CN114315783A - 生色过氧化物酶底物 - Google Patents
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Abstract
本申请描述了用于基于颜色检测靶标的生色缀合物。缀合物包括生色部分例如罗丹明，对甲氨基酚或荧光素。生色部分连接于过氧化物酶底物。生色缀合物可以用于免疫组织化学分析和原位杂交。缀合物可以用于通过颜色检测样品中的1个、2个、3个或更多个靶标。
Description
本申请是申请日为2016年12月19日、申请号为201680074513.4(国际申请号为PCT/IB2016/001920)、名称为“生色过氧化物酶底物”的发明专利申请的分案申请。
相关申请的交叉引用
本申请要求2015年12月18日提交的美国临时申请62/269,575的申请日的权益和优先权权利。
技术领域
本申请涉及生色缀合物，生色分析的方法例如免疫组织化学(IHC)和色原体原位杂交(CISH)，和制备生色缀合物的方法。
背景技术
当在显微镜载玻片上分析组织样品时，用有色染料将组织或组织的某些部分染色可以有助于分析。可视化或差异性识别显微结构的能力常常通过使用组织学染剂来增强。苏木素和伊红(H&E)染剂是组织学样品的光学显微镜法中最常使用的染剂。苏木素用于将细胞核染成蓝色，伊红将细胞质和细胞外结缔组织基质染成粉色。除了H&E染剂之外，其它染剂或染料已经应用于提供更具特异性的染色以及提供组织形态学的更详细视图。免疫组织化学(IHC)染剂具有大的特异性，因为它们使用用于IHC染色的过氧化物酶底物或碱性磷酸酶(AP)底物，提供均匀的染色图案，其向观察者显现为具有细胞结构(例如细胞膜，细胞质，和细胞核)的细胞内分辨率的均匀颜色。
福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织样品、中期分裂相或组织学涂片通常通过在载玻片上染色分析，其中特定的生物标志物例如有用的蛋白质或核酸可以用H&E和/或有色染料染色，下文称为"色原体"或"生色部分"。IHC染色是评价组织样品存在特异性生物标志物的常用工具。IHC染剂可精确地识别整个样品中的特异性靶标并允许定量化这些靶标。
IHC染色使用在组织学样品标记靶标的生色和/或荧光报告物。这通过将生物标志物直接或间接与酶(通常为辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(AP)的任一者)连接来进行，其随后催化在来自可溶的适宜酶底物的生物标志物(其表示出颜色)的位置催化不溶性有色沉淀物的形成。
在印迹/捕获测定中，将生物标志物从其原始位置提取到溶液中，然后重新固定在膜、凝胶、或芯片阵列上，但是生物标志物也用可见的颜色(色原体)染色，通常通过同一HRP或AP酶的作用进行。
与其它检测技术例如辐射能、化学发光或荧光相比，色原体通常具有远远较低的敏感性，但是具有的优点是永久、清楚可见的颜色，其可在视觉上观察，例如用明视场显微镜法进行观察。基于酶的生色检测固定在固体载体上或固定到固体载体中的固体生物样品或靶标中的靶标的其它限制包括：可用于靶标染色的生色HRP和AP底物的数目非常有限，这限制了使用这些靶标可视化系统来检测样品中的多个靶标。同样，一些色原体如HRP底物3,3'-二氨基联苯胺(DAB)不是特征在于界限清楚的光谱特征，而是不溶的吸收光的棕色沉淀物。此外，当涉及多个靶标的可视化时，其通常需要去使用多个基于酶的可视化系统的组合，例如HRP和AP。这些限制使得样品染色过程复杂、鲁棒性较小且昂贵，并且也使自动检测靶标和图像分析染色样品变得复杂。
罗丹明、对甲氨基酚和荧光素是强烈有色和荧光的。根据卤化和/或取代类型，它们几乎有任何颜色。它们已经已知了一个多世纪，并且几种用作专用染剂，其无需任何酶活性即可将组织样品染色。例如，罗丹明110用作线粒体染剂，为四溴荧光素，也称为伊红，广泛用于苏木素/伊红(H和E)双染剂，其中苏木素将细胞核染成蓝色，伊红将任何蛋白质基本上染成粉色或红色。因此尽管这些化合物的衍生物由于它们独特和明亮的颜色而作为潜在色原体似乎具有吸引力，但是非特异性组织染色，甚至在不存在任何酶活性的情况下，对于它们用作色原体是一个阻碍。另一个阻碍是提供在含水环境中具有适宜溶解度的衍生物。
罗丹明和荧光素化合物也是稳定的并且需要强制条件以进行进一步的反应。解决方案是在荧光素异硫氰酸酯("FITC")和四甲基罗丹明异硫氰酸酯("TRITC")或羧基荧光素和磺基罗丹明中引入额外的反应性基团，例如异硫氰酸酯。但是，增加这些反应性基团不容易做到并且得到两种最不可分离的异构体的混合物。FITC已经变得与反应性荧光素广泛关联，是用于制备抗体和核酸探针的荧光素衍生物的已证实的方法。但是，这样的衍生物是昂贵的，一些是令人望而却步地昂贵。
在过去十年中，在罗丹明和荧光素2'-酯衍生物的领域内已经取得了进展。参见，例如，Beija，Mariana et al.，"Synthesis and applications of Rhodaminederivatives as fluorescent probes."Chem.Soc.Rev.，2009，38，2410-2433；Afonso，A.M.Carlos，et al.，"An Expedient Synthesis of Cationic Rhodamine FluorescentProbes Suitable for Conjugation to Amino Acids and Peptides."Synthesis，2003，17，2647-2654；Xi Chen et al.，"An efficient and versatile approach for thepreparation of a rhodamine B ester bioprobe library."Dyes and Pigments 2012，94，296-303。
罗丹明和荧光素都具有2'羧酸，其可以在某些条件下衍生化为酯或酰胺。但是，罗丹明或荧光素的2'伯酰胺"折叠"成无色的螺内酰胺或螺内酯互变异构体，使得这些衍生物不适于用作色原体。酯和伯胺的酰胺不经历该互变异构化，因为它们缺少不稳定的N-H质子。
已经报告了制备罗丹明和荧光素的仲胺哌嗪的酰胺的方法。参见Nguyen T.etal.，"Practical synthetic route to rhodamine dyes"，Org.Lett.2003,18，3245-48；Huang，Chusem，et al.；"Versatile Probes for the Selective Detection of Vicinal-Dithiol-Containing proteins:Design，Syntheses，and Applications in LivingCells".Chem.Eur.J.2013，19,7739-7747。
荧光素异硫氰酸酯(FITC)是很多利用荧光的应用例如流式细胞仪中使用的荧光素的衍生物。FITC包括荧光素分子在其4’位用结构的单环苯基上的异硫氰酸酯反应性基团(-N＝C＝S)官能化。该衍生物对蛋白质上包括胺和巯基基团的亲核物质具有反应性。
最近已经描述了在靶标的组织化学检测中使用荧光素作为HRP底物的可检测部分。Lohse的WO2007/015168涉及单体或聚合物连接基分子用于生物和化学应用、它们的合成、以及缀合于各种可检测标记和其它物质的连接基的衍生物的合成和使用。连接基可以用于例如与荧光标记、核酸或核酸类似物探针、和固相系统联用，并且用于增强缀合的分子的溶解性。WO2009/036760、WO2010/094283、WO2010/094284、WO2011/047680和WO2012/143010涉及HRP底物经WO2007/015168的连接基在其4’位缀合于荧光素。后一种缀合物是无色但是荧光的，并且可以或用于靶标的直接荧光检测或用于靶标的间接组织化学检测：缀合物经酶反应沉积在标记有HRP活性的靶标位点，然后可以将沉积的缀合物或作为荧光染剂进行光学检测或作为半抗原进行免疫化学检测。通过HRP使缀合物沉积要求在沉积介质中存在一定量的DAB、阿魏酸或α-氰基-4-羟基肉桂酸(ACHCA)。
