal. Calcd for C37H31BF2N4O4: N, 8.69; C, 68.95; H, 4.85. Found: N, 8.39; C, 68.71; H, 5.02.
化合物１ (400 mg, 1.06 mmol) と 3-シアノ-2,4-ジメチルピロール(262 mg, 2.18 mmol) をジクロロメタン 200 mL に溶解させ、トリフルオロ酢酸 2 mL を滴下し加えた。終夜室温で撹拌した後、2,3-ジクロロ5,6-ジシアノ-p-ベンゾキノン(314 mg, 1.38 mmol) を加え、30 分室温で撹拌した。反応液を水 100 mL で 2 回、飽和食塩水 100 mL で 1 回洗浄した後、溶媒を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下溶媒を濃縮した。得られた固体をジクロロメタンを溶媒としアルミニウムオキサイドを通して濾過した。減圧下溶媒を留去し固体として粗製の化合物２を得た。得られた固体の化合物２を脱水トルエン 120 mL に溶解させた。この溶液に ジイソプロピルエチルアミン 3 mL を加え、三フッ化ホウ素・ジエチルエーテル錯体 2.5 mL を滴下し、室温で 5 分間撹拌した。反応液を水 100 mL で 2 回、飽和食塩水 50 mL で 1 回洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで溶媒を乾燥した。溶媒を減圧下留去し、カラムクロマトグラフィー（担体：シリカゲル 60 N, 溶媒：ジクロロメタン）で精製し、目的化合物３を 245 mg、36 %収率で得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3)： 1.54 (s, 6H), 2.70 (s, 6H) , 4.61 (s, 2H) , 5.05 (s, 2H) , 5.17 (s, 2H) , 6.42 (d, J = 2.0 Hz, 1H) , 6.78 (dd, J = 2.0, 8.4 Hz, 1H) , 7.00 (d, J = 8.4 Hz, 1H) , 7.31-7.43 (m, 10H). 13C NMR (75 MHz, CDCl3)： d 13.4, 13.8, 64.7, 67.4, 70.4, 100.6, 106.0, 108.0, 113.8, 113.9, 127.7, 128.5, 128.6, 128.7, 128.8, 129.4, 132.1, 134.6, 135.7, 144.1, 149.4, 155.0, 159.1, 161.8, 167.7. HRMS (ESI-): calcd for [M-H]-, 643.2328; Found, 643.2334. Anal. Calcd for C37H31BF2N4O4: N, 8.69; C, 68.95; H, 4.85. Found: N, 8.39; C, 68.71; H, 5.02.
(d) 化合物４〔2,6-ジシアノ-8-(4-ヒドロキシ-2-カルボキシメトキシフェニル)-1,3,5,7-テトラメチル-4,4-ジフルオロ-4-ボラ-3a,4a-ジアザ-s-インダセン〕の合成
化合物３ 35 mgをクロロホルム 10 mL に溶解し、これをエタノール 40 mL で希釈した。この溶液に 10 % Pd-C を少量加え、水素雰気下、終夜激しく撹拌した。反応液を濾過し、減圧下溶媒を留去した後にカラムクロマトグラフィー（担体：シリカゲル 60 , 溶媒：9 % メタノール／ジクロロメタン）により精製し、目的化合物４を 15 mg、59 % 収率で得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 1.75 (s, 6H) , 2.71 (s, 6H) , 4.61 (s, 2H) , 6.44 (d, J = 1.6 Hz, 1H) , 6.68 (dd, J = 1.6, 8.2 Hz, 1H) , 6.93 (d, J = 8.2 Hz, 1H). HRMS HRMS (ESI-): calcd for [M-H]-, 463.1389; found 463.1342
