JP2020506163A - クリプテート誘導体、及び発光ランタニド錯体としてのそれらの使用 - Google Patents

クリプテート誘導体、及び発光ランタニド錯体としてのそれらの使用 Download PDF

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Abstract

本発明は、優れた蛍光特性を有するクリプテートを提供する。クリプテートは、生物学的アッセイ、及び様々な分析物を検出及び特定するための方法に有益である。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
[0001]本出願は、２０１７年１月１２日に出願された米国特許仮出願第６２／４４５，５６６号の優先権を主張するものであり、この出願の教示は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
発明の背景
[0002]クリプテートは、テルビウム又はユウロピウムなどのランタニドイオンがしっかりと埋め込まれている又はキレート化された大員環を含む錯体である。クリプテートのかご状構造は、照射エネルギーを収集し、ランタニドイオンに収集されたエネルギーを移動させるのに有益である。ランタニドイオンは、特有の蛍光を有するエネルギーを放出させることができる。
[0003]クリプテートは様々な生物学的アッセイの形式で使用できる。いくつかのアッセイは、２つの蛍光団が使用される、時間分解蛍光共鳴エネルギー移動（ＴＲ−ＦＲＥＴ）のメカニズムに依拠にする。これらのアッセイでは、２つの蛍光団が互いに近接している場合、エネルギーは、ドナー蛍光団とアクセプター蛍光団との間で移動させられる。２つの蛍光団が所与の近傍内にある場合、エネルギー源（例えばＵＶ光）によるドナー（クリプテート）の励起は、アクセプターへのエネルギー移動を生じさせる。順に、アクセプターがその特有の波長で光を発する。ＴＲ−ＦＲＥＴが発生するために、ドナー分子の蛍光発光スペクトルは、アクセプター発色団の吸収又は励起スペクトルと重ならなければならない。その上、ドナー分子の蛍光寿命は、ＴＲ−ＦＲＥＴを発生させるために十分な持続時間でなければならない。
[0004]米国特許第６，４０６，２９７号は、「Ｓａｌｉｃｙｌａｍｉｄｅ−ｌａｎｔｈａｎｉｄｅ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｆｏｒ ｕｓｅ ａｓ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｍａｒｋｅｒｓ．」と題される。米国特許第６，４０６，２９７号は、ランタニド系列の金属イオンを含む発光ランタニド金属キレートと、サリチルアミジル部分を含む錯化剤とを対象とする。
[0005]米国特許第６，５１５，１１３号は、「Ｐｈｔｈａｌａｍｉｄｅ ｌａｎｔｈａｎｉｄｅ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｆｏｒ ｕｓｅ ａｓ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｍａｒｋｅｒｓ」と題される。米国特許第６，５１５，１１３号は、ランタニド系列の金属イオンを含む発光ランタニド金属キレートと、フタルアミジル部分を含む錯化剤とを対象とする。
[0006]上記の観点から、長い蛍光寿命を有し、且つアクセプターの励起スペクトルとの良好な発光スペクトルの重なりを有する新規なクリプテートの必要性が、当技術分野において存在する。そこで、これらの特質は、アッセイにおいて使用でき、より高い処理能力に加えて、順応性、確実性、及び感応性の増大がもたらされる。本発明は、これら及び他の必要性を提供する。
発明の簡単な概要
[0007]一実施形態では、本発明は、式Ｉ：
Figure 2020506163
［式中、点線が存在する場合、Ｒ及びＲ１は、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、１つ若しくは複数のハロゲン原子で任意選択で置換されたアルキル、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アミド、スルホナト、アルコキシカルボニルアルキル、又はアルキルカルボニルアルコキシからなる群から各々独立して選択されるか、或いは、Ｒ及びＲ１は一緒になって、点線の結合が存在しない任意選択で置換されたシクロプロピル基を形成し；Ｒ２及びＲ３は、各々独立して、水素、ハロゲン、ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ２−Ｘからなる群から選択されるメンバーであり、式中、Ｘは、ハロゲン、任意選択で置換されたアルキル、任意選択で置換されたアリール、任意選択で置換されたアルケニル、任意選択で置換されたアルキニル、任意選択で置換されたシクロアルキル、又は生体分子に連結できる活性化基であり、活性化基は、ハロゲン、活性化エステル、活性化アシル、任意選択で置換されたアルキルスルホネートエステル、任意選択で置換されたアリールスルホネートエステル、アミノ、ホルミル、グリシジル、ハロゲン、ハロアセトアミジル、ハロアルキル、ヒドラジニル、イミドエステル、イソシアナト、イソチオシアナト、マレイミジル、メルカプト、アルキニル、ヒドロキシル、アルコキシ、アミノ、シアノ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アミド、スルホナト、アルコキシカルボニルアルキル、環状無水物、アルコキシアルキル、水可溶化基（water solubilizing group）、又はＬからなる群から選択されるメンバーであり；Ｒ４は、各々独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキルであるか、或いは、Ｒ４基のうちの３つは存在せず、生じたオキシドがランタニドカチオンにキレート化されており；Ｑ１〜Ｑ４は、各々独立して、炭素又は窒素の群から選択されるメンバーである］
の化合物を提供する。
[0008]別の実施形態では、本発明は、式ＩＩ：
Figure 2020506163
［式中、点線が存在する場合、Ｒ及びＲ１は、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、１つ若しくは複数のハロゲン原子で任意選択で置換されたアルキル、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アミド、スルホナト、アルコキシカルボニルアルキル、又はアルキルカルボニルアルコキシからなる群から各々独立して選択されるか、或いは、Ｒ及びＲ１は一緒になって、点線の結合が存在しない任意選択で置換されたシクロプロピル基を形成し；Ｒ５及びＲ６は、各々独立して、水素、ハロゲン、ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ２−Ｘの群から選択されるメンバーであり、式中、Ｘは、ハロゲン、任意選択で置換されたアルキル、任意選択で置換されたアリール、任意選択で置換されたアルケニル、任意選択で置換されたアルキニル、任意選択で置換されたシクロアルキル、活性化エステル、活性化アシル、任意選択で置換されたアルキルスルホネートエステル、任意選択で置換されたアリールスルホネートエステル、アミノ、ホルミル、グリシジル、ハロゲン、ハロアセトアミジル、ハロアルキル、ヒドラジニル、イミドエステル、イソシアナト、イソチオシアナト、マレイミジル、メルカプト、アルキニル、ヒドロキシル、アルコキシ、アミノ、シアノ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アミド、スルホナト、アルコキシカルボニルアルキル、環状無水物、アルコキシアルキル、水可溶化基、又は−Ｌｑ−Ｂであり、−Ｌｑ−Ｂは連結基及び生体分子を含み、ここで、化合物は少なくとも１つの−Ｌｑ−Ｂを含み；Ｒ４は、各々独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキルであるか、或いは、Ｒ４基のうちの３つは存在せず、生じたオキシドがランタニドカチオンにキレート化されており；Ｑ１〜Ｑ４は、各々独立して、炭素及び窒素の群から選択されるメンバーである］
のバイオコンジュゲート化合物を提供する。
[0009]さらに別の実施形態では、本発明は、溶液中の分析物を検出するためのアッセイ方法であって、ランタニドイオンを含む式ＩＩの化合物に、試料を接触させるステップであり、式Ｉの化合物が分析物と結合する、ステップと、試料を光で励起させるステップと、蛍光発光を検出して、分析物を検出するステップとを含む、アッセイ方法を提供する。
[0010]これら及び他の態様、目的、並びに実施形態は、以下の詳細な説明及び図面を読むとより明白となるであろう。
本発明のクリプテートとのタンパク質のコンジュゲーションを例証する。 本発明のクリプテートとのタンパク質のコンジュゲーションを例証する。 本発明の詳細な化合物を例証する。 本発明の詳細な化合物を例証する。 本発明の詳細な化合物を例証する。 本発明の詳細な化合物を例証する。 本発明の詳細な化合物を例証する。 本発明の詳細な化合物を例証する。 本発明の詳細な化合物を例証する。 本発明の詳細な化合物を例証する。 本発明の詳細な化合物を例証する。 ルミ４（Ｌｕｍｉ４）（商標）−Ｔｂ３＋の、３６５ｎｍの励起帯を例証し、励起帯は５５０ｎｍの最大蛍光発光を示した。 ５５０ｎｍの最大発光に関する、Ｔｂ３＋と錯化したアルケンクリプテート（ｍ）（本発明）（「アルケンクリプテート（ｍ）−Ｔｂ」）の、３５０〜３５５ｎｍの励起帯を例証する。 ３６５ｎｍの励起波長の、アルケンクリプテート（ｍ）及びルミ４（商標）−Ｔｂ３＋（比較用）の、４９０〜６２０ｎｍの間の蛍光発光スペクトルを例証する。
発明の詳細な説明
Ｉ．定義
[0018]本明細書で使用される用語「１つの（a）」「１つの（an）」、又は「その（the）」は、１つのメンバーを有する態様のみを含むのではなく、１つを超えるメンバーを有する態様も含む。
[0019]数値を修飾するように本明細書で使用される用語「約（about）」は、数値の周辺の規定された範囲を示す。「Ｘ」が数値であれば、「約Ｘ」は、０．９Ｘ〜１．１Ｘの数値、及びより好適には０．９５Ｘ〜１．０５Ｘの値を示すであろう。「約Ｘ」に対するあらゆる言及は、詳細には、少なくとも値Ｘ、０．９５Ｘ、０．９６Ｘ、０．９７Ｘ、０．９８Ｘ、０．９９Ｘ、１．０１Ｘ、１．０２Ｘ、１．０３Ｘ、１．０４Ｘ、及び１．０５Ｘを示す。したがって、「約Ｘ」は、例えば「０．９８Ｘ」という、請求項を限定するための明細書のサポートを教示及び提供するように意図される。
[0020]修飾語「約」が、数の範囲の始まりを示すように適用されている場合、範囲の両端に適用する。したがって、「約５００〜８５０ｎｍ」は、「約５００ｎｍ〜約８５０ｎｍ」と同等である。「約」が１組の値のうちの第１の値を示すように適用される場合、その組のすべての値に適用する。したがって、「約５８０、７００、又は８５０ｎｍ」は、「約５８０ｎｍ、約７００ｎｍ、又は約８５０ｎｍ」と同等である。しかしながら、修飾語「約」が、範囲の端部又は１組の値のうちの後の値のみを示すように適用される場合、その値又は範囲の端部にのみ適用する。したがって、範囲「約２〜約１０」は、「約２〜約１０」と同じであるが、範囲「２〜約１０」とは同じではない。
[0021]本明細書で使用される「活性化アシル」は−Ｃ（Ｏ）−ＬＧ基を含む。「脱離基」又は「ＬＧ」は、求核アシル置換反応（すなわち、−Ｃ（Ｏ）−ＬＧのカルボニルに対する求核付加と、その後の脱離基の脱離）による置換えに影響を受けやすい基である。代表的な脱離基は、ハロゲン、シアノ、アジド、ｔ−ブチルカルボキシなどのカルボン酸誘導体、及びｉ−ＢｕＯＣ（Ｏ）Ｏ−などのカーボネート誘導体を含む。活性化アシル基はまた、本明細書で定義されているような活性化エステルか、或いは無水物（優先的に環式）又は混合無水物−ＯＣ（Ｏ）Ｒａ若しくは−ＯＣ（ＮＲａ）ＮＨＲｂ（好ましくは環式）を形成するためにカルボジイミドによって活性化されたカルボン酸であってもよく、式中、Ｒａ及びＲｂは、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６ペルフルオロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、シクロヘキシル、３−ジメチルアミノプロピル、又はＮ−モルホリノエチルからなる群から独立して選択されたメンバーである。好ましい活性化アシル基は、活性化エステルを含む。
