WO2006095696A1 - アデノシン三リン酸の検出方法及び検出用試薬 - Google Patents

アデノシン三リン酸の検出方法及び検出用試薬 Download PDF

Info

Publication number
WO2006095696A1
WO2006095696A1 PCT/JP2006/304295 JP2006304295W WO2006095696A1 WO 2006095696 A1 WO2006095696 A1 WO 2006095696A1 JP 2006304295 W JP2006304295 W JP 2006304295W WO 2006095696 A1 WO2006095696 A1 WO 2006095696A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
luciferin
polyphosphate
luciferase
atp
kinase
Prior art date
Application number
PCT/JP2006/304295
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Tadahiro Matsuno
Akio Kuroda
Original Assignee
Bussan Nanotech Research Institute, Inc.
National University Of Corporation Hiroshima University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bussan Nanotech Research Institute, Inc., National University Of Corporation Hiroshima University filed Critical Bussan Nanotech Research Institute, Inc.
Publication of WO2006095696A1 publication Critical patent/WO2006095696A1/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/008—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions for determining co-enzymes or co-factors, e.g. NAD, ATP
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
    • C12Q1/485—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase involving kinase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/66—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving luciferase

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting adenosine triphosphate (hereinafter referred to as “ATP”) and a reagent for detection.
  • ATP adenosine triphosphate
  • ATP in microorganisms has been detected by measuring bioluminescence (luminescence based on luciferin luciferase reaction) using ATP present in all living organisms as an indicator. The method to use is now being used.
  • Patent Documents 1 to 3 disclose adding coenzyme A, polyphosphoric acid, sulfhydryl compounds, etc. to a luciferin luciferase reaction system as a technique for enhancing the persistence of bioluminescence 'stability. It has been.
  • Patent Document 4 discloses adenosine monophosphate (hereinafter referred to as “AMP” t), adenylate kinase (hereinafter referred to as “ADK”), polyphosphate and polyphosphate kinase (hereinafter referred to as “PPK”). ) Is mixed with a sample containing soot, and the soot is amplified, then reacted with luciferin and luciferase to generate luminescence, and this amount of luminescence is measured to detect soot. ing.
  • AMP adenosine monophosphate
  • ADK adenylate kinase
  • PPK polyphosphate and polyphosphate kinase
  • Patent Document 1 Japanese Patent No. 3171595
  • Patent Document 2 JP-A-8-47399
  • Patent Document 3 JP 2002-191396 A
  • Patent Document 4 Japanese Patent Laid-Open No. 2001-299390
  • Patent Documents 1 to 3 described above have insufficient soot detection sensitivity.
  • an object of the present invention is to provide an ATP detection method having sufficiently high ATP detection sensitivity and accuracy, and an ATP detection reagent that makes it possible to implement such an ATP detection method.
  • the present invention provides the following ATP detection methods (1) to (3).
  • a sample containing ATP is mixed with polyphosphate, AMP, ADK, PPK, luciferin, luciferase and a divalent metal ion to amplify the soot, and to amplify and emit the luciferin,
  • a luminescence amount measuring step for measuring the amount of light emitted by the luciferin in the amplified luminescence step;
  • the ADK, the PPK, the luciferin, the luciferase, and the divalent metal ion are mixed in the presence of oxygen before being mixed with the sample.
  • An amplification luminescence step in which a sample containing soot is mixed with polyphosphate, AMP, ADK, PPK, luciferin, luciferase, and divalent metal ions to amplify the soot and emit the luciferin;
  • a luminescence amount measuring step for measuring the amount of light emitted by the luciferin in the amplified luminescence step;
  • the soot, the ADK, the PPK, the luciferin, the luciferase, and the divalent metal ion are mixed in the presence of oxygen before being mixed with the sample.
  • An amplification luminescence step in which a sample containing soot is mixed with polyphosphate, AMP, ADK, PPK, luciferin, luciferase, and divalent metal ions to amplify the soot, and to emit the luciferin,
  • a luminescence amount measuring step for measuring the amount of light emitted by the luciferin in the amplified luminescence step;
  • the polyphosphate, the ADK, the PPK, the luciferin, the luciferase, and the divalent metal ion are mixed in the presence of oxygen before being mixed with the sample.
  • ATP detection method characterized in that
  • soot reacts with luciferin, luciferase and divalent metal ions in the presence of oxygen to cause luminescence by luciferin.
  • ADK, PPK, luciferin, luciferase and divalent metal ions, or these substances and AMP or polyphosphate are already mixed before mixing with the sample.
  • the ATP amplification reaction and the luminescence reaction proceed simultaneously, and the operation becomes simple.
  • ATP in the sample is ATP amplified. Since the enzymes (ADK, PPK and luciferase) are already mixed with luciferin and divalent metal ions in the presence of oxygen before being subjected to the luminescence reaction, ATP in the enzyme is oxygen, luciferin, luciferase and It is consumed by reaction with divalent metal ions and converted to AMP.
  • the ATP detection methods (1) and (2) above can detect ATP in a sample with sufficiently high accuracy.
  • polyphosphate is already mixed with ADK, PPK, luciferin, luciferase and divalent metal ions before ATP in the sample is subjected to ATP amplification reaction and luminescence reaction. Therefore, there is no possibility that the wrinkles in the enzyme may be amplified. Most of the wrinkles in the enzyme are consumed before being amplified, so that it does not affect the detection of wrinkles in the sample. Therefore, the wrinkle detection method (3) can detect wrinkles in the sample with sufficiently high accuracy.
  • the amplification light emission step in the soot detection method of (1) above comprises a step of mixing a sample with polyphosphoric acid and AMP, and a mixture of the obtained sample, polyphosphoric acid and AMP in the presence of oxygen, ADK, Mixed with PPK, luciferin, luciferase and divalent metal ions It may be a step and power.
  • the amplification emission step in the ATP detection method of (2) above comprises the steps of mixing the sample with polyphosphoric acid, and mixing the obtained sample and polyphosphoric acid in the presence of oxygen with AMP, ADK, PPK, And a step of mixing with luciferin, luciferase and divalent metal ions.
  • the amplification emission step in the soot detection method of (3) above comprises the steps of mixing the sample with AMP, and the resulting mixture of the sample and AMP in the presence of oxygen with polyphosphate, ADK, PPK, luciferin, And a step of mixing with luciferase and divalent metal ions.
  • the amplified luminescence step in the soot detection method described in (1) to (3) above is performed by mixing the sample with polyphosphate, AMP, ADK, PPK, luciferin, luciferase and divalent metal ions in the presence of oxygen. It ’s the stepping force that makes it happen.
  • ADK and wrinkle form a fusion protein.
  • the amount of ADK and soot can be easily controlled, the stability of the soot amplification reaction is increased, and the reproducibility of the detection results is enhanced.
  • the present invention also provides a soot detection reagent used in the soot detection method of (1) to (3) above. That is, the following (i) to (iii) soot detection reagent is provided.
  • a reagent for detecting sputum characterized by being obtained by mixing ADK, PPK, luciferin, luciferase and divalent metal ions in the presence of oxygen