化合物３ 35 mgをクロロホルム 10 mL に溶解し、これをエタノール 40 mL で希釈した。この溶液に 10 % Pd-C を少量加え、水素雰気下、終夜激しく撹拌した。反応液を濾過し、減圧下溶媒を留去した後にカラムクロマトグラフィー（担体：シリカゲル 60 , 溶媒：9 % メタノール／ジクロロメタン）により精製し、目的化合物４を 15 mg、59 % 収率で得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 1.75 (s, 6H) , 2.71 (s, 6H) , 4.61 (s, 2H) , 6.44 (d, J = 1.6 Hz, 1H) , 6.68 (dd, J = 1.6, 8.2 Hz, 1H) , 6.93 (d, J = 8.2 Hz, 1H). HRMS HRMS (ESI-): calcd for [M-H]-, 463.1389; found 463.1342
例２：化合物４とパーオキシナイトライトの反応
化合物４の20 mmol/L DMF 溶液を10 μmol/L となるように100mmol/Lリン酸緩衝液
（ｐH7.4）に溶解した。 2 mmol/L、5 mmol/L、10 mmol/L、20 mmol/Lおよび 80 mmol/Lのパーオキシナイトライト 溶液を、終濃度が 1、2、4、5、10、20、50μmol/Lとなるように撹拌しながら加え、60秒後に蛍光スペクトルを測定した（励起波長505nm）。結果を図１、図２、及び図３に示す。図１、図２、及び図３から明らかなように、パーオキシナイトライトの添加量に依存した蛍光強度の増加が認められることから（極大蛍光波長518nm）、本発明の化合物４がパーオキシナイトライトとの反応によって濃度依存的に発蛍光することが示された。
化合物４の20 mmol/L DMF 溶液を10 μmol/L となるように100mmol/Lリン酸緩衝液
（ｐH7.4）に溶解した。 2 mmol/L、5 mmol/L、10 mmol/L、20 mmol/Lおよび 80 mmol/Lのパーオキシナイトライト 溶液を、終濃度が 1、2、4、5、10、20、50μmol/Lとなるように撹拌しながら加え、60秒後に蛍光スペクトルを測定した（励起波長505nm）。結果を図１、図２、及び図３に示す。図１、図２、及び図３から明らかなように、パーオキシナイトライトの添加量に依存した蛍光強度の増加が認められることから（極大蛍光波長518nm）、本発明の化合物４がパーオキシナイトライトとの反応によって濃度依存的に発蛍光することが示された。
例３：化合物４と種々の活性酸素との反応
化合物４の20 mmol/L DMF 溶液を10 μmol/L となるように100mmol/Lリン酸緩衝液（ｐH7.4）で希釈した溶液を調製し試験に使用した。調製した溶液を以下の条件：
(a)パーオキシナイトライトを終濃度10μmol/Lとなるよう添加
(b)過酸化水素を終濃度1mmol/Lとなるよう添加
(c)過酸化水素及び次亜塩素酸イオンをそれぞれ終濃度１mmol/L、100μmol/Lとなるよう添加
(d)過酸化水素及び硫酸鉄(II)をそれぞれ終濃度１mmol/L、50μmol/Lとなるよう添加
(e)次亜塩素酸イオンをを終濃度10μmol/Lとなるよう添加
(f)NOC-13（一酸化窒素放出剤：同仁化学研究所製）を終濃度100μmol/Lとなるよう添加
で3分（(f)のみ30分）処理し、それぞれ反応後の蛍光スペクトル変化を測定することで、(a)パーオキシナイトライト、(b)過酸化水素、(c)一重項酸素、(d)ヒドロキシルラジカル、(e)次亜塩素酸イオン、(f)一酸化窒素との反応性を比較した。結果を図4に示す。図４から明らかなように、本発明の化合物４は過酸化水素、一重項酸素、ヒドロキシルラジカル、次亜塩素酸イオン、一酸化窒素の添加では蛍光を全く発しないが、パーオキシナイトライトの添加によって強い蛍光を発することが確認された。すなわち、本発明の化合物４がパーオキシナイトライトに対して高い選択性を有していることが示された。
化合物４の20 mmol/L DMF 溶液を10 μmol/L となるように100mmol/Lリン酸緩衝液（ｐH7.4）で希釈した溶液を調製し試験に使用した。調製した溶液を以下の条件：