[0022]本明細書で使用される「活性化エステル」は、エチルエステル基（例えば、ＮＨＳエステル、スルホ−ＮＨＳエステル、ＰＡＭエステル、又はハロフェニルエステル）よりも、求核付加及び脱離による置換えを受けやすいカルボキシル基の誘導体を含む。活性化エステルの代表的なカルボニル置換基は、スクシンイミジルオキシ（ＯＣ４Ｈ４ＮＯ２）、スルホスクシンイミジルオキシ（ＯＣ４Ｈ３ＮＯ２ＳＯ３Ｈ）、−１−オキシベンゾトリアゾリル（ＯＣ６Ｈ４Ｎ３）；４−スルホ−２，３，５，６−テトラフルオロフェニル；又は、ニトロ、フルオロ、クロロ、シアノ、トリフルオロメチル、又はそれらの組み合わせ（例えば、ペンタフルオロフェニルオキシ、又は２，３，５，６−テトラフルオロフェニルオキシ）などの電子吸引性置換基によって、１回又は複数回、任意選択で置換されたアリールオキシ基を含む。好ましい活性化エステルは、スクシンイミジルオキシ、スルホスクシンイミジルオキシ、及び２，３，５，６−テトラフルオロフェニルオキシエステルを含む。
[0023]本明細書で使用される「アシル」は本明細書で定義されているようなアルカノイル、アロイル、ヘテロシクロイル、又はヘテロアロイル基を含む。代表的なアシル基は、アセチル、ベンゾイル、ニコチノイルなどを含む。
[0024]本明細書で使用される「アルカノイル」は、アルキル基が本明細書で定義された通りであるアルキル−Ｃ（Ｏ）−基を含む。代表的なアルカノイル基は、アセチル、エタノイルなどを含む。
[0025]本明細書で使用される「アルケニル」は、少なくとも１つの炭素−炭素二重又は三重結合を含む、２〜約１５個の炭素原子の直鎖又は分枝脂肪族炭化水素基を含む。好ましいアルケニル基は、２〜約１２個の炭素原子を有する。より好ましいアルケニル基は、２〜約６個の炭素原子を含む。一態様では、炭素−炭素二重結合を含む炭化水素基が好ましい。第２の態様では、炭素−炭素三重結合を含む炭化水素基が好ましい（すなわち、アルキニル）。本明細書で使用される「低級アルケニル」は、２〜約６個の炭素原子のアルケニルを含む。代表的なアルケニル基は、ビニル、アリル、ｎ−ブテニル、２−ブテニル、３−メチルブテニル、ｎ−ペンテニル、ヘプテニル、オクテニル、デセニル、プロピニル、２−ブチニル、３−メチルブチニル、ｎ−ペンチニル、ヘプチニルなどを含む。
[0026]アルケニル基は、非置換でも任意選択で置換されていてもよい。任意選択で置換されている場合、アルケニル基の１つ又は複数の水素原子（例えば、１〜４、１〜２、又は１）は、フルオロ、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、チオ、及びアルキルチオの群から独立して選択された部分で置き換えられていてもよい。
[0027]本明細書で使用される「アルケニレン」は、少なくとも１つの炭素−炭素二重又は三重結合を含む直鎖又は分枝状の２価炭化水素鎖を含む。好ましいアルケニレン基は、鎖中に２〜約１２個の炭素を含み、より好ましいアルケニレン基は、鎖中に２〜６個の炭素を含む。一態様では、炭素−炭素二重結合を含む炭化水素基が好ましい。第２の態様では、炭素−炭素三重結合を含む炭化水素基が好ましい。代表的なアルケニレン基は、−ＣＨ＝ＣＨ−、−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−、−Ｃ（ＣＨ３）＝ＣＨ−、−ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨＣＨ２−、エチニレン、プロピニルエン、ｎ−ブチニルエンなどを含む。
[0028]本明細書で使用される「アルコキシ」は、アルキル基が本明細書で定義された通りであるアルキル−Ｏ−基を含む。代表的なアルコキシ基は、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、ｉ−プロポキシ、ｎ−ブトキシ、ヘプトキシなどを含む。
[0029]アルコキシ基は、非置換でも任意選択で置換されていてもよい。任意選択で置換されている場合、アルコキシ基の１つ又は複数の水素原子（例えば、１〜４、１〜２、又は１）は、フルオロ、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、チオ、及びアルキルチオの群から独立して選択された部分で置き換えられていてもよい。
[0030]本明細書で使用される「アルコキシアルキル」は、アルキル及びアルキレン基が本明細書で定義された通りであるアルキル−Ｏ−アルキレン基を含む。代表的なアルコキシアルキル基は、メトキシエチル、エトキシメチル、ｎ−ブトキシメチル、及びシクロペンチルメチルオキシエチルを含む。
[0031]本明細書で使用される「アルコキシカルボニル」は、エステル基、すなわち、アルキルが本明細書で定義された通りであるアルキル−Ｏ−ＣＯ−基を含む。代表的なアルコキシカルボニル基は、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、ｔ−ブトキシカルボニルなどを含む。
[0032]本明細書で使用される「アルコキシアルキル」は、アルキル及びアルキレン基が本明細書で定義された通りであるアルキル−Ｏ−ＣＯ−アルキレン基を含む。代表的なアルコキシカルボニルアルキルは、メトキシカルボニルメチル、エトキシカルボニルメチル、メトキシカルボニルエチルなどを含む。
[0033]本明細書で使用される「アルキル」は、脂肪族炭化水素基を含み、脂肪族炭化水素基は、直鎖又は分枝鎖であってもよく、鎖中に約１〜約２０個の炭素原子を有する。好ましいアルキル基は、鎖中に１〜約１２個の炭素原子を有する。より好ましいアルキル基は、鎖中に１〜６個の炭素原子を有する。本明細書で使用される「分枝鎖」は、メチル、エチル、又はプロピルなどの１つ又は複数の低級アルキル基が、直鎖アルキル鎖に付着している分枝鎖を含む。本明細書で使用される「低級アルキル」は、鎖中に１〜約６個の炭素原子、好ましくは５又は６個の炭素原子を含み、直鎖又は分枝状であってもよい。代表的なアルキル基は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、及び３−ペンチルを含む。
[0034]アルキル基は、非置換でも任意選択で置換されていてもよい。任意選択で置換されている場合、アルキル基の１つ又は複数の水素原子（例えば、１〜４、１〜２、又は１）は、フルオロ、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、チオ、及びアルキルチオの群から独立して選択された部分で置き換えられていてもよい。
[0035]本明細書で使用される「アルキレン」は、１〜約６個の炭素原子の、直鎖又は分枝状の２価炭化水素鎖を含む。好ましいアルキレン基は、１〜約４個の炭素原子を有する低級アルキレン基である。代表的なアルキレン基は、メチレン、エチレンなどを含む。
[0036]本明細書で使用される「アルキルチオ」は、アルキル基が本明細書で定義された通りであるアルキル−Ｓ−基を含む。好ましいアルキルチオ基は、アルキル基が低級アルキルであるアルキルチオ基である。代表的なアルキルチオ基は、メチルチオ、エチルチオ、イソプロピルチオ、ヘプチルチオなどを含む。
[0037]本明細書で使用される「アルキルチオアルキル」は、アルキルチオ及びアルキレンが本明細書で定義されているアルキルチオ−アルキレン基を含む。代表的なアルキルチオアルキル基は、メチルチオメチル、エチルチオプロピル、イソプロピルチオエチルなどを含む。
[0038]本明細書で使用される「アミド」は、式Ｙ１Ｙ２Ｎ−Ｃ（Ｏ）−の基を含み、式中、Ｙ１及びＹ２は、独立して、水素、アルキル、若しくはアルケニルであるか；又は、Ｙ１及びＹ２は一緒になって、Ｙ１及びＹ２がそれを介して連結される窒素と共に、４〜７員のアザヘテロシクリル基（例えばピペリジニル）を形成する。代表的なアミド基は、第一級アミド（Ｈ２Ｎ−Ｃ（Ｏ）−）、メチルアミド、ジメチルアミド、ジエチルアミドなどを含む。「アミド」は、−Ｃ（Ｏ）ＮＲＲ’基であることが好ましく、式中、Ｒ及びＲ’は、Ｈ及びアルキルの群から独立して選択されたメンバーである。Ｒ及びＲ’のうちの少なくとも１つがＨであることがより好ましい。
[0039]本明細書で使用される「アミドアルキル」は、アミド及びアルキレン基が本明細書で定義された通りであるアミド−アルキレン基を含む。代表的なアミドアルキル基は、アミドメチル、アミドエチレン、ジメチルアミドメチルなどを含む。
[0040]本明細書で使用される「アミノ」は、式Ｙ１Ｙ２Ｎ−の基を含み、式中、Ｙ１及びＹ２は、独立して、水素、アシル、若しくはアルキルであるか；又は、Ｙ１及びＹ２は一緒になって、Ｙ１及びＹ２がそれを介して連結される窒素と共に、４〜７員のアザヘテロシクリル基（例えばピペリジニル）を形成する。任意選択で、Ｙ１及びＹ２が、独立して、水素又はアルキルである場合、さらなる置換基を窒素に加えて、第四級アンモニウムイオンを作ることができる。代表的なアミノ基は、第一級アミノ（Ｈ２Ｎ−）、メチルアミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノなどを含む。「アミノ」は、−ＮＲＲ’基であることが好ましく、式中、Ｒ及びＲ’は、Ｈ及びアルキルの群から独立して選択されたメンバーである。Ｒ及びＲ’のうちの少なくとも１つがＨであることが好ましい。
[0041]本明細書で使用される「アミノアルキル」は、アミノ及びアルキレンが本明細書で定義されているアミノ−アルキレン基を含む。代表的なアミノアルキル基は、アミノメチル、アミノエチル、ジメチルアミノメチルなどを含む。
[0042]本明細書で使用される「アロイル」は、アリールが本明細書で定義されているアリール−ＣＯ−基を含む。代表的なアロイルは、ベンゾイル、ナフト−１−オイル、及びナフト−２−オイルを含む。
[0043]本明細書で使用される「アリール」は、６〜約１４個の炭素原子、好ましくは６〜約１０個の炭素原子の芳香族の単環又は多環式の環系を含む。代表的なアリール基は、フェニル及びナフチルを含む。
[0044]本明細書で使用される「芳香環」は、酸素、硫黄、セレニウム、及び窒素の群から選択される０〜４個のヘテロ原子を含むこともある、５〜１２員の芳香族単環又は縮合多環式部分を含む。例示的な芳香環は、ベンゼン、ピロール、フラン、チオフェン、イミダゾール、オキサゾール、チアゾール、トリアゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリダジン、ピリミジン、ナフタレン、ベンゾチアゾリン、ベンゾチオフェン、ベンゾフラン類、インドール、ベンズインドール、キノリンなどを含む。芳香環基は、１つ又は複数の位置で、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、アルコキシカルボニル、ハロアルキル、シアノ、スルホナト、アミノスルホニル、アリール、スルホニル、アミノカルボニル、カルボキシ、アシルアミノ、アルキルスルホニル、アミノ、及び置換された又は置換されていない置換基で置換されていてもよい。
[0045]本明細書で使用される「生体分子」は、生体系で使用される天然又は合成の分子を含む。好ましい生体分子は、抗体、抗体断片、抗原、タンパク質、ペプチド、酵素基質、ホルモン、ハプテン、アビジン、ストレプトアビジン、炭水化物、炭水化物誘導体、オリゴ糖、多糖、及び核酸を含む。より好ましい生体分子は、抗体、タンパク質、ペプチド、アビジン、ストレプトアビジン、又はビオチンを含む。
[0046]本明細書で使用される「カルボキシ」及び「カルボキシル」は、ＨＯＣ（Ｏ）−基（すなわち、カルボン酸）、又はその塩を含む。
[0047]本明細書で使用される「カルボキシアルキル」は、アルキレンが本明細書で定義されている、ＨＯＣ（Ｏ）−アルキレン基を含む。代表的なカルボキシアルキル類は、カルボキシメチル（すなわち、ＨＯＣ（Ｏ）ＣＨ２−）、及びカルボキシエチル（すなわち、ＨＯＣ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２−）を含む。
[0048]本明細書で使用される「シクロアルキル」は、約３〜約１０個の炭素原子、好ましくは約５〜約１０個の炭素原子の非芳香族の単環又は多環式の環系を含む。より好ましいシクロアルキル環は、５又は６の環原子を含む。シクロアルキル基は、少なくとも１つのｓｐ２−混成炭素（例えば、環内又は環外のオレフィンを組み込む環）を任意選択で含む。代表的な単環式のシクロアルキル基は、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、シクロヘプチルなどを含む。代表的な多環式のシクロアルキル、１−デカリン、ノルボルニル、アダマンチルなどを含む。
[0049]本明細書で使用される「シクロアルキレン」は、約４〜約８個の炭素原子を有する２価シクロアルキルを含む。好ましいシクロアルキレニル基は、１，２−、１，３−、又は１，４−のｃｉｓ−又はｔｒａｎｓ−シクロヘキシレンを含む。
[0050]本明細書で使用される「ハロ」又は「ハロゲン」は、フルオロ、クロロ、ブロモ、又はヨードを含む。
[0051]本明細書で使用される「ヘテロ原子」は、炭素又は水素以外の原子を含む。代表的なヘテロ原子は、Ｏ、Ｓ、及びＮを含む。ヘテロ原子の窒素又は硫黄原子は、対応するＮ−オキシド、Ｓ−オキシド（スルホキシド）、又はＳ，Ｓ−ジオキシド（スルホン）に、任意選択で酸化させられる。好ましい態様では、ヘテロ原子は、アルキレン炭素原子（例えば−Ｃ１〜Ｃ９アルキレン−Ｏ−Ｃ１〜Ｃ９アルキレン−）に対して、少なくとも２つの結合を有する。いくつかの実施形態では、ヘテロ原子は、アシル、アルキル、アリール、シクロアルキル、ヘテロシクリル、又はヘテロアリール基（例えば、−Ｎ（Ｍｅ）−；−Ｎ（Ａｃ）−）とさらに置換される。