  • a reagent for detecting sputum which is obtained by mixing AMP, ADK, PPK, luciferin, luciferase and divalent metal ions in the presence of oxygen
  • a reagent for detecting sputum which is obtained by mixing polyphosphate, ADK, PPK, luciferin, luciferase and divalent metal ions in the presence of oxygen
  • reagent (i) By using the reagent (i) together with polyphosphoric acid and AMP, it is possible to perform the ATP detection method (1).
  • the reagent (ii) is used together with polyphosphoric acid, and the reagent (iii) is used together with AMP.
  • ADK and PPK are fusion proteins. I like to have a good quality.
  • an ATP detection method having sufficiently high ATP detection sensitivity and accuracy, and an ATP detection reagent that makes it possible to implement such an ATP detection method.
  • FIG. 1 is a diagram showing an ATP amplification process.
  • FIG. 2 is a graph showing the change over time in the amount of luminescence in Example 1.
  • FIG. 3 is a graph showing the change over time in the amount of luminescence in Example 2.
  • FIG. 4 is a graph showing the change over time in the light emission amount in Example 3.
  • FIG. 5 is a graph showing the change over time in the amount of luminescence in Comparative Example 1.
  • the method for detecting ATP of the present invention comprises the steps of mixing a sample with polyphosphate, AMP, ADK, PPK, luciferin, luciferase and divalent metal ions, and measuring the amount of light emitted by luciferin. Including, before mixing with ADK, PPK, luciferin, luciferase and divalent metal ions, or these substances and AMP or polyphosphate sample, it is already mixed in the presence of oxygen.
  • the ATP detection method of the present invention is the following ATP detection method (1) to (3):
  • a sample containing ATP is mixed with polyphosphate, AMP, ADK, PPK, luciferin, luciferase and a divalent metal ion to amplify the soot, and to amplify and emit the luciferin,
  • a luminescence amount measuring step for measuring the amount of light emitted by the luciferin in the amplified luminescence step;
  • the ADK, the PPK, the luciferin, the luciferase, and the divalent metal ion are mixed in the presence of oxygen before being mixed with the sample.
  • a sample containing soot is added to polyphosphate, AMP, ADK, PPK, luciferin, lucifer.
  • Amplifying and emitting step of amplifying the ATP and emitting the luciferin by mixing with a lyase and a divalent metal ion; and a luminescence measuring step of measuring the amount of light emitted by the luciferin in the amplified and luminescent step The AMP, the ADK, the PPK, the luciferin, the luciferase, and the divalent metal ion are mixed in the presence of oxygen before being mixed with the sample.
  • An amplification luminescence step in which a sample containing soot is mixed with polyphosphate, AMP, ADK, PPK, luciferin, luciferase, and divalent metal ions to amplify the soot, and to emit the luciferin
  • a light emission amount measuring step for measuring the amount of light emitted by the luciferin in the amplification light emission step, wherein the polyphosphate, the ADK, the PPK, the luciferin, the luciferase, and the luciferase And the divalent metal ion is mixed in the presence of oxygen before being mixed with the sample.
  • the mixing of the first step is not necessarily performed in the presence of oxygen, but the mixing of the subsequent step is performed in the presence of oxygen.
  • soot reacts with luciferin, luciferase, and divalent metal ions in the presence of oxygen to cause luminescence by luciferin.
  • a sample containing sputum, ADK, PPK, luciferin, luciferase and divalent metal ions, or these substances and AMP or polyphosphate are mixed at the same time, and ATP amplification Anti Since the reaction and the luminescence reaction proceed simultaneously, the reaction conditions (reaction time, reaction temperature, etc.) need only be controlled once, and the operation becomes simple.
  • ADK, PPK, and luciferase are likely to contain ATP as impurities! /, But in the methods for detecting ATP described in (1) to (3) above, ATP in the sample is ATP. Since the enzymes (ADK, PPK and luciferase) are already mixed with luciferin and divalent metal ions in the presence of oxygen before being subjected to amplification reaction and luminescence reaction, ATP in the enzyme is oxygen, It is consumed by reaction with luciferin, luciferase, and divalent metal ions, and converted to AMP.
  • the polyphosphate necessary for ATP amplification is not mixed with the enzyme before ATP in the sample is subjected to ATP amplification reaction and luminescence reaction. Therefore, ATP in the above enzyme is exclusively consumed as it is amplified. Therefore, the ATP detection methods (1) and (2) above can detect ATP in the sample with sufficiently high accuracy.
  • polyphosphate has already been mixed with ADK, PPK, luciferin, luciferase and divalent metal ions before ATP in the sample is subjected to ATP amplification reaction and luminescence reaction. The ability to amplify soot in the enzyme because it is mixed. Most of the soot in the enzyme is consumed before being amplified, so it does not affect the detection of soot in the sample. Therefore, the wrinkle detection method (3) can detect wrinkles in the sample with sufficiently high accuracy.
  • luciferin and luciferase When mixing the sample with polyphosphate, AMP, ADK, PPK, luciferin, luciferase and divalent metal ions in two steps, one of luciferin and luciferase can be performed only in the subsequent step. Even the first step can be mixed with the sample. When luciferin or luciferase is mixed in the first step, luciferin or luciferase is mixed in both steps. In this case, both luciferin and luciferase are not mixed in the first step! Because of / ⁇ , soot in the sample does not cause luminescence.
  • luciferase when luciferase is mixed in the first step, the power that may be detected in the luciferase is amplified and detected in a later step. Since it is consumed after being consumed, it does not affect the detection of soot in the sample.
  • divalent metal ions are The sample can be mixed with the sample not only in the first step but also in the first step.
  • any mixing in the ATP detection methods (1) to (3) above is preferably performed in a liquid solvent, particularly preferably in a buffer solution.
  • a buffer solution By mixing in a buffer, the pH is maintained within a certain range, and the stability of the ATP detection process and the reproducibility of the detection results are enhanced.
  • the pH of the buffer is preferably 4-9, more preferably 7-8. Mixing in the presence of oxygen should be done in a buffer solution in contact with air.
  • Polyphosphoric acid is a compound represented by the chemical formula (PO _) (n ⁇ 2), and ATP shown in FIG.
  • the number n of phosphate groups contained in polyphosphoric acid is preferably 10 ⁇ n ⁇ 1000, more preferably 10 ⁇ n ⁇ 100.
  • n 10
  • n> 1000 polyphosphate with larger molecules reacts with ADP and PPK.
  • ATP tends not to be sufficiently amplified.
  • polyphosphoric acid reacts with ADP and PPK, and ATP amplification is realized more immediately.
  • a commercially available polyphosphoric acid can be used.
  • Polyphosphoric acid may be present in the form of a salt or hydrate, or may not be present in the form of ions (for example, hydrogen ions are bonded to all or part of PO--).
  • ADK and PPK exist as separate proteins from each other! /, But may be fused to form a single fusion protein, but may form a fusion protein. I like it. If such a fusion protein is used, the amounts of ADK and PPK can be easily controlled, the stability of the ATP amplification reaction is increased, and the reproducibility of the detection results is increased.
