CN117088904A - 一种用于检测过氧化氢的化学发光探针及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及化学分析检测技术领域，尤其涉及一种用于检测过氧化氢的化学发光探针及其制备方法和应用，该探针具有如式(Ⅰ)所示的结构式，本发明所提出的如式(Ⅰ)所示的化合物对过氧化氢敏感性高，在靶向内质网的同时具有较高的过氧化氢敏感性，对过氧化氢的检测下限为126nM，能够检测126nM‑98μM浓度的过氧化氢，其在126nM‑98μM过氧化氢浓度范围内与其荧光强度成正比，能够为研究细胞内质网中过氧化氢的含量提供一种有效的研究工具，可为临床诊断领域提供早期预警。
Description
技术领域
本发明涉及化学分析检测技术领域，尤其涉及一种用于检测过氧化氢的化学发光探针及其制备方法和应用。
背景技术
过氧化氢是公认的活性氧和氮物种的前体，是氧代谢的重要产物，在免疫反应和细胞信号转导等许多生物过程中起着重要的作用。但是，过氧化氢的异常产生会破坏细胞生物分子，这与许多疾病密切相关。已知过氧化氢过量会导致氧化应激，氧化应激将导致大量植物生理化学过程以及各种疾病(例如癌症和神经退行性疾病)。因此，开发用于过氧化氢检测和定量测定的高灵敏性和选择性的荧光探针，对于监测过氧化氢的体内产生并阐明其生物学功能非常重要。内质网是细胞中最大的细胞器，它是细胞中蛋白质折叠和分解的重要场所，也是脂质的主要合成部位，内质网往往对细胞环境的变化有非常敏感的反应。因此，开发一种能够检测内质网上过氧化氢的探针非常有意义。
目前用于检测过氧化氢的方法主要有电化学法、比色法、质谱法、高效液相色谱法等，其普遍具有前处理复杂、破坏细胞组织结构、费用高昂等缺陷。近年来，荧光探针检测法因其高灵敏度、低毒性、操作简便等优势，受到科研工作者的青睐。目前采用荧光小分子检测过氧化氢的方法已经比较成熟。2019年CaixiaYin团队开发了一种检测过氧化氢的近红外检测器。2021年，TianyuLiang团队成功开发了一种过氧化氢响应以及粘度响应的双锁钥双光子荧光探针，并将其应用在在细胞成像和炎症治疗中。但是目前用于过氧化氢检测的荧光探针存在很多局限性，通常包括：(1)荧光探针的光稳定性差，在连续光照下易漂白；(2)对过氧化氢的选择性不够高，检测结果容易受到其他ROS的干扰；(3)一些荧光探针不能很好地避免生物背景荧光的干扰，导致检测精度差；(4)探针的荧光量子产率低，成像效果差；(5)合成路线比较复杂，导致检测试剂合成成本高，费事费力等。
内质网是一个复杂的细胞器，其中过氧化氢可以在不同的亚区域产生。内质网中的过氧化氢含量通常较低，因此对其进行检测需要具备高灵敏度的技术。然而，目前的技术在检测内质网中微量过氧化氢时存在一定的挑战。常规的检测方法可能无法满足对低浓度过氧化氢的敏感检测要求，从而影响了对内质网过氧化氢含量的准确测量。由于对内质网中过氧化氢含量的检测是一个具有一定挑战性的任务。目前存在的技术在这方面确实存在一些局限性，包括定位精确度低和灵敏度差的问题。化学发光作为小分子荧光探针的一类，近些年其设计与应用也备受关注，但目前还没有关于能够靶向检测细胞内质网中过氧化氢的化学发光探针被报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的不足，提供一种用于检测过氧化氢的化学发光探针及其制备方法，并将其应用于过氧化氢的检测中，以克服现有技术中对内质网中过氧化氢含量的检测存在定位精确度低、灵敏度差的问题。
为实现上述发明目的，本发明通过以下技术方案实现：
第一方面，本申请首先提供了一种用于检测过氧化氢的化学发光探针，该探针具有如式(Ⅰ)所示的结构式，
(Ⅰ)