[0052]本明細書で使用される「ヘテロアロイル」は、ヘテロアリールが本明細書で定義された通りであるヘテロアリール−Ｃ（Ｏ）−基を含む。代表的なヘテロアロイル基は、チオフェノイル、ニコチノイル、ピロール−２−イルカルボニル、ピリジノイルなどを含む。
[0053]本明細書で使用される「ヘテロシクロイル」は、ヘテロシクリルが本明細書で定義された通りであるヘテロシクリル−Ｃ（Ｏ）−基を含む。代表的なヘテロシクロイル基は、Ｎ−メチルプロリノイル、テトラヒドロフラノイルなどを含む。
[0054]本明細書で使用される「ヒドロキシアルキル」は、１つ又は複数のヒドロキシ基で置換された、本明細書で定義されているようなアルキル基を含む。好ましいヒドロキシアルキルは、低級アルキルを含む。代表的なヒドロキシアルキル基は、ヒドロキシメチル及び２−ヒドロキシエチルを含む。
[0055]本明細書で使用される「ランタニド」は、ネオジム（Ｎｄ）、サマリウム（Ｓｍ）、ユウロピウム（Ｅｕ）、テルビウム（Ｔｂ）、ジスプロシウム（Ｄｙ）、及びイッテルビウム（Ｙｂ）を含む。
[0056]「水可溶化基」は、より多くの親水性をクリプテートに与える基である。水可溶化基は、エチレンオキシドオリゴマーであることもある。特定の態様では、水可溶化基は、１つ又は複数のアルキレンオキシド繰り返し単位を含む。例えば、水可溶化基は、１つ又は複数のエチレングリコール単位−ｎ（ＯＣＨ２ＣＨ２）を含むことができる。しかしながら、ＰＥＧ基は、任意の長さであってもよく、ｎが１〜２０の間のエチレングリコール繰り返し単位を一般的には含む。ｎ＝１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、若しくは１５などの１〜１５であるか、ｎが４〜８である、ＣＨ３（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＣＯ若しくはＣＨ３（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎなどの他のＰＥＧ誘導体；又はＨＯＯＣＣＨ２ＣＨ２ＣＯ−、ＨＯＯＣＣＨ２ＣＨ２−、若しくはＣＨ３ＣＯ−が使用できる。当業者は、より多くの水溶性を分子に与える他の基を知っているであろう。
ＩＩ．実施形態
Ａ．クリプテート
[0057]一実施形態では、本発明は、式Ｉの化合物を提供する。
Figure 2020506163
[0058]式中、点線が存在する場合、Ｒ及びＲ１は、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、１つ若しくは複数のハロゲン（例えば、フッ素）原子を用いて任意選択で置換されたアルキル、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アミド、スルホナト、又はアルコキシカルボニルアルキル若しくはアルキルカルボニルアルコキシからなる群から各々独立して選択される。例えば、この切り取った式において、点線は以下に示されるように存在する。
Figure 2020506163
[0059]代替的な一実施形態では、Ｒ及びＲ１は一緒になって、点線の結合が存在しない任意選択で置換されたシクロプロピル基を形成する。本実施形態では、シクロプロピル基の炭素は、それらの原子価を、水素、又はハロ、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、チオ、及びアルキルチオなどのアルキル置換基で満たす。例えば、シクロプロピル基を形成し、炭素を、水素、ハロ、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、チオ、及びアルキルチオの基から独立して選択されるＲ７及びＲ８で示されるようにさらに置換できる。
Figure 2020506163
[0060]Ｒ２及びＲ３は、各々独立して、水素、ハロゲン、ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ２−Ｘからなる群から選択されるメンバーであり、式中、Ｘは、ハロゲン、任意選択で置換されたアルキル、任意選択で置換されたアリール、任意選択で置換されたアルケニル、任意選択で置換されたアルキニル、任意選択で置換されたシクロアルキル、又はタンパク質のような生体分子に連結できる活性化基であり、活性化基は、ハロゲン、活性化エステル、活性化アシル、任意選択で置換されたアルキルスルホネートエステル、任意選択で置換されたアリールスルホネートエステル、アミノ、ホルミル、グリシジル、ハロゲン、ハロアセトアミジル、ハロアルキル、ヒドラジニル、イミドエステル、イソシアナト、イソチオシアナト、マレイミジル、メルカプト、アルキニル、ヒドロキシル、アルコキシ、アミノ、シアノ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アミド、スルホナト、アルコキシカルボニルアルキル、環状無水物、アルコキシアルキル、水可溶性基、又はＬからなる群から選択されるメンバーである。
[0061]Ｒ４は、各々独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキルであるか、或いは、Ｒ４基のうちの３つは存在せず、生じたオキシドがランタニドカチオンにキレート化されている。
[0062]Ｑ１〜Ｑ４は、各々独立して、炭素及び窒素からなる群から選択されるメンバーである。特定の例では、Ｑ１、Ｑ２、Ｑ３、及びＱ４は各々、炭素である。他の例では、Ｑ１、Ｑ２、Ｑ３、及びＱ４は各々、窒素である。或いは、Ｑ１が炭素であり、Ｑ２が窒素であるか、又はＱ１が窒素であり、Ｑ２が炭素である。或いは、Ｑ１が炭素であり、Ｑ２が炭素であり、Ｑ３及びＱ４が各々窒素である。或いは、Ｑ１が炭素であり、Ｑ２が炭素であり、Ｑ３が炭素であり、Ｑ４が窒素である。或いは、Ｑ１が炭素であり、Ｑ２が炭素であり、Ｑ３が窒素であり、Ｑ４が炭素である。或いは、Ｑ１が窒素であり、Ｑ２が窒素であり、Ｑ３が炭素であり、Ｑ４が炭素である。或いは、Ｑ１が窒素であり、Ｑ２が炭素であり、Ｑ３が炭素であり、Ｑ４が炭素である。
[0063]特定の例では、Ｒ４基のうちの３つは存在せず、生じたオキシドがランタニドカチオンにキレート化されており、ランタニドカチオンは、ネオジム（Ｎｄ）、サマリウム（Ｓｍ）、ユウロピウム（Ｅｕ）、テルビウム（Ｔｂ）、ジスプロシウム（Ｄｙ）、又はイッテルビウム（Ｙｂ）であることもある。
[0064]特定の例では、Ｒ２及びＲ３のうちの少なくとも１つはＬである。Ｌは、直鎖又は分枝状か、環式又は複素環式か、飽和又は不飽和の連結であり、Ｃ、Ｎ、Ｐ、Ｏ、及びＳからなる群から選択される１〜６０の原子を有し、Ｌは、原子価を満たすようにさらなる水素原子を有することができ、その連結は、エーテル、チオエーテル、アミン、エステル、カルバメート、尿素、チオ尿素、オキシ、若しくはアミド結合；又は、単、二重、三重、若しくは芳香族炭素−炭素結合；又は、リン−酸素、リン−硫黄、窒素−窒素、窒素−酸素、若しくは窒素−プラチナ結合；又は芳香族若しくは複素環式芳香族結合のあらゆる組み合わせを含む。Ｌは、ＣＨ３（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎなどのＰＥＧ鎖であることもあり、式中、ｎ＝１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５などの１〜１５である。特定の例では、Ｌは活性化基の終端となる。
[0065]特定の例では、活性化基は、Ｌに付加される。例えば、Ｌは、−ＳＯ２ＮＲ９−Ｒ１０及びＣＯＲ１０であることができ、式中、Ｒ９は、Ｈ、アルキル、又はアリールであり、Ｒ１０は、活性化基で置換されたアルキル又はアリールである。特定の例では、Ｌは、イソチオシアネート、イソシアネート、スルホニルクロリド、アルデヒド、カルボジイミド、アシルアジド、無水物、フルオロベンゼン、カーボネート、ＮＨＳエステル、イミドエステル、エポキシド、又はフルオロフェニルエステルの群から選択されるメンバーで終端となる。
[0066]特定の例では、Ｒ及びＲ１は各々、水素である。特定の例では、Ｒ２及びＲ３のうちの少なくとも１つは、−ＳＯ２Ｃｌである。
[0067]特定の例では、Ｒ２及びＲ３のうちの少なくとも１つは、活性化アシル、活性化エステル、任意選択で置換されたアルキルスルホネートエステル、任意選択で置換されたアリールスルホネートエステル、任意選択で置換されたアミノ、ホルミル、グリシジル、ハロ、ハロアセトアミジル、ハロアルキル、ヒドラジニル、イミドエステル、イソシアナト、イソチオシアナト、マレイミジル、メルカプト、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アミド、スルホナト、アルコキシカルボニルアルキル、又はアルコキシアルキルの群から選択されるメンバーである。
[0068]特定の例では、Ｒ２及びＲ３のうちの少なくとも１つは、活性化アシル、活性化エステル、任意選択で置換されたアルキルスルホネートエステル、任意選択で置換されたアリールスルホネートエステル、ホルミル、グリシジル、ハロ、ハロアセトアミジル（ｈａｌｏａｃｅｔａｍｉｄｙｌ）、ハロアルキル、イミドエステル、イソシアナト、イソチオシアナト、又はマレイミジルの群から選択されるメンバーである。
[0069]特定の例では、Ｒ２及びＲ３のうちの少なくとも１つは、以下の群から選択されるメンバーであり：
Figure 2020506163
式中、上記の構造のｎ及びｙは、０、１、２、３、４、又は５などの０〜５から各々独立して選択される。
[0070]特定の例では、式Ｉの化合物が生体分子（Ｂ）と反応し、式ＩＩのバイオコンジュゲートを形成する。特定の例では、Ｒ２又はＲ３の置換基は、Ｂ（生体分子）との付着反応前の基を表わす。特定の例では、「−Ｌｑ−」は、生体分子Ｂに結び付いた式Ｉのクリプテートの間の、結果として生じる付着及び又は連結を含む。
[0071]特定の態様では、式Ｉの化合物は、キレート化されたランタニドカチオンを有する。例えば、特定の例では、式Ｉの化合物は以下の構造：
Figure 2020506163
を有し、式中、ランタニドイオンは、ネオジム（Ｎｄ）、サマリウム（Ｓｍ）、ユウロピウム（Ｅｕ）、テルビウム（Ｔｂ）、ジスプロシウム（Ｄｙ）、又はイッテルビウム（Ｙｂ）の群から選択されるメンバーである。特定の例では、ランタニドイオンＬｎ３＋は、ユウロピウム又はテルビウムである。特定の例では、ランタニドイオンはテルビウムである。
Ｂ．式Ｉの化合物の調製
[0072]式Ｉの化合物は、実施例Ｉに例示されるように、多段階の合成スキームを使用して調製する。簡潔に言えば、２−メトキシイソフタロイルジクロリドを、チアゾリジン−２−チオンの溶液と反応させて、（２−メトキシ−１，３−フェニレン）ビス（（２−チオキソチアゾリジン−３−イル）メタノン）を好収率で生成する（ステップ１）。ステップ２では、（２−メトキシ−１，３−フェニレン）ビス（（２−チオキソチアゾリジン−３−イル）メタノンを、Ｎ１，Ｎ１’−（エタン−１，２−ジイル）ビス（Ｎ１−（２−アミノエチル）エタン−１，２−ジアミンテトラヒドロブロミドの溶液に滴下して、Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−（（エタン−１，２−ジイルビス（アザントリイル））テトラキス（エタン−２，１−ジイル））テトラキス（２−メトキシ−３−（２−チオキソチアゾリジン−３−カルボニル）ベンズアミドを生成させる。このテトラチオキソチアゾリジン生成物をテトラアンモニウムアルケンと反応させて、ステップ９でアルケンクリプテートを生成する。どのような方法でも、テトラアンモニウムアルケンへの合成経路は、それ自体５つのステップのプロセスである（実施例Ｉのステップ３〜８を参照）。簡潔に述べると、環外のビニル基を、シクロヘキセニルラクトンへと組み入れる（ステップ３）。ステップ４は、ジオールを生成するためのラクトンの開環を例証する。ジオールを、ジｔｅｒｔ−ブチルカルバメートビスオキソアセテートと共に使用して、ステップ５及び６でジカルバメート部分を生成する。ジカルバメートのメタセシスにより、ステップ７で、保護されたテトラアンモニウムアルケンが生成される。テトラアンモニウムアルケンを、ステップ８で脱保護し、ステップ９で使用する。
[0073]メトキシアルケンクリプテートを、実施例ＩＩに記載されているように、フェノールに変換できる。フェノールの形態は、ランタニドイオン又は他のカチオンに対するキレート化を可能とする。
生体分子を標識する方法