  • ADK and PPK those derived from any of animals, plants and microorganisms can be used, but those derived from Escherichia coli are preferred from the viewpoint of ease of preparation of the enzyme.
  • ADK or PPK can be mass-produced in E. coli cells by, for example, incorporating an enzyme gene into an expression vector and introducing it into E. coli according to a known method. Enzymes produced in Escherichia coli cells are used after being disrupted by known methods and then purified by chromatography, electrophoresis, or the like. Purified ADK and PPK can be further treated with avirase to remove ATP and ADP in the enzyme as much as possible. Therefore, it is preferable to use force.
  • ADK and PPK fusion proteins can also be prepared in the same manner as described above except that a fusion gene in which the genes of both enzymes are linked is incorporated into the vector (Akio Kuroda et al., Biosci. Biotechnol. Biochem. , 68 (6), 1216-1220 (2 004)).
  • luciferin and luciferase examples include luciferin and luciferase derived from fireflies (Genji firefly, Heike firefly, American firefly, etc.). As luciferin and luciferase, commercially available products can be used.
  • Examples of the divalent metal ion include Mg 2+ , Ca 2+ , Mn 2+ and the like, with Mg 2+ being preferred.
  • the apparatus used in the ATP detection method of (1) to (3) includes a container for mixing the sample and various substances, and means for measuring the amount of light generated by the mixing. It only has to be a thing.
  • a container for mixing it is preferable to use a microtube, a microplate or a microchannel chip from the viewpoint of increasing the degree of light integration.
  • a luminometer As means for measuring the amount of luminescence, a luminometer, a germanium photodiode, a gallium arsenide photodiode, a phototransistor, a CCD element, or the like can be used.
  • the reagent for detecting ATP of the present invention is one of the following reagents for detecting ATP (i) to (iii).
  • a reagent for detecting sputum which is obtained by mixing ADK, PPK, luciferin, luciferase and divalent metal ions in the presence of oxygen
  • a reagent for detecting sputum which is obtained by mixing AMP, ADK, PPK, luciferin, luciferase and divalent metal ions in the presence of oxygen
  • a reagent for detecting sputum which is obtained by mixing polyphosphate, ADK, PPK, luciferin, luciferase and divalent metal ions in the presence of oxygen [0039]
  • the ATP detection reagents (i) to (iii) can be used in the ATP detection methods (1) to (3).
  • the ATP detection method (1) can be carried out.
  • the reagent (ii) is used with polyphosphoric acid
  • the reagent (iii) is used with AMP
  • the ATP detection methods (2) and (3) are carried out, respectively. enable.
  • the ATP detection reagents (i) to (iii) can also be used in ATP detection methods other than the above (1) to (3). That is, for example, an ATP-containing sample is mixed with polyphosphate, AMP, ADK, PPK, luciferin, luciferase and divalent metal ions to amplify soot, and the mixture obtained in the amplification step In addition, it can be used in a detection method comprising: a luminescence step in which luciferin and luciferase are further mixed to generate luminescence; and a luminescence amount measurement step in which the amount of light emitted in the luminescence step is measured.
  • the mixing (i) to (iii) for obtaining the ATP detection reagent is preferably performed in a liquid solvent in contact with air, particularly in a buffer solution.
  • the pH of the buffer is preferably 4-9, more preferably 7-8.
  • ADK and PPK in the reagents for detecting ATP in (i) to (iii) above exist as separate proteins, they are fused to form a single fusion protein. It is preferable that a fusion protein is formed.
  • Examples of luciferin and luciferase in the ATP detection reagents of (i) to (iii) above include luciferin and luciferase derived from fireflies (Genji firefly, Heike firefly, American firefly, etc.).
  • Solution A (AMP: 4.0 ⁇ 10 _5 M; polyphosphoric acid: 2 mM) prepared by dissolving 65 gma Sodium Phosphate Glass Type 65) in Tris—Mg buffer (pH 7.4) was prepared. Furthermore, a solution (fusion protein: 2.36 mg / mL) (1.7 L) in which fusion protein of ADK and PP K is dissolved in Tris—Mg buffer (pH 7.4) and Lucifer (trademark) manufactured by Kikkoman ) 250 plus (contains luciferin, luciferase and Mg 2+ ) Prepare a solution B mixed with (98.
  • a plate counter was used.
  • Table 1 shows changes over time in the light emission amount in Example 1.
  • FIG. 2 is a graph showing the change over time of the light emission amount in Example 1.
  • ATP 4.0 X 10 " 13 M, 4.0 X 10 _12 M
  • Tris-Mg buffer pH 7.4
  • a solution C AMP: 4. OX 10 _5 M
  • Tris—Mg buffer pH 7.4
  • polyphosphoric acid ((PO “))
  • Tris—Mg buffer pH 74.4 (polyphosphoric acid: 50 mM) (4.6 L) and the fusion protein of ADK and PPK in Tris—Mg buffer liquid (. pH 7 4) was dissolved in a solution (the fusion proteins:. 2 2mg / mL) and (1. 8 L), was mixed with Chicco ten thousand Co. Lucifer (TM) 250 plus (93. 6 L) Solution D was prepared to obtain a solution of soot detection reagent consisting of polyphosphate, ADK, PPK, luciferin, luciferase and divalent metal ions.
  • soot detection reagent consisting of polyphosphate, ADK, PPK, luciferin, luciferase and divalent metal ions.
  • the fusion protein of ADK and ⁇ was prepared according to the method described in the above-mentioned document (Akio Kuroda et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 68 (6), 1216-1220 (2004)).
  • a plate counter was used.
  • Table 2 shows the change over time of the light emission amount in Example 2.
  • FIG. 3 is a graph showing the change over time of the light emission amount in Example 2.
  • ATP solution (ATP: 4. OX 10 " 1 3 M) in which ATP was dissolved in Tris-Mg buffer (pH 7.4) was prepared.
  • AMP and polyphosphate ((P0 3_ )) (Sigma) Sodium Phosph
  • Solution A (AMP: 4.0 ⁇ 10 0 _5 M; polyphosphoric acid: 2 mM) in which ate Glass Type 65) was dissolved in Tris—Mg buffer (pH 7.4 ) was prepared. Furthermore, ADK and PPK fusion protein, luciferin and luciferase (luciferase recombinant produced by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) in Tris—Mg buffer (pH 7.4) solution E (fusion protein: 40 ⁇ g / mL) Luciferin: 2.7 M; luciferase: 0.45 ⁇ g / mL) was prepared to obtain a solution of ADK, PPK, luciferin, luciferase, and a soot detection reagent having a divalent metal ion strength.
  • AD ⁇ and ⁇ fusion proteins were prepared according to the method described in the above literature (Akio Kuroda et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 68
  • solution F ATP: 2.0X10 " 1 1 M, 2.0X10" 10 M, 2.0X10 " 9 M; AMP: 4. OX 10 Type 65
  • Prepared solution G fusion protein: 40 ⁇ g / mL prepared by dissolving ADK and PPK fusion protein in Tris—Mg buffer (pH 7.4)
  • the fusion protein of ADK and PPK was prepared according to the method described in the above literature (Akio Kuroda et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 68 (6), 1216-1220 (2004)).
  • Table 4 shows the change over time of the light emission amount in Comparative Example 1.
  • FIG. 5 is a graph showing the change over time in the amount of emitted light in Comparative Example 1.
  • the ATP detection method of the present invention can be used as a detection method for microorganisms such as bacteria using ATP as an index. It can also be used to measure the activity of enzymes that produce ATP (acetate kinase, etc.). Furthermore, in the production system of glycerin, glucose, creatine, creatinine, etc., the ability to generate ATP at the same time is used to detect these compounds.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