(a)パーオキシナイトライトを終濃度10μmol/Lとなるよう添加
(b)過酸化水素を終濃度1mmol/Lとなるよう添加
(c)過酸化水素及び次亜塩素酸イオンをそれぞれ終濃度１mmol/L、100μmol/Lとなるよう添加
(d)過酸化水素及び硫酸鉄(II)をそれぞれ終濃度１mmol/L、50μmol/Lとなるよう添加
(e)次亜塩素酸イオンをを終濃度10μmol/Lとなるよう添加
(f)NOC-13（一酸化窒素放出剤：同仁化学研究所製）を終濃度100μmol/Lとなるよう添加
で3分（(f)のみ30分）処理し、それぞれ反応後の蛍光スペクトル変化を測定することで、(a)パーオキシナイトライト、(b)過酸化水素、(c)一重項酸素、(d)ヒドロキシルラジカル、(e)次亜塩素酸イオン、(f)一酸化窒素との反応性を比較した。結果を図4に示す。図４から明らかなように、本発明の化合物４は過酸化水素、一重項酸素、ヒドロキシルラジカル、次亜塩素酸イオン、一酸化窒素の添加では蛍光を全く発しないが、パーオキシナイトライトの添加によって強い蛍光を発することが確認された。すなわち、本発明の化合物４がパーオキシナイトライトに対して高い選択性を有していることが示された。
例４：化合物４とパーオキシナイトライトとの反応生成物の確認
例１で得られた本発明の化合物20 mmol/L DMF 溶液を10 μmol/L となるように pH 7.4 の0.1 mol/L リン酸緩衝液に溶解し、パーオキシナイトライト溶液を添加後、HPLC による分析を行った。結果を図５に示す。それぞれ(A)反応前、(B)終濃度10μmol/L のパーオキシナイトライト添加後、(C)終濃度50 μmol/L パーオキシナイトライト添加後のHPLC分析結果を示す。図中、下段のラインは 500 nm における吸光度によって分析した結果であり、上段のラインは520 nm における蛍光強度（500 nm 励起）によって分析した結果である。
分析条件
カラム: GL Science Inc. Inertsil ODS-3, 5 μm 4.6 x 250 mm
流速： 1 mL/min
溶出液A:：0.1 % トリフルオロ酢酸水溶液
溶出液B： 80 % アセトニトリル水溶液（0.1 % トリフルオロ酢酸添加）
グラジェント： A/B: 60/40 => 0/100 (10 分)
例１で得られた本発明の化合物20 mmol/L DMF 溶液を10 μmol/L となるように pH 7.4 の0.1 mol/L リン酸緩衝液に溶解し、パーオキシナイトライト溶液を添加後、HPLC による分析を行った。結果を図５に示す。それぞれ(A)反応前、(B)終濃度10μmol/L のパーオキシナイトライト添加後、(C)終濃度50 μmol/L パーオキシナイトライト添加後のHPLC分析結果を示す。図中、下段のラインは 500 nm における吸光度によって分析した結果であり、上段のラインは520 nm における蛍光強度（500 nm 励起）によって分析した結果である。
分析条件
カラム: GL Science Inc. Inertsil ODS-3, 5 μm 4.6 x 250 mm
流速： 1 mL/min
溶出液A:：0.1 % トリフルオロ酢酸水溶液
溶出液B： 80 % アセトニトリル水溶液（0.1 % トリフルオロ酢酸添加）
グラジェント： A/B: 60/40 => 0/100 (10 分)
パーオキシナイトライトを添加せずにHPLC分析を行うと11.1分に500 nmの吸収を持つ無蛍光の化合物４のピークのみが観察されるが（A）、パーオキシナイトライトを添加した後のHPLC分析では、11.9分にパーオキシナイトライトとの反応生成物と考えられる蛍光性を有するピークが生成していることが観察された（B、C）。また、キュベット中で化合物４とパーオキシナイトライトを反応させた後，1 N 塩酸 によって反応液を酸性にして酢酸エチルで抽出した生成物をLCMSにて分析した。
分析条件
カラム: GL Science Inc. Inertsil ODS-3, 5 μm 2.1 x 150 mm
流速： 0.2 mL/min.
