JP5897332B2 - 観察方法 - Google Patents
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Description
本発明は、非線形発光分子、蛍光染色剤及び観察方法に関する。
医学や生物学などの分野では、生体機能や病理の解明に資するため、生体内の微小構造を探ることが極めて重要である。こうした生体試料の観察には、光学顕微鏡が頻繁に使用される。ところが、光学顕微鏡による観察では、光の波動性により、照明光の波長の半分以下の構造を観察することができない。従って、約２００ｎｍ以上のものしか観察できなかった（非特許文献１）。例えば、より短い波長のレーザ光を照明光に用いることで空間分解能を向上させることができる。しかし、レーザ光の短波長化は技術的に限界が有るので、その空間分解能の向上にも自ずと限界がある。
上述の光の限界を超える方法として、蛍光物質の多光子励起を用いる方法が提案されている。ところが、多光子励起には波長の長い光を用いる必要があるため、実質的な空間分解能を向上することはできない。また、他にも、複雑な光学系や分子の発光機構を利用して光の限界を超える手法が提案されている。しかし、使用する装置や物質の特殊性から、適用できる観察対象が限られてしまい、光学顕微鏡の空間分解能を実質的に向上することに成功していない。一方、生体内の微小構造を探ることの重要性から、光の限界を超えた空間分解能を実現できる光学観察手法の開発が望まれている。
特許文献１には、レーザ光を短波長化しなくても空間分解能を向上させることができる蛍光顕微鏡が開示されている。この蛍光顕微鏡では、蛍光の飽和によって生じる非線形光学効果を利用している。これにより、レーザ光を短波長化しなくても空間分解能が高い蛍光顕微鏡を実現することができる。しかし、この蛍光顕微鏡では、複雑な制御系を使用しなければならないので、その導入及び運用には多大なコストを要する。
また、発明者らは、本願に先立ち、空間分解能を向上させることができる非線形光学材料の発明を行った。この発明は、日本出願特願２００８−０１８６６５として特許出願されている。これによれば、非線形光学材料のドナー分子及びアクセプタ分子を混合して用いることにより、非線形光学効果を実現することができる。
Ｍａｘ Ｂｏｒｎ ｅｔ ａｌ．，"Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｏｐｔｉｃｓ"，第６版，（英国），Ｔｈｅ ｐｒｅｓｓ ｓｙｎｄｉｃａｔｅ ｏｆ ｔｈｅ ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，１９５９年，ｐ４４０
従来の多光子励起蛍光顕微鏡では、非線形光学効果を発生させるための励起光に、一定以上の波長を有するレーザ光を用いなければならない。よって、原理的にレーザ光を短波長化することができないので、実質的な空間分解能を向上させることができない。
本発明の目的は、非線形光学効果を利用した光学観察において、励起光の波長の限界を超えた空間分解能を実現する非線形発光分子を提供することにある。
本発明の第１の態様にかかる非線形発光分子は、励起光が入射されることにより非線形な蛍光反応が生じる非線形発光分子であって、１以上のドナーと１以上のアクセプタとを備え、前記１以上のドナーは、第１のドナーを含み、前記１以上のアクセプタは、前記第１のドナーと結合した第１のアクセプタを含み、励起光の入射により前記第１のドナー及び前記第１のアクセプタのいずれか一方が励起されるのに伴って、前記第１のドナーから前記第１のアクセプタへ電荷が移動することにより、前記第１のドナーと前記第１のアクセプタとは電荷分離状態を形成し、前記電荷分離状態が維持された状態において、前記ドナー又は前記アクセプタのうち、前記電荷分離状態を形成していないものが励起状態から基底状態に遷移する際に蛍光を発するものである。これにより、１つの蛍光光子を得るために、複数の励起光光子が必要になるため、非線形な蛍光反応を実現できる。
本発明の第２の態様にかかる非線形発光分子は、前記ドナーの数及び前記アクセプタの数により、非線形応答の次数が決定されることを特徴とするものである。これにより、非線形発光分子の非線形応答の次数を制御することができる。