　本発明は、アデノシン三リン酸を含有する試料を、ポリリン酸、アデノシン一リン酸、アデニル酸キナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び２価金属イオンと混合させて、アデノシン三リン酸を増幅させ、ルシフェリンを発光させる増幅発光ステップと、増幅発光ステップにおいてルシフェリンが発した光の量を測定する発光量測定ステップと、を備え、アデニル酸キナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び２価金属イオンが、試料と混合される前に、酸素存在下で混合されている、アデノシン三リン酸の検出方法を提供する。本発明によれば、感度及び精度が十分に高いアデノシン三リン酸の検出方法が提供される。

Description

明 細 書
アデノシン三リン酸の検出方法及び検出用試薬
技術分野
[0001] 本発明は、アデノシン三リン酸 (以下、「ATP」という。）の検出方法及び検出用試薬 に関する。
背景技術
[0002] 近年、細菌等の微生物の検出方法として、すべての生物中に存在する ATPを指標 とし、生物発光 (ルシフェリンールシフェラーゼ反応に基づく発光）を測定することによ つて微生物中の ATPを検出する方法が用いられるようになって 、る。
[0003] 例えば、下記特許文献 1〜3には、生物発光の持続性'安定性を高める技術として 、ルシフェリンールシフェラーゼ反応系にコェンザィム A、ポリリン酸、スルフヒドリル化 合物等を添加することが開示されて 、る。
[0004] また、下記特許文献 4には、アデノシン一リン酸 (以下、「AMP」 t 、う）、アデニル酸 キナーゼ（以下、「ADK」という）、ポリリン酸及びポリリン酸キナーゼ（以下、「PPK」と いう。）を、 ΑΤΡを含む試料と混合させて ΑΤΡを増幅させた後、ルシフェリン及びルシ フェラーゼと反応させて発光を生じさせ、この発光量を測定して ΑΤΡを検出する方法 が開示されている。
特許文献 1 :特許第 3171595号公報
特許文献 2 :特開平 8—47399号公報
特許文献 3：特開 2002— 191396号公報
特許文献 4:特開 2001— 299390号公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0005] しかし、上記特許文献 1〜3に開示された技術では、 ΑΤΡ検出感度が不十分であり
、極微量の ΑΤΡを検出することができない。
[0006] 他方、上記特許文献 4に開示された技術では、 ΑΤΡ検出感度が向上したものの、 反応系中に不純物として混入して 、る ΑΤΡ又はアデノシン二リン酸（以下、「ADP」と いう。）から ATPが生成 '増幅され、目的の ATP以外の ATPもそのまま感度よく検出 されるため、高い精度で目的の ATPを検出することができない。
[0007] そこで、本発明は、 ATPの検出感度及び精度が十分に高い ATPの検出方法、及 びそのような ATPの検出方法の実施を可能にする ATPの検出用試薬を提供するこ とを目的とする。
課題を解決するための手段
[0008] 上記目的を達成するため、本発明は、下記（1)〜（3)の ATPの検出方法を提供す る。
(1) ATPを含有する試料を、ポリリン酸、 AMP、 ADK、 PPK、ルシフェリン、ルシフエ ラーゼ及び 2価金属イオンと混合させて、前記 ΑΤΡを増幅させ、前記ルシフェリンを 発光させる増幅発光ステップと、前記増幅発光ステップにお 、て前記ルシフェリンが 発した光の量を測定する発光量測定ステップと、を備える ΑΤΡの検出方法であって
、前記 ADK、前記 PPK、前記ルシフェリン、前記ルシフェラーゼ及び前記 2価金属ィ オンが、前記試料と混合される前に、酸素存在下で混合されていることを特徴とする ΑΤΡの検出方法
(2) ΑΤΡを含有する試料を、ポリリン酸、 AMP、 ADK、 PPK、ルシフェリン、ルシフエ ラーゼ及び 2価金属イオンと混合させて、前記 ΑΤΡを増幅させ、前記ルシフェリンを 発光させる増幅発光ステップと、前記増幅発光ステップにお 、て前記ルシフェリンが 発した光の量を測定する発光量測定ステップと、を備える ΑΤΡの検出方法であって
、前記 ΑΜΡ、前記 ADK、前記 PPK、前記ルシフェリン、前記ルシフェラーゼ及び前 記 2価金属イオンが、前記試料と混合される前に、酸素存在下で混合されていること を特徴とする ΑΤΡの検出方法
(3) ΑΤΡを含有する試料を、ポリリン酸、 AMP、 ADK、 PPK、ルシフェリン、ルシフエ ラーゼ及び 2価金属イオンと混合させて、前記 ΑΤΡを増幅させ、前記ルシフェリンを 発光させる増幅発光ステップと、前記増幅発光ステップにお 、て前記ルシフェリンが 発した光の量を測定する発光量測定ステップと、を備える ΑΤΡの検出方法であって
、前記ポリリン酸、前記 ADK、前記 PPK、前記ルシフェリン、前記ルシフェラーゼ及 び前記 2価金属イオンが、前記試料と混合される前に、酸素存在下で混合されてい ることを特徴とする ATPの検出方法
[0009] 1分子の ATPは、図 1に示すように、 AMP、 ADK、ポリリン酸及び PPKとの反応に より、 2分子の ΑΤΡに増幅される。従って、上記（1)〜（3)の ΑΤΡ検出方法では、試 料中の ΑΤΡが増幅されることになり、十分に高い ΑΤΡ検出感度が得られる。
[0010] また、 ΑΤΡは、酸素存在下でルシフェリン、ルシフェラーゼ及び 2価金属イオンと反 応して、ルシフェリンによる発光を生じさせる。上記（1)〜（3)の ΑΤΡの検出方法で は、 ADK、 PPK、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び 2価金属イオン、又はこれらの物 質及び AMP若しくはポリリン酸が、試料と混合される前に既に混合されて ヽるため、 ATP増幅反応と発光反応とが同時に進行することになり、操作が簡便になる。
[0011] 更に、 ADK、 PPK及びルシフェラーゼには ATPが不純物として混入している可能 性が高いが、上記（1)〜（3)の ATPの検出方法では、試料中の ATPが ATP増幅反 応及び発光反応に供される前に既に、上記酵素 (ADK、 PPK及びルシフェラーゼ） が酸素存在下でルシフェリン及び 2価金属イオンと混合されているため、上記酵素中 の ATPは酸素、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び 2価金属イオンとの反応により消費 されて AMPに変化している。また、上記（1)及び（2)の ATPの検出方法では、試料 中の ATPが ATP増幅反応及び発光反応に供される前は、 ATP増幅に必要なポリリ ン酸が上記酵素と混合されていないので、上記酵素中の ATPは増幅されることなぐ 専ら消費されている。従って、上記（1)及び（2)の ATPの検出方法では、試料中の A TPを十分に高い精度で検出することができる。また、上記（3)の ATPの検出方法で は、試料中の ATPが ATP増幅反応及び発光反応に供される前に既に、ポリリン酸が ADK、 PPK、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び 2価金属イオンと混合されているた め、上記酵素中の ΑΤΡが増幅する可能性がある力 上記酵素中の ΑΤΡの大半は増 幅される前に消費されるので、試料中の ΑΤΡの検出には影響しない。従って、上記（ 3)の ΑΤΡの検出方法でも、試料中の ΑΤΡを十分に高い精度で検出することができ る。
[0012] 上記（1)の ΑΤΡの検出方法における増幅発光ステップは、試料をポリリン酸及び A MPと混合させるステップと、得られた試料、ポリリン酸及び AMPの混合物を、酸素 存在下で ADK、 PPK、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び 2価金属イオンと混合させ るステップと、力 なるものであってもよい。また、上記（2)の ATPの検出方法におけ る増幅発光ステップは、試料をポリリン酸と混合させるステップと、得られた試料及び ポリリン酸の混合物を、酸素存在下で AMP、 ADK、 PPK、ルシフェリン、ルシフェラ ーゼ及び 2価金属イオンと混合させるステップと、からなるものであってもよい。また、 上記（3)の ΑΤΡの検出方法における増幅発光ステップは、試料を AMPと混合させ るステップと、得られた試料及び AMPの混合物を、酸素存在下でポリリン酸、 ADK、 PPK、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び 2価金属イオンと混合させるステップと、から なるものであってもよい。また、上記（1)〜（3)の ΑΤΡの検出方法における増幅発光 ステップは、試料を、酸素存在下で同時に、ポリリン酸、 AMP、 ADK、 PPK、ルシフ エリン、ルシフェラーゼ及び 2価金属イオンと混合させるステップ力 なるものであって ちょい。
[0013] 上記（1)〜（3)の ΑΤΡの検出方法においては、 ADK及び ΡΡΚは融合タンパク質 を形成していることが好ましい。このような融合タンパク質を用いることによって、 ADK 及び ΡΡΚの量の制御が容易になり、また、 ΑΤΡ増幅反応の安定性が増し、検出結 果の再現性が高くなる。
[0014] 本発明はまた、上記（1)〜（3)の ΑΤΡの検出方法において用いられる ΑΤΡの検出 用試薬を提供する。すなわち、下記 (i)〜(iii)の ΑΤΡの検出用試薬を提供する。
(1) ADK、 PPK、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び 2価金属イオンを酸素存在下で 混合して得られることを特徴とする ΑΤΡの検出用試薬