[0074]式Ｉのクリプテート化合物は、様々な生体分子に付着できる。クリプテートを様々な型の生体分子に連結させる方法は、当技術分野において公知である。例えば、オリゴヌクレオチド標識手順を徹底的に見直すには、Ｒ．Ｈａｕｇｌａｎｄ ｉｎ Ｅｘｃｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｓｔｅｉｎｅｒ ｅｄ．，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ（１９８３）、Ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ Ｐｒｏｂｅ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ，ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（１９９６）、及びＧ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９６）を参照されたい。
[0075]特定の態様では、本発明は、式Ｉの化合物を有する配位子又は生体分子を標識する方法又はプロセスを提供し、標識する方法は、配位子又は生体分子と、式Ｉを有する化合物を接触させて、式ＩＩの対応するバイオコンジュゲート化合物を生成させるステップを含む。
[0076]適切な生体分子は、それに限定されるものではないが、抗体、抗体断片、抗原、アビジン、炭水化物、デオキシ核酸、ジデオキシヌクレオチド三リン酸、酵素補因子、酵素基質、ＤＮＡの断片、ＲＮＡの断片、ハプテン、ホルモン、核酸、ヌクレオチド、ヌクレオチド三リン酸、ヌクレオチドリン酸、ヌクレオチドポリリン酸、オリゴ糖、ペプチド、ＰＮＡ、多糖、タンパク質、ストレプトアビジンなどを含む。
[0077]一態様では、式Ｉのクリプテート化合物は、水溶液への十分な溶解性を有し、一旦クリプテート化合物が可溶性の配位子又は生体分子とコンジュゲートされると、配位子又は生体分子はその溶解性を保つ。特定の例では、バイオコンジュゲートは、有機媒体（例えば、ＤＭＳＯ又はＤＭＦ）への良好な溶解性も有し、所望の物質の標識への合成アプローチにおける相当な多様性をもたらす。
[0078]一態様では、クリプテートのＲ２又はＲ３の基は、生体分子のチオール、ヒドロキシル、カルボキシル、又はアミノ基と反応し、クリプテート（色素）と生体分子との間の連結基を形成する。他の態様では、この反応は、ｐＨ８〜９で、水性緩衝液と、ＤＭＦなどの有機溶剤との混合物で実行される。或いは、この反応は、蒸留水又は水性緩衝溶液で実行される。チオール又は酸性基に関しては、特に基質が反応性アミノ基も含む場合に、７以下のｐＨが反応溶媒にとって好ましい。
[0079]式Ｉの化合物を配位子又は生体分子に付着させるのに有益な反応性官能基の選択された例は、表１に示され、その結合は、クリプテート（色素）と配位子又は生体分子との反応に起因する。表１の列Ａは、反応性官能基のリストであり、反応性官能基は式Ｉの化合物又は生体分子に存在できる。列Ｂは、相補的反応性基（好ましくは、カルボキシル、ヒドロキシル、チオール、又はアミノ官能基）のリストであり、相補的反応性基は、生体分子又は式Ｉの化合物に存在でき、且つ列Ａに示された官能基と反応して、列Ｃの結合を形成する。特定の例では、Ｌｑは列Ｃの結合を含む。当業者は、本発明で使用するのに適切な他の結合を知っているであろう。
Figure 2020506163
Figure 2020506163
Figure 2020506163
Figure 2020506163
[0080]カルボン酸を有する式Ｉの化合物をアミン含有配位子又は生体分子と連結させる場合、最初に、活性化試薬を用いて、カルボン酸をより反応的な形態、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル又は混合無水物に変換できる。アミン含有配位子又は生体分子を、生じた活性化アシルで処理して、アミド結合を形成する。特定の態様では、この反応は、任意選択の共溶媒としてのＤＭＳＯ又はＤＭＦを用いて、ｐＨ８〜９の水性緩衝液で実行される。或いは、この反応は、蒸留水又は水性緩衝溶液で実行される。
[0081]同様に、式Ｉのイソシアネート又はイソチオシアネート含有化合物の付着は、カルボキシ色素のための手順と類似しているが、活性化ステップは必要ではない。アミン含有配位子又は生体分子は、活性化アシル化合物で直接処理されて、尿素又はチオ尿素の結合を形成する。より好ましい実施形態では、反応は任意選択の共溶媒としてのＤＭＳＯ又はＤＭＦを用いて、ｐＨ９〜１０の水性緩衝液で実行される。或いは、この反応は、蒸留水又は水性緩衝溶液で実行される。
[0082]他の態様では、式Ｉの化合物はカルボン酸を有し、ＥＤＣ架橋剤と反応させて、ｏ−アシルイソ尿素中間体を形成する。ｏ−アシルイソ尿素中間体は、第一級アミンを有する生体分子と反応して、アミドバイオコンジュゲートを形成できる。或いは、ｏ−アシルイソ尿素中間体は、アミン反応性スルホ−ＮＨＳエステルと反応させることができる。スルホ−ＮＨＳエステルは、第一級アミンを有する生体分子と反応させて、アミドバイオコンジュゲートを形成できる。
[0083]一態様では、生体分子は抗体である。抗体標識は、塩基性ｐＨ条件下、且つ室温で、有機共溶媒を任意選択で含む緩衝液中で実行されることが好ましい。標識抗体は、透析、又はＳＥＰＨＡＤＥＸＲ（登録商標） Ｇ−５０カラムなどの器具を使用して、式Ｉのあらゆる非コンジュゲート化合物を除去するゲル浸透クロマトグラフィーによって精製されるのも好ましい。当業者は、精製のための他の手法及び手段を知っているであろう。
[0084]さらに別の態様では、生体分子は、Ｒ２又はＲ３のマレイミジル置換基と反応することにより連結基を形成する、チオール基を含む。一態様では、生体分子は、タンパク質、ペプチド、抗体、チオール化ヌクレオチド、又はチオール化デオキシヌクレオチドである。
[0085]一態様では、生体分子は、キットを用いて、本発明に従って標識できる。特定の例では、キットは、緩衝液、及び本出願で開示されるような色素（すなわち式Ｉの化合物）を含む。キットは、１Ｍ ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ５）などのカップリング緩衝液を含んでいることが好ましく、酸又は塩基を任意選択で添加してｐＨを変更する（例えば、ｐＨ８．５が、スクシンイミドエステル類との反応にとって好ましく、ｐＨ７が、マレイミド類との反応にとって好ましい）。緩衝液は、適格な低い蛍光バックグラウンドを有することが好ましい。
[0086]任意選択で、キットは、精製サブキットを含むことができる。好ましい色素で生体分子を標識した後、標識された生体分子は、任意の副反応生成物、及び通常の加水分解から生じた任意の遊離加水分解生成物から分離されてもよい。１３以下のアミノ酸を含む生体分子に関しては、分取薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）により、不純物を除去することができる。特定の例では、分取ＴＬＣは、市販のＴＬＣキットを用いて任意選択で実施され、色素標識されたペプチド又はタンパク質を精製するために使用できる。
[0087]より大きいペプチド又はタンパク質などのより大きい生体分子に関しては、ＳＥＰＨＡＤＥＸＲ（登録商標） Ｇ−１５、Ｇ−２５、又はＧ−５０樹脂により、不要な誘導体を除去することができる。特定の例では、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ＫｉｔのＧｅｌ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎは、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（又はＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｒｂｏｒｏｕｇｈ、ＭＡ）から市販されており、色素標識されたペプチド及びタンパク質を遊離色素から分離するために使用できる。脱塩後に残る標識された生体分子は、さらに精製することなく、しばしば首尾よく使用できる。場合によっては、様々な生成物の活性を、ＨＰＬＣ又は他のクロマトグラフィー技術を用いて分析及び評価することが必要である可能性がある。
Ｃ．バイオコンジュゲート化合物
[0088]本発明の別の実施形態では、式ＩＩのバイオコンジュゲートが提供され：
Figure 2020506163
式中、点線が存在する場合、Ｒ及びＲ１は、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、１つ若しくは複数のハロゲン原子で任意選択で置換されたアルキル、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アミド、スルホナト、アルコキシカルボニルアルキル、又はアルキルカルボニルアルコキシからなる群から各々独立して選択される。
[0089]代替的な実施形態では、Ｒ及びＲ１は一緒になって、点線の結合が存在しない任意選択で置換されたシクロプロピル基を形成する。
[0090]Ｒ５及びＲ６は、各々独立して、水素、ハロゲン、ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ２−Ｘからなる群から選択されるメンバーであり、式中、Ｘは、ハロゲン、任意選択で置換されたアルキル、任意選択で置換されたアリール、任意選択で置換されたアルケニル、任意選択で置換されたアルキニル、任意選択で置換されたシクロアルキル、活性化エステル、活性化アシル、任意選択で置換されたアルキルスルホネートエステル、任意選択で置換されたアリールスルホネートエステル、アミノ、ホルミル、グリシジル、ハロゲン、ハロアセトアミジル、ハロアルキル、ヒドラジニル、イミドエステル、イソシアナト、イソチオシアナト、マレイミジル、メルカプト、アルキニル、ヒドロキシル、アルコキシ、アミノ、シアノ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アミド、スルホナト、アルコキシカルボニルアルキル、環状無水物、アルコキシアルキル、又は−Ｌｑ−Ｂであり、−Ｌｑ−Ｂは連結基及び生体分子を含み、化合物は少なくとも１つの−Ｌｑ−Ｂを含む。
[0091]−Ｌｑ−Ｂは、連結基及び生体分子を含み、ここで、化合物は少なくとも１つの−Ｌｑ−Ｂを含む。Ｂは生体分子である。Ｌｑは、クリプテートと生体分子との間に結果として生じる結合を含む。
[0092]Ｒ４は、各々独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキルであるか、或いは、Ｒ４基のうちの３つは存在せず、生じたオキシドがランタニドカチオンにキレート化されている。
[0093]Ｑ１〜Ｑ４は、各々独立して、炭素及び窒素の群から選択されるメンバーである。特定の例では、Ｑ１、Ｑ２、Ｑ３、及びＱ４は各々、炭素である。他の例では、Ｑ１、Ｑ２、Ｑ３、及びＱ４は各々、窒素である。或いは、Ｑ１が炭素であり、Ｑ２が窒素であるか、又はＱ１が窒素であり、Ｑ２が炭素である。或いは、Ｑ１が炭素であり、Ｑ２が炭素であり、Ｑ３及びＱ４が各々窒素である。或いは、Ｑ１が炭素であり、Ｑ２が炭素であり、Ｑ３が炭素であり、Ｑ４が窒素である。或いは、Ｑ１が炭素であり、Ｑ２が炭素であり、Ｑ３が窒素であり、Ｑ４が炭素である。或いは、Ｑ１が窒素であり、Ｑ２が窒素であり、Ｑ３が炭素であり、Ｑ４が炭素である。或いは、Ｑ１が窒素であり、Ｑ２が炭素であり、Ｑ３が炭素であり、Ｑ４が炭素である。
[0094]特定の態様では、本発明のための生体分子は、抗体、抗原、アビジン、炭水化物、デオキシ核酸、酵素補因子、酵素基質、ＤＮＡの断片、ＲＮＡの断片、ハプテン、ホルモン、核酸、ヌクレオチド、ヌクレオチド三リン酸、ヌクレオチドリン酸、ヌクレオチドポリリン酸、オリゴ糖、ペプチド、ＰＮＡ、多糖、タンパク質、ストレプトアビジンなどを含有する群から選択される。
[0095]特定の例では、Ｂは、抗体、抗体断片、タンパク質、又はペプチドである。
[0096]特定の例では、Ｌｑは、アミド、エーテル、チオエーテル、エステル、チオエステル、カルバメート、尿素、又はチオ尿素などの、結果として生じる結合を含む。Ｌｑは、クリプテートと生体分子との間に結合を作る任意のさらなる原子を任意選択で含む。
[0097]特定の例では、式ＩＩのバイオコンジュゲートは、以下の構造を有する：
Figure 2020506163
[0098]特定の例では、Ｂは、抗体又は抗体断片である。
Ｄ．式ＩＩＩのクリプテート
[0099]特定の他の態様では、本発明は、式ＩＩＩの化合物を提供する：
Figure 2020506163
[0100]特定の態様では、式ＩＩＩのＹはＣＨ又はＮであり；Ｌ１は〜ＣＨ２ＣＨ２〜であり、ＹがＣＨである場合、Ｌ１は〜ＣＨ＝ＣＨ〜であることもある。
[0101]Ｒ１は、水素、又はｎ＝１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、若しくは１５などの１〜１５であるか、ｎが４〜８である、ＣＨ３（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＣＯ若しくはＣＨ３（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎなどの水可溶化基であるか、或いは、Ｒ１は、ＨＯＯＣＣＨ２ＣＨ２ＣＯ−、ＨＯＯＣＣＨ２ＣＨ２−、若しくはＣＨ３ＣＯ−であることもある。