本発明の第３の態様にかかる非線形発光分子は、前記ドナーは、前記アクセプタよりも数が多く、かつ励起光の入射により励起され、励起された前記ドナーから前記アクセプタへ前記電荷が移動することにより、前記ドナーと前記アクセプタとは前記電荷分離状態を形成し、前記電荷分離状態が維持された状態で、前記電荷分離状態を形成していない前記ドナーが励起状態から基底状態に遷移する際に蛍光を発することを特徴とするものである。よって、ドナーにより蛍光光子が放出される非線形発光分子を得ることができる。
本発明の第４の態様にかかる非線形発光分子は、前記アクセプタは、前記ドナーよりも数が多く、かつ励起光の入射により励起され、前記ドナーから励起された前記アクセプタへ前記電荷が移動することにより、前記ドナーと前記アクセプタとは前記電荷分離状態を形成し、前記電荷分離状態が維持された状態で、前記電荷分離状態を形成していない前記アクセプタが励起状態から基底状態に遷移する際に蛍光を発することを特徴とするものである。よって、アクセプタにより蛍光光子が放出される非線形発光分子を得ることができる。
本発明の第５の態様にかかる非線形発光分子は、前記ドナーが、多光子吸収により励起されることを特徴とするものである。これにより、非線形発光分子の非線形応答次数を大きくすることができるので、より光学観察の空間分解能を上げることができる。
本発明の第６の態様にかかる非線形発光分子は、前記アクセプタが、多光子吸収により励起されることを特徴とするものである。これにより、非線形発光分子の非線形応答次数を大きくすることができるので、より光学観察の空間分解能を上げることができる。
本発明の第７の態様にかかる蛍光染色剤は、上記の非線形発光分子が溶媒に溶解され、前記溶媒中に溶解した前記非線形発光分子により、光学観察の対象となる試料が染色されることを特徴とするものである。これにより、試料を染色することができるので、光学観察の空間分解能を向上させることができる。
本発明の第８の態様にかかる蛍光染色剤は、前記非線形発光分子が、前記試料への前記非線形発光分子の定着を容易にするための添加剤と結合していることを特徴とするものである。これにより、試料を容易に染色することができるので、光学観察の空間分解能を向上させることができる。
本発明の第９の態様にかかる蛍光染色剤は、上記非線形発光分子が、液体中に分散している粒子に付着し、前記粒子が光学観察の対象となる試料に付着することを特徴とするものである。これにより、試料を容易に染色することができるので、光学観察の空間分解能を向上させることができる。
本発明の第１０の態様にかかる蛍光染色剤は、前記非線形発光分子により生体試料を染色することを特徴とするものである。これにより、生体試料を容易に染色することができるので、光学観察の空間分解能を向上させることができる。
本発明の第１１の態様にかかる観察方法は、上記の蛍光染色剤により染色された前記試料の観察方法であって、励起光であるレーザ光を集光して前記試料に照射し、前記レーザ光の焦点と前記試料の相対位置を変化させるように走査し、前記レーザ光の照射により発生した蛍光をレーザ光と分離して検出し、検出された前記蛍光の強度に基づいて観察を行うものである。これにより、高い空間分解能で試料を観察することができる。
本発明の第１２の態様にかかる観察方法は、前記試料中における前記レーザ光の焦点を、光軸方向に沿って移動させて前記蛍光を検出することを特徴とするものである。これにより、深さ方向についても高い空間分解能で試料を観察することができる。
本発明の第１３の態様にかかる観察方法は、共焦点光学系を介して前記蛍光を検出することを特徴とするものである。これにより、より高い空間分解能で試料を観察することができる。
本発明によれば、非線形光学効果を利用した光学観察において、励起光の波長の限界を超える高い空間分解能を実現する非線形発光分子を提供することができる。
以下に、本発明を適用可能な実施の形態が説明される。以下の説明は、本発明の実施形態を説明するものであり、本発明が以下の実施形態に限定されるものではない。説明の明確化のため、以下の記載は、適宜、省略及び簡略化がなされている。又、当業者であれば、以下の実施形態の各要素を、本発明の範囲において容易に変更、追加、変換することが可能であろう。なお、各図において同一の符号を付されたものは同様の要素を示しており、適宜、説明が省略される。
