CN103710020B

CN103710020B - 一种长波长荧光探针及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN103710020B
Application number: CN201310681158.5A
Authority: CN
Inventors: 王红; 张华山; 张李云; 郭小峰
Original assignee: Wuhan University WHU
Current assignee: Wuhan University WHU
Priority date: 2013-12-13
Filing date: 2013-12-13
Publication date: 2015-06-10
Anticipated expiration: 2033-12-13
Also published as: CN103710020A

Abstract

本发明公开了一种长波长荧光探针及其制备方法和应用。将1,3,5,7-四甲基-8-苯基-（2’-硝基）-二氟化硼二甲基吡咯与苯甲醛进行反应，生成3,5-二苯乙烯基较大的共轭体系，然后用锌粉将-NO₂还原成-NH₂，然后与马来酸酐进行加成反应，再与乙酸酐反应得到长波长荧光探针1,7-二甲基-3,5-二苯乙烯基-8-苯基-（2’-马来酰亚胺）-二氟化硼二吡咯甲烷。本发明的制备方法简单，制备的长波长荧光探针受环境pH值影响小，对巯基化合物选择性好、灵敏度高，该荧光探针自身荧光强度很弱，与巯基反应后荧光强度增强，可用于巯基化合物的检测，对生物体损伤较小，因而在生物组织和细胞荧光成像等方面具有广阔的应用前景。

Description

一种长波长荧光探针及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于荧光探针技术领域，涉及一种用于巯基化合物检测的长波长荧光探针及其制备方法和应用。

背景技术

巯基化合物是生物体内多种蛋白质和简单小分子的重要组成部分，在生物体的新陈代谢活动中起着重要的作用。研究表明，很多细胞内和细胞外的氧化还原反应、金属转移反应、二氧化碳固定和辅酶A参与的反应都在一定程度上与巯基化合物相关。体内巯基化合物含量过多或过少都会引发一些疾病，如肝损伤、阿兹海默症、冠心病和中风等。因此，巯基化合物的测定对了解和治疗这些疾病有很重要的意义。

荧光探针在巯基检测中得到广泛应用（Peng HJ,Chen WX,Cheng YF,Hakuna L,StronginR,Wang BH.Sensors 2012,12,15907-46;Chen X,Zhou Y,Peng XJ,Yoon J.Chem.Soc.Rev.,2010,39,2120-35）。我们利用荧光成像的手段可以对细胞或组织内的巯基化合物进行实时监测，然而，很多荧光试剂都会或多或少对生物体产生破坏，因此我们亟需一种不破坏生物细胞或组织活性的荧光探针。长波长荧光探针具有生物体干扰小、散射小、对生物组织穿透能力强等优点，适用于生物成像分析。目前，商品化的荧光素、罗丹明巯基荧光试剂相继被人们开发利用，但这些荧光试剂的荧光强度易受环境（如pH和温度）的影响，且其激发和发射波长大多在紫外可见光区，因而限制了在生物体中的应用。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种具有较大共轭体系、能够对巯基化合物反应灵敏的马来酰亚胺类长波长荧光探针。

本发明的另一目的在于提供上述长波长荧光探针的制备方法。

本发明的再一目的在于提供上述长波长荧光探针的应用。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种长波长荧光探针，化学命名为1,7-二甲基-3,5-二苯乙烯基-8-苯基-（2’-马来酰亚胺）-二氟化硼二吡咯甲烷（DMDSPAB-o-M），分子结构如下：

上述的长波长荧光探针采用的反应路线如下：

一种制备所述的长波长荧光探针的方法，具体包括以下步骤：

（1）在油水分离器中加入1,3,5,7-四甲基-8-苯基-（2’-硝基）-二氟化硼二甲基吡咯，然后边搅拌边加入苯制成饱和溶液，然后依次加入苯甲醛、哌啶和冰乙酸，密封后于75-85℃加热回流24～30h，经提纯得到1,7-二甲基-3,5-二苯乙烯基-8-苯基-（2’-硝基）-二氟化硼二吡咯甲烷，即中间产物1；

（2）将中间产物1溶于冰乙酸中，室温搅拌下加入锌粉，继续搅拌反应80～90min，经提纯得到1,7-二甲基-3,5-二苯乙烯基-8-苯基-（2’-氨基）-二氟化硼二吡咯甲烷，即中间产物2；

