JP2006208299A

JP2006208299A - 化学発光試薬

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Publication number: JP2006208299A
Application number: JP2005023573A
Authority: JP
Inventors: Osamu Nozaki; 修野崎; Masanori Munematsu; 眞徳宗末; Hiroko Kawamoto; 裕子河本
Original assignee: KEMUKO KK
Current assignee: KEMUKO KK
Priority date: 2005-01-31
Filing date: 2005-01-31
Publication date: 2006-08-10
Anticipated expiration: 2025-01-31
Also published as: JP4591820B2

Abstract

【課題】ルミノール化学発光と同等の感度を有しており、水解性において優れており、不純物の混入がなく、調製試薬が保存中に劣化することなく、しかも測定結果の再現性にも優れており、臨床検査の分野などにおいて、種々の物質の検出や定量に用いられるのに非常に適した新規な化学発光物質を提供する。
【解決手段】過酸化含窒素五員環化合物の溶液を凍結したものとしている。さらに、過酸化含窒素五員環化合物の溶液を凍結乾燥したものとしてもよい。
【選択図】なし

Description

この発明は、例えば臨床検査の分野において、種々の物質の検出や定量に用いられる新規な化学発光試薬に関するものである。

従来から、臨床検査の分野においては、測定対象物質を酵素標識し、この標識酵素の活性を化学発光測定する方法が開発されている。化学発光測定法は、その簡便、迅速、高感度などの点から、臨床検査には適しているといえる。この化学発光測定法に用いられる酵素としては、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコールオキシダーゼなどがあり、この化学発光測定法に用いられる化学発光物質としては、ルミノール、イソルミノール、ロフィン、ルシゲニン、過シュウ酸エステルなどがある（特許文献１〜６）。
特開昭５９−１７１８３９号特開平２−１７４６９４号特開平２−２９１２９９号特開平３−３５１４７号特開平７−３２７６９４号特開平８−３１３４４３号

しかしながら、従来の化学発光測定法に用いられる化学発光物質は、その化学発光検出に必須である水に比較的難溶性であったり、不純物の混入があったり、調製試薬が保存中に劣化するなどの点で、不利、不便であるという課題を有していた。

さらに、個別の化学発光物質の問題点として、ルミノールおよび過シュウ酸エステルでは、高濃度溶液調製にアセトニトリルなどの有機溶媒による溶解が必要であるという課題を有していた。ルシゲニンはその発光持続時間が短く、バックグラウンドノイズが多いという課題を有していた。また、ロフィン化学発光では、水難溶性と共にその発光収率が良くないという課題を有していた。

そこで、この発明は、上記従来の化学発光測定法に用いられる化学発光物質が有する課題を解決するためになされたものであり、ルミノール化学発光と同等の感度を有しており、水解性において優れており、不純物の混入がなく、調製試薬が保存中に劣化することなく、しかも測定結果の再現性にも優れており、臨床検査の分野などにおいて、種々の物質の検出や定量に用いられるのに非常に適した新規な化学発光物質を提供することを目的としてなされたものである。

この発明の化学発光試薬は、過酸化含窒素五員環化合物の溶液を凍結したものとしている。

さらに、この発明の化学発光試薬は、過酸化含窒素五員環化合物の溶液を凍結乾燥したものとしている。

そして、この発明の化学発光試薬は、前記含窒素五員環化合物を、ピロール系化合物、イミダゾール系化合物またはプリン系化合物から選択されるものとしている。

この発明の化学発光試薬は、ルミノール化学発光と同等の感度を有しており、水溶性において優れており、不純物の混入がなく、調製試薬が保存中に劣化することなく、直接酸化により発光し、しかも測定結果の再現性にも優れており、臨床検査の分野などにおいて、種々の物質の検出や定量に用いられるのに非常に適したものとなった。

以下、この発明の化学発光試薬について詳細に説明する。

この発明の化学発光試薬は、過酸化含窒素五員環化合物の溶液を凍結したものとするか、凍結乾燥したものとしている。すなわち、この発明の化学発光試薬は、含窒素五員環化合物の溶液と過酸化水素水とアルカリ性緩衝液を反応させ、その反応液を凍結したものとするか、凍結乾燥したものとしている。

この発明の化学発光試薬は、含窒素五員環化合物の溶液と過酸化水素水とアルカリ性緩衝液を、試験管にとり、混合液を約４０〜６０℃の加温下で、約３０分間、反応させた後、その試験管のまま凍結することにより、または凍結乾燥することにより調製される。

この発明の化学発光試薬は、前記反応液、あるいはその高速液体クロマトグラフィー分取液を凍結するだけ、または凍結乾燥するだけで、保存性に優れたものとなった。凍結したこの発明の化学発光試薬は、そのまま室温で解凍するだけで、種々の物質の検出や定量に用いられるものとなる。また、凍結乾燥したこの発明の化学発光試薬は、凍結乾燥前と同容量になる程度の蒸留水を加えて溶解させれば、種々の物質の検出や定量に用いられるものとなる。