[0102]Ｒ１はまた、反応性基Ｒ２（以下に定義されているような）、及び水溶性のチオール（Ｒ２が、マレイミドを含む場合）又はアミン（Ｒ２が、活性化エステル、チオシアネート、シアネート、ＳＯ２Ｃｌ、若しくはＳＯ２Ｆを含む場合）から任意選択で形成できる。例えば、図３及び図４の詳細な化合物を参照されたい。
[0103]Ｒ２は、マレイミド、ＮＨＳエステル、スルホ−ＮＨＳエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、テトラフルオロフェニルエステル、ＳＯ２Ｃｌ、又はＳＯ２Ｆなどのタンパク質反応性基である。
[0104]Ｚは、ｎが０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０などの０〜１０であるが、ｎが１〜３であることが好ましい−ＮＲ３（ＣＨ２）ｎ、又はｍが０、１、２、若しくは３などの０〜３及びｎが１、２、３、４、５などの１〜５であるが、ｎが１〜３であり、ｎが１であることが好ましい−ＮＲ３−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ（ＣＨ２）ｍなどの二官能性結合である。
[0105]Ｒ３は、水素、Ｃ１〜Ｃ５アルキル（Ｃ１ Ｃ２ Ｃ３ Ｃ４、若しくはＣ５）、又はメトキシエチルであるが、Ｒ３は水素であることが好ましい。
[0106]他の態様では、Ｚ−Ｒ２は、−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ、Ｎ＝Ｃ＝Ｏ、−ＣＨ２Ｎ＝Ｃ＝Ｓ、又は−ＣＨ２Ｎ＝Ｃ＝Ｏであることもある。
[0107]特定の他の態様では、ＹはＣＨ又はＮであり、Ｌ１は〜ＣＨ２ＣＨ２〜であり、ＹがＣＨである場合、Ｌ１は〜ＣＨ＝ＣＨ〜であることもある。
[0108]特定の態様では、Ｒ１は、Ｒ２と同じになることができ、マレイミド、ＮＨＳエステル、スルホ−ＮＨＳエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、テトラフルオロフェニルエステル、ＳＯ２Ｃｌ、又はＳＯ２Ｆなどのタンパク質反応性基であることもある。
[0109]Ｚは、ｎ＝１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０などの０〜１０であるが、ｎが１〜３であることが好ましい〜ＮＲ３（ＣＨ２）ｎ、又はｍが０、１、２、若しくは３などの０〜３、及びｎが１、２、３、４、５などの１〜５であるが、ｎが１〜３であり、ｎが１であることが好ましい−ＮＲ３−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ（ＣＨ２）ｍなどの二官能性結合である。
[0110]Ｒ３は、水素、Ｃ１〜Ｃ５アルキル、又はメトキシエチルであるが、Ｒ３が水素であることが好ましい。
[0111]特定の態様では、Ｚ−Ｒ２は、−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ、Ｎ＝Ｃ＝Ｏ、ＣＨ２Ｎ＝Ｃ＝Ｓ、又はＣＨ２Ｎ＝Ｃ＝Ｏであることもできる。
[0112]特定の態様では、式ＩＩＩの化合物は、四官能化されていてもよく、生体分子に結合させることができる。例えば、これらの四官能化された分子は、四官能化された反応性基のうちの１つ介して、抗体などのタンパク質に結合され、その後、過剰水、及び可溶性のチオール（マレイミド反応性基のため）又はアミン（エステル若しくはチオシアネート反応性基のため）で処理されて、他の３つの反応性基が不活性化される。例えば、チオール含有タンパク質が上記の化合物、次いでメルカプト酢酸で処理される場合、生じるタンパク質クリプテート錯体は、図１に示される。図２は、タンパク質に付着した式ＩＩＩの別の化合物を示す。
[0113]特定の態様では、式ＩＩＩの化合物は式Ｉの化合物の亜属式であることもある。言い換えれば、式ＩのＱ１〜Ｑ４は、式ＩＩＩにおいて以下のものである：Ｑ１及びＱ３は両方とも窒素であり；Ｑ４は炭素であり、Ｑ２は窒素、又は炭素であることもある。
[0114]特定の態様では、式Ｉの以下の切り取った式は、式ＩＩＩのＬ１と同等である。
Figure 2020506163
[0115]特定の他の態様では、式ＩのＲ２及びＲ３は、式ＩＩＩのＺＲ１及びＺＲ３と同等である。
[0116]さらに他の態様では、式ＩＩＩの詳細な化合物は、図３及び図４に示される。
[0117]当業者は、式ＩＩＩの化合物が式Ｉの化合物と類似する手段で合成できることを理解するであろう。
Ｅ．使用の方法
[0118]本明細書で使用される検出可能な光学応答は、観察によって又は器械的に検出可能な光学信号の変化又は発生を含む。一般的には、検出可能な応答は、強度、蛍光の励起若しくは発光波長分布、蛍光寿命、蛍光偏光、又はそれらの組み合わせの変化などの、光又は蛍光の変化である。染色の程度及び／又は位置は、基準の又は予想される応答と比較され、試料が、所与の特徴を備えているのか、及びその特徴をどの程度備えているのかを示す。本発明のいくつかの化合物は、蛍光発光が少ないこともあるが、クエンチャー又は発色団色素のように依然として有益である。そのような発色団は、ＦＲＥＴ用途のエネルギーアクセプターとして有益であるか、又は試料又は試料の部分に所望の色を単純に与えるのに有益である。
[0119]ＦＲＥＴは、ドナー分子（例えばクリプテート色素）が光を吸収し、励起状態に移ることによるプロセスである。光を発するのではなくむしろ、第１の分子は、他の特性を有するアクセプター分子（例えば、異なる波長で蛍光を発する色素、又はクエンチャー）にその励起状態を移動させ、アクセプター分子が蛍光を発するか、又は励起をクエンチする。移動の効率が２つの分子の接近に依存するので、それにより、分子錯体形成又は生体分子構造についての情報を示すことができる。
ＩＩＩ．実施例
[0120]実施例Ｉは、本発明の化合物を得るためのステップＡ−Ｈを含む多段階の合成スキームを例証する。
Ａ．ステップ１。
（２−メトキシ−１，３−フェニレン）ビス（（２−チオキソチアゾリジン−３−イル）メタノン）の合成（ｃ）
Figure 2020506163
[0121]１，４−ジオキサン５０ｍｌ中の２−メトキシイソフタル酸（ａ）（５．００ｇ、２５．５ｍｍｏｌ）の撹拌懸濁液に、塩化チオニル（６．５ｍｌ、８９．３ｍｍｏｌ）及び無水ジメチルホルムアミド５０μｌを注意深く添加した。反応物を加熱し、不活性雰囲気下で１６時間還流した。一旦冷却したら、反応物を、アルゴンでフラッシングされた回転蒸発により濃縮し、高真空下で１６時間直ちに乾燥させた。粗製酸クロリド（ｂ）を無水ジクロロメタン６２ｍｌに溶解し、−７８℃まで冷却させた。その温度で、無水ジクロロメタン８５ｍｌに溶解したチアゾリジン−２−チオン（６．７０ｇ、５６．１ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（７．０ｍｌ、５０．２ｍｍｏｌ）の溶液を滴下し、反応物を、室温にて１６時間、不活性雰囲気下で撹拌した。山吹色の反応混合物を、ブライン、１０％塩酸（水溶液）で洗浄し、１０％水酸化ナトリウム（水溶液）で２回洗浄した。合わせた有機物を、硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空で濃縮した。粗製材料を、フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、１２０ｇ、１５〜７０％酢酸エチル／ヘキサン）を介して精製して、（２−メトキシ−１，３−フェニレン）ビス（（２−チオキソチアゾリジン−３−イル）メタノン）（ｃ）（６．５６ｇ、７７％の収率）を、黄色の粉体としてもたらした。１Ｈ ＮＭＲ（４９９ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ７．４３（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ）、７．１３（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，１Ｈ）、４．５９（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，４Ｈ）、３．９０（ｓ，３Ｈ）、３．４１（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，４Ｈ）；ＭＳ：Ｃ１５Ｈ１４Ｎ２Ｏ３Ｓ４の質量計算値：３９７．９９；実測値：陽イオン：３９９．７（Ｍ＋Ｈ）＋、４２１．６（Ｍ＋Ｎａ）＋。
Ｂ．ステップ２。
Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−（（エタン−１，２−ジイルビス（アザントリイル））テトラキス（エタン−２，１−ジイル））テトラキス（２−メトキシ−３−（２−チオキソチアゾリジン−３−カルボニル）ベンズアミド）（ｅ）の合成
Figure 2020506163
[0122]ＣＨ２Ｃｌ２（８０ｍｌ）中の（２−メトキシ−１，３−フェニレン）ビス（（２−チオキソチアゾリジン−３−イル）メタノン（ｅ、４．０ｇ、１０．０ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＭＡ６ｍｌ及びＤＭＳＯ２ｍｌに溶解したＮ１，Ｎ１’−（エタン−１，２−ジイル）ビス（Ｎ１−（２−アミノエチル）エタン−１，２−ジアミン）テトラヒドロブロミド（ｄ、２１１ｍｇ、０．３８ｍｍｏｌ）及びトリメチルアミン（０．８０ｍｌ）の溶液を、１ｍｌ／時間の速度でシリンジポンプを用いて滴下した。反応混合物を、２日間アルゴン下で撹拌した後、ＤＣＭ１２０ｍｌで希釈し、ＤＣＭ溶液を水（１００ｍｌ × ３）で洗浄した。有機層を、硫酸ナトリウムを用いて乾燥させ、溶媒を取り除いた。生じた残留物を、カラムクロマトグラフィー（４０ｇ、シリカゲルカラム、０〜２５％イソプロパノール／ＤＣＭ）により直接精製して、Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−（（エタン−１，２−ジイルビス（アザントリイル））テトラキス（エタン−２，１−ジイル））テトラキス（２−メトキシ−３−（２−チオキソチアゾリジン−３−カルボニル）ベンズアミド）（ｅ）（１８０ｍｇ、３３％の収率）を、黄色の粉体としてもたらした。１Ｈ ＮＭＲ（４９９ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ８．０２（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，４Ｈ）、７．７３（ｓ，４Ｈ）、７．４０（ｄｄ，Ｊ＝７．６，１．８Ｈｚ，４Ｈ）、７．１８（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，４Ｈ）、４．６４（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，８Ｈ）、３．８６（ｓ，１２Ｈ）、３．８０（ｓ，４Ｈ）、３．５３（ｓ，４Ｈ）、３．４３（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，８Ｈ）、２．７４（ｄ，Ｊ＝２９．８Ｈｚ，８Ｈ）、２．６１（ｓ，４Ｈ）；ＭＳ：Ｃ５８Ｈ６４Ｎ１０Ｏ１２Ｓ８の質量計算値：１３４８．３；実測値：陽イオン：１３４９．９（Ｍ＋Ｈ）＋。
Ｃ．ステップ３。
４−ビニルテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−オン（ｇ）の合成
Figure 2020506163
[0123]無水テトラヒドロフラン３５ｍｌ中で懸濁されたリチウムブロミド（２．６６ｇ、３０．６ｍｍｏｌ）及び臭化銅ジメチルスルフィド錯体（３．１５ｇ、１５．３ｍｍｏｌ）の−７８℃の溶液に、ビニルマグネシウムブロミド（１．０Ｍ、３０．５ｍｌ）を、シリンジポンプを介して滴下した。一旦添加が完了したら、反応を、その温度でさらに３０分間撹拌した。その溶液に、無水テトラヒドロフラン１０ｍｌに溶解した５，６−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−オン（ｆ）（０．５０ｇ、５．１０ｍｍｏｌ）を、シリンジポンプを介して滴下し、−７８℃で２０分間撹拌した。反応を−４０℃まで加温し、１時間撹拌した後、飽和塩化アンモニウムでクエンチした。反応物を室温まで加温し、固体をジエチルエーテルで複数回ろ過洗浄することにより取り除いた。合わせたろ液をブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空で濃縮した。粗製材料を、フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、１２ｇ、０〜５０％酢酸エチル／ヘキサン）を介して精製して、４−ビニルテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−オン（ｇ）（０．４０８ｇ、６４％の収率）を淡黄色の油としてもたらした。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ５．８６〜５．７０（ｍ，１Ｈ）、５．１７〜５．０４（ｍ，２Ｈ）、４．４３（ｄｔ，Ｊ＝１１．４，４．７Ｈｚ，１Ｈ）、４．３０（ｄｄｄ，Ｊ＝１１．４，９．９，３．９Ｈｚ，１Ｈ）、２．７９〜２．６１（ｍ，２Ｈ）、２．４５〜２．３１（ｍ，１Ｈ）、２．０６〜１．９４（ｍ，１Ｈ）、１．７２（ｄｔｄ，Ｊ＝１４．４，９．８，４．８Ｈｚ，１Ｈ）；ＭＳ：Ｃ７Ｈ１０Ｏ２の質量計算値：１２６．０７；実測値：陽イオン：１２７．２（Ｍ＋Ｈ）＋、１４９．２（Ｍ＋Ｎａ）＋。