（3）将中间产物2溶于冰乙酸中，室温搅拌下加入马来酸酐，继续搅拌反应1～2h后，经提纯得到1,7-二甲基-3,5-二苯乙烯基-8-苯基-（2’-马来亚酸）-二氟化硼二吡咯甲烷，即中间产物3；

（4）将中间产物3溶于乙酸酐中，加入无水乙酸钠，75～85℃加热回流22～24h，经提纯得到1,7-二甲基-3,5-二苯乙烯基-8-苯基-（2’-马来酰亚胺）-二氟化硼二吡咯甲烷，即所述的长波长荧光探针。

步骤（1）所述的1,3,5,7-四甲基-8-苯基-（2’-硝基）-二氟化硼二甲基吡咯、苯甲醛、哌啶和冰乙酸的投量摩尔比为1：2～4：8～9：10～14；步骤（1）所述的提纯所采取的方法为：将反应液进行减压抽滤，将得到的滤液减压蒸馏以除去溶剂，然后用二氯甲烷为淋洗液进行柱层析提纯。

步骤（2）所述的中间产物1、锌粉和冰乙酸的投量摩尔比为1：200～230：1300～1500；步骤（2）所述的提纯所采取的方法为：将反应液进行减压抽滤，将得到的滤液减压蒸馏以除去溶剂，然后用二氯甲烷为淋洗液进行柱层析提纯。

步骤（3）所述的中间产物2、马来酸酐和冰乙酸的投量摩尔比为1：5.5～6.5：2100～2300；步骤（3）所述的提纯所采取的方法为：将反应液进行减压抽滤，将得到的滤液减压蒸馏以除去溶剂，然后用二氯甲烷/甲醇（19/1,v/v）为淋洗液进行柱层析提纯。

步骤（4）所述的中间产物3、无水乙酸钠和乙酸酐的投量摩尔比为1：1.2～1.4：1300～1500；步骤（4）所述的提纯所采取的方法为：将反应液进行减压抽滤，将得到的滤液减压蒸馏以除去溶剂，然后用二氯甲烷/环己烷（3/1,v/v）为淋洗液进行柱层析提纯。

所述的长波长荧光探针在生物体巯基化合物检测中的应用。

本发明具有以下优点和效果：

1.本发明制备方法简单，制备的长波长荧光探针受环境pH值的影响小，对巯基化合物选择性好、灵敏度高。

2.本发明制备的长波长荧光探针自身荧光强度很弱，与巯基反应后荧光强度增强，可用于巯基化合物的检测。

3.本发明制备的长波长荧光探针具有较长的激发波长和发射波长，对生物体损伤较小，在生物组织和细胞荧光成像等方面具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为实施例3所制备的DMDSPAB-o-M的质谱图。

图2为DMDSPAB-o-M与GSH反应前后的荧光光谱图；其中，图中A和A’分别代表荧光探针自身的荧光激发光谱和发射光谱，B和B’分别代表荧光探针与GSH反应后的荧光激发光谱和发射光谱。

图3为DMDSPAB-o-M与不同共存物（17种氨基酸和5种金属离子）反应后的荧光强度图。

图4为DMDSPAB-o-M用于检测GSH的标准曲线图。

图5为DMDSPAB-o-M的巯基反应产物在光照下荧光强度的变化曲线图；■代表对照组，●代表实验组。

图6为DMDSPAB-o-M对活性ECV-304内皮细胞巯基化合物荧光成像显微镜图；A为不加试剂的细胞荧光成像图，a为不加试剂的细胞亮场图；B为加入试剂的细胞荧光成像图，b为加入试剂的细胞亮场图。