まず、本発明にかかる非線形発光分子の非線形応答の原理について、発光過程を例に説明する。図１Ａ〜Ｅは、励起光となるレーザ光を照射した場合における、非線形発光分子の発光過程を示す図である。図１Ａ〜Ｅでは、Ｄは基底状態のドナー、Ａは基底状態のアクセプタ、Ｄ＊は励起状態のドナー、Ｄ＋は電荷分離状態のドナー、Ａ−は電荷分離状態のアクセプタを表す。図１Ａに示すように、この非線形発光分子は、ドナー１及び２とアクセプタ３とが結合して、１つの分子を構成している。この非線形発光分子では、ドナー１と２が蛍光を発する。本実施の形態では、光励起されたドナーで生じた電荷がアクセプタへ移動して電荷分離状態を形成することを利用して、非線形な光学応答を実現している。
ドナー１、２及びアクセプタ３のいずれもが基底状態である非線形発光分子（図１Ａ）において、例えば、ドナー１に励起光であるレーザ光の光子（以下、励起光光子と表記）が入射すると、ドナー１は励起されて光誘起による電荷が生じる（図１Ｂ）。
光誘起により生じた電荷はドナー１からアクセプタ３へ移動し、電荷分離状態を形成する。（図１Ｃ）。この電荷分離状態が解消される前に、ドナー２に励起光光子が入射すると、ドナー２は励起される（図１Ｄ）。ところが、ドナー１とアクセプタ３とは、既に電荷分離状態を形成している。よって、ドナー２で生じた電荷はアクセプタ３へ移動することができない。
そのため、ドナー２は蛍光発光して蛍光光子を放出し、基底状態に遷移する（図１Ｅ）。すなわち、この非線形発光分子は、２個の励起光光子を吸収して１個の蛍光光子を放出するため、励起光強度と蛍光強度との関係には、２次の非線形性が生じる。
なお、非線形発光分子の非線形応答は、上述の図１Ａ〜Ｅの過程に限られるものではない。上述では、ドナー１とアクセプタ３とが電荷分離状態を形成した後に、ドナー２が励起される場合について示されている。しかし、ドナー１及びドナー２が両方とも励起された後に、ドナー１とアクセプタ３とが電荷分離状態を形成し、ドナー２が蛍光発光することも可能である。
図１Ａ〜Ｅに示す非線形発光分子は、ドナー２個とアクセプタ１個が結合した分子構造を有しているが、ドナーとアクセプタの結合数を増加させることで、より高次の非線形性を有する非線形発光分子を実現することが可能である。すなわち、（ｎ＋１）個のドナーが存在する非線形発光分子では、ｎ個のアクセプタが電荷分離状態の形成に関与する必要がある。但し、ｎは１以上の整数である。つまり、ドナーが発光するためには、（ｎ＋１）個の励起光光子が入射されなければならない。従って、この非線形発光分子は（ｎ＋１）次の非線形性を示す。よって、空間分解能をより向上することができる。
なお、上記の非線形発光分子の励起光―蛍光応答を計算により求めることができる。この計算手法では、ドナー１、２及びアクセプタ３は、二準位系モデルを用いて表される。図３は、非線形発光分子において、ドナーが基底状態又は励起状態となる場合と、ドナーとアクセプタとが電荷分離状態を形成する場合と、を組み合わせたエネルギー遷移を示す図である。図３に示すように、この非線形発光分子は５通りの状態が考えられ、それぞれの状態について、下記の５つの微分方程式で表すことができる。
Ｄは基底状態のドナー、Ａは基底状態のアクセプタ、Ｄ＊は励起状態のドナー、Ｄ＋Ａ−は電荷分離状態を表す。また、ｋｅｘは励起の遷移速度［ｓ−１］、ｋＳＴＥＤは誘導放出の遷移速度［ｓ−１］、σは吸収断面積［ｃｍ２］、ｋｅｍは自然発光の遷移速度［ｓ−１］、ｋｅｔは電荷分離状態形成の遷移速度［ｓ−１］、ｋｒｅｃは電荷再結合の遷移速度［ｓ−１］である。
計算に当たっては、ｋｅｘ＝σ×Φ、ｋＳＴＥＤ＝σ×Φ、σ＝１．８５×１０−１６、ｋｅｍ＝１／（５．８７×１０−９）、ｋｅｔ＝１／（１．００×１０−１２）、ｋｒｅｃ＝１／（１０．０×１０−９）とした。なお、Φ［ｓ・ｃｍ２］は単位時間、単位面積当たりの励起光光子の入射量である。
図４は、上述の計算の結果を示すグラフである。このグラフは、横軸に励起光強度、縦軸に蛍光強度をとった両対数グラフであり、励起光強度の増加と共に、蛍光強度が非線形に増加することが確認できる。すなわち、本非線形発光分子を利用することにより、光学観察の分解能を向上させることができる。