この発明の化学発光試薬おける含窒素五員環化合物は、ピロール系化合物、イミダゾール系化合物またはプリン系化合物から選択されるものとしている。ピロール系化合物としては、例えばピロール、プロリン、ポルフィリンなどが挙げられ、イミダゾール系化合物としては、例えばイミダゾール、２−メチルイミダゾール、４−メチルイミダゾール、４−メチル−５−ヒドロキシメチルイミダゾール、ベンズイミダゾール、４−ニトロイミダゾール、アラントイン、エチレンウレア、ヒスチジン、ピラゾ−ルなどが挙げられ、プリン系化合物としては、例えばテオフィリン、カフェイン、キサンチン、アロプリノール、イノシン、トリプトファン、アデニン、アデノシン、ニコチンアミドアデニシンジヌクレオチド（ＮＡＤ）、還元型ニコチンアミドアデニシンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）、アデノシントリフォスフェート（ＡＴＰ）、アデノシンジフォスフェート（ＡＤＰ）、アデノシンモノフォスフェート（ＡＭＰ）、サイクリックＡＭＰ、セロトニン、アシクロビルなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

この発明の化学発光試薬おけるアルカリ性緩衝液としては、トリシン緩衝液、トリス塩酸緩衝液、ホウ酸緩衝液などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、そのアルカリ性緩衝液の濃度は、緩衝液の種類によって相違するが、トリシン緩衝液では５０ｍｍｏｌ／Ｌとし、この場合のｐＨ値は９．４であった。

この発明の化学発光試薬おける過酸化水素水の濃度は、１００ｍｍｏｌ／Ｌ程度が好ましい。

この発明の化学発光試薬を各種調製し、それぞれの化学発光試薬を用いて、ペルオキシダーゼ活性の測定を行った。
（実施例１）
０．１ｍｏｌ／Ｌピロール溶液（５０ｍｍｏｌ／Ｌトリシン緩衝液でｐＨ調製）２ｍＬを試験管に取り、この試験管に１００ｍｍｏｌ過酸化水素水０．２ｍＬを加え、約６０℃の加温下で、約３０分間、反応させる。次いで、この試験管を冷凍庫に入れ、試験管ごと凍結し、この発明の化学発光試薬を得た。

この実施例１で得た化学発光試薬の入った試験管を冷凍庫から取り出し、化学発光試薬を室温で解凍し、その解凍液５０μＬを、固定化ペルオキシダーゼ充填フローセルにフローインジェクションシステムを用いて注入したところ、ルミノール化学発光と同程度の化学発光強度を確認することができた。

（実施例２）
０．１ｍｏｌ／Ｌプロリン溶液（５０ｍｍｏｌ／Ｌトリシン緩衝液でｐＨ調製）２ｍＬを試験管に取り、この試験管に１００ｍｍｏｌ過酸化水素水０．２ｍＬを加え、約６０℃の加温下で、約３０分間、反応させる。次いで、この試験管を冷凍庫に入れ、試験管ごと凍結し、この発明の化学発光試薬を得た。

この実施例２で得た化学発光試薬の入った試験管を冷凍庫から取り出し、化学発光試薬を室温で解凍し、その解凍液５０μＬを、固定化ペルオキシダーゼ充填フローセルにフローインジェクションシステムを用いて注入したところ、ルミノール化学発光と同程度の化学発光強度を確認することができた。

（実施例３）
０．１ｍｏｌ／Ｌイミダゾール溶液（５０ｍｍｏｌ／Ｌトリシン緩衝液でｐＨ調製）２ｍＬを試験管に取り、この試験管に１００ｍｍｏｌ過酸化水素水０．２ｍＬを加え、約６０℃の加温下で、約３０分間、反応させる。次いで、この試験管を冷凍庫に入れ、試験管ごと凍結し、この発明の化学発光試薬を得た。

この実施例３で得た化学発光試薬の入った試験管を冷凍庫から取り出し、化学発光試薬を室温で解凍し、その解凍液５０μＬを、固定化ペルオキシダーゼ充填フローセルにフローインジェクションシステムを用いて注入したところ、ルミノール化学発光と同程度の化学発光強度を確認することができた。