溶出液A:：0.1 % ギ酸水溶液
溶出液B： 80 % アセトニトリル水溶液（0.1 % トリフルオロ酢酸添加）
グラジェント： A/B: 60/40 => 0/100 (10 min.)
分析条件
カラム: GL Science Inc. Inertsil ODS-3, 5 μm 2.1 x 150 mm
流速： 0.2 mL/min.
溶出液A:：0.1 % ギ酸水溶液
溶出液B： 80 % アセトニトリル水溶液（0.1 % トリフルオロ酢酸添加）
グラジェント： A/B: 60/40 => 0/100 (10 min.)
結果を図６に示す。この結果、13.1分に化合物４の質量463（[M-H]-）のピークが観察され、15.1分に質量508のピークが観察された。15.1分の質量508のピークは、下記スキームで別途合成したニトロ化体のHRMS [M-H]-の分析結果（calcd for [M-H]-, 508.1239;Found, 508.1214.）に測定誤差範囲内で一致していた。以上のことから、本発明の化合物４は、パーオキシナイトライトと反応して、ベンゼン環上の水素原子がニトロ基で置換された化合物となることが示された。
例５：化合物４を用いたパーオキシナイトライトのイメージング
HeLa細胞を5% CO2インキュベーター中、10%(v/v)ウシ胎児血清、ペニシリン(100 units/mL)、ストレプロマイシン(100 μg/mL)を添加したDulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)中で前培養した。このHeLa細胞を35 mm径ガラス底ディッシュ(MatTek Corporation)に播き、DMEM中でさらに一晩培養した。24時間後に培地を除去し、HeLa細胞をハンクス液（HBSS）で洗浄(2×1 mL)した。化合物4の2 μmol/L HBSS溶液(補助溶媒として0.01% DMFおよび0.01% Cremophor EL(SIGMA)を含有)を2 mL添加し、HeLa細胞を室温で20分間インキュベートした。続いてHeLa細胞をHBSSで洗浄(2×1 mL)した。パーオキシナイトライト添加前およびパーオキシナイトライトを終濃度10μmol/Lとなるように添加後の蛍光像を、励起波長470-490 nm、蛍光波長510-550 nmで撮影した。
HeLa細胞を5% CO2インキュベーター中、10%(v/v)ウシ胎児血清、ペニシリン(100 units/mL)、ストレプロマイシン(100 μg/mL)を添加したDulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)中で前培養した。このHeLa細胞を35 mm径ガラス底ディッシュ(MatTek Corporation)に播き、DMEM中でさらに一晩培養した。24時間後に培地を除去し、HeLa細胞をハンクス液（HBSS）で洗浄(2×1 mL)した。化合物4の2 μmol/L HBSS溶液(補助溶媒として0.01% DMFおよび0.01% Cremophor EL(SIGMA)を含有)を2 mL添加し、HeLa細胞を室温で20分間インキュベートした。続いてHeLa細胞をHBSSで洗浄(2×1 mL)した。パーオキシナイトライト添加前およびパーオキシナイトライトを終濃度10μmol/Lとなるように添加後の蛍光像を、励起波長470-490 nm、蛍光波長510-550 nmで撮影した。
結果を図７に示す。図中、（A)は化合物4をロードしたHeLa細胞の微分干渉顕微鏡像、（B)はパーオキシナイトライト添加前の蛍光強度を擬似カラーで示した蛍光像、（C)はパーオキシナイトライト添加後の蛍光強度を擬似カラーで示した蛍光像、（D)は（A)と（B）の融合像である。（B)及び（C)から明らかなように、本発明の化合物を使用してパーオキシナイトライトの蛍光イメージングが可能であった。
本発明の化合物はパーオキシナイトライトを高選択的に測定可能な蛍光プローブとして有用であり、特にバイオイメージング法に適応可能なパーオキシナイトライト高選択的蛍光プローブとして有用である。
Claims (13)
- 下記の一般式(I)：
ただし、上記の各置換基の組み合わせは、パーオキシナイトライトとの反応前には式(I)で表される化合物は実質的に非蛍光性であり、パーオキシナイトライトとの反応後には式(I)で表される化合物において式(A)で表される基がニトロ化された化合物は実質的に高い蛍光性となる組み合わせである｝で表される化合物又はその塩。 - 一般式(I)で表される化合物において、
R1、R2、R3、R6、R7及びR8の置換基の組み合わせが、パーオキシナイトライトとの反応前には式(I)で表される化合物が実質的に非蛍光となるように上記インダセン環部分に実質的に低い電子密度を与える組み合わせであり、かつR11、R12、R13、R14及びR15の置換基の組み合わせは式(A)で表されるベンゼン環に実質的に高い電子密度を与える組み合わせであり、さらに、