(ii) AMP, ADK、 PPK、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び 2価金属イオンを酸素存 在下で混合して得られることを特徴とする ΑΤΡの検出用試薬
(iii)ポリリン酸、 ADK、 PPK、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び 2価金属イオンを酸 素存在下で混合して得られることを特徴とする ΑΤΡの検出用試薬
[0015] 上記 (i)の試薬は、ポリリン酸及び AMPとともに用いることによって、上記（1)の AT Pの検出方法の実施を可能にする。上記 (ii)の試薬は、ポリリン酸とともに用いること によって、また、上記 (iii)の試薬は、 AMPとともに用いることによって、それぞれ上記
(2)及び（3)の ATPの検出方法の実施を可能にする。
[0016] 上記（i)〜（iii)の ATPの検出用試薬においては、 ADK及び PPKは融合タンパク 質を形成して ヽることが好ま 、。
発明の効果
[0017] 本発明によれば、 ATPの検出感度及び精度が十分に高い ATPの検出方法、及び そのような ATPの検出方法の実施を可能にする ATPの検出用試薬が提供される。 図面の簡単な説明
[0018] [図 1]ATP増幅過程を示す図である。
[図 2]実施例 1における発光量の経時変化を示すグラフである。
[図 3]実施例 2における発光量の経時変化を示すグラフである。
[図 4]実施例 3における発光量の経時変化を示すグラフである。
[図 5]比較例 1における発光量の経時変化を示すグラフである。
発明を実施するための最良の形態
[0019] 以下、本発明の ATPの検出方法及び検出用試薬の実施形態について説明する。
[0020] (ATPの検出方法）
本発明の ATPの検出方法は、試料を、ポリリン酸、 AMP、 ADK、 PPK、ルシフェリ ン、ルシフェラーゼ及び 2価金属イオンと混合させるステップと、ルシフェリンが発した 光の量を測定するステップと、を含み、 ADK、 PPK、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及 び 2価金属イオン、又はこれらの物質及び AMP若しくはポリリン酸力 試料と混合さ れる前に、既に酸素存在下で混合されていることを特徴とする。
[0021] すなわち、本発明の ATPの検出方法は、下記（1)〜（3)の ATPの検出方法である
(1) ATPを含有する試料を、ポリリン酸、 AMP、 ADK、 PPK、ルシフェリン、ルシフエ ラーゼ及び 2価金属イオンと混合させて、前記 ΑΤΡを増幅させ、前記ルシフェリンを 発光させる増幅発光ステップと、前記増幅発光ステップにお 、て前記ルシフェリンが 発した光の量を測定する発光量測定ステップと、を備える ΑΤΡの検出方法であって
、前記 ADK、前記 PPK、前記ルシフェリン、前記ルシフェラーゼ及び前記 2価金属ィ オンが、前記試料と混合される前に、酸素存在下で混合されていることを特徴とする ΑΤΡの検出方法
(2) ΑΤΡを含有する試料を、ポリリン酸、 AMP、 ADK、 PPK、ルシフェリン、ルシフエ ラーゼ及び 2価金属イオンと混合させて、前記 ATPを増幅させ、前記ルシフェリンを 発光させる増幅発光ステップと、前記増幅発光ステップにお 、て前記ルシフェリンが 発した光の量を測定する発光量測定ステップと、を備える ATPの検出方法であって 、前記 AMP、前記 ADK、前記 PPK、前記ルシフェリン、前記ルシフェラーゼ及び前 記 2価金属イオンが、前記試料と混合される前に、酸素存在下で混合されていること を特徴とする ΑΤΡの検出方法
(3) ΑΤΡを含有する試料を、ポリリン酸、 AMP、 ADK、 PPK、ルシフェリン、ルシフエ ラーゼ及び 2価金属イオンと混合させて、前記 ΑΤΡを増幅させ、前記ルシフェリンを 発光させる増幅発光ステップと、前記増幅発光ステップにお 、て前記ルシフェリンが 発した光の量を測定する発光量測定ステップと、を備える ΑΤΡの検出方法であって 、前記ポリリン酸、前記 ADK、前記 PPK、前記ルシフェリン、前記ルシフェラーゼ及 び前記 2価金属イオンが、前記試料と混合される前に、酸素存在下で混合されてい ることを特徴とする ΑΤΡの検出方法
[0022] 上記（1)〜（3)の ΑΤΡの検出方法では、試料と、ポリリン酸、 AMP、 ADK、 PPK、 ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び 2価金属イオンとの混合は、二ステップに分けて、 まず、ポリリン酸及び ΑΜΡ、又はポリリン酸のみ、若しくは AMPのみを試料と混合さ せ、次に、その混合物と残りの物質とを混合させても、また、一ステップで試料とすべ ての物質とを混合させてもょ 、。
[0023] 一ステップで試料とすべての物質とを混合させる場合、混合は酸素存在下で行う。
二ステップに分ける場合は、初めのステップの混合は必ずしも酸素存在下で行わなく てもよ 、が、後のステップの混合は酸素存在下で行う。
[0024] 1分子の ATPは、図 1〖こ示すよう〖こ、 AMP、 ADK、ポリリン酸及び PPKとの反応に より、 2分子の ΑΤΡに増幅される。従って、上記（1)〜（3)の ΑΤΡの検出方法では、 試料中の ΑΤΡが増幅されることになり、十分に高い ΑΤΡ検出感度が得られる。
[0025] また、 ΑΤΡは、酸素存在下でルシフェリン、ルシフェラーゼ及び 2価金属イオンと反 応して、ルシフェリンによる発光を生じさせる。上記（1)〜（3)の ΑΤΡ検出方法では、 ΑΤΡを含む試料と、 ADK、 PPK、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び 2価金属イオン 、又はこれらの物質及び AMP若しくはポリリン酸とが同時に混合され、 ATP増幅反 応と発光反応とが同時に進行するため、反応条件 (反応時間、反応温度等)の制御 は一回で済み、操作が簡便になる。
[0026] 更に、 ADK、 PPK及びルシフェラーゼには ATPが不純物として混入して!/、る可能 性が高いが、上記（1)〜（3)の ATPの検出方法では、試料中の ATPが ATP増幅反 応及び発光反応に供される前に既に、上記酵素 (ADK、 PPK及びルシフェラーゼ） が酸素存在下でルシフェリン及び 2価金属イオンと混合されているため、上記酵素中 の ATPは、酸素、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び 2価金属イオンとの反応により消 費されて、 AMPに変化している。また、上記（1)及び（2)の ATPの検出方法では、 試料中の ATPが ATP増幅反応及び発光反応に供される前は、 ATP増幅に必要な ポリリン酸が上記酵素と混合されていないので、上記酵素中の ATPは、増幅されるこ となぐ専ら消費されている。従って、上記（1)及び（2)の ATPの検出方法では、試 料中の ATPを十分に高い精度で検出することができる。また、上記（3)の ATPの検 出方法では、試料中の ATPが ATP増幅反応及び発光反応に供される前に既に、ポ リリン酸が ADK、 PPK、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び 2価金属イオンと混合され ているため、上記酵素中の ΑΤΡが増幅する可能性がある力 上記酵素中の ΑΤΡの 大半は増幅される前に消費されるので、試料中の ΑΤΡの検出には影響しない。従つ て、上記（3)の ΑΤΡの検出方法でも、試料中の ΑΤΡを十分に高い精度で検出する ことができる。
[0027] 試料と、ポリリン酸、 AMP、 ADK、 PPK、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び 2価金 属イオンとの混合を二ステップに分ける場合は、ルシフェリン及びルシフェラーゼの ヽ ずれか一方は、後のステップだけでなぐ初めのステップでも試料と混合させることが できる。初めのステップでルシフェリン又はルシフェラーゼを混合させる場合は、両ス テツプでルシフェリン又はルシフェラーゼが混合されることになる。この場合、初めの ステップでは、ルシフェリン及びルシフェラーゼの両方が混合されるわけではな！/ヽの で、試料中の ΑΤΡが発光を生じさせることはない。なお、初めのステップでルシフェラ ーゼが混合される場合は、ルシフェラーゼ中に混入して ヽる ΑΤΡが後のステップで 増幅されて検出される可能性がある力 大半は増幅される前に発光反応に供されて 消費されるので、試料中の ΑΤΡの検出には影響しない。また、 2価金属イオンは、後 のステップだけでなく、初めのステップでも試料と混合させることができる。
[0028] 上記（1)〜（3)の ATPの検出方法におけるいずれの混合も、液体溶媒中で行うの が好ましぐ特に緩衝液中で行うのが好ましい。混合を緩衝液中で行うことによって、 pHが一定範囲に維持され、 ATP検出過程の安定性、及び検出結果の再現性が高 まる。緩衝液の pHは好ましくは 4〜9であり、更に好ましくは 7〜8である。酸素存在下 で行う混合は、空気に接した緩衝液中で行えばょ ヽ。
[0029] ポリリン酸は化学式 (PO _) (n≥ 2)で表される化合物であり、図 1に示された ATP
3 n