1,2-二氧杂环丁烷类的化学发光探针是当下最热门的荧光探针之一，它具有无需外源光激发的特点，使其与传统荧光探针相比有着背景光低、荧光持续时间长、对底物的检测更加便捷等优势。对甲苯磺酰胺是一种常见的内质网靶向基团，被用于传统荧光探针结构的构建，该靶向基团被诸多文献应用，证明其具有内质网靶向的高效性和专一性。化学发光探针与荧光探针是两种不同类型的探针，迄今为止，靶向内质网的化学发光探针仍然未见报道。考虑到无需外源光激发即可对体内内质网进行实时成像的必要性，申请人首次将内质网靶向基团应用到化学发光探针上，并成功构建出如式(Ⅰ)所示的化合物探针。该探针由内质网靶向基——对甲苯磺酰胺以及化学发光屏蔽器——频哪硼酸醇酯构成，能够被过氧化氢响应，并成功的在细胞的内质网中检测到探针的荧光。
如式(Ⅰ)所示的化合物的作用机制为：硼酸酯结构被过氧化氢氧化后，发生1,6消旋，羟基去质子化，如式(Ⅰ)所示的化合物进入不稳定的高能态，随后分子发生解离，化学发光被开启。
第二方面，本申请提供了一种用于制备以上所述的用于检测过氧化氢的化学发光探针的方法，包括以下步骤：
(1)将如式(Ⅱ)所示的化合物溶于溶剂中，加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、N-羟基苯并三唑酮、N-甲苯磺酰基乙二胺、N,N-二异丙基乙胺进行反应，反应结束后，分离纯化得到如式(Ⅲ)所示的化合物；
(2)将如式(Ⅲ)所示的化合物溶于溶剂中，加入碱、4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯，在惰性气体的气氛中进行反应，反应结束后，分离纯化得到如式(Ⅳ)所示的化合物；
(3)将如式(Ⅳ)所示的化合物溶于溶剂中，加入的亚甲基蓝并通入氧气，光照反应结束后，分离纯化得到如式(Ⅰ)所示的化合物；
(Ⅰ)(Ⅱ)/>(Ⅲ)(Ⅳ)/>
本发明中的如式(Ⅱ)所示的化合物为已公开的化合物，其合成制备的方法可参考文献：Green,O.,Eilon,T.,Hananya,N.,Gutkin,S.,Bauer,C.R.,&Shabat,D.(2017).Opening aGateway for Chemiluminescence Cell Imaging:Distinctive Methodologyfor Design of Bright Chemiluminescent Dioxetane Probes.ACS Cent Sci,3(4),349-358.。
为了获得效果更好的内质网靶向化合物，申请人对一系列已经被报道的内质网靶向基团化合物进行筛选，下面列举两款筛选过程中所合成的化合物；
化合物(a)：
化合物(b)：
在一系列筛选后，申请人设计的如式(Ⅰ)所示的化合物所携带的内质网靶向基团——对甲基苯磺酰胺与其他靶向基团相比，其具有更高的内质网靶向性，灵敏度更高，响应性能更优越，因此确定如式(Ⅰ)所示的化合物作为最终化合物。
作为优选，所述溶剂为二氯甲烷、乙腈、甲苯、四氢呋喃、二甲基甲酰胺中的一种或多种。
作为优选，所述步骤(1)中的如式(Ⅱ)所示的化合物、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、N-羟基苯并三唑酮、N-甲苯磺酰基乙二胺、N,N-二异丙基乙胺的物质的量之比为1:1.5～2.5:2.5～3.5:1:2.5～3.5。
进一步优选，所述步骤(1)中的如式(Ⅱ)所示的化合物、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、N-羟基苯并三唑酮、N-甲苯磺酰基乙二胺、N,N-二异丙基乙胺的物质的量之比为1：2：3：1：3。
作为优选，所述步骤(2)中的如式(Ⅲ)所示的化合、碱、4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯的物质的量之比为1:3～4:1～1.5。
