JP2006223163A - Atp増幅−サイクリング法による微量atpの定量方法およびキット - Google Patents
Atp増幅−サイクリング法による微量atpの定量方法およびキット Download PDFInfo
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Abstract
【解決手段】 試料から抽出したATPを増幅させた後、ATP増幅に用いた酵素を不活化し、当該増幅後のATP試料を、ATPサイクリング法を併用した酵素比色法または電気的定量法を用いて定量する。この方法により、従来の比色法よるATP定量方法と比較して、約1,000,000倍検出感度の高いATP定量方法、ATPサイクリング法と比色法を組み合わせたものに比べて約1,000倍検出感度の上昇が実現できる。
【選択図】 なし
Description
ホタルルシフェリン+ATP+O2+H2O→オキシルシフェリン+AMP+PPi+CO2+光
上記ルシフェリン/ルシフェラーゼによる発光法によるATPの定量は、感度が良好であり迅速性にも優れているため、発光法以外のATP定量方法はほとんど実用化されていない。
本発明のATP定量方法は、試料から抽出したATPを増幅させるATP増幅工程、ATP増幅工程で用いられたアデニレートキナーゼを不活化させる不活化工程、増幅されたATPとリン酸化可能な化合物とを反応させ、リン酸化化合物とADPとを生成させるとともに、生じたADPをATPに再生し、リン酸化化合物の生成を増幅させるATPサイクリング工程、および生成されたリン酸化化合物を定量する定量工程を包含するものであればよい。以下、各工程について順に説明する。なお、上記各工程以外の工程が設けられていてもよく、上記以外の工程の内容は限定されない。
ATP増幅工程では、試料から抽出したATPを増幅させる。
不活化工程では、上記ATP増幅工程で用いられたADKを不活化させる。
ATPサイクリング工程では、上記ATP増幅工程で増幅されたATPとリン酸化可能な化合物とを反応させ、リン酸化化合物とADPとを生成させるとともに、生じたADPをATPに再生し、リン酸化化合物の生成を増幅させる。
定量工程では、上記ATPサイクリング工程で生成したリン酸化化合物を定量する。リン酸化化合物を定量することによって、試料中のATP量を間接的に定量することができる。
本発明のキットは、上述の本発明のATP定量方法を実施するために用いられるキットであればよい。キットの構成としては、ATP増幅反応に用いられる試薬、ATPサイクリング反応およびATPサイクリング反応に用いられる試薬、リン酸化化合物の定量に用いられる試薬が含まれていることが好ましい。
ATP増幅およびATPサイクリングを併用したヘキソキナーゼ法、ATPサイクリングのみを併用したヘキソキナーゼ法、およびヘキソキナーゼ法のみ、の3通りの方法を用いて比色によりATP量を測定した。
ATP試料は、3.3×10−4fmol(0.33amol)〜3.3×107fmol(33nmol)の範囲で公比10の12段階を用いた。
以下の手順で実験を行った。
(1) 20μLのATP増幅反応溶液を25℃で60分間反応する。
(2) 95℃で1分間処理し、酵素を不活化する。
(3) ATPサイクリング試薬10μLを添加し、25℃で60分間反応する。
(4) 発色試薬15.5μLを添加し、25℃で15分間反応する。
(5) 分光光度計を用いて、OD450を測定する。
結果を図6に示した。図6から明らかなように、ATP増幅およびATPサイクリングを併用した場合(図中、ATP増幅+サイクリング法)、ATPサイクリングのみを併用した場合(図中、サイクリング法のみ)、およびヘキソキナーゼ法による発色のみの場合(図中、これまでの発色法)のいずれも、試料中のATP量に依存して吸光度の上昇が観察され、試料中のATP量と吸光度が比例することが示された。しかし、試料を直接ヘキソキナーゼ法に適用した場合(ヘキソキナーゼ法による発色のみの場合)には、感度が非常に低く、検出限界は約300pmol(3×10−9mol)であった。ATPサイクリングのみを併用した場合には、検出感度は約1000倍上昇し、検出限界は約300fmol(3×10−13mol)であった。一方、ATP増幅およびATPサイクリングを併用した場合には、検出感度がさらに約1000倍上昇し、約300amol(3×10−16mol)のATPを検出することが可能であった。
ヘキソキナーゼ:10ユニット、G6P脱水素酵素:10ユニット、ジアホラーゼ:5ユニット、グルコース:1.8mM、NADP:0.6mM、HEPES−KOH(pH7.2):33mM、(NH4)2SO4:26.4mM、MgCl2:2.64mM、[Fe(CN)6]3−:2.4mMを含む溶液4.8mLを調製し、作用極1、参照極2および対極3を挿入した(図5参照)。スターラーを用いて溶液を混合し、安定化した後、16.5mMのATPを0.3mL添加した。