具体实施方式

下面的实施例是对本发明的进一步说明，而非限定本发明的范围。

实施例1

将1,3,5,7-四甲基-8-苯基-（2’-硝基）二氟化硼二甲基吡咯（0.65mmol）溶于苯（15mL）中，然后依次加入苯甲醛（1.30mmol）、哌啶（0.52mL）和冰乙酸（0.39mL），用油水分离器装置75℃回流30h，减压蒸馏除去溶剂，用二氯甲烷为淋洗液进行柱层析提纯，得到1,7-二甲基-3,5-二苯乙烯基-8-苯基-（2’-硝基）-二氟化硼二吡咯甲烷（276.5mg，产率为78%），即中间产物1；将中间产物1（276.5mg，0.50mmol）溶于47mL冰乙酸中，加入6.5g锌粉，常温下搅拌80min，抽滤得到滤液，减压蒸馏除去溶剂，用二氯甲烷为淋洗液进行柱层析提纯，得到1,7-二甲基-3,5-二苯乙烯基-8-苯基-（2’-氨基）-二氟化硼二吡咯甲烷（194.3mg，产率为75%），即中间产物2；将中间产物2（194.3mg，0.38mmol）溶于45.6mL冰乙酸中，室温搅拌下加入0.2g马来酸酐，继续搅拌2h后，减压蒸馏除去溶剂，用二氯甲烷/甲醇（19/1，v/v）为淋洗液进行柱层析提纯，得到1,7-二甲基-3,5-二苯乙烯基-8-苯基-（2’-马来亚氨酸）-二氟化硼二吡咯甲烷（173.6mg，产率为74%），即中间产物3；将中间产物3（173.6mg，0.29mmol）溶于36mL乙酸酐中，加入28mg无水乙酸钠，80℃加热回流23h，用二氯甲烷/环己烷（3/1，v/v）为淋洗液进行柱层析提纯，即得到棕色晶体状的DMDSPAB-o-M（103.5mg，产率为60%）。

实施例2

将1,3,5,7-四甲基-8-苯基-（2’-硝基）二氟化硼二甲基吡咯（1.56mmol）溶于20mL苯中，然后依次加入苯甲醛（4.68mmol），哌啶（1.3mL）和冰乙酸（1.1mL），用油水分离器装置80℃加热回流24小时，减压蒸馏除去溶剂，用二氯甲烷为淋洗液进行柱层析提纯，得到蓝色固体粉末化合物2，1,7-二甲基-3,5-二苯乙烯基-8-苯基-（2’-硝基）-二氟化硼二吡咯甲烷（680.4mg，产率为80%），即中间产物1；将中间产物1（680.4mg，1.24mmol）溶于100mL冰乙酸中，加入锌粉（17.5g），常温下搅拌90min，抽滤得到滤液，减压蒸馏除去溶剂，用二氯甲烷为淋洗液进行柱层析提纯，得到蓝色固体粉末化合物1,7-二甲基-3,5-二苯乙烯基-8-苯基-（2’-氨基）-二氟化硼二吡咯甲烷（498.3mg，78%），即中间产物2；将中间产物2（498.3mg，0.97mmol）溶于120mL冰乙酸中，室温搅拌下加入0.6g马来酸酐，继续搅拌2h后，减压蒸馏除去溶剂，用二氯甲烷/甲醇（19/1，v/v）为淋洗液进行柱层析提纯，得到产物1,7-二甲基-3,5-二苯乙烯基-8-苯基-（2’-马来亚氨酸）-二氟化硼二吡咯甲烷（428.3mg，72%），即中间产物3；将中间产物3（428.3mg，0.70mmol）溶于90mL乙酸酐中，加入75mg无水乙酸钠，85℃加热回流22h，用二氯甲烷/环己烷（3/1，v/v）为淋洗液进行柱层析提纯，，得到棕色晶体状的DMDSPAB-o-M（345mg，58%）。

实施例3

将1,3,5,7-四甲基-8-苯基-（2’-硝基）二氟化硼二甲基吡咯（1.56mmol）溶于20mL苯中，然后依次加入苯甲醛（6.25mmol），哌啶（1.4mL）和冰乙酸（1.25mL），用油水分离器装置85℃加热回流28小时，减压蒸馏除去溶剂，用二氯甲烷为淋洗液进行柱层析提纯，得到蓝色固体粉末化合物2，1,7-二甲基-3,5-二苯乙烯基-8-苯基-（2’-硝基）-二氟化硼二吡咯甲烷（671.9mg，产率为79%），即中间产物1；将中间产物1（671.9mg，1.22mmol）溶于104mL冰乙酸中，加入锌粉（18.3g），常温下搅拌84min，抽滤得到滤液，减压蒸馏除去溶剂，用二氯甲烷为淋洗液进行柱层析提纯，，得到蓝色固体粉末化合物3，1,7-二甲基-3,5-二苯乙烯基-8-苯基-（2’-氨基）-二氟化硼二吡咯甲烷（485.5mg，76%），即中间产物2；将中间产物2（498.3mg，0.95mmol）溶于120mL冰乙酸中，室温搅拌下加入0.60g马来酸酐，继续搅拌1.5h后，减压蒸馏除去溶剂，用二氯甲烷/甲醇（19/1，v/v）为淋洗液进行柱层析提纯，得到产物4，1,7-二甲基-3,5-二苯乙烯基-8-苯基-（2’-马来亚氨酸）-二氟化硼二吡咯甲烷（420.3mg，71%），即中间产物3；将中间产物3（420.3mg，0.67mmol）溶于90mL乙酸酐中，加入75mg无水乙酸钠，75℃加热回流24h，用二氯甲烷/环己烷（3/1，v/v）为淋洗液进行柱层析提纯，得到棕色晶体化合物DMDSPAB-o-M（335mg，56%）。其核磁谱图解析为：¹H NRM1.58(s6H)，6.92(s2H)，7.03(s2H)，7.40(d2H)，7.45(t6H)，7.54(s2H)，7.59(d4H)和7.70(s4H)。DMDSPAB-o-M的质谱图如图1所示，傅里叶变换质谱：经理论计算可知该化合物的分子式为C₃₇H₂₈BF₂N₃O₂，[M+Na]⁺618.2141，图中计算:[M+Na]⁺618.2122。