发明内容
本申请提供能够用作具有过氧化物酶活性的酶的底物的生色缀合物分子，并且描述了它们用于检测样品中的分子靶标的用途。
本申请涉及以下技术方案：
1.一种生色缀合物，其包含：
(a)生色部分，和
(b)过氧化物酶底物部分，
其中所述生色部分和所述过氧化物酶底物部分经连接基连接在一起，
其中所述缀合物为式I化合物：
其中X是-OH，-ORX或-NRXRXX，
其中Y是＝O或＝N+RYRYY；
其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、RX、RXX、RY、和RYY独立地选自氢和具有小于40个原子的取代基；
L是包含5至29个连续连接原子的直链的连接基；和
PS是过氧化物酶底物部分，其中所述过氧化物酶底物部分具有下式：
其中
R21是-H，
R22是-H，-O-X，或-N(X)2；
R23是-OH；
R24是-H，-O-X，或-N(X)2；
R25是-H，-O-X，或-N(X)2；
R26是-CON-(X)2，-CONH(X)，或-COO(X)；
其中H是氢；O是氧；N是氮；X是H，烷基或芳基。
2.根据第1项所述的生色缀合物，其中
R1选自氢，R11，任选取代有一个或多个相同或不同R14基团的(C1-C20)烷基或杂烷基，任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的(C5-C20)芳基或杂芳基，和任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的(C6-C40)芳基烷基或杂芳基烷基，或者，R1可以与R2一起形成任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的苯并、萘并或多环亚芳基并基团；
R2选自氢，R11，任选取代有一个或多个相同或不同R14基团的(C1-C20)烷基或杂烷基，任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的(C5-C20)芳基或杂芳基，和任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的(C6-C40)芳基烷基或杂芳基烷基，或者，R2可以与R1一起形成任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的苯并、萘并或多环亚芳基并基团，或者，当X是-NRXRXX时，R2可以与RX一起形成任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的5元或6元环；
RX当存在时选自氢，任选取代有一个或多个相同或不同R14基团的(C1-C20)烷基或杂烷基，任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的(C5-C20)芳基或杂芳基，和任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的(C6-C40)芳基烷基或杂芳基烷基，或者，RX可以与R2一起形成任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的5元或6元环；
RXX当存在时选自任选取代有一个或多个相同或不同R14基团的(C1-C20)烷基或杂烷基，任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的(C5-C20)芳基或杂芳基，和任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的(C6-C40)芳基烷基或杂芳基烷基，或者，RXX可以与R3一起形成任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的5元或6元环；
R3选自氢，R11，任选取代有一个或多个相同或不同R14基团的(C1-C20)烷基或杂烷基，任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的(C5-C20)芳基或杂芳基，和任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的(C6-C40)芳基烷基或杂芳基烷基，或者，当X是-NRXRXX时，R3可以与RXX一起形成任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的5元或6元环；
R4选自氢，R11，任选取代有一个或多个相同或不同R14基团的(C1-C20)烷基或杂烷基，任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的(C5-C20)芳基或杂芳基，和任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的(C6-C40)芳基烷基或杂芳基烷基，或者，当Y是-N+RYRYY时，R4可以与Ryy一起形成任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的5元或6元环；Ryy当存在时选自任选取代有一个或多个相同或不同R14基团的(C1-C20)烷基或杂烷基，任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的(C5-C20)芳基或杂芳基，和任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的(C6-C40)芳基烷基或杂芳基烷基，或者Ryy可以与R4一起形成任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的5元或6元环；
RY当存在时选自氢，任选取代有一个或多个相同或不同R14基团的(C1-C20)烷基或杂烷基，任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的(C5-C20)芳基或杂芳基，和任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的(C6-C40)芳基烷基或杂芳基烷基，或者，RY可以与R5一起形成任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的5元或6元环；
RYY当存在时选自任选取代有一个或多个相同或不同R14基团的(C1-C20)烷基或杂烷基，任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的(C5-C20)芳基或杂芳基，和任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的(C6-C40)芳基烷基或杂芳基烷基，或者，RXX可以与R6一起形成任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的5元或6元环；
R5选自氢，R11，任选取代有一个或多个相同或不同R14基团的(C1-C20)烷基或杂烷基，任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的(C5-C20)芳基或杂芳基，和任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的(C6-C40)芳基烷基或杂芳基烷基，或者，R5可以与R6一起形成任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的苯并、萘并或多环亚芳基并基团，或者，当Y是-N+RYRYY时，R5可以与Ry一起形成任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的5元或6元环；