Ｄ．ステップ４。
３−ビニルペンタン−１，５−ジオールの合成（ｈ）
Figure 2020506163
[0124]手順：ＴＨＦ（３０ｍｌ）中の４−ビニルテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−オン（ｇ、０．９３ｇ、７．４９ｍｍｏｌ）の溶液を、Ｅｔ２Ｏ（３０ｍｌ）中のリチウムアルミニウムヒドリド（１．１０ｇ、２９．９６ｍｍｏｌ）の０℃のスラリーにゆっくりと添加し、一旦添加が完了したら、反応混合物を室温までゆっくりと加温し、１６時間撹拌した。小規模な精密検査とその後のＴＬＣにより、出発材料が完全に消費されたことが示される。反応物を０℃まで冷却し、１５％ＮａＯＨ溶液（３ｍｌ）を滴下して、反応をクエンチし、その後水２ｍｌを滴下した。反応スラリーを、ジエチルエーテル３０ｍｌで希釈し、その後シリカゲルのプラグでろ過し、固体をジエチルエーテルで洗浄した。有機相を合わせ、真空下で溶媒を取り除き、粗製生成物を、カラムクロマトグラフィー（２４ｇ、シリカゲルカラム、４０〜１００％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）により精製して、３−ビニルペンタン−１，５−ジオール（ｈ、０．６ｇ、６１．５％の収率）を、無色の油としてもたらした。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ５．６０（ｄｄｄ，Ｊ＝１７．１，１０．１，９．０Ｈｚ，１Ｈ）、５．１５〜４．９５（ｍ，２Ｈ）、３．７５〜３．５１（ｍ，４Ｈ）、２．３６（ｑｔ，Ｊ＝９．３，４．８Ｈｚ，１Ｈ）、２．０２（ｄ，Ｊ＝３．９Ｈｚ，２Ｈ）、１．６８（ｄｄｄｄ，Ｊ＝１３．８，７．４，６．４，４．８Ｈｚ，２Ｈ）、１．５４（ｄｄｔ，Ｊ＝１３．７，９．３，５．９Ｈｚ，２Ｈ）；ＭＳ：Ｃ７Ｈ１４Ｏ２の質量計算値：１３０．１；実測値：陽イオン：１５３．１（Ｍ＋Ｎａ）＋。
Ｅ．ステップ５及び６。
ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（３−ビニルペンタン−１，５−ジイル）ジカルバメートの合成（ｊ）
Figure 2020506163
[0125]ＴＨＦ（１８ｍｌ）中のＤＥＡＤ（２．３９ｇ、１３．７４ｍｍｏｌ）の溶液を、ＴＨＦ（３０ｍｌ）に溶解した３−ビニルペンタン−１，５−ジオール（ｈ、１．０５ｇ、８．０７ｍｍｏｌ）、エチル２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−２−オキソアセテート（４．４１ｇ、２０．３ｍｍｏｌ）、及びトリフェニルホスフィン（５．３３ｇ、２０．３ｍｍｏｌ）の溶液に、０℃で滴下した。完了後、反応を室温まで加温し、１６時間撹拌した。溶媒を真空下で取り除き、生じた残留物をＴＨＦ５０ｍｌに溶解し、４Ｍ ＬｉＯＨ（水）溶液１０ｍｌを０℃でゆっくりと添加した。添加完了後、反応を室温まで加温して、１６時間撹拌した。溶媒を真空下で取り除き、残留物をＥｔＯＡｃ１５０ｍｌ及び水１００ｍｌに溶解した。有機層を分離し、水溶液をＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ × ２）で抽出した。有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を取り除いた後に、残留物を、カラムクロマトグラフィー（８０ｇ、シリカゲルカラム、０〜４０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）により精製して、ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（３−ビニルペンタン−１，５−ジイル）ジカルバメート（ｊ）（１．３０ｇ、４９％の収率）をもたらした。１Ｈ ＮＭＲ（４９９ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ５．５４（ｄｄｄ，Ｊ＝１７．０，１０．３，８．９Ｈｚ，１Ｈ）、５．０８〜４．９９（ｍ，２Ｈ）、４．５３（ｓ，２Ｈ）、３．１５（ｓ，２Ｈ）、３．０５（ｓ，２Ｈ）、２．０８（ｑｔ，Ｊ＝９．２，４．７Ｈｚ，１Ｈ）、１．６２〜１．５３（ｍ，４Ｈ）、１．４４（ｓ，１８Ｈ）；ＭＳ：Ｃ１７Ｈ３２Ｎ２Ｏ４の質量計算値：３２８．２４；実測値：陽イオン：３２９．５（Ｍ＋Ｈ）＋、３５１．４（Ｍ＋Ｎａ）＋。
Ｆ．ステップ７。
ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（３，６−ビス（２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）エチル）オクタ−４−エン−１，８−ジイル）（Ｅ）−ジカルバメート（ｋ）の合成
Figure 2020506163
[0126]脱気ジクロロメタン１９ｍｌに溶解したジ−ｔｅｒｔ−ブチル（３−ビニルペンタン−１，５−ジイル）ジカルバメート（ｊ）（０．７７０ｇ、２．３４ｍｍｏｌ）の溶液に、グラブス第２世代触媒（０．２００ｇ、０．２３４ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を、不活性雰囲気下で４８時間、還流で撹拌した。粗製材料をセライトのパッドを通してろ過し、フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、４０ｇ、１０−６０％酢酸エチル／ヘキサン）により直接精製して、ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（３，６−ビス（２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）エチル）オクタ−４−エン−１，８−ジイル）（Ｅ）−ジカルバメート（ｋ）（０．１３５ｇ、１８％の収率）を、黒色の固体としてもたらした。１Ｈ ＮＭＲ（４９９ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ５．１７（ｄｄ，Ｊ＝５．５，２．６Ｈｚ，２Ｈ）、４．７７（ｓ，４Ｈ）、３．２０〜３．０８（ｍ，４Ｈ）、３．０８〜２．９５（ｍ，４Ｈ）、２．０３（ｔｄ，Ｊ＝９．３，４．７Ｈｚ，２Ｈ）、１．６６〜１．５６（ｍ，４Ｈ）、１．４３（ｓ，３６Ｈ）、１．３９〜１．３２（ｍ，４Ｈ）；ＭＳ：Ｃ３２Ｈ６０Ｎ４Ｏ８の質量計算値：６２８．４４；実測値：陽イオン：６２９．９（Ｍ＋Ｈ）＋、６５２．０（Ｍ＋Ｎａ）＋、６６７．７（Ｍ＋Ｋ）＋。
[0127]任意選択で、ＬＨ２０ ＧＰＣ樹脂でのゲル浸透クロマトグラフィーを、生成物ｋの精製に使用することが可能である。メタセシス反応は、約１０〜２０％完了した時点で進行が止まり、かなりの出発材料のジ−ｔｅｒｔ−ブチル（３−ビニルペンタン−１，５−ジイル）ジカルバメートが反応混合物中に存在する。任意選択で、クロマトグラフィー、及び炭での処置後に未反応のアルケンを単離し、アルケンを再使用して、繰り返しメタセシス反応で、生成物のジ−ｔｅｒｔ−ブチル（３，６−ビス（２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）エチル）オクタ−４−エン−１，８−ジイル）（Ｅ）−ジカルバメート（ｋ）をさらに作ることにより、収率を改善することができた。
Ｇ．ステップ８．（Ｅ）−３，６−ビス（２−アンモニオエチル）オクタ−４−エン−１，８−ジアミニウム）テトラ−（２，２，２−トリフルオロアセテート（ｌ）の合成
Figure 2020506163
[0128]無水ジクロロメタン１．７ｍｌに溶解したジ−ｔｅｒｔ−ブチル（３，６−ビス（２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）エチル）オクタ−４−エン−１，８−ジイル）（Ｅ）−ジカルバメート（ｋ）（０．０３６ｇ、０．０５７ｍｍｏｌ）の０℃の溶液に、トリフルオロ酢酸（８８μｌ、１．１５ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を、不活性雰囲気下で、１６時間にわたり室温までゆっくりと加温した。反応物を真空で濃縮し、生じた薄茶色の固体を水に溶解させた。その水溶液を、マイクロシリンジフィルターを通してろ過し、そのろ液を真空で濃縮して、（Ｅ）−３，６−ビス（２−アンモニオエチル）オクタ−４−エン−１，８−ジアミニウム）テトラ−（２，２，２−トリフルオロアセテート）（ｌ）（０．０３８ｇ、９７％の収率）を、灰白色の固体としてもたらした。１Ｈ ＮＭＲ（４９９ＭＨｚ，重水）δ５．４４（ｄｄ，Ｊ＝５．６，２．７Ｈｚ，２Ｈ）、３．１２〜２．９２（ｍ，８Ｈ）、２．３７〜２．２２（ｍ，２Ｈ）、１．９４〜１．８０（ｍ，４Ｈ）、１．７９〜１．６７（ｍ，４Ｈ）。
Ｈ．ステップ９．アルケンクリプテート（ｍ）（ＣＣＡＯＭ４）の合成
Figure 2020506163
[0129]脱気ジメチルスルホキシド１ｍｌ、脱気ジメチルアセトアミド２ｍｌ、及び脱気クロロホルム２２ｍｌに溶解した（Ｅ）−３，６−ビス（２−アンモニオエチル）オクタ−４−エン−１，８−ジアミニウム）テトラ−（２，２，２−トリフルオロアセテート（ｌ）（０．０３４ｇ、０．０５０ｍｍｏｌ）の溶液に、脱気トリエチルアミン１２０μｌ及びジイソプロピルエチルアミン５０μｌを添加した。任意選択で、ＤＭＳＯの代わりにイソプロパノールを使用して、（Ｅ）−３，６−ビス（２−アンモニオエチル）オクタ−４−エン−１，８−ジアミニウム）テトラ−（２，２，２−トリフルオロアセテートを溶解することが好ましい。音波粉砕して、遊離塩基（（Ｅ）−３，６−ビス（２−アンモニオエチル）オクタ−４−エン−１，８−ジアミン））を形成した後に、その溶液を、脱気クロロホルム２５ｍｌに溶解したＮ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−（（エタン−１，２−ジイルビス（アザントリイル））テトラキス（エタン−２，１−ジイル））テトラキス（２−メトキシ−３−（２−チオキソチアゾリジン−３−カルボニル）ベンズアミド（ｅ）（０．０６７ｇ、０．０５０ｍｍｏｌ）の溶液と同時に、２つのシリンジポンプを介して７日間にわたり、脱気ジクロロメタン１７５ｍｌ中の脱気トリエチルアミン９８μｌを含有する反応槽に添加した。３日目に、脱気トリエチルアミン１．４ｍｌを反応混合物に添加した。一旦添加が完了したら、１６時間室温で撹拌し、且つ還流で４０時間撹拌した。一旦冷却したら、反応物を、真空で濃縮し、フラッシュクロマトグラフィー（逆相Ｃ１８、１５．５ｇ、水中の５−９５％アセトニトリル／２５ｍＭ酢酸アンモニウム）を介して直接精製して、アルケンクリプテート（ｍ、ＣＣＡＯＭ４）（０．０１７ｇ、３１％の収率）を、白色固体としてもたらした。いくつかの可能性のある配座異性体／異性体の共存が原因で、１Ｈ−ＮＭＲによる特性決定は、困難であることが判明した。ＨＰＬＣ及び質量分析法の組み合わせを代わりに使用した。ＭＳ：Ｃ５８Ｈ７２Ｎ１０Ｏ１２の質量計算値：１１０１．２７；実測値：陽イオン：１１０２．００（Ｍ＋Ｈ）＋、１１２４．００（Ｍ＋Ｎａ）＋。ＨＰＬＣ保持時間＝５．５８分（単一ピーク）。
[0130]ＨＰＬＣ条件：カラム：Ａｇｉｌｅｎｔ ＳＢ−Ｃ１８ Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ １２０、４．６×１５０ｍｍ、２．７μｍ、溶媒Ａ：水中の２５ｍＭ酢酸アンモニウム、溶媒Ｂ：アセトニトリル、流量：９ｍｌ／分勾配：５％の溶媒Ｂで０．５分間〜９５％の溶媒Ｂで６分以上、９５％の溶媒Ｂで２．５分間〜５％の溶媒Ｂで１分以上。
[0131]実施例ＩＩは、フェノールアルケンクリプテート二酢酸（ｏ）の合成を例証する。
Figure 2020506163