増幅反応のサイクルにおいて、連続的に ADPにリン酸基を供与して ATPを生成する 役割を果たす。ポリリン酸に含まれるリン酸基の数 nは、好ましくは 10≤n≤1000で あり、より好ましくは 10≤n≤100である。 nく 10の場合は、リン酸基の数が少なぐリ ン酸基が連続的に供与されにくいため、他方、 n> 1000の場合は、分子が大きぐポ リリン酸が ADP及び PPKと反応しにくいため、 ATPが十分に増幅されない傾向があ る。 10≤n≤100の場合は、ポリリン酸が ADP及び PPKと反応しやすぐ ATPの増 幅がより確実に実現される。ポリリン酸は、市販のものを用いることができる。なお、ポ リリン酸は、塩又は水和物の形態で存在していてもよぐまた、イオンの形態で存在し ていなくてもよい (例えば、全部又は一部の PO—に水素イオンが結合した状態で存
3
在していてもよい）。
[0030] ADK及び PPKは、互いに別個のタンパク質として存在して!/、ても、融合して一個 の融合タンパク質を形成して 、てもよ 、が、融合タンパク質を形成して 、ることが好ま しい。このような融合タンパク質を用いれば、 ADK及び PPKの量を制御しやすくなり 、また、 ATP増幅反応の安定性が増し、検出結果の再現性が高くなる。
[0031] ADK及び PPKとしては、動物、植物及び微生物のいずれに由来するものも用いる ことができるが、酵素の調製の簡便さの点で、大腸菌由来のものが好適である。 AD K又は PPKは、例えば、公知の方法に従って、酵素の遺伝子を発現ベクターに組み 込み、これを大腸菌に導入することにより、大腸菌の菌体内で大量生産させることが できる。大腸菌の菌体内で生産された酵素は、公知の方法に従って菌体を破壊した 後、クロマトグラフィー、電気泳動等により精製して用いる。精製した ADK及び PPK は、更にアビラーゼで処理することにより酵素中の ATP及び ADPをできるだけ除去 して力も用いるのが好ましい。 ADK及び PPKの融合タンパク質も、両酵素の遺伝子 を連結させた融合遺伝子をベクターに組み込む点を除けば、上記と同様の方法で調 製することができる（黒田章夫ら、 Biosci. Biotechnol. Biochem., 68(6), 1216-1220 (2 004)参照)。
[0032] ルシフェリン及びルシフェラーゼとしては、ホタル（ゲンジボタル、ヘイケボタル、ァメ リカホタル等）に由来するルシフェリン及びルシフェラーゼが挙げられる。ルシフェリン 及びルシフェラーゼは、巿販のものを用いることができる。
[0033] また、 2価金属イオンとしては、 Mg2+、 Ca2+、 Mn2+等が挙げられるが、 Mg2+が好 ましい。
[0034] 上記（1)〜（3)の ATPの検出方法において用いる装置は、試料と各種物質との混 合を行うための容器と、混合によって生じた光の量を測定する手段とを備えるもので あればよい。
[0035] 混合のための容器としては、光の集積度を高める観点から、マイクロチューブ、マイ クロプレート又はマイクロチャネルチップを用いることが好まし 、。
[0036] 発光量を測定する手段としては、ルミノメーター、ゲルマニウムフォトダイオード、ガリ ゥムヒ素フォトダイオード、フォトトランジスタ、 CCD素子等を用いることができる。
[0037] 上記（1)〜（3)の ATPの検出方法を用いて試料中の ATPを定量する場合は、各 種の ATP濃度の標準溶液について、用いる検出方法と同様の操作を行って発光量 の経時変化を求めておき、これと、試料について求めた発光量の経時変化とを比較 すればよい。
[0038] (ATPの検出用試薬）
本発明の ATPの検出用試薬は、下記 (i)〜 (iii)の ATPの検出用試薬である。
(i) ADK、 PPK、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び 2価金属イオンを酸素存在下で 混合して得られることを特徴とする ΑΤΡの検出用試薬
(ii) AMP, ADK、 PPK、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び 2価金属イオンを酸素存 在下で混合して得られることを特徴とする ΑΤΡの検出用試薬
(iii)ポリリン酸、 ADK、 PPK、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び 2価金属イオンを酸 素存在下で混合して得られることを特徴とする ΑΤΡの検出用試薬 [0039] 上記 (i)〜(iii)の ATPの検出用試薬は、上記（1)〜（3)の ATPの検出方法におい て用いることができる。上記 (i)の試薬は、ポリリン酸及び AMPとともに用いることによ つて、上記（1)の ATPの検出方法の実施を可能にする。上記 (ii)の試薬は、ポリリン 酸とともに用いることによって、また、上記 (iii)の試薬は、 AMPとともに用いることによ つて、それぞれ上記（2)及び（3)の ATPの検出方法の実施を可能にする。
[0040] また、上記 (i)〜 (iii)の ATPの検出用試薬は、上記（1)〜（3)以外の ATPの検出 方法においても用いることができる。すなわち、例えば、 ATPを含有する試料を、ポリ リン酸、 AMP、 ADK、 PPK、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び 2価金属イオンと混 合させて、 ΑΤΡを増幅させる増幅ステップと、増幅ステップで得られた混合物に、更 にルシフェリン及びルシフェラーゼを混合させて、発光を生じさせる発光ステップと、 発光ステップで発せられた光の量を測定する発光量測定ステップと、を備える ΑΤΡ の検出方法において用いることができる。具体的には、上記増幅ステップにおいて試 料と混合させるポリリン酸、 AMP、 ADK、 PPK、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び 2 価金属イオンの一部として、上記 (i)〜（iii)の 、ずれかの ATPの検出用試薬を用い ることがでさる。
[0041] 上記 (i)〜 (iii)の ATPの検出用試薬を得るために行う混合は、大気に接した液体 溶媒中、特に緩衝液中で行うのが好ましい。緩衝液の pHは好ましくは 4〜9であり、 更に好ましくは 7〜8である。
[0042] 上記（i)〜（iii)の ATPの検出用試薬における ADK及び PPKは、互いに別個のタ ンパク質として存在して 、ても、融合して一個の融合タンパク質を形成して 、てもよ ヽ 力 融合タンパク質を形成していることが好ましい。
[0043] また、上記 (i)〜（iii)の ATPの検出用試薬におけるルシフェリン及びルシフェラー ゼとしては、ホタル（ゲンジボタル、ヘイケボタル、アメリカホタル等）に由来するルシフ エリン及びルシフェラーゼが挙げられる。
[0044] また、上記 (i)〜（iii)の ATPの検出用試薬における 2価金属イオンとしては、 Mg2+
、 Ca2+、 Mn2+等が挙げられるが、 Mg2+が好ましい。
実施例
[0045] 以下、本発明の実施例及び比較例を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定 されるものではない。
[0046] (実施例 1)
まず、 ATPを Tris— Mg緩衝液（pH7. 4)に溶解した 2種の ATP溶液 (ATP :4. 0 X 10"13M, 4. O X 10_12M)を調製した。また、 AMP及びポリリン酸（（PO ") ) (Si
3 65 gma社製 Sodium Phosphate Glass Type 65)を Tris— Mg緩衝液（pH7. 4)に溶解し た溶液 A(AMP :4. 0 X 10_5M ;ポリリン酸： 2mM)を調製した。更に、 ADK及び PP Kの融合タンパク質を Tris— Mg緩衝液 (pH7. 4)に溶解した溶液 (融合タンパク質： 2. 36mg/mL) (1. 7 L)と、キッコ一マン社製ルシフェール（商標） 250プラス（ル シフェリン、ルシフェラーゼ及び Mg2+を含有する。 ) (98. 3 L)とを混合した溶液 B を調製して、 ADK、 PPK、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び 2価金属イオンからなる ΑΤΡの検出用試薬の溶液を得た。 ADK及び ΡΡΚの融合タンパク質は、前記文献（ 黒田章夫ら、 Biosci. Biotechnol. Biochem., 68(6), 1216-1220 (2004))に記載の方法 に従って調製した。
[0047] 次に、 96穴マイクロプレートのゥエル中で 2種の ATP溶液 (ATP : 4. 0 X 10"13M, 4. 0 X 10"12M) (各 50 /z L)に溶液 A (50 /z L)を混合させた後、更に溶液 B (100 L)を混合させて、発光量 (CPSZ10)を経時的に測定した。また、 ATPを含まない T ris— Mg緩衝液 (pH7. 4)をコントロールとし、これについても同様の操作を行った。 発光量の測定には、 Perkin- Elmer社製 Wallac 1420 ARVO マルチラベルマイクロ
MX
プレートカウンターを用いた。
[0048] 表 1は、実施例 1における発光量の経時変化を示す。また、図 2は、実施例 1におけ る発光量の経時変化を示すグラフである。
[0049] [表 1]
Figure imgf000012_0001
表 1及び図 2から明らかなように、 ATP溶液及びコントロールのいずれについても、 反応開始後 4〜5分までは、計測器のダークカウントとの判別が困難なほど低い発光 量しか測定されな力つたが、やがて時間の経過とともに、発光量が等比級数的に増 カロし始めた。また、発光量及びその増加量は ATP量 (ATP濃度）に依存していた。 反応開始後 10分の時点では、 ATPの初期濃度が 4. O X 10_13Mの場合でも、発光 量は十分に大きぐかつ、コントロールとの差異も十分に大き力つた。