式（A）のR11、R12、R13、R14及びR15の置換基の組み合わせが、式(I)で表される化合物とパーオキシナイトライトとの反応後には、式(I)で表される化合物において式(A)で表される基がニトロ化された化合物が実質的に高い蛍光性となるように上記ベンゼン環の電子密度を十分に高く保つ組み合わせである請求項１に記載の化合物又はその塩。 - R1、R3、R6及びR8がメチル基であり、R2及びR7がシアノ基であり、R4及びR5がフッ素原子であり、Xが上記の式(A)で表される基（式中の置換基は上記定義と同義である）である請求項１又は２に記載の化合物又はその塩。
- 下記一般式（II）：
- R21及びR22が水酸基及び置換基を有していてもよいC1-8アルコキシ基の組み合わせであり、R23、R25、R28及びR30が置換基を有していてもよいC1-8アルキル基であり、R24及びR29がシアノ基であり、R26及びR27がフッ素原子である請求項４に記載の化合物又はその塩。
- R21及びR22が水酸基及びモノカルボキシ基置換C1-4アルコキシ基の組み合わせであり、R23、R25、R28及びR30がC1-4アルキル基であり、R24及びR29がシアノ基であり、R26及びR27がフッ素原子である請求項４に記載の化合物又はその塩。
- 下記一般式（III）：
- R51、R52、R53及びR54の置換基の組み合わせが一般式(III)で表される化合物が実質的に高い蛍光性となるように式(B)におけるベンゼン環の電子密度を十分に高く保つ組み合わせである請求項７に記載の化合物又はその塩。
- R41、R43、R46及びR48がメチル基であり、R42及びR47がシアノ基であり、R44及びR45がフッ素原子であり、Yが上記の式(B)で表される基（式(B)中、R51が置換基を有していてもよいC1-8アルコキシ基であり、R52及びR54が水素原子であり、R53が水酸基である）である請求項７又は８に記載の化合物又はその塩。
- 下記一般式（IV）：
- R63、R65、R68及びR70がメチル基であり、R64及びR69がシアノ基であり、R66及びR67がフッ素原子であり、R61が水酸基であり、R62が置換基を有していてもよいC1-8アルコキシ基である請求項１０に記載の化合物又はその塩。
- R63、R65、R68及びR70がメチル基であり、R64及びR69がシアノ基であり、R66及びR67がフッ素原子であり、R61が水酸基であり、R62がメトキシ基、エトキシ基またはカルボキシメトキシ基である請求項１０に記載の化合物又はその塩。
- パーオキシナイトライトの測定法であって、下記の工程：
(a)上記一般式(I)で表される化合物又はその塩とパーオキシナイトとを反応させる工程、及び
(b)上記工程(a)で生成した上記一般式(III)で表される化合物の蛍光強度を測定する工程
を含む方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US73581505P | 2005-11-14 | 2005-11-14 | |
| US60/735,815 | 2005-11-14 | ||
| PCT/JP2006/322599 WO2007055364A1 (ja) | 2005-11-14 | 2006-11-14 | パーオキシナイトライト蛍光プローブ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPWO2007055364A1 true JPWO2007055364A1 (ja) | 2009-04-30 |
| JP5228190B2 JP5228190B2 (ja) | 2013-07-03 |
Family
ID=38023355
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2007544228A Active JP5228190B2 (ja) | 2005-11-14 | 2006-11-14 | パーオキシナイトライト蛍光プローブ |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US8178669B2 (ja) |
| JP (1) | JP5228190B2 (ja) |
| WO (1) | WO2007055364A1 (ja) |
Families Citing this family (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20060275912A1 (en) * | 2003-02-28 | 2006-12-07 | Tetsuo Nagano | Fluorescent probes |
| US8258171B2 (en) | 2006-11-15 | 2012-09-04 | The University Of Tokyo | pH-sensitive fluorescent probe |
| US8309319B2 (en) * | 2007-02-27 | 2012-11-13 | The University Of Tokyo | Fluorescent probe for measurement of UDP-glucuronosyltransferase |
| WO2008108074A1 (ja) * | 2007-03-01 | 2008-09-12 | The University Of Tokyo | 蛍光プローブ |