[0132]無水ジクロロメタン０．６ｍｌに溶解したアルケンクリプテート（ＣＣＡＯＭｅ）（ｍ）（０．０１２ｇ、０．０１１ｍｍｏｌ）の−１０℃の溶液に、ジクロロメタン中のボロントリブロミド（０．４５ｍｌ、１．０Ｍ）を添加し、反応スラリーを、８日間室温にて、不活性雰囲気下で撹拌した。蒸発が原因で、溶媒の損失を補うために、無水ジクロロメタンを毎日添加して、反応濃度を維持した。反応物を真空で濃縮し、メタノールで３回共蒸発させて、残留揮発物を取り除いた。生じた残留物を、０．５Ｍ水酸化ナトリウム（水溶液）２ｍｌに溶解し、ろ過して固体を取り除いた。合わせたろ液のｐＨを、濃縮酢酸を用いて約５に調節し、生じた白い沈殿物を遠心分離により採取し、真空下で乾燥させて、フェノールアルケンクリプテート二酢酸（ＣＣＡＯＨ４）（ｏ）（０．０１２ｇ、９９％の収率）を、灰白色の固体としてもたらす。ＣＤ３ＯＤ中の１Ｈ ＮＭＲでは、解読するには多過ぎる重複シグナルが存在したが、Ｄ２Ｏ／ＮａＯＤを使用することにより、この重複シグナルを単純化した。１Ｈ ＮＭＲ（４９９ＭＨｚ，重水）δ７．８５〜７．６９（ｍ，５Ｈ）、７．６８〜７．５５（ｍ，３Ｈ）、６．４８〜６．３５（ｍ，４Ｈ）、５．７９〜５．６７（ｍ，１Ｈ）、５．３４（ｄｄ，Ｊ＝１５．３，９．０Ｈｚ，１Ｈ）、３．７２〜３．３７（ｍ，８Ｈ）、３．３７〜３．０１（ｍ，８Ｈ）、２．９７〜２．７２（ｍ，１２Ｈ）、１．９７〜１．７８（ｍ，２Ｈ）、１．７８〜１．５７（ｍ，４Ｈ）、１．３６〜１．１９（ｍ，４Ｈ）。ＭＳ：Ｃ５４Ｈ６４Ｎ１０Ｏ１２の質量計算値：１０４４．４７（遊離塩基）；実測値：陽イオン：１０４５．８０（Ｍ＋Ｈ）＋、陰イオン：１０４３．８０（Ｍ−Ｈ）−。ＨＰＬＣ保持時間＝５．６２〜５．７５分（不均一な二重線）。ＴＬＣ（１０％メタノール／ジクロロメタン）：２つのスポットＲｆ＝０．０５及び０．１０。任意選択で、ＣＣＡＯＨ４を、ＴｂＣｌ３を添加してテルビウム錯体に変換すること、並びに水及びアセトニトリル中の０．１％ＴＦＡを用いる、逆相ＨＰＬＣ又は中圧逆相クロマトグラフィーを使用して精製することにより、精製できる。テルビウム錯体は、逆相クロマトグラフィーにより、ＣＣＡＯＨ４及び誘導体のための未錯化配位子よりも容易に精製される。
[0133]ＨＰＬＣ条件：カラム：Ａｇｉｌｅｎｔ ＳＢ−Ｃ１８ Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ １２０、４．６×１５０ｍｍ、２．７μｍ、溶媒Ａ：水中の２５ｍＭ酢酸アンモニウム、溶媒Ｂ：アセトニトリル、流量：０．９ｍｌ／分、勾配：５％の溶媒Ｂで０．５分間〜９５％の溶媒Ｂで６分以上、９５％の溶媒Ｂで２．５分間〜５％の溶媒Ｂで１分以上。
[0134]実施例ＩＩＩは、クリプテートスルホニルクロリド：ＣＣＡＯＨ−ＳＯ２−Ｃｌ（ｐ）の合成を例証する。
Figure 2020506163
[0135]クロロスルホン酸（０．５ｍｌ）を、−１０℃でＣＣＡＯＨ（ｏ）（５．０ｍｇ、４．７８μｍｏｌ）に添加し、反応物を、不活性雰囲気下で、室温までゆっくりと加温しながら１６時間撹拌した。反応混合物の一部を、氷水の溶液に注意深く添加することによりクエンチして、灰白色の沈殿物（ＣＣＡＯＨ−ＳＯ２−Ｃｌ）（ｐ）（ｐＨ＝１で湿重量約１．０ｍｇ、推測上ＨＣｌ及びＨ２ＳＯ４を含有する）をもたらし、沈殿物を遠心分離及び水のデカントにより採取した。ＨＰＬＣ保持時間＝４．８５〜４．９１（二重線）及び５．１６〜５．２１（二重線）分。任意選択で、より長い反応時間を使用することにより、ＣＣＡＯＨテルビウム錯体をスルホン化できる。テルビウムは、このプロセス間に失われる。
[0136]任意選択で、スルホニルクロリドＣＣＡＯＨ４−ＳＯ２Ｃｌを、ＮａＯＨ水溶液（＞１Ｍ）に溶解し、周囲温度で一晩温置することによってスルホン酸のＣＣＡＯＨ４−ＳＯ２ＯＨに変換することが好ましい。ｐＨ１まで酸性化した後に、ＴｂＣｌ３を添加して、ＣＣＡＯＨ−ＳＯ３Ｈテルビウム錯体を形成し、ＣＣＡＯＨ−ＳＯ３Ｈテルビウム錯体を、水及びアセトニトリル中の０．１％ＴＦＡを用いる、逆相ＨＰＬＣ又は中圧を使用して精製する。テルビウム錯体は、逆相クロマトグラフィーにより、ＣＣＡＯＨ４及び誘導体のための未錯化配位子よりも容易に精製される。ＣＣＡＯＨ−ＳＯ３Ｈテルビウム錯体を、ＤＭＦ中の過剰なオキサリルクロリドで処理して、スルホニルクロリドのＣＣＡＯＨ４−ＳＯ２Ｃｌを形成する。その後、この物質を、過剰なアミン（例えば、ｔ−ブチルグリシネート）で処理して、クリプテートスルホンアミドのＣＣＡＯＨ４−ＳＯ２ＮＨＲ、及び副生成物としてのオキサリルアミド誘導体を形成できる。クリプテートスルホンアミドを、ＴｂＣｌ３で処理してテルビウムを再導入し、２つの溶離剤としての水及びアセトニトリル中の０．１％ＴＦＡを用いる、勾配逆相ＨＰＬＣ又は中圧を使用して、精製することができる（例えば、ＣＣＡＯＨ４−ＳＯ２ＮＨＣＨ２ＣＯＯｔ−Ｂｕテルビウム錯体を作る）。ＣＣＡＯＨ４−ＣＣＡＯＨ４−ＳＯ２ＮＨＣＨ２ＣＯＯ−ｔ−Ｂｕテルビウム錯体を、ＣＣＡＯＨ４−ＳＯ２ＮＨＣＨ２ＣＯＯＨテルビウム錯体へと加水分解する。この方法で作られたＣＣＡＯＨ４−ＳＯ２ＮＨＣＨ２ＣＯＯＨテルビウム錯体は、ＣＣＡＯＨ４テルビウム錯体に近い蛍光スペクトルを示した。その錯体は、ＭＡＬＤＩ質量分析間にＴｂを明らかに失い、ＭＡＬＤＩ質量分析において、テルビウムを含まないＣＣＡＯＨ４−ＳＯ２ＮＨＣＨ２ＣＯＯＨのピークを、Ｍ＋Ｈ、Ｍ＋Ｎａ、及びＭ＋Ｋピークとして示した。
[0137]任意選択で、上で概説した方法用のスルホン酸のＣＣＡＯＨ４−ＳＯ３Ｈを、発煙硫酸でＣＣＡＯＨを処理することにより作る。
[0138]任意選択で、上で概説した方法では、オキサリルクロリド／ＤＭＦを、トリクロロトリアゼン、ＰＯＣｌ３、又は別のスルホン酸活性化剤と取り替えて、ＣＣＡＯＨ４ＳＯ３Ｈを、ＣＣＡＯＨ４ＳＯ２Ｃｌ又は別の活性スルホンアミドに変換する。
[0139]任意選択で、上で概説した方法では、スルホンアミドが非活性化エステルを含む場合、粗製の非活性化エステルは、カルボン酸に加水分解し、ＴｂＣｌ３で処理し、２つの溶離剤として水及びアセトニトリル中の０．１％ＴＦＡを用いる、勾配逆相ＨＰＬＣ又は中圧逆相クロマトグラフィーを使用して精製できる。例えば、このような方法で、ｔ−ブチル−グリシンスルホンアミドのＣＣＡＯＨ４−ＳＯ２ＮＨＣＨ２ＣＯＯ−ｔ−Ｂｕは、ＣＣＡＯＨ４−ＳＯ２ＮＨＣＨ２ＣＯＯＨＴｂ錯体に変換され、精製される。
[0140]次の構造を以下に示す：
Figure 2020506163
Figure 2020506163
[0141]ＬＣＭＳ分析：Ｃ５４Ｈ６３ＣｌＮ１０Ｏ１４Ｓの質量計算値：１１４２．３９（遊離塩基）；実測値：陽イオン：１１２５．７３（Ｍ−Ｃｌ＋ＨＯＨ）＋、カラムで加水分解することによってもたらされたスルホン酸を観察した。これは、以下の実験によりさらにサポートされる。
[0142]ＨＰＬＣ条件：カラム：Ａｇｉｌｅｎｔ ＳＢ−Ｃ１８ Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ １２０、４．６×１５０ｍｍ、２．７μｍ、溶媒Ａ：水中の２５ｍＭ酢酸アンモニウム、溶媒Ｂ：アセトニトリル、流量：０．９ｍｌ／分、勾配：５％の溶媒Ｂで０．５分間〜９５％の溶媒Ｂで６分以上、９５％の溶媒Ｂで２．５分間〜５％の溶媒Ｂで１分以上。任意選択で、２つの溶離剤として水及びアセトニトリル中の０．１％ＴＦＡを用いる、勾配逆相ＨＰＬＣ又は中圧を使用することにより、分析ＨＰＬＣでより良い性能を得る。
[0143]スルホニルクロリドの形成を、次の反応を使用して検証した（ＣＣＡＯＨ−ＳＯ２−ＮＨ−Ｃｙ（ｑ）の合成）：
Figure 2020506163
[0144]シクロヘキシルアミン（５０μｌ）の０℃の溶液に、新たに調製したＣＣＡＯＨ−ＳＯ２−Ｃｌ（ｑ）（１．０ｍｇ、０．８７４μｍｏｌ）を添加して、白色固体を形成した。その固体に、無水ジメチルホルムアミド０．３ｍｌを添加し、その懸濁液を室温で、密封されたバイアルの中、不活性雰囲気下で１６時間撹拌した。小アリコートを取り出し、ＤＭＳＯに溶解させて、分析に使用した。新たなピークのＨＰＬＣ保持時間＝５．８７〜５．９２（二重線）分。
[0145]ＬＣＭＳ分析：Ｃ６０Ｈ７５Ｎ１１Ｏ１４Ｓの質量計算値：１２０５．５２（遊離塩基）；実測値：陽イオン：１２０６．８７（Ｍ＋Ｈ）＋。
[0146]ＨＰＬＣ条件：カラム：Ａｇｉｌｅｎｔ ＳＢ−Ｃ１８ Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ １２０、４．６×１５０ｍｍ、２．７μｍ、溶媒Ａ：水中の２５ｍＭ酢酸アンモニウム、溶媒Ｂ：アセトニトリル、流量：０．９ｍｌ／分、勾配：５％の溶媒Ｂで０．５分間〜９５％の溶媒Ｂで６分以上、９５％の溶媒Ｂで２．５分間〜５％の溶媒Ｂで１分以上。
[0147]実施例ＩＶは、スルホニルクロリドに迂回方路の合成を例証する。
Figure 2020506163
[0148]クロロスルホン酸（０．８ｍｌ）を、−１０℃でＣＣＡＯＨ（ｏ）（８．０ｍｇ、７．６５μｍｏｌ）に添加し、反応物を、不活性雰囲気下で室温までゆっくりと加温しながら４０時間撹拌した。反応混合物を、氷水の溶液に注意深く添加することによりクエンチして、灰白色の沈殿物をもたらした。溶液のｐＨを、６．０Ｍ水酸化ナトリウム（水溶液）で１０に調節し、３０分間撹拌した。その後、溶液のｐＨを、１．０Ｍ塩酸（水溶液）で５に調節し、全溶液を逆相Ｃ１８カラムに載せ、溶離させて（０〜９５％のメタノール／水（０．１％のトリフルオロ酢酸を含有する））、ＣＣＡＯＨ−ＳＯ２−ＯＨ（約８．０ｍｇ）を白色固体としてもたらす。ＬＣＭＳ分析：Ｃ５４Ｈ６４Ｎ１０Ｏ１５Ｓの質量計算値：１１２４．４３（遊離酸）；実測値：陽イオン：１１２５．７３（Ｍ＋Ｈ）＋。
Figure 2020506163
[0149]メタノール４．０ｍｌに溶解したＣＣＡＯＨ−ＳＯ２−ＯＨナトリウム（ＤＪＳ−１４−１９８）（ｐ）（８．０ｍｇ、７．１１μｍｏｌ）の溶液に、メタノールに溶解したテルビウム（ＩＩＩ）クロリド六水和物（１．４０ｍｌ、０．００５Ｍ）及び１Ｍ水酸化ナトリウム（水溶液）３０μｌを添加し、反応物を、６０℃で３０分間、雰囲気不活性下で加熱した。反応物を真空で濃縮し、さらに精製することなく後のステップで使用した。
Figure 2020506163
[0150]ジクロロメタン２．０ｍｌ及び無水ジメチルホルムアミド５．０μｌに溶解したＣＣＡＯＨＴｂＳＯ２−ＯＨナトリウム（ＤＪＳ−１４−２０１）（ｑ）（８．０ｍｇ、６．２３μｍｏｌ）の溶液に、オキサリルクロリド（８．０μｌ、９３μｍｏｌ））を添加し、反応物を、２時間室温にて、不活性雰囲気下で撹拌した。反応物を真空で濃縮し、さらに精製することなく後のステップで使用した。
Figure 2020506163
[0151]無水ジメチルホルムアミド２．０ｍｌに溶解した、トリエチルアミン（１５μｌ、０．１０４ｍｍｏｌ）及びｔｅｒｔ−ブチルグリシネート（１７μｌ、０．１２３ｍｍｏｌ）の溶液を、ＣＣＡＯＨＴｂ−ＳＯ２−Ｃｌ（ＤＪＳ−１４−２０２）（ｒ）（８．０ｍｇ、６．１４μｍｏｌ）に添加し、反応物を、４時間室温にて、不活性雰囲気下で撹拌した。反応物を真空で濃縮し、さらに精製することなく後のステップで使用した。
Figure 2020506163
[0152]無水ジクロロメタン２．０ｍｌに溶解したＣＣＡＯＨＴｂＳＯ２−ＮＨＣＨ２ＣＯＯＨ（ＤＪＳ−１４−２０３）（８．０ｍｇ、５．７３μｍｏｌ）の溶液に、トリフルオロ酢酸（０．４０ｍｌ、５．２７ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を、１６時間室温にて、不活性雰囲気下で撹拌した。反応物を、真空で濃縮し、ＤＭＳＯ／水に溶解し、フラッシュクロマトグラフィー（逆相Ｃ１８、０．１％トリフルオロ酢酸を含む１０〜８０％のメタノール／水）を介して直接精製して、ＣＣＡＯＨＴｂＳＯ２−ＮＨＣＨ２ＣＯＯＨ（ｔ）（１４−２０４ｐ２、１．５ｍｇ）と、ＴＦＡ／ＤＣＭでさらに処理されて、ＣＣＡＯＨＴｂＳＯ２−ＮＨＣＨ２ＣＯＯＨ（ｔ）を与えた第２の試料（１４−２０４ｐ３、３．４ｍｇ）（４．９ｍｇ（２つの試料として）、５ステップ以上で５５％の収率）とを、ＵＶ下で緑色の蛍光を保つ淡黄色の油としてもたらした。ＭＡＬＤＩ：Ｃ５６Ｈ６７Ｎ１１Ｏ１６Ｓの質量計算値：１１８１．４５（金属を含まない錯体）；実測値：陽イオン：１１８２（Ｍ＋Ｈ）＋、１２０４（Ｍ＋Ｎａ）＋、１２２０（Ｍ＋Ｋ）＋。金属錯体はＭＡＬＤＩ／ＴＯＦでイオン化せず、そのため観察されなかった。
[0153]ＨＰＬＣ条件：カラム：Ａｇｉｌｅｎｔ ＳＢ−Ｃ１８ Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ １２０、４．６×１５０ｍｍ、２．７μｍ、溶媒Ａ：水中の２５ｍＭ酢酸アンモニウム、溶媒Ｂ：アセトニトリル、流量：０．９ｍｌ／分、勾配：５％の溶媒Ｂで０．５分間〜９５％の溶媒Ｂで６分以上、９５％の溶媒Ｂで２．５分間〜５％の溶媒Ｂで１分以上。
[0154]実施例Ｖは、本発明のアルケンクリプテート（ｍ）の蛍光特性を例証する。
[0155]実施例Ｉに従って調製されたアルケンクリプテート（ｍ）の蛍光特性を分析した。Ｃｉｓｂｉｏから市販されているルミ４（商標）クリプテートを、比較用クリプテートとして本実施例で使用した。各例では、クリプテート３．８ｍｇを、１ｍｇ／ｍＬ（０．８３ｍＭ）の濃度までメタノール３．８ｍＬに溶解した。個別に、５ｍＭシトレート（ｐＨ５．１３）中のＴｂＣｌ３の２ｍｇ／ｍＬ（５．３５ｍＭ）溶液を調製した。ＴｂＣｌ３の２ｍｇ／ｍＬ（５．３５ｍＭ）溶液を、クリプテート溶液１ｍＬに１．５倍のモル過剰まで混合することにより、テルビウム−クリプテート錯体を得た。
[0156]定性的な蛍光を、励起のために３６５ｎｍでフィルタをかけた紫外線（ＵＶ）光を使用して、暗室で分析した。ＴｂＣｌ３は、これらの条件下で可視的に蛍光性ではなかった。アルケンクリプテート（ｍ）単独では青いバックグラウンド蛍光を可視的に発した一方で、Ｔｂイオン錯化アルケンクリプテート（ｍ）は緑色の蛍光を可視的に生じさせた。同様に、Ｔｂイオン錯化ルミ４（商標）は、緑色の蛍光を可視的に生じさせたが、この試料の色はより深い緑であった。