[0051] (実施例 2)
まず、 ATPを Tris— Mg緩衝液（pH7. 4)に溶解した 2種の ATP溶液 (ATP :4. 0 X 10"13M, 4. 0 X 10_12M)を調製した。また、 AMPを Tris— Mg緩衝液（pH7. 4) に溶解した溶液 C (AMP :4. O X 10_5M)を調製した。更に、ポリリン酸（（PO ") )
3 65
(Sigma社製 Sodium Phosphate Glass Type 65)を Tris— Mg緩衝液（pH7. 4)に溶解 した溶液（ポリリン酸： 50mM) (4. 6 L)と、 ADK及び PPKの融合タンパク質を Tris — Mg緩衝液 (pH7. 4)に溶解した溶液 (融合タンパク質：2. 2mg/mL) (1. 8 L) と、キッコ一マン社製ルシフェール（商標） 250プラス（93. 6 L)とを混合した溶液 D を調製して、ポリリン酸、 ADK、 PPK、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び 2価金属ィ オンからなる ΑΤΡの検出用試薬の溶液を得た。 ADK及び ΡΡΚの融合タンパク質は 、前記文献（黒田章夫ら、 Biosci. Biotechnol. Biochem., 68(6), 1216-1220 (2004))に 記載の方法に従って調製した。
[0052] 次に、 96穴マイクロプレートのゥエル中で 2種の ATP溶液 (ATP : 4. 0 X 10"13M, 4. 0 X 10"12M) (各 50 /z L)に溶液 C (50 /z L)を混合させた後、更に溶液 D (100 L)を混合させて、発光量 (CPSZ10)を経時的に測定した。また、 ATPを含まない T ris— Mg緩衝液 (pH7. 4)をコントロールとし、これについても同様の操作を行った。 発光量の測定には、 Perkin- Elmer社製 Wallac 1420 ARVO マルチラベルマイクロ
MX
プレートカウンターを用いた。
[0053] 表 2は、実施例 2における発光量の経時変化を示す。また、図 3は、実施例 2におけ る発光量の経時変化を示すグラフである。
[0054] [表 2] 時間 (分） 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 コントロール 18 39 93 230 431 945 1907 3761 7354 13612 24023
ΑΤΡ : 4·0 Χ 10— '3Μ 18 62 162 326 654 1364 2753 5444 10782 20319 36762
ATP : 4.0 X 10",2M 33 151 338 777 1623 3294 7013 13805 26251 45772 72502
[0055] 表 1及び図 2から明らかなように、 ATP溶液及びコントロールのいずれについても、 反応開始後 4〜5分までは、計測器のダークカウントとの判別が困難なほど低い発光 量しか測定されな力つたが、やがて時間の経過とともに、発光量が等比級数的に増 カロし始めた。また、発光量及びその増加量は ATP量 (ATP濃度）に依存していた。 反応開始後 10分の時点では、 ATPの初期濃度が 4. O X 10_13Mの場合でも、発光 量は十分に大きぐかつ、コントロールとの差異も十分に大き力つた。
[0056] (実施例 3)
まず、 ATPを Tris— Mg緩衝液 (pH7. 4)に溶解した ATP溶液 (ATP :4. O X 10"1 3M)を調製した。また、 AMP及びポリリン酸（（P03_) ) (Sigma社製 Sodium Phosph
65
ate Glass Type 65)を Tris— Mg緩衝液（pH7. 4)に溶解した溶液 A (AMP :4. 0 X 1 0_5M ;ポリリン酸： 2mM)を調製した。更に、 ADK及び PPKの融合タンパク質、ルシ フェリン及びルシフェラーゼ (和光純薬工業社製ルシフェラーゼ組換え体)を Tris— Mg緩衝液 (pH7. 4)に溶解した溶液 E (融合タンパク質： 40 μ g/mL；ルシフェリン ： 2. 7 M ;ルシフェラーゼ： 0. 45 μ g/mL)を調製して、 ADK、 PPK、ルシフェリン 、ルシフェラーゼ及び 2価金属イオン力もなる ΑΤΡの検出用試薬の溶液を得た。 AD Κ及び ΡΡΚの融合タンパク質は、前記文献（黒田章夫ら、 Biosci. Biotechnol. Bioche m.， 68(6), 1216-1220 (2004))に記載の方法に従って調製した。
[0057] 次に、エツペンチューブ中で ATP溶液 (ATP :4. 0 X 10"13M) (100 μ L)に溶液 A (100 L)を混合させた後、更に溶液 E (200 μ L)を混合させた。 ΑΤΡ溶液と溶液 Αとの混合液に溶液 Εを混合させてから一分毎に、 10 Lの混合液をルミチューブに 取り、これにキッコ一マン社製ルシフェール（商標） 250プラス（50 L)を更に混合さ せて、その発光量 (RLU)を測定した。また、 ATPを含まない Tris— Mg緩衝液 (pH7 . 4)をコントロールとし、これについても同様の操作を行った。発光量の測定には、キ ッコーマン社製ルミテスタ C 1000を用いた。 [0058] 表 3は、実施例 3における発光量の経時変化を示す。また、図 4は、実施例 3におけ る発光量の経時変化を示すグラフである。
[0059] [表 3]
Figure imgf000015_0001
[0060] 表 3及び図 4から明らかなように、 ATP溶液及びコントロールのいずれについても、 反応開始後 2分までは、計測器のダークカウントとの判別が困難なほど低い発光量し か測定されな力つた力 やがて時間の経過とともに、発光量が等比級数的に増加し 始めた。また、発光量及びその増加量は ATP量 (ATP濃度）に依存していた。反応 開始後 6分の時点では、 ATPの初期濃度が 4. OX 10_13Mの場合でも、発光量は 十分に大きぐかつ、コントロールとの差異も十分に大き力つた。
[0061] (比較例 1)
まず、 ATPゝ AMP及びポリリン酸（（PO ") ) (Sigma社製 Sodium Phosphate Glass
3 65
Type 65)を Tris— Mg緩衝液（pH7.4)に溶解した 3種の溶液 F (ATP: 2.0X10"1 1M, 2.0X10"10M, 2.0X10"9M;AMP:4. OX 10_5M;ポリリン酸： 2mM)を調 製した。また、 ADK及び PPKの融合タンパク質を Tris— Mg緩衝液（pH7.4)に溶 解した溶液 G (融合タンパク質： 40 μ g/mL)を調製した。 ADK及び PPKの融合タ ンパク質は、前記文献（黒田章夫ら、 Biosci. Biotechnol. Biochem., 68(6), 1216-1220 (2004))に記載の方法に従って調製した。
[0062] 次に、エツペンチューブ中で 3種の溶液 F(ATP: 2.0X10" M, 2.0X10_1°M , 2.0Χ10"9Μ) (各 100 L)に溶液 G (100 L)を混合させた後、一定時間ごとに 溶液 F及び Gの混合溶液 10 Lをルミチューブに取り、キッコ一マン社製ルシフエ一 ル (商標） 250プラス (50 μ L)を更に混合させて、発光量 (RLU)を経時的に測定し た。また、 AMP及びポリリン酸（（PO ") ) (Sigma社製 Sodium Phosphate Glass Typ
3 65
e 65)を Tris— Mg緩衝液（pH7.4)に溶解した溶液 (AMP :4.0X10_5M;ポリリン 酸： 2mM)をコントロールとし、これについても同様の操作を行った。発光量の測定に は、キッコ一マン社製ルミテスター C— 1000を用いた。
[0063] 表 4は、比較例 1における発光量の経時変化を示す。図 5は、比較例 1における発 光量の経時変化を示すグラフである。
[0064] [表 4]
Figure imgf000016_0001
[0065] 表 4及び図 5から明らかなように、実施例 1〜3と同様に、発光量及びその増加量は ATP量 (ATP濃度）に依存して 、た。
[0066] しかし、実施例 1及び 2の結果 (特に、 ATPの初期濃度が 4. O X 10_ 12Mの場合に おける反応開始後 10分の発光量)と、比較例 1の結果 (特に、 ATPの初期濃度が 2. O X 10_12Mの場合における反応開始後 10分の発光量）とを比較すると、実施例 1及 び 2の方が明らかに、発光量が大きぐかつ、コントロールとの差異も大きいことが分 かる。また、実施例 3の結果 (特に、 ATPの初期濃度が 4. O X 10_13Mの場合におけ る反応開始後 6分の発光量）と、比較例 1の結果 (特に、 ATPの初期濃度が 2. 0 X 1 0_ 12Mの場合における反応開始後 10分の発光量）とを比較すると、実施例 3の方が 明らかに、発光量が大きぐかつ、コントロールとの差異も大きいことが分かる。
[0067] 実施例 1〜3及び比較例 1により、本発明の ATPの検出方法又は検出用試薬を用 いれば、極微量の ATPであっても、十分に高い感度及び精度で検出することができ ることが示された。
産業上の利用可能性
[0068] 本発明の ATPの検出方法は、 ATPを指標とした細菌等の微生物の検出方法とし て利用することができる。また、 ATPを産生する酵素（アセテートカイネース等）の活 性の測定に利用することもできる。更に、グリセリン、グルコース、クレアチン、クレアチ ニン等の生成系では ATPを同時に生じる力 これらの化合物の検出に利用すること ちでさる。