3−1.異なる温度における安定性の比較
純水(pH7.0)にポリリン酸(シグマ社製)またはアセチルリン酸(シグマ社製)を1mMとなるようにそれぞれ溶解した。このポリリン酸溶液およびアセチルリン酸溶液を、それぞれ4℃、18℃または37℃の温度条件で保存し、12時間後に溶液中の遊離リン酸量を既知のモリブデンリン法によって測定し、これを分解量とみなして分解率を算出した。
50mM Tris緩衝液(pH7.8)、50mM HEPES緩衝液(pH5.2)または純水(pH7.0)に、ポリリン酸(シグマ社製)またはアセチルリン酸(シグマ社製)を1mMとなるようにそれぞれ溶解した。各溶液を37℃で保温し、15分後、30分後、60分後および120分後にサンプリングして遊離リン酸量を既知のモリブデンリン法によって測定し、これを分解量とみなして分解率を算出した。
2 参照極
3 対極
4 電流計
5 反応槽
Claims (12)
- 試料中に含まれるATPを定量する方法であって、
試料から抽出したATPを増幅させるATP増幅工程、
ATP増幅工程で用いられたアデニレートキナーゼを不活化させる不活化工程、
増幅されたATPとリン酸化可能な化合物とを反応させ、リン酸化化合物とADPとを生成させるとともに、生じたADPをATPに再生し、リン酸化化合物の生成を増幅させるATPサイクリング工程、および
生成されたリン酸化化合物を定量する定量工程
を包含することを特徴とする方法。 - 上記ATPサイクリング工程では、ADPをATPに再生するためにポリリン酸化合物およびポリリン酸キナーゼを用いることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 上記ATP増幅工程では、AMP、アデニレートキナーゼ、ポリリン酸化合物およびポリリン酸キナーゼを用いることを特徴とする請求項1または2に記載の方法。
- 上記リン酸化可能な化合物がグルコースであり、上記リン酸化化合物がグルコース−6−リン酸であることを特徴とする請求項1ないし3のいずれか1項に記載の方法。
- 上記定量工程では、上記リン酸化化合物を開始物質とする酸化還元反応において受け渡される電子の総量を定量することにより行われることを特徴とする請求項1ないし4のいずれか1項に記載の方法。
- 上記酸化還元反応では、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸が用いられることを特徴とする請求項5に記載の方法。
- 上記酸化還元反応では、さらにジアホラーゼおよび還元されることにより可視光領域で呈色する色素を生じる色原体が用いられ、受け渡された電子の総量を比色定量することを特徴とする請求項6に記載の方法。
- 上記色原体がテトラゾリウムであることを特徴とする請求項7に記載の方法。
- 上記酸化還元反応では、さらにジアホラーゼ、フェリシアン化イオンおよび電極が用いられ、受け渡された電子の総量を電気的に定量することを特徴とする請求項6に記載の方法。
- 請求項1ないし9のいずれか1項に記載の方法を実施するために用いられるキットであって、
ポリリン酸化合物、ポリリン酸キナーゼ、アデニレートキナーゼ、AMP、グルコース、ヘキソキナーゼまたはグルコキナーゼ、グルコース−6−リン酸脱水素酵素、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、ジアホラーゼおよび色原体またはフェリシアン化化合物を備えることを特徴とするキット。 - ATPとリン酸化可能な化合物とを反応させ、リン酸化化合物を生成させるリン酸化化合物生成工程、および、リン酸化化合物を定量する定量工程を包含するATP定量方法であって、
上記定量工程では、上記リン酸化化合物を開始物質とする酸化還元反応において受け渡される電子の総量を、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、ジアホラーゼ、フェリシアン化イオンおよび電極を用いて定量することを特徴とする方法。 - ATPとリン酸化可能な化合物とを反応させ、リン酸化化合物とADPとを生成させるとともに、生じたADPをATPに再生し、リン酸化化合物の生成を増幅させるATPサイクリング工程、および、リン酸化化合物を定量する定量工程を包含するATP定量方法であって、
上記定量工程では、上記リン酸化化合物を開始物質とする酸化還元反応において受け渡される電子の総量を、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、ジアホラーゼ、フェリシアン化イオンおよび電極を用いて定量することを特徴とする方法。
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