[0157]テルビウム錯体は、一般的には、３６５ｎｍの励起で、約４９０、５５０、５８０、及び６２０ｎｍの特有の蛍光発光ピークを生じさせ、５５０ｎｍのピークが顕著なピークである。ＴｂＣｌ３と錯化した比較例のルミ４（商標）（「ルミ４（商標）−Ｔｂ」）の発光スペクトルを、５５０ｎｍの最大発光の最適励起波長に関して分析した。結果は、３６５ｎｍの励起が、ルミ４（商標）−Ｔｂにおいて５５０ｎｍの最大蛍光発光を生じさせたことを示した（図５）。ＴｂＣｌ３（「アルケンクリプテート（ｍ）−Ｔｂ」）と錯化したアルケンクリプテート（ｍ）を、最適励起波長に関して分析したとき、５５０ｎｍの最大発光は、３５０〜３５５ｎｍの間の励起波長で観察された（図６）。３５０〜３５５ｎｍの励起の錯化アルケンクリプテート（ｍ）−Ｔｂの蛍光は、ＴｂＣｌ３単独よりも広範囲に強かったが、未錯化のアルケンクリプテート（ｍ）が、若干のバックグラウンド蛍光を生じさせた。
[0158]これらの結果は、テルビウムイオンアルケンクリプテート（ｍ）が、３６５ｎｍの励起波長で５５０ｎｍの有意な蛍光を有することを示す。このことが、アルケンクリプテート（ｍ）及びルミ４（商標）錯化クリプテートに関して、それぞれ３５０〜３５５及び３６５ｎｍの励起波長で、５５０ｎｍの発光が達成されることが好ましいことを示す。
[0159]本発明のクリプテート及び比較用クリプテートの蛍光発光スペクトルを、３６５ｎｍ（図７）の励起波長で直接比較した。４００〜６５０ｎｍの広い発光バンドパスで、データを記録した。テルビウム単独は、ＴｂＣｌ３の形態で用意され、約４９０、５５０、５８０、及び６２０ｎｍの特有の発光ピークを予想通りに生じさせた。顕著に、本発明のクリプテートと錯化したテルビウムは、テルビウム蛍光発光を約２．５ｌｏｇ増大させた。
[0160]クリプテート錯体の両方は、約４９０、５５０、５８０、及び６２０ｎｍの特有のテルビウム発光ピークを有する発光スペクトルを生じさせたが、第４のピークは、アルケンクリプテート（ｍ）−Ｔｂ試料において６３０ｎｍにわずかにずれた。さらなるショルダーピークがアルケンクリプテート（ｍ）−Ｔｂ試料の約４４０ｎｍで観察されたが、これは、クリプテート自体のバックグラウンド蛍光が原因であった可能性がある。本発明の試料の５５０ｎｍの発光がわずかに低いのは、おそらく３６５ｎｍの励起が原因であり、３６５ｎｍの励起は、ルミ４（商標）−Ｔｂの発光に最適であり（図５）、クリプテート−Ｔｂに準最適である（図６）。総体として、これらの結果は、アルケンクリプテート（ｍ）が、特有のテルビウムスペクトルパターンを維持しながら、テルビウム蛍光をルミ４（商標）に匹敵するレベルにまで大幅に増加させることを示す。
[0161]本明細書で引用される刊行物及び特許出願はすべて、あたかも各個々の刊行物又は特許出願が参照により詳細に又は個別に組み込まれるかのように、参照により本明細書に組み込まれる。前述の発明は、理解しやすくするための例証及び例としてある程度詳細に記載されているが、添付の請求項の趣旨と範囲を逸脱することなく、特定の変更と修正を加えてもよいということが、本発明の教示を照らせば当業者には明らかであろう。

Claims (22)

  1. 式Ｉ：
    Figure 2020506163
    ［式中、点線が存在する場合、Ｒ及びＲ１は、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、１つ若しくは複数のハロゲン原子で任意選択で置換されたアルキル、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アミド、スルホナト、アルコキシカルボニルアルキル、又はアルキルカルボニルアルコキシからなる群から各々独立して選択されるか、或いは、Ｒ及びＲ１は一緒になって、前記点線の結合が存在しない任意選択で置換されたシクロプロピル基を形成し；
    Ｒ２及びＲ３は、各々独立して、水素、ハロゲン、ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ２−Ｘからなる群から選択されるメンバーであり、式中、Ｘは、ハロゲン、任意選択で置換されたアルキル、任意選択で置換されたアリール、任意選択で置換されたアルケニル、任意選択で置換されたアルキニル、任意選択で置換されたシクロアルキル、又は生体分子に連結できる活性化基であり、前記活性化基は、ハロゲン、活性化エステル、活性化アシル、任意選択で置換されたアルキルスルホネートエステル、任意選択で置換されたアリールスルホネートエステル、アミノ、ホルミル、グリシジル、ハロゲン、ハロアセトアミジル、ハロアルキル、ヒドラジニル、イミドエステル、イソシアナト、イソチオシアナト、マレイミジル、メルカプト、アルキニル、ヒドロキシル、アルコキシ、アミノ、シアノ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アミド、スルホナト、アルコキシカルボニルアルキル、環状無水物、アルコキシアルキル、水可溶化基、及びＬからなる群から選択されるメンバーであり；
    Ｒ４は、各々独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキルであるか、或いは、前記Ｒ４の基のうちの３つは存在せず、生じたオキシドがランタニドカチオンにキレート化されており；
    Ｑ１〜Ｑ４は、各々独立して、炭素及び窒素からなる群から選択されるメンバーである］
    の化合物。
  2. Ｒ及びＲ１が各々水素である、請求項１に記載の化合物。
  3. Ｒ２及びＲ３のうちの少なくとも１つが−ＳＯ２Ｃｌである、請求項１又は２に記載の化合物。
  4. Ｒ２及びＲ３のうちの少なくとも１つが、ハロゲン、活性化アシル、任意選択で置換されたアルキルスルホネートエステル、任意選択で置換されたアリールスルホネートエステル、任意選択で置換されたアミノ、ホルミル、グリシジル、ハロ、ハロアセトアミジル、ハロアルキル、ヒドラジニル、イミドエステル、イソシアナト、イソチオシアナト、マレイミジル、メルカプト、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アミド、スルホナト、アルコキシカルボニルアルキル、及びアルコキシアルキルの群から選択されるメンバーである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物。
  5. Ｒ２及びＲ３のうちの少なくとも１つが、活性化アシル、任意選択で置換されたアルキルスルホネートエステル、任意選択で置換されたアリールスルホネートエステル、ホルミル、グリシジル、ハロ、ハロアセトアミジル、ハロアルキル、イミドエステル、イソシアナト、イソチオシアナト、及びマレイミジルの群から選択されるメンバーである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物。
  6. Ｒ２及びＲ３のうちの少なくとも１つが、以下の群：
    Figure 2020506163
    ［式中、ｎ及びｙが、各々独立して０〜５から選択される］
    から選択されるメンバーである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の化合物。
  7. 式Ｉの前記化合物が、キレート化されたランタニドカチオンを有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物。
  8. 化Ｉの前記化合物が、以下の構造：
    Figure 2020506163
    を有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の化合物。
  9. 前記ランタニドイオンが、ネオジム（Ｎｄ）、サマリウム（Ｓｍ）、ユウロピウム（Ｅｕ）、テルビウム（Ｔｂ）、ジスプロシウム（Ｄｙ）、及びイッテルビウム（Ｙｂ）からなる群から選択されるメンバーである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物。
  10. 前記ランタニドイオンＬｎ３＋が、ユウロピウム及びテルビウムからなる群から選択される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の化合物。
  11. 前記ランタニドイオンがテルビウムである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の化合物。
  12. 化ＩＩ：
    Figure 2020506163
    ［式中、点線が存在する場合、Ｒ及びＲ１は、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、１つ若しくは複数のハロゲン原子で任意選択で置換されたアルキル、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アミド、スルホナト、アルコキシカルボニルアルキル、又はアルキルカルボニルアルコキシからなる群から各々独立して選択されるか、或いは、Ｒ及びＲ１は一緒になって、前記点線の結合が存在しない任意選択で置換されたシクロプロピル基を形成し；
    Ｒ５及びＲ６は、各々独立して、水素、ハロゲン、ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ２−Ｘからなる群から選択されるメンバーであり、式中、Ｘは、ハロゲン、任意選択で置換されたアルキル、任意選択で置換されたアリール、任意選択で置換されたアルケニル、任意選択で置換されたアルキニル、任意選択で置換されたシクロアルキル、活性化エステル、活性化アシル、任意選択で置換されたアルキルスルホネートエステル、任意選択で置換されたアリールスルホネートエステル、アミノ、ホルミル、グリシジル、ハロゲン、ハロアセトアミジル、ハロアルキル、ヒドラジニル、イミドエステル、イソシアナト、イソチオシアナト、マレイミジル、メルカプト、アルキニル、ヒドロキシル、アルコキシ、アミノ、シアノ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アミド、スルホナト、アルコキシカルボニルアルキル、環状無水物、アルコキシアルキル、水可溶化基、及び−Ｌｑ−Ｂであり、−Ｌｑ−Ｂは、連結基及び生体分子を含み、前記化合物は少なくとも１つの−Ｌｑ−Ｂを含み、
    Ｒ４は、各々独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキルであるか、或いは、前記Ｒ４の基のうちの３つは存在せず、生じたオキシドがランタニドカチオンにキレート化されており、
    Ｑ１〜Ｑ４は、各々独立して、炭素及び窒素からなる群から選択されるメンバーである］
    のバイオコンジュゲート化合物。
  13. Ｂが、抗体、タンパク質、又はペプチドである、請求項１２に記載のバイオコンジュゲート化合物。
  14. Ｌｑが、アミド、エーテル、チオエーテル、エステル、チオエステル、カルバメート、尿素、及びチオ尿素からなる群から選択されるメンバーを含む、請求項１２又は１３に記載のバイオコンジュゲート化合物。
  15. 化ＩＩの前記化合物が、以下の構造：
    Figure 2020506163
    を有する、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載のバイオコンジュゲート化合物。
  16. 溶液中の分析物を検出するためのアッセイ方法であって、
    ランタニドイオンを含む式ＩＩの化合物に、試料を接触させるステップであり、式ＩＩの前記化合物が分析物と結合する、ステップと、
    前記試料を光で励起させるステップと、
    蛍光発光を検出して、前記分析物を検出するステップと
    を含む、アッセイ方法。
  17. 化ＩＩの前記化合物が、以下の構造：
    Figure 2020506163
    を有し、
    Ｂが、アクセプター蛍光団を有する分析物に結合し、
    前記アクセプター蛍光団からの蛍光発光を検出する、請求項１６に記載のアッセイ方法。
  18. ランタニドカチオンが、ユウロピウム及びテルビウムからなる群から選択されるメンバーである、請求項１６又は１７に記載のアッセイ方法。
  19. 前記励起がＵＶ光による、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載のアッセイ方法。
  20. 前記励起の波長が、約３００ｎｍ〜約４００ｎｍの間である、請求項１６〜１９のいずれか一項に記載のアッセイ方法。
  21. 前記アクセプター蛍光団が、可視〜近赤外線で発する、請求項１６〜２０のいずれか一項に記載のアッセイ方法。
  22. 可視〜近赤外線が、５００〜８００ｎｍの間である、請求項１６〜２０のいずれか一項に記載のアッセイ方法。
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