Claims

請求の範囲
[1] アデノシン三リン酸を含有する試料を、ポリリン酸、アデノシン一リン酸、アデニル酸 キナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び 2価金属イオンと混 合させて、前記アデノシン三リン酸を増幅させ、前記ルシフヱリンを発光させる増幅発 光ステップと、
前記増幅発光ステップにおいて前記ルシフヱリンが発した光の量を測定する発光 量測定ステップと、を備えるアデノシン三リン酸の検出方法であって、
前記アデニル酸キナーゼ、前記ポリリン酸キナーゼ、前記ルシフェリン、前記ルシフ エラーゼ及び前記 2価金属イオンが、前記試料と混合される前に、酸素存在下で混 合されていることを特徴とするアデノシン三リン酸の検出方法。
[2] アデノシン三リン酸を含有する試料を、ポリリン酸、アデノシン一リン酸、アデニル酸 キナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び 2価金属イオンと混 合させて、前記アデノシン三リン酸を増幅させ、前記ルシフヱリンを発光させる増幅発 光ステップと、
前記増幅発光ステップにおいて前記ルシフヱリンが発した光の量を測定する発光 量測定ステップと、を備えるアデノシン三リン酸の検出方法であって、
前記アデノシン一リン酸、前記アデニル酸キナーゼ、前記ポリリン酸キナーゼ、前記 ルシフェリン、前記ルシフェラーゼ及び前記 2価金属イオンが、前記試料と混合される 前に、酸素存在下で混合されていることを特徴とするアデノシン三リン酸の検出方法
[3] アデノシン三リン酸を含有する試料を、ポリリン酸、アデノシン一リン酸、アデニル酸 キナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び 2価金属イオンと混 合させて、前記アデノシン三リン酸を増幅させ、前記ルシフヱリンを発光させる増幅発 光ステップと、
前記増幅発光ステップにおいて前記ルシフヱリンが発した光の量を測定する発光 量測定ステップと、を備えるアデノシン三リン酸の検出方法であって、
前記ポリリン酸、前記アデニル酸キナーゼ、前記ポリリン酸キナーゼ、前記ルシフエ リン、前記ルシフェラーゼ及び前記 2価金属イオンが、前記試料と混合される前に、 酸素存在下で混合されていることを特徴とするアデノシン三リン酸の検出方法。
[4] 前記増幅発光ステップが、
前記試料を前記ポリリン酸及び前記アデノシン一リン酸と混合させるステップと、 得られた前記試料、前記ポリリン酸及び前記アデノシン一リン酸の混合物を、酸素 存在下で前記アデニル酸キナーゼ、前記ポリリン酸キナーゼ、前記ルシフェリン、前 記ルシフェラーゼ及び前記 2価金属イオンと混合させるステップと、
力もなることを特徴とする、請求項 1に記載のアデノシン三リン酸の検出方法。
[5] 前記増幅発光ステップが、
前記試料を前記ポリリン酸と混合させるステップと、
得られた前記試料及び前記ポリリン酸の混合物を、酸素存在下で前記アデノシン 一リン酸、前記アデニル酸キナーゼ、前記ポリリン酸キナーゼ、前記ルシフェリン、前 記ルシフェラーゼ及び前記 2価金属イオンと混合させるステップと、
力もなることを特徴とする、請求項 2に記載のアデノシン三リン酸の検出方法。
[6] 前記増幅発光ステップが、
前記試料を前記アデノシン一リン酸と混合させるステップと、
得られた前記試料及び前記アデノシン一リン酸の混合物を、酸素存在下で前記ポ リリン酸、前記アデニル酸キナーゼ、前記ポリリン酸キナーゼ、前記ルシフェリン、前 記ルシフェラーゼ及び前記 2価金属イオンと混合させるステップと、
力もなることを特徴とする、請求項 3に記載のアデノシン三リン酸の検出方法。
[7] 前記増幅発光ステップが、前記試料を、酸素存在下で同時に、前記ポリリン酸、前 記アデノシン一リン酸、前記アデニル酸キナーゼ、前記ポリリン酸キナーゼ、前記ル シフェリン、前記ルシフェラーゼ及び前記 2価金属イオンと混合させるステップ力 な ることを特徴とする、請求項 1〜3のいずれか一項に記載のアデノシン三リン酸の検 出方法。
[8] 前記アデ-ル酸キナーゼ及び前記ポリリン酸キナーゼが融合タンパク質を形成して いることを特徴とする、請求項 1〜7のいずれか一項に記載のアデノシン三リン酸の 検出方法。
[9] アデニル酸キナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び 2価金 属イオンを酸素存在下で混合して得られることを特徴とするアデノシン三リン酸の検 出用試薬。
[10] アデノシン一リン酸、アデニル酸キナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、ルシフェリン、ルシ フェラーゼ及び 2価金属イオンを酸素存在下で混合して得られることを特徴とするァ デノシン三リン酸の検出用試薬。
[11] ポリリン酸、アデニル酸キナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、ルシフェリン、ルシフェラー ゼ及び 2価金属イオンを酸素存在下で混合して得られることを特徴とするアデノシン 三リン酸の検出用試薬。
[12] 前記アデ-ル酸キナーゼ及び前記ポリリン酸キナーゼが融合タンパク質を形成して
V、ることを特徴とする、請求項 9〜： L 1の 、ずれか一項に記載のアデノシン三リン酸の 検出用試薬。
PCT/JP2006/304295 2005-03-10 2006-03-06 アデノシン三リン酸の検出方法及び検出用試薬 WO2006095696A1 (ja)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2005-068177 2005-03-10
JP2005068177 2005-03-10
JP2005-288995 2005-09-30
JP2005288995A JP2006280365A (ja) 2005-03-10 2005-09-30 アデノシン三リン酸の検出方法及び検出用試薬

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2006095696A1 true WO2006095696A1 (ja) 2006-09-14

Family

ID=36953290

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2006/304295 WO2006095696A1 (ja) 2005-03-10 2006-03-06 アデノシン三リン酸の検出方法及び検出用試薬

Country Status (2)

Country Link
JP (1) JP2006280365A (ja)
WO (1) WO2006095696A1 (ja)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6932638B2 (ja) * 2015-06-30 2021-09-08 キッコーマンバイオケミファ株式会社 Ａｔｐ測定におけるａｔｐ分解活性の低減方法
CN110603331A (zh) * 2017-05-01 2019-12-20 株式会社钟化 利用了atp的物质的制造方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS535752B2 (ja) * 1972-02-07 1978-03-01
WO1998048031A1 (fr) * 1997-04-18 1998-10-29 Yamasa Corporation Procede de production d'adenosine 5'-triphosphate et utilisation de ladite substance
JP2001211900A (ja) * 2000-02-07 2001-08-07 Satake Corp 生物発光によるアデニンヌクレオチドの検査方法
JP2001269200A (ja) * 2000-01-17 2001-10-02 Satake Corp 生物発光によるアデニンヌクレオチドの検査方法
JP2001299390A (ja) * 2000-04-20 2001-10-30 Satake Corp Ａｔｐを連鎖的に増幅させる方法及び該方法を利用して極微量のａｔｐを検査する方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2000189197A (ja) * 1998-12-25 2000-07-11 Kikkoman Corp Ａｔｐ消去剤、ａｔｐ消去法および細胞内ａｔｐの測定法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS535752B2 (ja) * 1972-02-07 1978-03-01
WO1998048031A1 (fr) * 1997-04-18 1998-10-29 Yamasa Corporation Procede de production d'adenosine 5'-triphosphate et utilisation de ladite substance
JP2001269200A (ja) * 2000-01-17 2001-10-02 Satake Corp 生物発光によるアデニンヌクレオチドの検査方法
JP2001211900A (ja) * 2000-02-07 2001-08-07 Satake Corp 生物発光によるアデニンヌクレオチドの検査方法
JP2001299390A (ja) * 2000-04-20 2001-10-30 Satake Corp Ａｔｐを連鎖的に増幅させる方法及び該方法を利用して極微量のａｔｐを検査する方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ISHIGE K. ET AL.: "Inorganic polyphosphate kinase and adenylate kinase participate in the polyphosphate:AMP phosphotransferase activity of Escherichia coli", PROC. NATL. ACAD. SCI. U.S.A., vol. 97, no. 26, 19 December 2000 (2000-12-19), pages 14168 - 14171, XP002347702 *
SATOH T. ET AL.: "ATP amplification for ultrasensitive bioluminescence assay: detection of a single bacterial cell", BIOSCI. BIOTECHNOL. BIOCHEM., vol. 68, no. 6, June 2004 (2004-06-01), pages 1216 - 1220, XP003000031 *
SHIMOMURA K. ET AL.: "Rensateki ATP Zofuku Hanno ni yoru Biryo ATP no Kenshutsu Gijutsu kaihatsu", PREPRINTS OF SCEJ ANNUAL MEETING, vol. 66, 2 March 2001 (2001-03-02), pages 647, XP002985325 *

Also Published As

Publication number Publication date
JP2006280365A (ja) 2006-10-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2211167B1 (en) Method and kit for measurement of endotoxin level
KR101396691B1 (ko) 루시페라제 검출을 개선시키기 위한 암모늄 및 포스페이트이온의 용도
EP3303613B1 (en) Method to detect activity of a polymerase
JP4901005B2 (ja) 細胞アッセイ、方法及び試薬
US20070166729A1 (en) Method and reagent for sequencing
Kawasaki et al. Determination of inorganic phosphate by flow injection method with immobilized enzymes and chemiluminescence detection
Ou et al. Terminal protection of small-molecule-linked DNA for sensitive fluorescence detection of protein binding based on nucleic acid amplification
US10689698B2 (en) Electrochemical detection of polymerase reactions by specific metal-phosphate complex formation
Seok et al. Colorimetric detection of PCR products of DNA from pathogenic bacterial targets based on a simultaneously amplified DNAzyme
Park et al. A graphene oxide-based platform for the assay of RNA synthesis by RNA polymerase using a fluorescent peptide nucleic acid probe
JP2010187634A (ja) βグルカンの濃度測定方法および濃度測定用キット
WO2006095696A1 (ja) アデノシン三リン酸の検出方法及び検出用試薬
JP5305208B1 (ja) アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素を用いたアミノ酸の定量方法
Honda et al. Generation of circularly permuted fluorescent-protein-based indicators for in vitro and in vivo detection of citrate
JP2005537801A (ja) トランスフェラーゼ酵素活性を検出する方法
US7989190B2 (en) Composition for analyzing nucleic acid
CN108949917B (zh) 一种汞离子错配型通用隔断超快扩增比色传感器
CN107075552A (zh) 利用弗氏志贺菌腺苷三磷酸双磷酸酶的分析和诊断方法
JP2006223163A (ja) Ａｔｐ増幅−サイクリング法による微量ａｔｐの定量方法およびキット
Wu et al. Phosphorylation-induced formation of a cytochrome c-peptide complex: a novel fluorescent sensing platform for protein kinase assay
JP5812285B2 (ja) デヒドロゲナーゼまたは対応する基質の測定方法および測定用キット
EP3985128A1 (en) Isothermal nucleic acid amplification methods for point-of-need diagnosis of emerging infectious diseases
JP5344665B2 (ja) アデノシン三リン酸を増幅させるための反応器およびアデノシン三リン酸の増幅方法、並びにその利用
US20230366040A1 (en) Rapid and low-cost nucleic acid detection using translation-based sequence verification assays
Zeng et al. Label-free aptasensor for adenosine deaminase sensing based on fluorescence turn-on

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: RU

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 06715315

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1