（実施例４〜１２）
０．１ｍｏｌ／Ｌとした、２−メチルイミダゾール（実施例４）、４−メチルイミダゾール（実施例５）、４−メチル−５−ヒドロキシメチルイミダゾール（実施例６）、ベンズイミダゾール（実施例７）、４−ニトロイミダゾール（実施例８）、アラントイン（実施例９）、エチレンウレア（実施例１０）、ヒスチジン（実施例１１）、ピラゾ−ル（実施例１２）の各溶液（何れも５０ｍｍｏｌ／Ｌトリシン緩衝液でｐＨ調製）２ｍＬをそれぞれ試験管に取り、これらの試験管にそれぞれ１００ｍｍｏｌ過酸化水素水０．２ｍＬを加え、約６０℃の加温下で、約３０分間、反応させる。次いで、これらの試験管を冷凍庫に入れ、試験管ごと凍結し、この発明の化学発光試薬を得た。

これら実施例４〜１２で得た化学発光試薬の入った試験管を冷凍庫から取り出し、化学発光試薬を室温で解凍し、それらの解凍液５０μＬを、固定化ペルオキシダーゼ充填フローセルにフローインジェクションシステムを用いて注入したところ、何れもルミノール化学発光と同程度の化学発光強度を確認することができた。

（実施例１３）
０．１ｍｏｌ／Ｌテオフィリン溶液（５０ｍｍｏｌ／Ｌトリシン緩衝液でｐＨ調製）２ｍＬを試験管に取り、この試験管に１００ｍｍｏｌ過酸化水素水０．２ｍＬを加え、約６０℃の加温下で、約３０分間、反応させる。次いで、この試験管を冷凍庫に入れ、試験管ごと凍結し、この発明の化学発光試薬を得た。

この実施例１３で得た化学発光試薬の入った試験管を冷凍庫から取り出し、化学発光試薬を室温で解凍し、その解凍液５０μＬを、固定化ペルオキシダーゼ充填フローセルにフローインジェクションシステムを用いて注入したところ、ルミノール化学発光と同程度の化学発光強度を確認することができた。

（実施例１４〜２６）
０．１ｍｏｌ／Ｌとした、カフェイン（実施例１４）、キサンチン（実施例１５）、アロプリノール（実施例１６）、イノシン（実施例１７）、トリプトファン（実施例１８）、アデニン（実施例１９）、アデノシン（実施例２０）、ＮＡＤ（実施例２１）、ＮＡＤＨ（実施例２２）、ＡＴＰ（実施例２３）、ＡＤＰ（実施例２４）、ＡＭＰ（実施例２５）、サイクリックＡＭＰ（実施例２６）、の各溶液（何れも５０ｍｍｏｌ／Ｌトリシン緩衝液でｐＨ調製）２ｍＬをそれぞれ試験管に取り、これらの試験管にそれぞれ１００ｍｍｏｌ過酸化水素水０．２ｍＬを加え、約６０℃の加温下で、約３０分間、反応させる。次いで、これらの試験管を冷凍庫に入れ、試験管ごと凍結し、この発明の化学発光試薬を得た。

これら実施例１４〜２６で得た化学発光試薬の入った試験管を冷凍庫から取り出し、化学発光試薬を室温で解凍し、それらの解凍液５０μＬを、固定化ペルオキシダーゼ充填フローセルにフローインジェクションシステムを用いて注入したところ、何れもルミノール化学発光と同程度の化学発光強度を確認することができた。

（実施例２７）
０．１ｍｏｌ／Ｌピロール溶液（５０ｍｍｏｌ／Ｌトリシン緩衝液でｐＨ調製）２ｍＬを試験管に取り、この試験管に１００ｍｍｏｌ過酸化水素水０．２ｍＬを加え、約６０℃の加温下で、約３０分間、反応させる。次いで、この試験管を凍結乾燥機に入れ、試験管ごと凍結乾燥し、この発明の化学発光試薬を得た。

この実施例２７で得た化学発光試薬の入った試験管に、蒸留水２ｍＬを加え、化学発光試薬を溶解させ、その溶解液５０μＬを、固定化ペルオキシダーゼ充填フローセルにフローインジェクションシステムを用いて注入したところ、ルミノール化学発光と同程度の化学発光強度を確認することができた。

（実施例２８）
０．１ｍｏｌ／Ｌプロリン溶液（５０ｍｍｏｌ／Ｌトリシン緩衝液でｐＨ調製）２ｍＬを試験管に取り、この試験管に１００ｍｍｏｌ過酸化水素水０．２ｍＬを加え、約６０℃の加温下で、約３０分間、反応させる。次いで、この試験管を凍結乾燥機に入れ、試験管ごと凍結乾燥し、この発明の化学発光試薬を得た。

この実施例２８で得た化学発光試薬の入った試験管に、蒸留水２ｍＬを加え、化学発光試薬を溶解させ、その溶解液５０μＬを、固定化ペルオキシダーゼ充填フローセルにフローインジェクションシステムを用いて注入したところ、ルミノール化学発光と同程度の化学発光強度を確認することができた。