| WO2009139452A1 (ja) | 2008-05-16 | 2009-11-19 | 国立大学法人東京大学 | 活性酸素測定用試薬 |
| WO2010143445A1 (ja) | 2009-06-10 | 2010-12-16 | パナソニック株式会社 | 無線通信端末及び無線通信方法 |
| JP5897332B2 (ja) * | 2009-06-26 | 2016-03-30 | 国立大学法人大阪大学 | 観察方法 |
| JP2011241160A (ja) * | 2010-05-17 | 2011-12-01 | Yamamoto Chem Inc | 色変換材料、該材料を含む組成物、該組成物を使用した色変換光学部品および該色変換光学部品を使用した発光素子 |
| KR101397530B1 (ko) * | 2012-08-10 | 2014-05-20 | 한국과학기술원 | 비대칭이고 치환 가능한 벤즈아줄렌 형태의 형광 화합물 및 그의 제조방법 |
| JP6258355B2 (ja) * | 2013-01-28 | 2018-01-10 | カウンスィル オブ サイエンティフィック アンド インダストリアル リサーチＣｏｕｎｃｉｌ Ｏｆ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ | 水中の亜硝酸イオンの選択的な検出のための新規アザｂｏｄｉｐｙ化合物及びその調製方法 |
| CN103710020B (zh) * | 2013-12-13 | 2015-06-10 | 武汉大学 | 一种长波长荧光探针及其制备方法和应用 |
| TWI687428B (zh) * | 2014-03-27 | 2020-03-11 | 中央研究院 | 反應性標記化合物及其用途 |
| ES2925694T3 (es) | 2015-03-12 | 2022-10-19 | Becton Dickinson Co | Colorantes poliméricos de BODIPY y métodos de uso de los mismos |
| KR102148058B1 (ko) * | 2015-09-25 | 2020-08-26 | 주식회사 엘지화학 | 함질소 고리 화합물 및 이를 포함하는 색변환 필름 |
| CN111848671B (zh) * | 2020-07-29 | 2022-06-21 | 湖南文理学院 | 一种过氧亚硝酰阴离子比率远红外荧光探针、制备方法和应用 |
| CN114539299B (zh) * | 2020-11-25 | 2024-05-03 | 香港科技大学 | 用于检测过氧亚硝酸阴离子的化合物和包括其的纳米颗粒及其应用 |
| CN113045596B (zh) * | 2021-03-24 | 2022-09-13 | 台州学院 | 一种过氧亚硝基阴离子和粘度双响应型荧光探针及其制备和应用 |
| WO2023167305A1 (ja) * | 2022-03-02 | 2023-09-07 | 国立大学法人 東京大学 | 酵素活性の検出方法、及び当該方法に用いる蛍光プローブ |
| CN114644646B (zh) * | 2022-04-07 | 2024-04-12 | 西北工业大学 | 一种以苄基硼酸频哪醇酯类为检测基团的近红外荧光探针及其制备方法和应用 |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AT405461B (de) | 1997-05-30 | 1999-08-25 | Avl List Gmbh | Lumineszenzindikator |
| WO2001064664A1 (fr) | 2000-02-29 | 2001-09-07 | Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd. | Reactifs destines au dosage de l'oxygene actif |
| JP3967943B2 (ja) * | 2002-03-22 | 2007-08-29 | 哲雄 長野 | 蛍光プローブ |
| US20060275912A1 (en) | 2003-02-28 | 2006-12-07 | Tetsuo Nagano | Fluorescent probes |
| JP4710268B2 (ja) * | 2003-07-23 | 2011-06-29 | 東レ株式会社 | ピロメテン化合物、それを用いた発光素子材料ならびに発光素子 |
| CN1660783A (zh) * | 2004-12-13 | 2005-08-31 | 大连理工大学 | 多酰胺荧光化合物及其在正离子超敏光信号识别中的应用 |
| US7897787B2 (en) * | 2005-09-13 | 2011-03-01 | The University Of Tokyo | Maleimide derivative |