R6选自氢，R11，任选取代有一个或多个相同或不同R14基团的(C1-C20)烷基或杂烷基，任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的(C5-C20)芳基或杂芳基，和任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的(C6-C40)芳基烷基或杂芳基烷基，或者，R6可以与R5一起形成任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的苯并、萘并或多环亚芳基并基团；
R7、R8和R9各自彼此独立地选自氢，R11，任选取代有一个或多个相同或不同R14基团的(C1-C20)烷基或杂烷基，任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的(C5-C20)芳基或杂芳基，和任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的(C6-C40)芳基烷基或杂芳基烷基；
R10选自氢，R11，任选取代有一个或多个相同或不同R14基团的(C1-C20)烷基或杂烷基，任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的(C5-C20)芳基或杂芳基，和任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的(C6-C40)芳基烷基或杂芳基烷基，卤素，卤代烷基，-OR12，-SR12，-SOR12，-SO2R12，和腈；
R11选自-NR15R15，-OR16，-SR16，卤素，卤代烷基，-CN，-NC，-OCN，-SCN，-NO，-NO2，-N3，-S(O)R16，-S(O)2R16，-S(O)2OR16，-S(O)NR15R15，-S(O)2NR15R15，-OS(O)R16，-OS(O)2R16，-OS(O)2NR15R15，-OP(O)2R16，-OP(O)3R16R16，-P(O)3R16R16，-C(O)R16，-C(O)OR16，-C(O)NR15R15，-C(NH)NR15R15，-OC(O)R16，-OC(O)OR16，-OC(O)NR15R15和-OC(NH)NR15R15；
R12选自任选取代有亲脂性取代基的(C1-C20)烷基或杂烷基，任选取代有亲脂性取代基的(C5-C20)芳基或杂芳基和任选取代有亲脂性取代基的(C2-C26)芳基烷基或杂芳基烷基；
R13选自氢，(C1-C8)烷基或杂烷基，(C5-C20)芳基或杂芳基，和(C6-C28)芳基烷基或杂芳基烷基；
R14选自-NR15R15，＝O，-OR16，＝S，-SR16，＝NR16，＝NOR16，卤素，
卤代烷基，-CN，-NC，-OCN，-SCN，-NO，-NO2，＝N2，-N3，-S(O)R16，-S(O)2R16，-S(O)2OR16，-S(O)NR15R15，-S(O)2NR15R15，-OS(O)R16，-OS(O)2R16，-OS(O)2NR15R15，-OS(O)2OR16，-OS(O)2NR15R15，-C(O)R16，-C(O)OR16，-C(O)NR15R15，-C(NH)NR15R15，-OC(O)R16，-OC(O)OR16，-OC(O)NR15R15和-OC(NH)NR15R15；
R15各自独立地为氢或R16，或者，R15各自与其所键接的氮原子一起形成5元至8元饱和或不饱和环，所述环可以任选包括一个或多个相同或不同的另外的杂原子并且可以任选取代有一个或多个相同或不同R13或R16基团；
R16各自独立地为R13，或取代有一个或多个相同或不同R13或R17基团的R13；和
R17各自选自-NR13R13，-OR13，＝S，-SR13，＝NR13，＝NOR13，卤素，卤代烷基，-CN，-NC，-OCN，-SCN，-NO，-NO2，＝N2，-N3，-S(O)R13，-S(O)2R13，-S(O)2OR13，-S(O)NR13R13，-S(O)2NR13R13，-OS(O)R13，-OS(O)2R13，-OS(O)2NR13R13，-OS(O)2OR16，-OS(O)2NR13R13，-C(O)R13，-C(O)OR13，-C(O)NR13R13，-C(NH)NR15R13，-OC(O)R13，-OC(O)OR13，-OC(O)NR13R13和-OC(NH)NR13R13。
3.根据第1项所述的缀合物，其中所述生色部分选自罗丹明和荧光素，及其盐。
4.根据第1项所述的缀合物，其中所述生色部分选自罗丹明，罗丹明6G，四甲基罗丹明，罗丹明B，罗丹明101，罗丹明110，荧光素，和O-羧基甲基荧光素。
5.根据第1至4项中任一项所述的缀合物，其中所述生色部分是2'-哌嗪酰胺衍生物。
6.根据第1至5项中任一项所述的生色缀合物，其中所述生色缀合物选自表1中所示的分子和＝N部分的盐。
7.根据第1至6项中任一项所述的缀合物，其中R23是-OH且R24是-H。
8.根据第1至6项中任一项所述的缀合物，其中R21或R25中的任一个是-OH，R22和R24是-H，R23是-OH。
9.根据第1至6项中任一项所述的缀合物，其中所述过氧化物酶底物是阿魏酸，肉桂酸，咖啡酸，芥子酸，2,4-二羟基肉桂酸或4-羟基肉桂酸(香豆酸)的残基。
10.根据第1至9中任一项所述的缀合物，其中所述连接基是包含1或2个式III的重复单元的化合物：
其中R31选自甲基，乙基，丙基，OCH2，CH2OCH2，(CH2OCH2)2，NHCH2，NH(CH2)2，CH2NHCH2，环烷基，烷基-环烷基，烷基-环烷基-烷基，杂环基(例如具有4至8个原子的含氮环)，烷基-杂环基，烷基-杂环基-烷基，并且其中不多于3个连续重复的乙氧基，R32和R33独立地选自NH和O。
11.根据第1至10项中任一项所述的缀合物，其中所述连接基选自式IIIa、IIIb、或IIIc的部分：
12.一种组合物，其包含至少一种根据第1至11项中任一项所述的生色缀合物和溶剂以及任选的以下物质中的一种或多种：(i)有机改性剂；(ii)酶增强剂；(iii)铁螯合剂；(iv)洗涤剂；(v)抗菌剂；(vi)有机或无机盐；或(vii)酶底物。
13.用于检测样品中的具有过氧化物酶活性或连接于过氧化物酶的靶标的成套用品，所述成套用品包括至少一种根据第1至11项中任一项的生色缀合物。
14.通过生色检测来检测样品中的靶标的方法，所述方法包括：
培育推测在水溶液中包含靶标的样品，其中所述靶标包含过氧化物酶活性，或者所述靶标直接或间接连接于过氧化物酶，其中所述水溶液包含：
a)至少一种第1至11项中任一项所述的生色缀合物；
b)过氧化物化合物；
检测所述样品中的所述生色缀合物的有色沉淀物，由此检测所述样品中的靶标。
15.根据第14项所述的方法，其进一步包括用具有式IX或式XIV的第二生色缀合物培育所述样品：
其中X为-OH，-ORX或-NRXRXX，
其中Y为＝O或＝N+RYRYY；
其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、RX、RXX、RY、和RYY独立地选自氢和具有小于40个原子的取代基；
L是包含5至29个连续连接原子的直链的连接基；和
PS为过氧化酶底物部分；
其中X1和X2选自-OH，-ORX和-NRXRXX，X1和X2优选为不同，
其中Y1和Y2选自＝O或＝N+RYRYY，Y1和Y2优选为不同，
其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、RX、RXX、RY、和RYY独立地选自氢和具有小于40个原子的取代基，或者如本申请别处所定义；和
其中R34是甲基，乙基，丙基，OCH2，CH2OCH2，(CH2OCH2)2，NHCH2，NH(CH2)2，CH2NHCH2，环烷基，烷基-环烷基，烷基-环烷基-烷基，杂环基(例如具有4至8个原子的含氮环)，烷基-杂环基，或烷基-杂环基-烷基。