（実施例２９）
０．１ｍｏｌ／Ｌイミダゾール溶液（５０ｍｍｏｌ／Ｌトリシン緩衝液でｐＨ調製）２ｍＬを試験管に取り、この試験管に１００ｍｍｏｌ過酸化水素水０．２ｍＬを加え、約６０℃の加温下で、約３０分間、反応させる。次いで、この試験管を凍結乾燥機に入れ、試験管ごと凍結乾燥し、この発明の化学発光試薬を得た。

この実施例２９で得た化学発光試薬の入った試験管に、蒸留水２ｍＬを加え、化学発光試薬を溶解させ、その溶解液５０μＬを、固定化ペルオキシダーゼ充填フローセルにフローインジェクションシステムを用いて注入したところ、ルミノール化学発光と同程度の化学発光強度を確認することができた。

（実施例３０〜３８）
０．１ｍｏｌ／Ｌとした、２−メチルイミダゾール（実施例３０）、４−メチルイミダゾール（実施例３１）、４−メチル−５−ヒドロキシメチルイミダゾール（実施例３２）、ベンズイミダゾール（実施例３３）、４−ニトロイミダゾール（実施例３４）、アラントイン（実施例３５）、エチレンウレア（実施例３６）、ヒスチジン（実施例３７）、ピラゾ−ル（実施例３８）の各溶液（何れも５０ｍｍｏｌ／Ｌトリシン緩衝液でｐＨ調製）２ｍＬをそれぞれ試験管に取り、これらの試験管にそれぞれ１００ｍｍｏｌ過酸化水素水０．２ｍＬを加え、約６０℃の加温下で、約３０分間、反応させる。次いで、これらの試験管を凍結乾燥機に入れ、試験管ごと凍結乾燥し、この発明の化学発光試薬を得た。

これら実施例３０〜３８で得た化学発光試薬の入った試験管に、蒸留水２ｍＬを加え、化学発光試薬を溶解させ、それらの溶解液５０μＬを、固定化ペルオキシダーゼ充填フローセルにフローインジェクションシステムを用いて注入したところ、何れもルミノール化学発光と同程度の化学発光強度を確認することができた。

（実施例３９）
０．１ｍｏｌ／Ｌテオフィリン溶液（５０ｍｍｏｌ／Ｌトリシン緩衝液でｐＨ調製）２ｍＬを試験管に取り、この試験管に１００ｍｍｏｌ過酸化水素水０．２ｍＬを加え、約６０℃の加温下で、約３０分間、反応させる。次いで、この試験管を凍結乾燥機に入れ、試験管ごと凍結乾燥し、この発明の化学発光試薬を得た。

この実施例３９で得た化学発光試薬の入った試験管に、蒸留水２ｍＬを加え、化学発光試薬を溶解させ、その溶解液５０μＬを、固定化ペルオキシダーゼ充填フローセルにフローインジェクションシステムを用いて注入したところ、ルミノール化学発光と同程度の化学発光強度を確認することができた。

（実施例４０〜５２）
０．１ｍｏｌ／Ｌとした、カフェイン（実施例４０）、キサンチン（実施例４１）、アロプリノール（実施例４２）、イノシン（実施例４３）、トリプトファン（実施例４４）、アデニン（実施例４５）、アデノシン（実施例４６）、ＮＡＤ（実施例４７）、ＮＡＤＨ（実施例４８）、ＡＴＰ（実施例４９）、ＡＤＰ（実施例５０）、ＡＭＰ（実施例５１）、サイクリックＡＭＰ（実施例５２）、の各溶液（何れも５０ｍｍｏｌ／Ｌトリシン緩衝液でｐＨ調製）２ｍＬをそれぞれ試験管に取り、これらの試験管にそれぞれ１００ｍｍｏｌ過酸化水素水０．２ｍＬを加え、約６０℃の加温下で、約３０分間、反応させる。次いで、これらの試験管を凍結乾燥機に入れ、試験管ごと凍結乾燥し、この発明の化学発光試薬を得た。

これら実施例４０〜５２で得た化学発光試薬の入った試験管に、それぞれ蒸留水２ｍＬを加え、化学発光試薬を溶解させ、それらの溶解液５０μＬを、固定化ペルオキシダーゼ充填フローセルにフローインジェクションシステムを用いて注入したところ、何れもルミノール化学発光と同程度の化学発光強度を確認することができた。

Claims

過酸化含窒素五員環化合物の溶液を凍結したことを特徴とする化学発光試薬。
過酸化含窒素五員環化合物の溶液を凍結乾燥したことを特徴とする化学発光試薬。
前記含窒素五員環化合物が、ピロール系化合物、イミダゾール系化合物またはプリン系化合物から選択されるものであることを特徴とする請求項１または２記載の化学発光試薬。