また、この非線形発光分子では、アクセプタが蛍光を発する分子構造としてもよい。この場合、例えば、（ｍ＋１）個のアクセプタとｍ個のドナーが結合した分子構造とすることができる。但し、ｍは１以上の整数である。この非線形発光分子では、励起光光子の入射により、アクセプタが励起される。そして、励起されたアクセプタに、ドナーから電子が移動することにより電荷分離状態が形成される。よって、この非線形発光分子にｍ個の励起光光子が入射すると、ｍ個の電荷分離状態が形成される。この電荷分離状態が解消される前に、電荷分離状態の形成に関与していないアクセプタに励起光光子が入射すると、このアクセプタは励起される。この励起されたアクセプタは、蛍光発光して蛍光光子を放出し、基底状態に遷移する。つまり、アクセプタが発光するためには、（ｍ＋１）個の光子が入射されなければならない。従って、この非線形発光分子は（ｍ＋１）次の非線形性を有することとなり、空間分解能を向上させることができる。
更に、ドナー又はアクセプタは、多光子吸収により励起されてもよい。この場合、１個の蛍光光子を得るためには、更に多数の励起光光子が必要となる。よって、非線形応答の次数をより大きくすることができるので、空間分解能を向上させる観点から有利である。特に、試料深部の非線形発光分子の励起に有効であり、試料内部の微小構造を高い分解能で観察することができる。
更にまた、ドナー又はアクセプタを励起できるのであれば、例えば、紫外光レーザ、可視光レーザ又は赤外光レーザなどの、任意の波長のレーザ光を励起光として利用することができる。従来の多光子励起蛍光顕微鏡では長波長のレーザ光を用いる必要があるのに比べ、本実施の形態では、紫外光などの短波長レーザを使用できるので、実質的な空間分解能を向上させることができる点で有効である。
次に、上記の非線形発光分子の使用方法について説明する。本実施の形態にかかる非線形発光分子は、例えば、生体試料の光学観察に用いられる蛍光染料として使用される。生体試料に定着された非線形発光分子に、励起光を照射することにより発生する蛍光の強度を観測する。これにより、高い空間分解能で生体内の微小構造を観察することが可能となる。
本実施の形態では、この非線形発光分子を溶媒に溶解して、溶液として使用する。例えば、この非線形発光分子を水に溶解した水溶液を、蛍光染色剤として使用する。この蛍光染色剤を用いて染色された試料にレーザ光を照射し、試料からの蛍光強度を観測することで、光の限界を超えた空間分解能を実現することができる。なお、溶媒は水に限られず、試料を染色できるのであれば、他の液体を溶媒として使用することが可能である。
上記の非線形発光分子は単体で用いるのみならず、例えば、生体試料の細胞壁や核などの構成要素への定着を容易にするため、蛋白質などの所定の添加物と結合させて用いてもよい。これにより、生体試料に定着される非線形発光分子の実質的な濃度を高くすることができる。よって、励起光であるレーザ光が照射された場合の蛍光強度が強くなり、高いコントラスト比が得られる点で有効である。また、添加物を適切に選択することにより、生体試料の特定の構成要素を選択的に染色することも可能である。これにより、特定の微小構造を選択的に観察することが可能である。
更に、上記の非線形発光分子を液体中に分散している微粒子などに付着させて用いてもよい。これによれば、非線形発光分子は微粒子に付着しているまとまった分子数単位で生体試料に付着する。よって、生体試料に付着する非線形発光分子の実質的な濃度を高くするこができる。従って、励起光であるレーザ光が照射された場合の蛍光強度が強くなり、高いコントラスト比が得られる点で有効である。
次に、本実施の形態における観察方法について説明する。本実施の形態では、励起光としてレーザ光を用いる。レーザ光の断面強度分布は、例えばガウス分布のように、レーザ光のスポット中心で光強度が最大になる。そして、スポット中心から離れるにしたがって光強度は小さくなる。従って、上記の非線形発光分子により染色された生体試料にレーザ光を照射すると、レーザ光のスポット中心から、非線形発光分子が非線形応答する光強度を有する範囲内で、強い蛍光発光を得ることができる。これにより、レーザ光のスポットを絞り込むのと同等の効果を得ることができる。よって、この蛍光強度を観測することにより、レーザ光の回折限界を超えて、生体試料の微小構造を観察することが可能となる。
また、この非線形発光分子を用いれば、励起光として安価な連続発振レーザを用いることができる。よって、従来の多光子励起蛍光顕微鏡のような、高価なパルスレーザは必要ない。また、蛍光強度の観測には、既存の一般的な光学機器を利用できる。従って、安価かつ簡素な光学系及びレーザシステムにより、生体試料を観察することができる。
実施の形態１
上記の非線形発光分子を用いた試料の観察方法について説明する。本実施の形態では、上記の非線形発光分子を蛍光染料として用いる。具体的には、非線形発光分子が溶解している蛍光染色剤により、観察対象である生体試料を染色する。生体試料の染色は、例えば、免疫染色法により行うことができる。この生体試料を、例えばレーザ走査蛍光顕微鏡により観察する。図２は、非線形発光分子の分子構造の一例を示す図である。本実施の形態においては、例えば図２に示す分子構造を有する非線形発光分子を用いることができる。
上記の非線形発光分子を用いた試料の観察方法について説明する。本実施の形態では、上記の非線形発光分子を蛍光染料として用いる。具体的には、非線形発光分子が溶解している蛍光染色剤により、観察対象である生体試料を染色する。生体試料の染色は、例えば、免疫染色法により行うことができる。この生体試料を、例えばレーザ走査蛍光顕微鏡により観察する。図２は、非線形発光分子の分子構造の一例を示す図である。本実施の形態においては、例えば図２に示す分子構造を有する非線形発光分子を用いることができる。
図５は、レーザ走査蛍光顕微鏡の光学系を模式的に示す構成図である。このレーザ走査蛍光顕微鏡は、図５に示すように、励起光であるレーザ光がレーザ光源１１から出射される。出射されたレーザ光は、レンズ１２で屈折されダイクロイックミラー１３に入射する。ダイクロイックミラー１３は励起光であるレーザ光を透過して、対物レンズ１４に入射する。そしてレーザ光は対物レンズ１４により、非線形発光分子によって染色された生体試料１６に集光される。
生体試料１６はＸＹＺ３軸駆動が可能なステージ１５上にセットされている。例えば、ステージ１５をレーザ光の光軸と水平な面内で駆動させながら、レーザ光を照射することにより、生体試料１６を走査することができる。生体試料１６の試料に定着されている非線形発光分子は、励起光であるレーザ光スポットの中心近傍において蛍光発光する。蛍光強度は、励起光であるレーザ光が生体試料１６に入射する位置に応じて変化する。
この蛍光は、対物レンズ１４を透過してダイクロイックミラー１３で反射され、検出器１７に入射する。そして蛍光強度が検出器１７で検出される。その後、蛍光強度に応じた信号を画像に変換する。
この観察方法によれば、励起光であるレーザ光のスポットよりも小さな微小構造を観察することができる。従って、光の限界を超えた空間分解能で、生体試料の微小構造を観察することができる。
その他の実施の形態
なお、本発明は上記実施の形態に限られたものではなく、趣旨を逸脱しない範囲で適宜変更することが可能である。例えば、上記の非線形発光分子を用いれば、生体試料の３次元観察を行うことも可能である。すなわち、励起光であるレーザ光の焦点を生体試料の深さ方向（光軸方向）で移動させて蛍光発光強度を観測することで、深さ方向についても空間分解能を向上させることができる。従って、生体試料の平面的情報のみならず、立体的情報を取得することが可能である。
なお、本発明は上記実施の形態に限られたものではなく、趣旨を逸脱しない範囲で適宜変更することが可能である。例えば、上記の非線形発光分子を用いれば、生体試料の３次元観察を行うことも可能である。すなわち、励起光であるレーザ光の焦点を生体試料の深さ方向（光軸方向）で移動させて蛍光発光強度を観測することで、深さ方向についても空間分解能を向上させることができる。従って、生体試料の平面的情報のみならず、立体的情報を取得することが可能である。
また、蛍光強度の検出は、共焦点光学系を介して行うことも可能である。これにより、レーザ光の焦点での蛍光を選択的に検出することができるので、空間分解能を更に向上させることができる。
また、図２に示す非線形発光分子はあくまで一例であり、ドナーとアクセプタとが電荷分離状態を形成できるのであれば、他の分子構造をとることができる。
なお、本発明の観察対象は、生体試料に限られない。非線形発光分子を試料へ定着又は付着させることが可能であり、蛍光強度の測定が可能であれば、他の試料を観察することができることは言うまでもない。
また、本発明にかかるレーザ走査蛍光顕微鏡は、上述の図５に示す構成に限られない。観察対象をレーザ走査できるのであれば、異なる構成のレーザ走査蛍光顕微鏡を用いることができることは勿論である。
この出願は、２００９年６月２６日に出願された日本出願特願２００９−１５２１３８を基礎とする優先権を主張し、その開示の全てをここに取り込む。
この発明は、微小構造を観察するための光学観察手法に適用できる。すなわち、光の限界を超えた空間分解能をもたらす光学観察手法を実現し、例えば生体内の微小構造や生体分子の局在の観察を行うことができる。
１、２ ドナー
３ アクセプタ
１１ レーザ光源
１２ レンズ
１３ ダイクロイックミラー
１４ 対物レンズ
１５ ステージ
１６ 生体試料
１７ 検出器
３ アクセプタ
１１ レーザ光源
１２ レンズ
１３ ダイクロイックミラー
１４ 対物レンズ
１５ ステージ
１６ 生体試料
１７ 検出器
Claims (11)
- 励起光が入射されることにより非線形な蛍光反応が生じる非線形発光分子が溶媒に溶解された蛍光染色剤により染色された試料の観察方法であって、
前記非線形発光分子は、
１以上のドナーと１以上のアクセプタとを備え、
前記１以上のドナーは、第１のドナーを含み、
前記１以上のアクセプタは、前記第１のドナーと結合した第１のアクセプタを含み、
第１の光子の入射により前記第１のドナー及び前記第１のアクセプタのいずれか一方が励起されるのに伴って、前記第１のドナーから前記第１のアクセプタへ電荷が移動することにより、前記第１のドナーと前記第１のアクセプタとは電荷分離状態を形成し、
前記電荷分離状態が維持された状態において、前記１以上のドナーのうちで前記第１のドナー以外のドナー又は前記１以上のアクセプタのうちで前記第１のアクセプタ以外のアクセプタのうち、前記電荷分離状態を形成していないドナー又はアクセプタに第２の光子が入射することで、前記電荷分離状態を形成していないドナー又はアクセプタが励起され、励起状態から基底状態に遷移する際に前記電荷分離状態を形成していないドナー又はアクセプタが蛍光を発するものであり、
前記蛍光染色剤は、前記溶媒中に溶解した前記非線形発光分子により、光学観察の対象となる前記試料を染色するものであり、
励起光である連続発振レーザ光を集光して前記試料に照射し、
前記連続発振レーザ光の焦点と前記試料の相対位置を変化させるように走査し、
前記連続発振レーザ光の照射により発生した蛍光を前記連続発振レーザ光と分離して検出し、
検出された前記蛍光の強度に基づいて観察を行う、
観察方法。 - 前記試料中における前記連続発振レーザ光の焦点を、光軸方向に沿って移動させて前記蛍光を検出することを特徴とする、
請求項１に記載の観察方法。 - 共焦点光学系を介して前記蛍光を検出することを特徴とする、
請求項２に記載の観察方法。 - 前記ドナーの数及び前記アクセプタの数により、非線形応答の次数が決定されることを特徴とする、
請求項１乃至３のいずれか一項に記載の観察方法。 - 前記ドナーは、前記アクセプタよりも数が多く、かつ励起光の入射により励起され、
励起された前記ドナーから前記アクセプタへ前記電荷が移動することにより、前記ドナーと前記アクセプタとは前記電荷分離状態を形成し、
前記電荷分離状態が維持された状態で、前記電荷分離状態を形成していない前記ドナーが励起状態から基底状態に遷移する際に蛍光を発することを特徴とする、
請求項１乃至４のいずれか一項に記載の観察方法。 - 前記アクセプタは、前記ドナーよりも数が多く、かつ励起光の入射により励起され、
前記ドナーから励起された前記アクセプタへ前記電荷が移動することにより、前記ドナーと前記アクセプタとは前記電荷分離状態を形成し、
前記電荷分離状態が維持された状態で、前記電荷分離状態を形成していない前記アクセプタが励起状態から基底状態に遷移する際に蛍光を発することを特徴とする、
請求項１乃至４のいずれか一項に記載の観察方法。 - 前記ドナーは、多光子吸収により励起されることを特徴とする、
請求項５に記載の観察方法。 - 前記アクセプタは、多光子吸収により励起されることを特徴とする、
請求項６に記載の観察方法。 - 前記蛍光染色材の前記非線形発光分子は、前記試料への前記非線形発光分子の定着を容易にするための添加剤と結合していることを特徴とする、
請求項１乃至８のいずれか一項に記載の観察方法。 - 前記蛍光染色材の前記非線形発光分子が、液体中に分散している粒子に付着し、
前記粒子が光学観察の対象となる試料に付着することを特徴とする、
１乃至８のいずれか一項に記載の観察方法。 - 前記試料は生体試料であることを特徴とする、
請求項１乃至１０のいずれか一項に記載の観察方法。
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