进一步优选，所述步骤(2)中的如式(Ⅲ)所示的化合、碱、4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯的物质的量之比为1：3：1.2。
作为优选，所述步骤(2)中的碱为哌啶、三乙胺、碳酸钾、碳酸钠中的一种或多种。
作为优选，所述步骤(3)中的惰性气体为氮气。
作为优选，所述步骤(3)中的如式(Ⅳ)所示的化合物和亚甲基蓝的物质的量之比为1:0.2～0.3。
进一步优选，所述步骤(3)中的如式(Ⅳ)所示的化合物和亚甲基蓝的物质的量之比为1：0.3。
进一步优选，所述步骤(1)中的反应条件为室温反应1-3h，所述步骤(2)中反应3-6h，所述步骤(3)中光照反应30-60min。
进一步优选，所述步骤(1)和(2)中的分离纯化步骤具体为：将反应结束后得到的反应液经乙酸乙酯萃取，取有机相进行减压浓缩，用体积比为1：1的石油醚与乙酸乙酯混合溶液作为洗脱剂进行柱层析纯化，收集含目标产物的洗脱液，减压浓缩，得到纯化后的反应产物；所述步骤(3)中的分离纯化步骤具体为：将反应结束后得到的反应液经二氯甲烷萃取，取有机相进行减压浓缩，用体积比为1：1的石油醚与乙酸乙酯混合溶液作为洗脱剂进行柱层析纯化，收集含目标产物的洗脱液，减压浓缩，得到纯化后的反应产物。
第三方面，本申请提供了以上所述的用于检测过氧化氢的化学发光探针或者所述的制备方法所制备得到的化学发光探针在过氧化氢检测中的应用。
进一步优选，所述化学发光探针在靶向检测细胞内质网中过氧化氢的含量中的应用。
本发明具有以下有益效果：
(1)本发明首次将内质网靶向基团应用到化学发光探针上，不仅赋予化学发光探针具有内质网靶向性，而且在靶向内质网的同时能够对过氧化氢进行响应激发出550nm的荧光发射；
(2)由于如式(Ⅰ)所示的化学发光探针无需外源光激发，因此具有背景干扰低、对生物样品的光损伤小等优点；
(3)如式(Ⅰ)所示的化合物对过氧化氢敏感性高，在靶向内质网的同时具有较高的过氧化氢敏感性，对过氧化氢的检测下限为126nM，能够检测126nM-98μM浓度的过氧化氢，其在126nM-98μM过氧化氢浓度范围内与其荧光强度成正比；
(4)本发明所提出的如式(Ⅰ)所示的化合物能够为研究细胞内质网中过氧化氢的含量提供一种有效的研究工具，可为临床诊断领域提供早期预警。
附图说明
图1为本发明中实施例1制备的如式(Ⅰ)所示的化合物的核磁氢谱。
图2为本发明中实施例1制备的如式(Ⅰ)所示的化合物的核磁碳谱。
图3为本发明中实施例4制备的如式(Ⅰ)所示的化合物，加入到含有过氧化氢的PBS缓冲液中的荧光发射光谱图。
图4为本发明中实施例5制备的如式(Ⅰ)所示的化合物在PBS缓冲液(pH＝7.4)条件下，选择性结果的荧光图。
图5为本发明中实施例6制备的如式(Ⅰ)所示的化合物在不同的光照时间和pH条件下的荧光图。
图6为本发明中实施例7制备的如式(Ⅰ)所示的化合物MTT实验结果。
图7为本发明中实施例8制备的如式(Ⅰ)所示的化合物在MCF-7细胞中的共定位荧光成像结果。
图8为本发明中实施例9制备的如式(Ⅰ)所示的化合物在细胞层面的过氧化氢检测结果。
具体实施方式
下面结合说明书附图以及具体实施例对本发明做进一步描述。本领域普通技术人员在基于这些说明的情况下将能够实现本发明。此外，下述说明中涉及到的本发明的实施例通常仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。因此，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
下列实施例中的式(Ⅰ)所示的化合物、式(Ⅱ)所示的化合物、式(Ⅲ)所示的化合物、式(Ⅳ)所示的化合物分别如下所示：
(Ⅰ)(Ⅱ)/>(Ⅲ)(Ⅳ)/>