16.进行生色原位杂交的方法，其包括：
使核酸靶标与探针接触，所述探针与所述核酸靶标在杂交条件下杂交，其中所述探针包括(1)至少部分与所述核酸靶标互补的核酸序列，和(2)过氧化物酶，或特异性结合对的第一成员；其中所述靶标和探针形成络合物；
当所述探针包括(2)时，使所述络合物与所述特异性结合对的第二成员接触，其中所述特异性结合对的第二成员接触，其中所述第二成员直接或间接连接于过氧化物酶、并且特异性结合于所述第一成员；
用至少一种第1至11项中任一项所述的生色缀合物培育所述络合物；所述培育进行足以在所述靶标形成有色沉淀物的时间和温度；
检测所述有色沉淀物。
17.检测两个或更多个靶标的方法，其包括：
在样品中的第一靶标处提供过氧化物酶活性；
使所述样品与第一生色缀合物接触；
在所述第一靶标处形成第一有色沉淀物；
从所述第一靶标除去所述过氧化物酶活性；
从所述样品除去未沉淀的第一生色缀合物；
在样品中的第二靶标处提供过氧化物酶活性；
使所述样品与第二生色缀合物接触；
在所述第二靶标处形成第二有色沉淀物；和
检测所述第一有色沉淀物和所述第二有色沉淀物，从而检测所述样品中的所述第一靶标和第二靶标，
其中所述第一生色缀合物和第二生色缀合物中的至少之一是第1至11项中任一项所述的缀合物，并且其中所述第一生色缀合物分子和所述第二生色缀合物具有一个或多个彼此不同的光谱特征。
18.根据第17项所述的方法，其中所述方法进一步包括：从所述第二靶标除去所述过氧化物酶活性；从所述样品除去未沉淀的第二生色缀合物；在所述样品中的第三靶标处提供过氧化物酶活性；使所述样品与第三生色缀合物接触，所述第三生色缀合物具有一个或多个与所述第一生色缀合物和第二生色缀合物不同的光谱特征。
19.制备罗丹明或荧光素的仲酰胺的方法，所述方法包括：
使罗丹明或荧光素的2'-烷基羧基甲基衍生物与过量的仲胺在适宜的温度在无水溶剂中反应，形成仲酰胺。
20.根据第19项所述的方法，其进一步包括以下步骤：通过使罗丹明和2-卤代乙酰基酯反应制备2'-烷基羧基甲基衍生物。
附图说明
当阅读附图时，根据以下详述可以最好地理解本发明的教导。特征未必按比例绘制。当实践时，同样的附图标记指代同样的特征。
图1是Ki67染色的扁桃体组织的显微照片。左边的照片用化合物2(以下所述)染色；右边的照片用DAB染色。
图2是CK-PAN染色的肝组织的显微照片。左边的照片也用DAB染色；右边的照片用化合物2染色。
图3是CDX-2染色的正常结肠组织的显微照片。左边的照片用DAB染色；右边的照片用化合物2染色。
具体实施方式
术语
应该理解，本申请使用的术语仅针对描述特定实施方式的目的，不意在限制。定义的术语除了定义术语的技术和科技含义之外，还按照本发明教导的技术领域中通常理解和接受的含义。例如，分子生物学中常用术语的定义可见Benjamin Lewin，GenesVII，published by Oxford University Press，2000(ISBN019879276X)；Kendrew et al.(eds.)，The Encyclopedia of Molecular Biology，published by BlackwellPublishers，1994(ISBN 0632021829)；和Robert A.Meyers(ed.)，Molecular Biology andBiotechnology:a Comprehensive Desk Reference，published by Wiley，John&Sons，Inc.，1995(ISBN0471186341)；和其它类似的参考文献。
正如说明书和所附权利要求中使用，除非上下文明确地相反指出，否则术语"一个"、"一种"和"这个"包括单数和复数指代物两者。因此，例如，"一个部分"包括一个装置和多个部分。
正如说明书和所附权利要求中使用且除了它们的常见含义之外，术语"基本上"或"基本上地"表示本领域技术人员可接受的界限或程度之内。例如，"基本上删除的"表示本领域技术人员认为删除可接受。
正如说明书和所附权利要求中使用且除了它们的常见含义之外，术语"大约"和"约"表示本领域技术人员可接受的界限或量之内。术语"约"通常指代指定数字±15％。例如，"约10"可以指示8.7至1.15的范围。例如，"大约相同"表示本领域技术人员认为项目经比较是相同的。
"部分(moiety)"是分子的保持整个分子与生色缀合物性能相关的化学和/或物理和/或功能特征的部分；例如，"过氧化物酶底物部分"是分子的能够用作具有过氧化物酶活性的酶的底物的部分；"过氧化物酶部分"是分子的具有固有过氧化物酶活性的部分，例如酶。
"缀合物"是指共价连接成较大构建体的两个或更多个分子(或两个或更多个分子的两个或更多个部分)。
本申请上下文中的术语"连接的"表示经化学键连接。
"靶标"是待通过使用本发明生色缀合物和方法检测的测试样品中的物体；本发明靶标包括化学和生物分子和结构。本发明靶标的实施方式在本申请讨论。
"生物标志物"是指与对于特定细胞类型、组织、细胞结构、生理条件等为特征性的特征相关的一个或多个生物物体，例如分子，分子络合物，结构，颗粒或有机体。通常认为这样的生物物体是该特定细胞类型、组织、细胞结构、生理条件的标志物。这样的生物标志物的非限制性实例包括但不限于特定的核苷酸序列、蛋白质或其它生物分子，例如碳水化合物或脂质，染色体或细胞膜结构，病毒，细菌，微生物等。在一些实施方式中，术语靶标可与术语生物标志物互换使用，并且涉及对于特定细胞类型、组织、生理条件等为特征性的分子、分子络合物、结构或颗粒，其中认为测试样品中的任何后者生物标志物的总群体是靶标。
"光谱特征"是由于下述分子或部分发射或吸收的电磁辐射的特征，所述分子或部分使得从一个能态转变到另一能态，例如从较高能态转变到较低能态。在分子的或部分的发射光谱中仅出现某些颜色，因为某些频率的光被发射，某些频率的光被吸收。光谱特征可以总结为或称为分子或部分的颜色。
术语"罗丹明"可以表示基于呫吨的相关染料的家族，其包括罗丹明6G和罗丹明B；或术语"罗丹明"可以表示以下具体化合物：
如上下文指示。
术语"荧光素"可以表示基于呫吨的相关染料的家族，其包括荧光素异硫氰酸酯，NHS-荧光素，和O-羧基荧光素；或术语"荧光素"可以表示以下具体化合物：
为了简短，使用某些缩写："Rho"是指罗丹明；"TMRho"是指四甲基罗丹明；"Flu"是指荧光素；"Pip"是指哌嗪；"Cou"是指香豆素；"Caf"是指咖啡酸；"Fer"是指阿魏酸；"Cin"是指肉桂酸；"Tyr"是指酪氨酸；"Et"是指乙基。其它缩写也可以出现在本申请中。
"光谱学窄的"是指由UV-VIS光谱测得的其吸光度最大值在一半峰高度具有小于50nm宽度的色原体，在+99％水中在pH为6-8按10μM浓度测得。"洋红色色原体"是光谱学窄的色原体，其峰值吸光度为525至536nm，在+99％水中在pH为6.0-8.0按10μM浓度测得。"绿黄色色原体"是下述色原体，其峰值吸光度低于475nm，且小于10％的吸光度在530nm或相对于峰值吸光度高于峰值吸光度，在+99％水中在pH为6.0-8.0按10μM浓度测得。"黄色色原体"是下述色原体，其峰值吸光度低于505nm，且小于10％的吸光度在530nm或相对于峰值吸光度高于峰值吸光度，在+99％水中在pH为6.0-8.0按10μM浓度测得。"青色色原体"是下述色原体，其吸光度最大值高于615nm，且小于10％相对于峰值吸光度的相对吸光度在530至400nm之间的任何波长，在+99％水中在pH为6.0-8.0按10μM浓度测得。"橙色色原体"是"光谱学窄的"色原体，其具有495至520nm的吸光度最大值，在+99％水中在pH为6-8按10μM浓度测得。"二色性色原体"是下述色原体，其具有至少两个吸光度最大值，它们隔开至少50nm宽的局部最小值和再一个在390至700nm之间的整体最小值，在水中在pH为6至8测得。
发明详述
在以下的发明详述中，为了解释和不产生限制，陈述公开具体详情的代表性实施方式以便提供对本发明教导的彻底理解。可以省略已知系统、化合物、材料、使用方法和制造方法的描述或详情，由此避免使实例实施方式模糊不清。但是，本领域技术人员视界内的系统、部分和方法可以根据代表性实施方式使用。
本申请提供生色过氧化物酶底物缀合物(本申请可互换地称为"生色缀合物"，"缀合物分子"或"报告物分子")。本发明缀合物分子将DAB的一个或多个优点组合，而没有一个或多个缺点。
本发明生色缀合物的实施方式包括包括连接于生色部分的过氧化物酶底物部分的分子，它们(a)是无毒的，(b)经HRP-介导的反应从溶液沉淀作为明亮和光谱上窄的和强烈的染剂；(c)一旦混合，在水溶液中稳定超过24小时；和/或(d)当沉淀时不溶于有机溶剂。
在一些实施方式中，本申请的生色缀合物吸收和/或发射约450nm至约600nm范围内的光。在一些实施方式中，生色缀合物吸收536nm的光，染剂的颜色可以定义为洋红色。在一些实施方式中，生色缀合物是黄色的并且吸收450nm的光。在一些实施方式中，生色缀合物是紫色的并且吸收接近600nm的光。本发明生色缀合物的实施方式可以用作过氧化物酶的底物，例如HRP，它们在光谱上较窄，不是二色性的，且当沉淀时不会改变它们的光谱特征；经生色缀合物的酶沉淀制备的染剂在水或有机溶液中的溶解性就算有也很差，当暴露于用于使染色样品成像的光源时不会漂泊。这些特征使得本发明生色缀合物特别适于自动图像分析和复用。此外，生色缀合物的分子具有定义明确的化学结构并且可容易通过本申请所述的方法制备。
生色缀合物分子
本发明生色缀合物的一些实施方式可以由通式(I)表示：
(S)-L-(Z)，
其中S是过氧化物酶底物部分，
Z是生色部分，
L是连接基，
其中生色缀合物分子具有以下特征中的一种、两种、三种、四种、五种或全部，且优选为全部特征：(1)包括过氧化物酶的一个底物部分，例如HRP底物；(2)包括一个生色部分，其为Rho或Flu 2’-酯或2’-仲酰胺衍生物；(3)酶底物和生色部分经水溶性连接基化合物连接在一起并且彼此相隔的距离为至少5个连续相互连接的原子，(4)连接基化合物(在本申请也称为"连接基分子"、"连接基"或"L")包括5-29个相互连接的原子的链(对应缩写为"L5-L29")；其中，在一些优选的实施方式中，连接基化合物包括两个连续的碳然后是一个氧或氮原子；(5)缀合物基本上可溶于水溶液中；(6)缀合物作为在溶液中的和作为沉淀物的色原体均是基本上稳定的。
表1展示本发明生色缀合物的一些非限制性实例：
表1
表2列出了这些缀合物的质量和吸收：
表2
如表2所示，已经制备了具有相异的最大吸收的生色缀合物。这使得能够用一种或多种相异的颜色将组织样品染色。例如，分析样品的方法可以包括：用化合物14标记第一靶标，使得在样品的位置用洋红色染剂检测或识别第一靶标，和用化合物5标记第二靶标，使得将第二靶标作为紫色染剂检测和识别。
出乎意料地，在具有哌嗪和醚的生色缀合物的峰值吸光度中观察到系统趋势。哌嗪酰胺与相应罗丹明和荧光素相比吸收的光高约15nm，含酯缀合物与相应罗丹明和荧光素相比吸收的光高约10nm。这使得能够细调生色缀合物的色调。
生色部分
生色缀合物可以包括能够提供可见颜色的生色部分。生色部分可以是呫吨衍生物，例如荧光素、对甲氨基酚或罗丹明残基。
在一些实施方式中，生色缀合物包括(a)生色部分，和(b)过氧化物酶底物部分，其中生色部分和过氧化物酶部分经连接基连接在一起，并且其中连接基包括至少一个具有至少5个连续连接的原子的直链。例如，生色缀合物可以是式I化合物：
其中X是-OH，-ORX或-NRXRXX，
其中Y是＝O或＝N+RYRYY；
其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、RX、RXX、RY、和RYY独立地选自氢和具有小于40个原子的取代基；
L是连接基；和
PS是过氧化物酶底物部分。
在一些实施方式中，可以优选残基X和Y的某些组合。例如，如果X是-OH或-ORX，则优选Y为＝O。在另一种优选的组合中，如果X是-NRXRXX，则Y是＝N+RYRYY。
在式I的生色缀合物的一些实施方式中，R1选自氢，R11，任选取代有一个或多个相同或不同R14基团的(C1-C20)烷基或杂烷基，任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的(C5-C20)芳基或杂芳基，和任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的(C6-C40)芳基烷基或杂芳基烷基，或者，R1可以与R2一起形成任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的苯并、萘并或多环亚芳基并基团。
在式I的生色缀合物的一些实施方式中，R2选自氢，R11，任选取代有一个或多个相同或不同R14基团的(C1-C20)烷基或杂烷基，任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的(C5-C20)芳基或杂芳基，和任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的(C6-C40)芳基烷基或杂芳基烷基，或者，R2可以与R1一起形成任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的苯并、萘并或多环亚芳基并基团，或者，当X是-NRXRXX时，R2可以与RX一起形成任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的5元或6元环。
在式I的生色缀合物的一些实施方式中，RX当存在时选自氢，任选取代有一个或多个相同或不同R14基团的(C1-C20)烷基或杂烷基，任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的(C5-C20)芳基或杂芳基，和任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的(C6-C40)芳基烷基或杂芳基烷基，或者，RX可以与R2一起形成任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的5元或6元环。
在式I的生色缀合物的一些实施方式中，RXX当存在时选自任选取代有一个或多个相同或不同R14基团的(C1-C20)烷基或杂烷基，任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的(C5-C20)芳基或杂芳基，和任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的(C6-C40)芳基烷基或杂芳基烷基，或者，RXX可以与R3一起形成任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的5元或6元环。
在式I的生色缀合物的一些实施方式中，R3选自氢，R11，任选取代有一个或多个相同或不同R14基团的(C1-C20)烷基或杂烷基，任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的(C5-C20)芳基或杂芳基，和任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的(C6-C40)芳基烷基或杂芳基烷基，或者，当X是-NRXRXX时，R3可以与RXX一起形成任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的5元或6元环。
在式I的生色缀合物的一些实施方式中，R4选自氢，R11，任选取代有一个或多个相同或不同R14基团的(C1-C20)烷基或杂烷基，任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的(C5-C20)芳基或杂芳基，和任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的(C6-C40)芳基烷基或杂芳基烷基，或者，当Y是-N+RYRYY时，R4可以与RYY一起形成任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的5元或6元环；Ryy当存在时选自任选取代有一个或多个相同或不同R14基团的(C1-C20)烷基或杂烷基，任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的(C5-C20)芳基或杂芳基，和任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的(C6-C40)芳基烷基或杂芳基烷基，或者，Ryy可以与R4一起形成任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的5元或6元环。
在式I的生色缀合物的一些实施方式中，RY当存在时选自氢，任选取代有一个或多个相同或不同R14基团的(C1-C20)烷基或杂烷基，任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的(C5-C20)芳基或杂芳基，和任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的(C6-C40)芳基烷基或杂芳基烷基，或者，RY可以与R5一起形成任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的5元或6元环。
在式I的生色缀合物的一些实施方式中，RYY当存在时选自任选取代有一个或多个相同或不同R14基团的(C1-C20)烷基或杂烷基，任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的(C5-C20)芳基或杂芳基，和任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的(C6-C40)芳基烷基或杂芳基烷基，或者，RXX可以与R6一起形成任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的5元或6元环。
在式I的生色缀合物的一些实施方式中，R5选自氢，R11，任选取代有一个或多个相同或不同R14基团的(C1-C20)烷基或杂烷基，任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的(C5-C20)芳基或杂芳基，和任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的(C6-C40)芳基烷基或杂芳基烷基，或者，R5可以与R6一起形成任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的苯并、萘并或多环亚芳基并基团，或者，当Y是-N+RYRYY时，R5可以与Ry一起形成任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的5元或6元环。
在式I的生色缀合物的一些实施方式中，R6选自氢，R11，任选取代有一个或多个相同或不同R14基团的(C1-C20)烷基或杂烷基，任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的(C5-C20)芳基或杂芳基，和任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的(C6-C40)芳基烷基或杂芳基烷基，或者，R6可以与R5一起形成任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的苯并、萘并或多环亚芳基并基团。
在式I的生色缀合物的一些实施方式中，R7、R8和R9各自彼此独立地选自氢，R11，任选取代有一个或多个相同或不同R14基团的(C1-C20)烷基或杂烷基，任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的(C5-C20)芳基或杂芳基，和任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的(C6-C40)芳基烷基或杂芳基烷基。
在式I的生色缀合物的一些实施方式中，R10选自氢，R11，任选取代有一个或多个相同或不同R14基团的(C1-C20)烷基或杂烷基，任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的(C5-C20)芳基或杂芳基，和任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的(C6-C40)芳基烷基或杂芳基烷基，卤素，卤代烷基，-OR12，-SR12，-SOR12，-SO2R12，和腈。
在一些实施方式中，R11选自-NR15R15，-OR16，-SR16，卤素，卤代烷基，-CN，-NC，-OCN，-SCN，-NO，-NO2，-N3，-S(O)R16，-S(O)2R16，-S(O)2OR16，-S(O)NR15R15，-S(O)2NR15R15，-OS(O)R16，-OS(O)2R16，-OS(O)2NR15R15，-OP(O)2R16，-OP(O)3R16R16，-P(O)3R16R16，-C(O)R16，-C(O)OR16，-C(O)NR15R15，-C(NH)NR15R15，-OC(O)R16，-OC(O)OR16，-OC(O)NR15R15和-OC(NH)NR15R15。
在一些实施方式中，R12选自任选取代有亲脂性取代基的(C1-C20)烷基或杂烷基，任选取代有亲脂性取代基的(C5-C20)芳基或杂芳基和任选取代有亲脂性取代基的(C2-C26)芳基烷基或杂芳基烷基。
在一些实施方式中，R13选自氢，(C1-C8)烷基或杂烷基，(C5-C20)芳基或杂芳基和(C6-C28)芳基烷基或杂芳基烷基。
在一些实施方式中，R14选自-NR15R15，＝O，-OR16，＝S，-SR16，＝NR16，＝NOR16，卤素，卤代烷基，-CN，-NC，-OCN，-SCN，-NO，-NO2，＝N2，-N3，-S(O)R16，-S(O)2R16，-S(O)2OR16，-S(O)NR15R15，-S(O)2NR15R15，-OS(O)R16，-OS(O)2R16，-OS(O)2NR15R15，-OS(O)2OR16，-OS(O)2NR15R15，-C(O)R16，-C(O)OR16，-C(O)NR15R15，-C(NH)NR15R15，-OC(O)R16，-OC(O)OR16，-OC(O)NR15R15和-OC(NH)NR15R15。
在一些实施方式中，R15各自独立地为氢或R16，或者，R15各自与它们所键接于的氮原子一起形成5元至8元饱和或不饱和环，所述环可以任选包括一个或多个相同或不同的另外的杂原子并且可以任选取代有一个或多个相同或不同R13或R16基团。
在一些实施方式中，R16各自独立地为R13，或取代有一个或多个相同或不同R13或R17基团的R13。
在一些实施方式中，R17各自选自-NR13R13，-OR13，＝S，-SR13，＝NR13，＝NOR13，卤素，卤代烷基，-CN，-NC，-OCN，-SCN，-NO，-NO2，＝N2，-N3，-S(O)R13，-S(O)2R13，-S(O)2OR13，-S(O)NR13R13，-S(O)2NR13R13，-OS(O)R13，-OS(O)2R13，-OS(O)2NR13R13，-OS(O)2OR16，-OS(O)2NR13R13，-C(O)R13，-C(O)OR13，-C(O)NR13R13，-C(NH)NR15R13，-OC(O)R13，-OC(O)OR13，-OC(O)NR13R13和-OC(NH)NR13R13。
在一些实施方式中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、和R10独立地选自-H，-卤素，-甲基，-乙基，-丙基，-异丙基，-乙烯基，-SO3H，-PO3H，-NO2，-COOH，-NH2，-CN，-OH，-OMe和-OEt。
在一些实施方式中，生色部分可以选自：罗丹明，罗丹明6G，四甲基罗丹明，罗丹明B，罗丹明101，罗丹明110，荧光素，和O-羧基甲基荧光素及其盐。在一些其它实施方式中，生色部分可以选自罗丹明116，罗丹明123，罗丹明19。在一些实施方式中，生色部分是包括选自以下阴离子的罗丹明盐：Cl-，Br-，TFA-，和ClO4 -。
二色性色原体是随着浓度改变色调或颜色的色原体。已知二色性色原体的一个实例是南瓜籽油。南瓜籽油主要吸收蓝光，对绿光具有吸光度最小值在远红波长中具有较小的第二吸光度峰。由于通过该油的光路较短，油呈现出微绿色。随着光路增大，颜色从棕色变为红色。如果想要通过光谱法测量南瓜籽油的浓度，则这种变化是有价值的。在低浓度，精确测量可以基于蓝色吸光度。此外，由于吸光度随着浓度增大而增大，使得蓝色吸光度变得不准确(因为蓝光基本上被吸收)，这时可以切换为红色吸光度(这在低浓度是明显不准确的，因为基本上没有吸收红光)。因此，二色性色原体的技术效果是二色性色原体具有扩大的人和仪器感知的动态范围。
二色性效应可以通过混合两种或更多种本申请色原体获得。因为大多数在光谱上非常窄且在可见光谱内吸收，两种色原体的任何混合物都具有足以分开的吸光度最大值，这将为二色性的。
以下描述了将二色性色原体混合以制得随浓度改变色调的色原体的各种实例，称为二色性橙和二色性红。
在一些实施方式中，两个或更多个生色部分相互连接，由此形成具有两种不同吸光度的分子或缀合物。适宜的化合物包括具有式XIV的那些：
其中X1和X2选自-OH，-ORX和-NRXRXX，X1和X2优选为不同，
其中Y1和Y2选自＝O或＝N+RYRYY，Y1和Y2优选为不同，
其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、RX、RXX、RY、和RYY独立地选自氢和具有小于40个原子的取代基，或者如本申请别处所定义；和
其中R34是甲基，乙基，丙基，OCH2，CH2OCH2，(CH2OCH2)2，NHCH2，NH(CH2)2，CH2NHCH2，环烷基，烷基-环烷基，烷基-环烷基-烷基，杂环基(例如具有4至8个原子的含氮环)，烷基-杂环基，或烷基-杂环基-烷基，优选为哌嗪、哌啶、吡咯烷、咪唑烷、吡唑烷、氮杂环丁烷、或其它4元至8元(或者为5元至7元)环或杂环基团，其任选具有胺、羧基或酯取代基。
优选的式XIV化合物吸收具有至少两个相异的吸收最大值的光，例如，第一吸收最大值和第二吸收最大值，它们相隔至少5nm、或为至少10nm、或为至少20nm。
例如，已经制备根据式XIVb的双色的罗丹明6G-荧光素色原体：
该化合物表现出橙-红色。其仍具有Boc基团，因此可以添加过氧化物酶底物例如香豆酸。
在其中缀合物中两个或更多个生色部分相互连接的一些实施方式中，缀合物具有两种不同的吸收。例如，本申请提供式XIVa的FRET缀合物：
其中X1和X2选自-OH、-ORX和-NRXRXX，且X1和X2优选为不同，
其中Y1和Y2选自＝O或＝N+RYRYY，且Y1和Y2优选为不同，
其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、RX、RXX、RY、和RYY独立地选自氢或具有小于40个原子的取代基，或者如本申请别处定义；和
其中R38是4元至8元环烷基或4元至8元杂环基(例如具有4至8个原子的含氮环)，优选为哌啶基或哌嗪基。
优选的式XIVa化合物是下述那些，其中第一生色部分(例如，荧光素衍生物)的发射和第二生色部分(例如，罗丹明衍生物)的吸光度重叠。
在式XIV和XIVa的一些实施方式中，缀合物包括第一生色部分和第二生色部分，第一生色部分是羧基-荧光素，第二生色部分选自罗丹明6G和罗丹明B。
在式XIV和XIVa的一些实施方式中，R1至R10的一个或多个(优选为R10)任选地连接于连接基(L)，且连接基任选地连接于过氧化物酶底物(PS)。式XIV和XIVa的一些实施方式当它们包括经小于30个原子的连接基连接于过氧化物酶底物的生色部分时落入式I的范围内；这样的实施方式不在式I的范围外，只是因为它们包括第二生色部分。通过将两种颜色都构建到同一分子中，在给定位点的两个生色部分之间的比率是固定的。相比之下，当将具有不同颜色的两种色原体混合物时，一种色原体可以优选根据扩散、靶标强度、和其它因素沉淀，这可以产生可变的颜色。
作为再另一个方面，提供根据式IX的生色缀合物：
其中X是-OH，-ORX或-NRXRXX，
其中Y是＝O或＝N+RYRYY；
其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、RX、RXX、RY、和RYY独立地选自氢和具有小于40个原子的取代基；
L是包括具有5至29个连续连接原子的直链的连接基；和
PS是过氧化物酶底物部分，例如本申请定义的过氧化物酶底物。
更特别地，提供根据式IXa的生色缀合物：
其中L是包括具有5至29个连续连接原子的直链的连接基；和
PS是过氧化物酶底物部分，例如本申请定义的过氧化物酶底物。
制备新的色原体，其称为化合物35并且具有下式IXa：
化合物35是在中性水中的吸光度最大值在640nm的青色色原体。化合物35可以与本申请所述的其它生色缀合物组合，以用不同颜色将靶标或样品染色。
连接基
在本申请中，连接基("L")是包含具有5至少于30个邻接原子的链的水溶性分子部分，例如29个、28个、27个、26个、25个、24个、23个、22个、21个、20个、19个、18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个、11个、10个、9个、8个、7个、6个或5个邻接原子。在一些实施方式中，原子的链可以是线型的，在其它实施方式中，其可以包括一个或多个环结构。在优选的实施方式中，连接基分子包括具有5至29个原子的邻接链，其中每两个相连的碳原子之后是杂原子例如氧原子或氮原子。在一些实施方式中，连接基具有不多于两个连续的重复乙氧基。
在一些实施方式中，连接基是是包含1或2个下式的重复单元的化合物：
其中R31选自甲基，乙基，丙基，OCH2，CH2OCH2，(CH2OCH2)2，NHCH2，NH(CH2)2，CH2NHCH2，环烷基，烷基-环烷基，烷基-环烷基-烷基，杂环基(例如具有4至8个原子的含氮环)，烷基-杂环基，烷基-杂环基-烷基，和其中不多于3个连续重复的乙氧基，R32和R33独立地选自NH和O。更特别地，在一些实施方式中，连接基选自式IIIa、IIIb或IIIc：
连接基可以基于连接基前体例如化合物22，其中连接基前体经调整适于与过氧化物酶底物部分和生色部分反应或与过氧化物酶底物部分的反应性前体和生色部分反应。例如，化合物22可以用于如下制备包含式IIIa至IIIc的连接基的缀合物：使化合物22与过氧化物酶底物部分前体例如COMU(活化的香豆酸)和生色部分前体例如四甲基罗丹明哌嗪酰胺氢溴化物反应。
化合物22可以按照以下实施例3中所述或通过其它过程制备。其它连接基和连接基前体可以通过Lohse的WO2007/015168中或其它地方陈述的过程制备。
可以将连接基的性质改性以获得所需性能，例如通过改变连接基的长度或支化来进行。此外，可以将连接基化学修饰以携载各种取代基。可以取代基进一步化学保护和/或活化，从而允许连接基可以进一步衍生化。
过氧化物酶底物部分
本发明生色缀合物包括过氧化物酶底物部分。术语"过氧化物酶"涉及具有催化下述形式的反应的酶活性的酶：
ROOR'+电子供体(2e-)+2H+→ROH+R'OH
对于很多过氧化物酶，最佳底物是过氧化氢，但是其它的活性更大，如有机氢过氧化物例如有机过氧化物。电子供体的性质极大地取决于酶的结构，例如辣根过氧化物酶(HRP)/EC 1.11.1.7)可以使用多种有机化合物作为电子供体和受体两者。HRP具有可接近的活性位点，很多化合物可以达到反应位点。
