CN104946728B - 一种萤火虫荧光素酶活性的测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物检测领域，具体涉及一种萤火虫荧光素酶活性的测定方法。包括以下步骤：配制含有ATP、Mn²⁺、Ca²⁺、荧光素、氨基乙酰双甘氨肽和磷酸盐的混合液；调节pH值；预冷混合液至4℃；在混合液中孵育生物素化荧光素酶；加入ATP，放入检测仪中，测定荧光信号的强度。本发明中的测定方法有利于荧光素酶的高通量筛选和使用。

Description

一种萤火虫荧光素酶活性的测定方法

技术领域

本发明属于生物检测领域，具体涉及一种萤火虫荧光素酶活性的测定方法。

背景技术

荧光素酶（Luciferase）是自然界中能够产生生物萤光的酶的统称，其中最有代表性的是一种学名为Photinuspyrali的萤火虫体内的荧光素酶。在相应化学反应中，荧光的产生是来自于荧光素的氧化，有些情况下反应体系中也包括三磷酸腺苷（ATP）。

荧光素酶发出的光的颜色主要取决于荧光素周围的氨基酸。在正常情况下它发出黄绿光。但如果将其中的丝氨酸变为天冬氨酸（蛋白质编号2d1t），则它会发出红光。

荧光生成反应通常分为以下两步：

1：荧光素+ATP→荧光素化腺苷酸（luciferyladenylate）+PPi

2：荧光素化腺苷酸+O2→氧荧光素+AMP+光

这一反应非常节省能量，几乎所有输入反应的能量都被转化为光。与之形成鲜明对比的是人类使用的白炽灯，只有约10%的能量被转化为光，剩余的能量都变为热能而被浪费。

在荧光素酶中加入正确的萤光素底物就可以放出萤光，而发出的光子可以被光敏感元件，如萤光探测器或改进后的光学显微镜探测到。这就使得对包括感染在内的多种生命活动进程进行观察成为可能。例如，萤光素酶可以被用于检测血库中所存血液中的红血球是否开始破裂。法医可以用含有萤光素酶的溶液来检测犯罪现场中残留的血迹。医院用萤光素酶的发光来发现特定的疾病。萤光素酶还可以作为“报告蛋白”被用于分子生物学研究中，例如，用于在转染过萤光素酶的细胞中检测特定启动子的转录情况或用于探测细胞内的ATP的水平；这一技术被称为报告基因检测法或萤光素酶检测法。萤光素酶是一个热敏感蛋白，因此经常被用于研究蛋白热变性过程中热休克蛋白的保护能力。

基因组测序是当代生命科学技术的前沿核心技术之一，其中的焦磷酸测序法采用了荧光素酶进行检测，读长大，精确度高。现有技术在检测荧光素酶的过程中，光信号强度较差，持续时间短，不利于荧光素酶的高通量筛选和使用。

发明内容

本发明的一个目的是一种萤火虫荧光素酶活性的测定方法，所述测定方法包括：

（1）配制含有ATP、Mn²⁺、Ca²⁺、荧光素、氨基乙酰双甘氨肽和磷酸盐的混合液；

（2）调节pH值；

（3）预冷混合液至4℃；

（4）在混合液中孵育生物素化荧光素酶；

（5）加入ATP，放入检测仪中，测定荧光信号的强度。

所述混合液中还含有Tris-HCl缓冲液。

所述混合液中还含有温和还原剂，所述温和还原剂为TCEP（三(2-羧乙基)膦）、DTT、(NH₄)₂S、NH₄HS、Na₂S、NaHS和NaHSO₃中的一种或几种，优选为TCEP、DTT和NaHS，体积比为3:1:2。

所述温和还原剂在60mM以下。

所述生物素化荧光素酶结合于磁珠上，磁珠为M280链霉素抗生物素蛋白磁珠。

所述Mg²⁺是由MgCl₂提供的，所述Ca²⁺是由CaCl₂提供的。

所述磷酸盐离子是由H₂PO₄ ^-、HPO₄ ^2-和PO₄ ^3-中的一种或几种提供的，优选为HPO₄ ^2-。

所述混合液的pH值为7.0-8.0。

所述混合液中ATP为0.4-0.8μM。

所述孵育为4s-6s。

所述检测仪为微量发光检测仪BPLC。

检测时加入不同浓度的结合有荧光素酶的磁珠，分梯度检测酶活。

所述检测酶活时，每120μl Tris-HCl中，加入结合有荧光素酶的磁珠0.35-0.46μl。

本发明还提供了一种用于检测萤火虫荧光素酶活性的试剂盒，包括权利要求1所述的混合液。

本发明中的测定方法在检测荧光素酶的过程中，光信号强度大，持续时间长，有利于荧光素酶的高通量筛选和使用。本发明具有操作简单，时间短，通量大的特点，可大批量筛选荧光素酶，应用于高强度的焦磷酸测序反应。

具体实施方式

实施例1

（1）配制混合液，含有120μl Tris-HCl、3mM MnCl₂、2 mM CaCl₂、1mM萤火虫荧光素、15mM氨基乙酰双甘氨肽、1.2mM磷酸盐、6mM TCEP、2mM DTT和4mM NaHS；