实施例4 DMDSPAB-o-M与谷胱甘肽（GSH）反应前后的荧光光谱

将实施例1所制备的DMDSPAB-o-M溶于二甲基亚砜（DMSO）中配制储备液，DMDSPAB-o-M的摩尔浓度为1×10^-3M。使用前用DMSO稀释至浓度为5×10^-5M。

在10mL比色管中加入1.25mL PBS缓冲液（pH9.00）、1mL乙腈、90μL5×10^-5M的DMDSPAB-o-M溶液和150μL1×10^-5M的GSH水溶液，混匀后在37℃下反应6min，即得到反应液；在10mL比色管中加入1.25mL PBS缓冲液（pH9.00）、1mL乙腈、90μL5×10^-5M的DMDSPAB-o-M溶液，混匀后在37℃下反应6min，即得到空白对照溶液。

分别在反应液和空白对照溶液中加入1.5mL乙腈,再用去离子水定容至5mL，于λ_ex/λ_em=632nm/645nm下测定两者的荧光强度。结果表明该荧光探针本身的荧光强度很弱，与GSH反应后荧光强度大大增强，结果如图2所示。

实施例5：非巯基氨基酸对DMDSPAB-o-M荧光强度的影响

用与实施例4同样的方法做DMDSPAB-o-M与非巯基氨基酸反应的对照试验，用荧光分光光度计测定DMDSPAB-o-M与不同非巯基氨基酸反应前后的荧光强度。结果如图3所示，DMDSPAB-o-M与其他非巯基氨基酸反应前后的荧光强度很小，相比于图2中DMDSPAB-o-M与GSH反应后的荧光强度较弱，所以生物质中含有其他杂质时，几乎不影响DMDSPAB-o-M对巯基化合物的检测。

实施例6 DMDSPAB-o-M用于检测GSH的方法标准曲线

于10mL比色管中加入1.25mL PBS缓冲溶液（pH9.00）、1mL乙腈、90μL5×10^-5MDMDSPAB-o-M溶液和不同量的1×10^-5M GSH水溶液（6.0～200nM），混合摇匀后在37℃反应6min。反应结束后，先加入1.5mL乙腈,再用去离子水定容至5mL，于λ_ex/λ_em=632nm/645nm下测定DMDSPAB-o-M与不同浓度GSH反应后的荧光强度。制作标准曲线（r²=0.999，n=6），结果如图4所示。DMDSPAB-o-M用于测定GSH的浓度线性范围为6.0到200.0nM，线性方程为y=3.50x-20.41（x：GSH浓度，nM;y：相对荧光强度；激发发射狭缝宽度：3nm/3nm)，检出限（S/N=3）为4.4×10^-10M，相对标准偏差（R.S.D，n=6）为2.0%，结果表明DMDSPAB-o-M用于巯基化合物检测的灵敏度很高。

实施例7：巯基荧光反应物的光稳定性

在离心管中依次加入400μL pH9.00 PBS缓冲溶液、400μL乙腈，然后加入200μL1×10^-3M DMDSPAB-o-M溶液和少量GSH固体粉末，摇匀后在37℃反应30min，然后加入200μL1M HCl溶液和400μL乙腈定容至2mL，根据实施例6所得的线性方程计算可知，DMDSPAB-o-M和GSH反应产物的浓度为1×10^-4M，用乙腈将其稀释到5×10^-5M。

实验组：用功率为2mW、激发波长为635nm的半导体激光照射，每隔5min或10min，取100μL5×10^-5M DMDSPAB-o-M和GSH反应产物的溶液用乙腈稀释到5mL。在荧光仪上测定其荧光强度；对照组：相同浓度的反应产物，避光保存，同样每隔5min或10min测其荧光强度。结果如图5所示，在2h内，实验组溶液的荧光强度变化非常小，说明DMDSPAB-o-M具有良好的光稳定性。

实施例8：细胞成像

在盛有盖玻片的培养皿中配制含10wt%胎牛血清培养液，将人内皮细胞(即EVC-304细胞)接种于上述培养皿中，置于37℃的CO₂培养箱中，使细胞贴壁生长。将接种好的EVC-304细胞用PBS溶液清洗后，用30μM的DMDSPAB-o-M溶液对EVC-304细胞染色10min，染色后取出玻片，用PBS溶液洗去玻片上多余的染液，在荧光显微镜下观察成像效果，激发波长500～590nm，发射波长>610nm。结果如图6所示，细胞中不加DMDSPAB-o-M时，几乎没有荧光（图6A）；加入DMDSPAB-o-M后，荧光强度明显增强（图6B），进一步说明了DMDSPAB-o-M细胞成像效果好，可应用于医疗诊断领域。

以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步的详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种长波长荧光探针，其特征在于，化学命名为1,7-二甲基-3,5-二苯乙烯基-8-苯基-(2’-马来酰亚胺)-二氟化硼二吡咯甲烷，分子结构如下：

2.一种制备权利要求1所述的长波长荧光探针的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

(1)在油水分离器中加入1,3,5,7-四甲基-8-苯基-(2’-硝基)-二氟化硼二甲基吡咯，然后边搅拌边加入苯制成饱和溶液，然后依次加入苯甲醛、哌啶和冰乙酸，密封后于75-85℃加热回流24～30h，经提纯得到1,7-二甲基-3,5-二苯乙烯基-8-苯基-(2’-硝基)-二氟化硼二吡咯甲烷，即中间产物1；

(2)将中间产物1溶于冰乙酸中，室温搅拌下加入锌粉，继续搅拌反应80～90min，经提纯得到1,7-二甲基-3,5-二苯乙烯基-8-苯基-(2’-氨基)-二氟化硼二吡咯甲烷，即中间产物2；

(3)将中间产物2溶于冰乙酸中，室温搅拌下加入马来酸酐，继续搅拌反应1～2h后，经提纯得到1,7-二甲基-3,5-二苯乙烯基-8-苯基-(2’-马来亚酸)-二氟化硼二吡咯甲烷，即中间产物3；

(4)将中间产物3溶于乙酸酐中，加入无水乙酸钠，75～85℃加热回流22～24h，经提纯得到1,7-二甲基-3,5-二苯乙烯基-8-苯基-(2’-马来酰亚胺)-二氟化硼二吡咯甲烷，即所述的长波长荧光探针。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述的1,3,5,7-四甲基-8-苯基-(2’-硝基)-二氟化硼二甲基吡咯、苯甲醛、哌啶和冰乙酸的投量摩尔比为1：2～4：8～9：10～14；步骤(1)所述的提纯所采取的方法为：将反应液进行减压抽滤，将得到的滤液减压蒸馏以除去溶剂，然后用二氯甲烷为淋洗液进行柱层析提纯。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述的中间产物1、锌粉和冰乙酸的投量摩尔比为1：200～230：1300～1500；步骤(2)所述的提纯所采取的方法为：将反应液进行减压抽滤，将得到的滤液减压蒸馏以除去溶剂，然后用二氯甲烷为淋洗液进行柱层析提纯。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述的中间产物2、马来酸酐和冰乙酸的投量摩尔比为1：5.5～6.5：2100～2300；步骤(3)所述的提纯所采取的方法为：将反应液进行减压抽滤，将得到的滤液减压蒸馏以除去溶剂，然后用体积比为19:1的二氯甲烷/甲醇为淋洗液进行柱层析提纯。

6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)所述的中间产物3、无水乙酸钠和乙酸酐的投量摩尔比为1：1.2～1.4：1300～1500；步骤(4)所述的提纯所采取的方法为：将反应液进行减压抽滤，将得到的滤液减压蒸馏以除去溶剂，然后用体积比为3:1的二氯甲烷/环己烷为淋洗液进行柱层析提纯。

7.权利要求1所述的长波长荧光探针在生物体巯基化合物检测中的应用。