式(Ⅱ)所示的化合物为已公开的化合物，其合成制备的方法可参考文献：Green,O.,Eilon,T.,Hananya,N.,Gutkin,S.,Bauer,C.R.,&Shabat,D.(2017).Opening aGateway for Chemiluminescence Cell Imaging:Distinctive Methodology for Designof Bright Chemiluminescent Dioxetane Probes.ACS Cent Sci,3(4),349-358.。
实施例1：用于检测过氧化氢的化学发光探针的制备
(1)如式(Ⅲ)所示的化合物的制备
将如式(Ⅱ)所示的化合物(90mg，0.264mmol)溶于5mL二甲基甲酰胺(DMF)中，先后向反应液中加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDCI)(101mg，0.528mmol)、N-羟基苯并三唑酮(Hobt)(107mg，0.794mmol)、N-甲苯磺酰基乙二胺(56mg，0.264mmol)、N,N-二异丙基乙胺(102mg，0.794mmol)，室温下反应1h。反应完成后用20mL乙酸乙酯稀释，先后用20mL的1M HCl、20mL的饱和碳酸氢钠以及20mL的饱和食盐水洗涤。浓缩有机相，在洗脱剂为石油醚/乙酸乙酯1:1条件下经柱分离纯化得到如式(Ⅲ)所示的化合物(43mg，得率为30.38％)，为白色固体。
1H NMR(500MHz,DMSO)δ＝10.14(s,1H),8.11(s,1H),7.69(s,2H),7.63(s,1H),7.57(s,1H),7.40(s,3H),6.83(s,1H),6.75(s,1H),6.59(s,1H),3.22(s,3H),3.20(s,2H),3.16(s,1H),2.81(s,2H),2.64(s,1H),2.36(s,3H),1.81(ddd,J＝45.2,27.4,15.1,12H).13C NMR(126MHz,DMSO)δ＝166.26(s),143.33–143.17(m),137.83(s),134.85(s),134.72–134.56(m),131.59(s),126.94–126.78(m),121.92(s),121.50(s),116.49(s),57.86(s),55.25(s),37.34(s),32.24(s).。
(2)如式(Ⅳ)所示的化合物的制备
把如式(Ⅲ)所示的化合物(43mg，0.080mmol)溶于3mL的DMF中，向反应液加入K2CO3(33mg，0.24mmol)、4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯(29mg，0.096mmol)，整个反应过程氮气保护，反应4h。反应液用15mL乙酸乙酯稀释，加入10mL饱和氯化钠萃取。有机相被浓缩后，用石油醚/乙酸乙酯1:1为洗脱剂，通过柱分离纯化后得到如式(Ⅳ)所示的化合物(40mg，得率为66.48％)，为白色固体。
1H NMR(500MHz,DMSO)δ＝8.16(s,1H),7.76–7.63(m,6H),7.55(s,1H),7.40(s,4H),6.88(s,1H),6.83(s,1H),6.62(s,1H),5.31(s,2H),3.22(s,2H),3.16(s,3H),3.14(s,1H),2.83(s,2H),2.36(s,3H),1.93–1.55(m,12H),1.29(s,11H).。
(3)如式(Ⅰ)所示的化合物的制备
把如式(Ⅳ)所示的化合物(40mg，0.053mmol)溶于5mL的二氯甲烷(DCM)中，加入亚甲基蓝(5mg，0.015mmol)通入氧气，光照反应30min。待反应结束后用10mL的DCM稀释，使用10mL饱和氯化钠洗涤三遍。浓缩有机相，在柱层析硅胶分离纯化，洗脱剂比例为石油醚/乙酸乙酯1:1。得到化合物(1)(30mg，得率72.12％)，为白色固体。核磁氢谱见图1，核磁碳谱见图2。
1H NMR(500MHz,DMSO)δ＝8.22(s,137H),7.68(dt,J＝22.2,11.2,1006H),7.59(s,119H),7.49(s,110H),7.39(d,J＝7.9,592H),6.68(s,176H),5.33(s,260H),4.88–4.76(m,1H),3.22(s,337H),3.17(s,381H),3.10(s,178H),2.82(s,324H),2.37(d,J＝10.7,609H),2.11–1.40(m,1817H),1.27(s,2127H).。
实施例2：用于检测过氧化氢的化学发光探针的制备
本实施例与实施例1的不同之处在于：
(1)如式(Ⅲ)所示的化合物的制备
将如式(Ⅱ)所示的化合物(90mg，0.264mmol)溶于5mL二甲基甲酰胺(DMF)中，先后向反应液中加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDCI)(76mg，0.396mmol)、N-羟基苯并三唑酮(Hobt)(89mg，0.66mmol)、N-甲苯磺酰基乙二胺(56mg，0.264mmol)、N,N-二异丙基乙胺(85mg，0.66mmol)，分离纯化得到如式(Ⅲ)所示的化合物(39mg，得率为27.56％)，为白色固体。
(2)如式(Ⅳ)所示的化合物的制备
把如式(Ⅲ)所示的化合物(43mg，0.080mmol)溶于3mL的DMF中，向反应液加入K2CO3(38.5mg，0.28mmol)、4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯(29mg，0.096mmol)，分离纯化后得到如式(Ⅳ)所示的化合物(37mg，得率为61.49％)，为白色固体。
(3)如式(Ⅰ)所示的化合物的制备
将如式(Ⅲ)所示的化合物(0.10g，0.42mmol)、如式(Ⅳ)所示的化合物(0.13g，0.42mmol)和哌啶(7.1mg，0.084mmol)加入4ml乙醇溶液中，得到如式(Ⅰ)所示的化合物纯品28mg，产物收率为67.32％，为白色固体。其余与实施例1相同。
实施例3：用于检测过氧化氢的化学发光探针的制备
本实施例与实施例1的不同之处在于：
(1)如式(Ⅲ)所示的化合物的制备
将如式(Ⅱ)所示的化合物(90mg，0.264mmol)溶于5mL二甲基甲酰胺(DMF)中，先后向反应液中加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDCI)(126mg，0.66mmol)、N-羟基苯并三唑酮(Hobt)(124mg，0.924mmol)、N-甲苯磺酰基乙二胺(56mg，0.264mmol)、N,N-二异丙基乙胺(118mg，0.924mmol)，分离纯化得到如式(Ⅲ)所示的化合物(42mg，得率为29.68％)，为白色固体。
(2)如式(Ⅳ)所示的化合物的制备
把如式(Ⅲ)所示的化合物(43mg，0.080mmol)溶于3mL的DMF中，向反应液加入K2CO3(44mg，0.32mmol)、4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯(29mg，0.096mmol)，分离纯化后得到如式(Ⅳ)所示的化合物(39mg，得率为64.81％)，为白色固体。
(3)如式(Ⅰ)所示的化合物的制备
将如式(Ⅲ)所示的化合物(0.10g，0.42mmol)、如式(Ⅳ)所示的化合物(0.13g，0.42mmol)和哌啶(7.1mg，0.084mmol)加入4ml乙醇溶液中，得到如式(Ⅰ)所示的化合物纯品30mg，产物收率为72.12％，为白色固体。其余与实施例1相同。
实施例4：如式(Ⅰ)所示的化合物(5μM)在PBS检测体系里发射光谱图(发射波长550nm。)
在磷酸缓冲液中(PBS，10mM，pH＝7.4)，如式(Ⅰ)所示的化合物(5μM)与过氧化氢(40μM)接触后，立刻出现了化学发光信号；与未加H2O2的对照组相比，如式(Ⅰ)所示的化合物在最大发射550nm处检测到了明显的化学发光，如式(Ⅰ)所示的化合物的荧光强度比对照组增加了接近40倍，荧光谱图见图3。
实施例5：如式(Ⅰ)所示的化合物(5μM)在PBS检测体系(pH7.4)下选择性结果的荧光光谱检测(发射波长550nm)。
我们考察了如式(Ⅰ)所示的化合物对于不同生物中常见干扰物的荧光信号抗干扰能力，包括过氧化氢、三价铁离子、钙离子、钾离子、二价铜离子、镁离子、钠离子、溴离子、氯离子、氟离子、碘离子、磷酸根离子、半胱氨酸、谷氨酸、谷胱甘肽、硫化氢、超氧化钾、次氯酸、硝基、空白。所有的待测底物浓度为20μM。如式(Ⅰ)所示的化合物在生理环境下不会与除H2O2外的干扰物质发生响应，表明如式(Ⅰ)所示的化合物对H2O2有较高的选择性，化学发光信号的抗干扰能力能够满足在细胞层面的成像条件。荧光谱图见图4，其中1-20分别为过氧化氢、三价铁离子、钙离子、钾离子、二价铜离子、镁离子、钠离子、溴离子、氯离子、氟离子、碘离子、磷酸根离子、半胱氨酸、谷氨酸、谷胱甘肽、硫化氢、超氧化钾、次氯酸、硝基、空白。发射波长为550nm。
实施例6：如式(Ⅰ)所示的化合物(5μM)稳定性测定
为了探究如式(Ⅰ)所示的化合物的稳定性，我们在这里分别进行了探针的光稳定性实验和如式(Ⅰ)所示的化合物在不同pH条件下添加H2O2(20μM)的化学发光响应情况。如式(Ⅰ)所示的化合物在光照12h内依然能够保持结构的稳定性，且仅在pH7-9之间时化学发光信号增强，pH为8时达到最大值。结果表明，如式(Ⅰ)所示的化合物的光稳定性和最适pH环境足够满足探针的在生物体中的检测要求，荧光谱图见图5。
实施例7：如式(Ⅰ)所示的化合物的MTT细胞实验。
我们采用MTT法来检测如式(Ⅰ)所示的化合物对于细胞毒性，其原理是活细胞中的线粒体含有琥珀酸脱氢酶和细胞色素C，噻唑蓝(MTT)在这两者的作用下生成不溶于水的蓝紫色甲瓒结晶，从而沉积在细胞中。后续用DMSO溶解细胞中的蓝紫色甲瓒结晶，使用酶标仪，在波长550nm检测吸光值。同时，死细胞中不含有琥珀酸脱氢酶，无法与MTT形成蓝紫色甲瓒。因此细胞的存活率与蓝紫色甲瓒的沉积成正比，OD值越大越能表明细胞的存活率高。
检测步骤如下：首先将HELa细胞以约2×104个细胞/孔的细胞种接密度在96孔细胞培养板培养，并在含5％CO2的37℃细胞恒温培养箱内培育24h。培养基中加入胎牛血清和适量抗体(青霉素和链霉素)。再分别加入不同浓度如式(Ⅰ)所示的化合物(0-50μM)孵育24h，每孔加入50μLMTT(1mg/mLPBS的缓冲液)，在37℃，5％CO2下继续孵育4h，取出培养基，向每个孔加入150μL DMSO。振荡5min后，在590nm处检测吸光度，MTT实验结果见图6。
实施例8：如式(Ⅰ)所示的化合物的细胞共定位成像。
如式(Ⅰ)所示的化合物的内质网共定位成像我们选用的是MCF-7细胞。将MCF-7细胞培育24h后，向细胞中加入过氧化氢，培育1h后用PBS缓冲液冲洗多余的培养基。向细胞中加入如式(Ⅰ)所示的化合物培育1h，用PBS清洗细胞三次后，接着向细胞中加入内质网商用红色染料ER-Tracker Red，培育15min。再次用PBS缓冲液清洗三次，使用共聚焦显微镜进行成像，共定位结果由LAX S进行计算。结果可知，如式(Ⅰ)所示的化合物的绿色荧光与内质网商用探针的红色荧光有很好的匹配，共定位系数为0.93。表明如式(Ⅰ)所示的化合物能够很好的完成靶向内质网，并在活细胞中完成荧光成像，荧光谱图见图7。
实施例9：如式(Ⅰ)所示的化合物(5μM)在细胞层面的过氧化氢检测。
如式(Ⅰ)所示的化合物在细胞层面的过氧化氢成像，我们选用的是HeLa细胞。首先将待测细胞用PBS缓冲液清洗三次，洗去多余的培养液，然后向其中加入DMEM培养基。为了更加明显的成像效果，我们将细胞分为两组。两组细胞分别用过氧化氢(40μM)和不用过氧化氢培育0.5h后，用PBS缓冲液清洗两次，将如式(Ⅰ)所示的化合物(10μM)立刻向加入这两组细胞，并孵育20min。使用共聚焦显微镜在绿色通道下观察细胞情况。在没有添加外源过氧化氢的细胞并没有明显的荧光显示，而添加外源过氧化氢的细胞显示出了较强的绿色荧光。说明过氧化氢对如式(Ⅰ)所示的化合物的化学发光释放有着决定性作用，如式(Ⅰ)所示的化合物能够在细胞层面检测过氧化氢的变化。实验结果表明，该化合物可用于细胞层面的过氧化氢检测，荧光谱图见图8。
Claims (10)
1.一种用于检测过氧化氢的化学发光探针，其特征在于，该探针具有如式（Ⅰ）所示的结构式，
（Ⅰ）。
2.一种用于制备如权利要求1所述的用于检测过氧化氢的化学发光探针的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将如式（Ⅱ）所示的化合物溶于溶剂中，加入1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺、N-羟基苯并三唑酮、N-甲苯磺酰基乙二胺、N,N-二异丙基乙胺进行反应，反应结束后，分离纯化得到如式（Ⅲ）所示的化合物；
（2）将如式（Ⅲ）所示的化合物溶于溶剂中，加入碱、4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯，在惰性气体的气氛中进行反应，反应结束后，分离纯化得到如式（Ⅳ）所示的化合物；
（3）将如式（Ⅳ）所示的化合物溶于溶剂中，加入的亚甲基蓝并通入氧气，光照反应结束后，分离纯化得到如式（Ⅰ）所示的化合物；
（Ⅰ），（Ⅱ）/>，（Ⅲ），（Ⅳ）/>。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述溶剂为二氯甲烷、乙腈、甲苯、四氢呋喃、二甲基甲酰胺中的一种或多种。
4.如权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中的如式（Ⅱ）所示的化合物、1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺、N-羟基苯并三唑酮、N-甲苯磺酰基乙二胺、N,N-二异丙基乙胺的物质的量之比为1:1.5~2.5:2.5~3.5:1:2.5~3.5。
5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中的如式（Ⅲ）所示的化合物、碱、4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯的物质的量之比为1:3~4:1~1.5。
6.如权利要求2或5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中的碱为哌啶、三乙胺、碳酸钾、碳酸钠中的一种或多种。
7.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中的惰性气体为氮气。
8.如权利要求2或7所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中的如式（Ⅳ）所示的化合物和亚甲基蓝的物质的量之比为1:0.2~0.3。
9.权利要求1所述的用于检测过氧化氢的化学发光探针或者权利要求2~8中任意一项所述的制备方法所制备得到的化学发光探针在过氧化氢检测中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述化学发光探针在靶向检测细胞内质网中过氧化氢的含量中的应用。
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