（2）调节pH值至7.5；

（3）预冷混合液至4℃；

（4）取0.35μl结合有荧光素酶的磁珠加入混合液中，磁珠为M280链霉素抗生物素蛋白磁珠，于4℃振荡孵育；

（5）加入0.4μM ATP，振荡2s，迅速置于微量发光检测仪BPLC中，测定荧光信号的强度。

实施例2

（1）配制混合液，含有120μl Tris-HCl、3mM MgCl₂、2 mM CaCl₂、100ng萤火虫荧光素、11mM氨基乙酰双甘氨肽、1.5mM NaHPO₄ ²、3mM TCEP；

（2）调节pH值至7.0；

（3）预冷混合液至4℃；

（4）取0.4μl结合有荧光素酶的磁珠加入混合液中，磁珠为M280链霉素抗生物素蛋白磁珠，振荡5s；

（5）加入0.8μM ATP，振荡4s，迅速置于微量发光检测仪BPLC中，测定荧光信号的强度，再以同样方法分别对结合有荧光素酶的磁珠40nl和4nl进行测定。

实施例3

（1）配制混合液，含有120μl Tris-HCl、1mM MgCl₂、3 mM CaCl₂、90ng萤火虫荧光素、12mM氨基乙酰双甘氨肽、0.5mM KH₂PO₄、1mM Na₂HPO₄、1mM Na₃PO₄、4mM (NH₄)₂S、1mMNaHSO₃；

（2）调节pH值至8.0；

（3）预冷混合液至4℃；

（4）取0.45μl结合有荧光素酶的磁珠加入混合液中，磁珠为M280链霉素抗生物素蛋白磁珠，于4℃振荡孵育5s；

（5）加入0.7μM ATP，振荡5s，迅速置于微量发光检测仪BPLC中，测定荧光信号的强度。

实施例4

（1）配制混合液，含有120μl Tris-HCl、3mM MgCl₂、2mM CaCl₂、80ng萤火虫荧光素、18mM氨基乙酰双甘氨肽、2mM NaH₂PO₄、1mM K₂HPO₄、5mM NH₄HS；

（2）调节pH值至7.6；

（3）预冷混合液至4℃；

（4）取0.46μl结合有荧光素酶的磁珠加入混合液中，磁珠为M280链霉素抗生物素蛋白磁珠，4℃孵育6s；

（5）加入0.6μM ATP，振荡5s，迅速置于微量发光检测仪BPLC中，测定荧光信号的强度。

实施例5

（1）配制混合液，含有120μl Tris-HCl、4mM MgCl₂、0.5mM CaCl₂、80ng萤火虫荧光素、18mM氨基乙酰双甘氨肽、2mM NaH₂PO₄、1mM K₂HPO₄、3mM NH₄HS和2mM Na₂S；

（2）调节pH值至7.8；

（3）预冷混合液至4℃；

（4）取0.4μl结合有荧光素酶的磁珠加入混合液中，磁珠为M280链霉素抗生物素蛋白磁珠，4℃孵育4s；

（5）加入0.55μM ATP，振荡5s，迅速置于微量发光检测仪BPLC中，测定荧光信号的强度，再以同样方法分别对结合有荧光素酶的磁珠40nl和4nl进行测定。

上述详细说明是针对本发明其中之一可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本发明技术方案的范围内。

Claims (10)

1.一种萤火虫荧光素酶活性的测定方法，其特征在于，包括以下步骤：

配制含有ATP、Mn²⁺、Ca²⁺、荧光素、氨基乙酰双甘氨肽和磷酸盐的混合液，该混合液的pH值为7.5-8.0；

调节pH 值；

预冷混合液至4℃；

在混合液中孵育生物素化荧光素酶；

加入ATP，放入检测仪中，测定荧光信号的强度。

2.如权利要求1所述的萤火虫荧光素酶活性的测定方法，其特征在于，所述混合液中还含有Tris-HCl 缓冲液。

3.如权利要求1所述的萤火虫荧光素酶活性的测定方法，其特征在于，所述混合液中还含有温和还原剂，所述温和还原剂为TCEP、DTT、(NH₄)₂S、NH₄HS、Na₂S、NaHS 和NaHSO₃中的一种或几种。

4.如权利要求3所述的萤火虫荧光素酶活性的测定方法，其特征在于，所述温和还原剂为TCEP、DTT 和NaHS，体积比为3:1:2。

5.如权利要求1所述的萤火虫荧光素酶活性的测定方法，其特征在于，所述温和还原剂在60mM 以下。

6.如权利要求1所述的萤火虫荧光素酶活性的测定方法，其特征在于，所述生物素化荧光素酶结合于磁珠上，磁珠为M280 链霉素抗生物素蛋白磁珠。

7.如权利要求1所述的萤火虫荧光素酶活性的测定方法，其特征在于，所述Mg²⁺是由MgCl₂提供的，所述Ca²⁺是由CaCl₂提供的。

8.如权利要求1所述的萤火虫荧光素酶活性的测定方法，其特征在于，所述磷酸盐离子是由H₂PO₄ ^-、HPO₄ ^2-和PO₄ ^3-中的一种或几种提供的。

9.如权利要求8所述的萤火虫荧光素酶活性的测定方法，其特征在于，所述磷酸盐离子是由HPO₄ ^2-提供的。

10.一种用于检测萤火虫荧光素酶活性的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1 所述的混合液。