| US7705040B2 (en) * | 2005-10-07 | 2010-04-27 | The University Of Hong Kong | Reagents for highly specific detection of peroxynitrite |
-
2006
- 2006-11-14 JP JP2007544228A patent/JP5228190B2/ja active Active
- 2006-11-14 US US12/093,479 patent/US8178669B2/en active Active
- 2006-11-14 WO PCT/JP2006/322599 patent/WO2007055364A1/ja active Application Filing
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP5228190B2 (ja) | 2013-07-03 |
| US20090258434A1 (en) | 2009-10-15 |
| WO2007055364A1 (ja) | 2007-05-18 |
| US8178669B2 (en) | 2012-05-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5228190B2 (ja) | パーオキシナイトライト蛍光プローブ | |
| JP6351511B2 (ja) | 非対称Ｓｉローダミン及びロドールの合成 | |
| US8143069B2 (en) | Fluorescent probe and method of measuring hypochlorite ion | |
| US9329184B2 (en) | Fluorescent probe | |
| EP3096143B1 (en) | Iron(ii) ion detection agent and detection method using same | |
| JP4899046B2 (ja) | 新規ルシフェリン誘導体 | |
| JP5588962B2 (ja) | プロテアーゼ測定用蛍光プローブ | |
| WO2010126077A1 (ja) | 近赤外蛍光化合物 | |
| JPWO2005024049A1 (ja) | 蛍光プローブ | |
| KR20030031468A (ko) | 활성산소 측정용 시약 | |
| US8394850B2 (en) | Fluorescent probe specific to hydrogen peroxide | |
| JP5636080B2 (ja) | ｐＨ感受性蛍光プローブ | |
| CN109336835B (zh) | 用于检测髓过氧化物酶活性荧光探针及其制备方法和应用 | |
| CN109928940B (zh) | 基于碱性蓝-3的检测次氯酸的近红外荧光探针分子的制备 | |
| JP2000239272A (ja) | 亜鉛蛍光プローブ | |
| WO2019168199A1 (ja) | カルボキシペプチダーゼ活性検出用蛍光プローブ | |
| JPWO2007013201A1 (ja) | 亜鉛蛍光プローブ | |
| JP2005022985A (ja) | 亜鉛蛍光プローブ | |
| JP5360609B2 (ja) | 低酸素環境測定用試薬 | |
| JP2004101389A (ja) | アルミニウムイオン及び／又は第二鉄イオン測定用プローブ | |
| JPWO2007111345A1 (ja) | 活性酸素測定用試薬 | |
| EP2907877A1 (en) | Reagent for imaging intracellular acetylation | |
| JP2004315501A (ja) | 亜鉛蛍光プローブ | |
| CN117088904A (zh) | 一种用于检测过氧化氢的化学发光探针及其制备方法和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20091110 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20120703 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20120831 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20120925 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20121217 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20121217 |
|
| A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20130115 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20130219 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |