CN108640902B - 一种识别纯水体系内二氧化硫的荧光探针及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种在纯水相识别二氧化硫的荧光探针EPI‑RS，其化学结构式如式（I）所示。本发明还公开了所述荧光探针在检测过程中荧光变化及选择性等光谱性质。实验证明：本发明的荧光探针通过荧光淬灭不仅能识别检测二氧化硫，而且其选择性好，最后该探针在活细胞靶标分子的标记领域具有潜在的应用价值。
Figure 100004_DEST_PATH_IMAGE002

Description

一种识别纯水体系内二氧化硫的荧光探针及其应用
技术领域
本发明属于有机小分子荧光探针领域，具体涉及一种识别二氧化硫（SO2）荧光探针及其应用，尤其涉及一种在纯水体系内专一识别SO2的吲哚类化合物荧光探针及其应用。
背景技术
二氧化硫(SO2) 作为一种重要的气体信号分子，在各种生理过程中发挥着重要作用，其浓度异常与许多类型的疾病如癌症、心血管疾病、神经系统疾病相关联。近来，SO2已证实是学术界与人类重大疾病相关的活性小分子。因此，实时监测活细胞中的SO2，对于相关疾病的诊断具有非常重要的意义。
目前，SO2的检测手段主要分为两类：直接法和间接法。直接法是一类直接利用SO2自身物理、化学性质对其进行分析检测的方法，包括原子吸收、发射光谱法和离子选择性电极法；间接法是一类利用SO2的识别位点进行检测，主要是通过设计合成光物理性质较好的荧光平台，基于该平台的荧光探针进行在体外和生物体内进行检测。但是，综合分析目前报道的SO2荧光探针主要存在以下不足：第一，在纯水体系内检测SO2 依然很难，由于合成探针的本身具有较大的疏水性结构；第二，在纯水体系内SO2探针的选择性不高，容易受到其他氧化应激分析物的干扰；基于此，开发新型荧光探针在纯水体系内中专一识别二氧化硫（SO2）的荧光探针，并给出检测曲线判断SO2水平，有着重要的实际应用价值。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种可以在纯水体系中检测SO2的荧光探针，同时检测的选择性高。
一种识别纯水体系内二氧化硫的荧光探针，命名为EPI-RS，其化学结构式如式（I）所示：
Figure 373737DEST_PATH_IMAGE001
（I）。
上述EPI-RS的制备方法，包括以下步骤：
Figure 321534DEST_PATH_IMAGE002
（1）将化合物1与吡啶盐2以甲醇做溶剂，哌啶作催化剂，在氮气保护下回流反应，反应结束后，柱层层析得到化合物3；
（2）将化合物3与乙酰丙酸4以乙腈做溶剂，二环己基碳二亚胺DCC与4-二甲氨基吡啶DMAP作为催化剂，进行室温反应，反应结束后，将产物通过柱层析法进行分离提纯，得化合物5。
上述荧光探针用于制备检测细胞内SO2的生物传感器。
相关实验证实：检测环境是水相时，本发明所述的荧光探针EPI-RS在纯水体系内荧光增强明显，而在二氧化硫存在的条件下荧光淬灭，证明该探针可能是二氧化硫探针（图3）。在SO2选择性试验中，当用430nm光激发，只有SO2发生11倍的淬灭（图4）；在SO2滴定实验中（图5），随着二氧化硫的逐渐增加，探针EPI-RS荧光逐渐淬灭。在探针的动力学研究中，在430nm氙灯连续照射两个小时，探针在二氧化硫存在的条件下，探针荧光强度趋于缓慢淬灭状态（图6）。推断，该探针在细胞内能检测到细胞器的二氧化硫活性分子，因此本发明所述的识别纯水体系内SO2的荧光探针是一类新型的高选择性荧光探针分子
本发明所述的识别纯水体系内SO2的荧光探针的识别机理是通关荧光团中二氧化硫的识别位点乙酰丙酸与二氧化硫发生氧化反应导致的荧光团的淬灭效应。其识别反应产物如（II）所示：
Figure 313761DEST_PATH_IMAGE004
（II）。
本发明的有益效果
1、效果好
本发明所述的荧光探针EPI-RS在纯水体系内荧光增强明显，而在二氧化硫存在的条件下荧光淬灭；在SO2滴定实验中，随着二氧化硫的逐渐增加，探针EPI-RS荧光逐渐淬灭；在探针的动力学研究中，在430nm氙灯连续照射两个小时，探针在二氧化硫存在的条件下，探针荧光强度趋于缓慢淬灭状态。
2、选择性好
在SO2选择性试验中，当用430nm光激发，只有SO2发生11倍的淬灭。
3、合成简便
本发明所述吲哚类化合物在体外对活性小分子高选择性检测和合成手段也具有新颖性和简便性。
4、研究意义重大
本发明的荧光探针在纯水体系内通过荧光增强而为检测二氧化硫荧光淬灭性提供荧光平台，该探针及其研究为生物学成像应用奠定了理论基础，预示该探针在活细胞内二氧化硫的检测的实现提供重要工具。
附图说明
图1：化合物3的核磁共振氢谱图。
图2：EPI-RS的核磁共振氢谱图。
图3：探针本身及其在二氧化硫存在下的荧光光谱。激发波长430 nm。
图4：探针对二氧化硫的选择性。激发波长为430 nm；探针母液的浓度：10-3M，选择性离子的浓度为0.1 mM。
图5：SO2的滴定图；横坐标：荧光强度，纵坐标：波长。
图6：探针加入SO2后的动力学变化图；横坐标：相对荧光强度，纵坐标：时间。
其中激发波长为430 nm；探针的浓度:10-3M；时间7200s。
图7为EPI-RS在细胞中对外源性SO2响应的成像。
具体实施方式
以下所述仅为本发明较好的实施例，仅仅用于描述本发明，不能理解为对本发明的范围的限制。
实施例1
EPI-RS的合成：
1:将0.40g(1mmol)化合物0.66g(1.1mmol) 化合物2，溶于20mL甲醇中, 滴入两滴哌啶做催化剂，在氮气保护下进行回流反应，反应过夜，反应结束。将粗品通过柱层析法，用CH2Cl2/CH3OH=70:1的展开剂进行分离提纯得到化合物3，并对其进行核磁共振氢谱分析其结构（见图1）。1H NMR (400 MHz, MeDH) δ8.48 (t, J = 8.0Hz, 3H), 7.89 (s, 1H),7.84 (d, J = 8.0Hz, 2H), 7.36 (d, J=16Hz, 1H), 7.01 (t, J=6Hz, 1H), 6.94 (d,J=8Hz, 1H), 4.43 (q, J = 6.6 Hz, 2H), 3.34 (s, 1H), 1.58 (t, J = 8Hz, 3H).
2:将0.30g化合物3(0.76mmol)，0.22g乙酰丙酸4(2.3mmol),0.63gDCC(1.52mmol)，0.009gDMAP(0.076mmol),溶于30ml乙腈中，室温条件下进行反应，反应8h,反应结束得到粗品，将粗品通过柱层析法，用CH2Cl2/CH3OH=70:1的展开剂进行分离提纯得到产物，并对其进行核磁共振氢谱分析其结构（见图2）。1H NMR (400 MHz, MeDH) δ8.60 (d,J = 8Hz, 2H), 8.32 (d, J = 16Hz, 1H), 8.06 (d, J=4Hz, 3H), 7.34 (d, J=8Hz,1H), 7.20 (t, J=4Hz, 1H), 7.17 (d, J=4Hz, 1H), 6.90 (d, J=8Hz, 1H), 4.48 (q,J=8Hz 2H), 3.00-2.98 (m, 4H), 2.20 (s, 3H), 1.60 (t, J=8Hz 3H).
实施例2
EPI-RS在纯水体系内对二氧化硫的响应：
预先准备1份10 mL的10-3 M本发明的探针N, N-二甲基甲酰胺溶液，然后分别取10μL加入两个相同的5mL容量瓶中，其中一个瓶中加入二氧化硫当量为探针当量的100倍，用PBS的溶液稀释到2mL，然后进行荧光检测（λEx = 430nm），结果见图3。
结论： 表明该探针在在纯水体系内响应。
实施例3
EPI-RS对二氧化硫的选择性(见图4)：
其中：激发波长为430 nm；探针母液的浓度：10-3M，选择性离子的浓度为0.1mM。取10μL探针母液稀释到2ml进行，后取2mL的上述稀释液，加入各种离子进行光谱测试,其中各种离子浓度均为0.1mM。探针的测试环境均为PBS缓冲溶液。
结论：测试结果表明，探针EPI-RS对二氧化硫具有高选择性。加入二氧化硫后，探针响应倍数为11倍左右。
实施例 4
二氧化硫的滴定：
配制10 mL浓度为0.1mM SO2的水溶液及本发明的探针母液（浓度为10-3M）作为备用。
将二氧化硫浓度从0当量滴定到100当量并进行荧光检测（λEx = 430nm, λEm=545nm），计算各体系中荧光强度，建立荧光强度与二氧化硫浓度标准曲线 (见图5)。
结论：随着二氧化硫的加入，探针的荧光强度趋于下降至平衡的趋势。
实施例 5
荧光探针在细胞中的成像：
将适当密度的3T-3细胞接种到两个灭菌的培养皿中，在CO2培养箱（温度为37℃，5% CO2）中培养，待细胞贴壁后，分为2组实验：第一组，向培养皿中加入荧光探针EPI-RS，使其终浓度均为10 μM，孵育30 min后，后进行成像。第二组，向培养皿中加入荧光探针EPI-RS使其终浓度均为10μM，孵育30 min后，将探针用PBS冲洗两次，加入Na2SO3,使SO2的终浓度为100μM,孵育30分钟继续作用30 min后进行明场成像、荧光成像（激发波长为488nm，发射波段为500-550nm），图像如图7所示，其中第1-3列分别为2组实验的明场成像、荧光成像与叠加图。由图7可知，只加入探针EPI-RS时，细胞具有较强的绿色荧光，加入Na2SO3后，细胞绿色荧光明显减弱，说明本发明荧光探针EPI-RS能够进入细胞中并检测细胞中的二氧化硫。

Claims (3)

1.一种识别纯水体系内二氧化硫的荧光探针，命名为EPI-RS，其特征在于，其化学结构式如式（I）所示：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
（I）。
2.一种权利要求1所述的EPI-RS的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
（1）将化合物1与吡啶盐2以甲醇做溶剂，哌啶作催化剂，在氮气保护下回流反应，反应结束后，柱层层析得到化合物3；
（2）将化合物3与乙酰丙酸4以乙腈做溶剂，二环己基碳二亚胺DCC与4-二甲氨基吡啶DMAP作为催化剂，进行室温反应，反应结束后，将产物通过柱层析法进行分离提纯，得化合物5。
3.一种权利要求1所述的EPI-RS在制备检测细胞内SO2的生物传感器上的应用。
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