具有过氧化物酶活性的酶可以由过氧化物酶的分子或包含酶活性的酶的片段表示，所述酶分子直接或间接连接于结合剂的分子，所述片段占过氧化物酶分子整个尺寸的例如51％至99.9％，或小于51％。
过氧化物酶可以与其它分子直接或间接缀合，其它分子例如为能够结合样品(例如生物样品，例如组织学样品)中有用靶标的试剂。术语"直接缀合"表示酶部分经化学键连接(例如化学缀合)于另一分子；术语"间接缀合"表示过氧化物酶经连接基分子连接于分子，所述连接基分子具有一个与结合剂键合的化学键和另一个与过氧化物酶键合的化学键。将酶部分缀合的方法是本领域公知的。
在一种实施方式中，过氧化物酶的部分是HRP的部分，例如整个HRP分子，其能够表现HRP酶活性的片段。其也可以为包括具有酶活性的HRP的部分等的重组蛋白。在另一种实施方式中，过氧化物酶可以是大豆过氧化物酶(SP)。
包括具有过氧化物酶活性的酶的试剂的非限制性实例可以是抗体分子，例如直接或间接与HRP的一个或多个部分缀合的初级抗体或二级抗体分子或其衍生物例如Fab，和与HRP缀合的核酸结合剂。这样的结合剂可以直接或间接结合于靶标并由此形成络合物，所述络合物各自包含靶标以及包括具有过氧化物酶活性的酶的结合剂的一个或多个分子。
对于每个结合剂分子，HRP或其它过氧化物酶部分的数目可以为1至10或更多，例如20-50或更多。
包括过氧化物酶活性的固体样品(例如组织学样品)或固体载体(例如膜或显微镜载玻片)的位置在本申请有时称为"靶标位点"。在一种实施方式中，靶标位点可以包括过氧化物酶活性，例如过氧化物酶的部分，其直接固定在固体载体之上或之内。在另一种实施方式中，靶标位点可以包括过氧化物酶活性，其直接固定在固体载体之上或之内，即过氧化物酶的部分连接于能够直接或间接结合于固定在载体之上或之内的靶标的试剂。
在一些实施方式中，过氧化物酶部分是辣根过氧化物酶(HRP)或大豆过氧化物酶(SP)的底物的部分。在一些实施方式中，过氧化物酶部分(在一些式中也标为S或PS)是非生色的或无色的HRP或SP底物的部分。在一些实施方式中，过氧化物酶底物的部分具有下式(式II)：
其中
R21是-H，-O-X，或N(X)2；
R22是-H，-O-X，或-N(X)2；
R23是-OH；
R24是-H，-O-X，或-N(X)2；
R25是-H，-O-X，或N(X)2；
R26是-CON-(X)(2)，-CONH(X)，或COO(X)；
其中H是氢；O是氧；N是氮；X是H，烷基或芳基。在一些实施方式中，S或PS是阿魏酸的残基。在其它实施方式中，S是咖啡酸的残基。在其它实施方式中，S或PS是芥子酸的残基。在一种优选的实施方式中，S是香豆酸的残基。
包含生色缀合物的组合物
作为另一方面，提供包含任何本申请所述生色缀合物的组合物(本申请称为"生色组合物"或"生色介质")。一些组合物包括本申请所述的生色缀合物之一。其它组合物包括本申请所述的生色缀合物中的两种或更多种，例如，精确的两种生色缀合物(即，两种类型的生色分子，而非精确的两种分子)或精确的三种生色缀合物、或精确的四种生色缀合物。
组合物可以包含一种或多种溶剂、盐、洗涤剂、和其它组分。在不同的实施方中，生色组合物可以进一步包括以下的一种或多种：(i)有机改性剂；(ii)酶增强剂；(iii)铁螯合剂；(iv)洗涤剂；(v)抗菌剂；(vi)有机或无机盐；(vii)酶底物，例如过氧化物酶底物。加入生色组合物的添加剂的清单并非限制性的，能够增强或削弱本发明生色缀合物作为过氧化物酶底物或生色分子的性能的任何化合物根据其使用实施方式可以作为组合物的一部分。
在一些实施方式中，生色组合物或介质可以包含任何液体溶剂，优选为水性溶剂(水)，其中生色缀合物最初可溶但是能够反应以在过氧化物酶活性的位点形成不溶性沉淀物。液体溶剂可以包含主要溶剂例如水和有机助溶剂例如NMP或2-吡咯烷酮。液体溶剂可以包含具有适当缓冲能力的缓冲剂，例如，磷酸盐缓冲的盐水(PBS)，Tris缓冲液，和/或咪唑缓冲液。组合物可以是具有以下pH值的缓冲的水溶液：3至9，或者为约3至约6，或者为约4至约7，或者为约5至约8。
在一些实施方式中，生色组合物或介质可以包含有机或无机盐。无机盐可以选自氯化钠，氯化镁，氯化钾，氯化钙，磷酸钠，或硫酸铵，及其组合。有机盐可以选自乙酸钠，乙酸铵或咪唑盐例如咪唑盐酸盐，或其它。盐的浓度可以为约10-3M至饱和度，例如，约20mM至约200mM，或约25mM至约100mM。在一些实施方式中，介质可以包含以下浓度的盐：约10mM，20mM，50mM，75mM或100mM。
在一些实施方式中，生色组合物可以包括：洗涤剂例如聚乙二醇-对-异丁基苯基醚(NP-40)，或表面活性剂例如选自以下的表面活性剂：基于单月桂酸聚乙二醇山梨醇酐酯的表面活性剂(Tween)，或基于嵌段共聚物的表面活性剂(pluronic等)或其它。洗涤剂的量可以为约0.001％至约5％，或基于v/v或基于w/v。
在一些实施方式中，有机改性剂在组合物中的存在量可以为约1％至约20％(v/v或w/v)，但是，在一些实施方式中，可能需要较高浓度的有机改性剂。有机改性剂可以是例如聚乙二醇(PEG)。其它实例包括但不限于选自以下的有机改性剂：C1-C4醇，N-甲基吡咯烷酮(NMP)，二甲基亚砜(DMSO)，单乙二醇和二乙二醇，环丁砜，N,N-二甲基甲酰胺(DMF)及其组合。在一些实施方式中，可以有利地使用聚乙二醇(PEG)，例如，PEG2000，或丙二醇。聚乙二醇或其它有机改性剂在组合物中的量可以为约0.1％(v/v)至约20％(v/v)，例如约1％(v/v)至约15％(v/v)，例如5-10％(v/v)。
术语"酶增强剂"表示增强过氧化物酶的催化活性的任何化合物。这样的酶增强剂可以选自苯基亚硼酸衍生物和二价金属离子例如镍或钙。酶增强剂的量可以为约10-7至约10-3M。
铁螯合剂的实例包括乙二胺四乙酸(EDTA)或乙二胺羟基苯基乙酸类型螯合剂(EDHPA)。铁螯合剂的浓度可以为约10-9至约10-6M。
生色组合物可以作为稳定溶液提供。本发明上下文中的术语"稳定的"表示生色组合物用作过氧化物酶-介导的缀合物沉淀的反应介质的能力和生色缀合物使在显著的时间段过程中相同的光谱特征基本上保持不变的能力；例如可以制备组合物并将其在使用前在室温保持至少4小时。也可以制备组合物并将其进行防腐保护以保持较长的时间段，例如12小时至12个月，或更长的时间段。为延长生色组合物的保存期限，以下可是有用的：将组合物在低于20℃的温度例如在4-10℃储存，和/或向组合物中添加抗菌化合物。抗菌化合物可以是通常用于生色化合物的任何抗菌化合物。
生色缀合物在组合物中的浓度可以为约10-9M至约10-2M，这取决于使用方法的特性。例如约10-5M至约10-3M，例如约10-4M至约10-3M。
在一些实施方式中，生色组合物也可以包含过氧化物化合物。例如，介质可以包括过氧化氢(H2O2)，例如，其浓度为0.0002％至0.04％，或约0.5mM至约1.5mM。在一些实施方式中，当生色组合物包含过氧化物化合物时，在没有进行以上讨论的改变特征的情况下，组合物的稳定性可能降至例如1-2周储存期。
在一些实施方式中，本发明组合物基本上不含本申请生色缀合物的过氧化物酶底物部分之外的过氧化物酶底物和过氧化物化合物。
如上提及，在一些实施方式中，本发明组合物可以包含洗涤剂。在一些优选的实施方式中，洗涤剂是非离子的非变性洗涤剂。在一些实施方式中，组合物包含0.001％至10％的洗涤剂，或者0.01％至1％、或者0.05％至0.5％。
在一些实施方式中，双组份制剂提供为成套用品或用于方法。第一组分包含在缓冲液中的本申请所述的生色缀合物，所述缓冲液具有较低的pH(例如pH为4至5，例如，pH为4.8)以避免随时间水解。第二组分是具有较高pH(例如pH为7-8，例如，pH为7.4)的过氧化氢的缓冲溶液。两种组分当混合时形成具有中间pH(例如pH为6-7，例如，pH为6.8)的工作溶液。这样的双组份制剂可以通过仪器混合或手动混合，并且在冷室温具有2年以上的保存期限。制剂当在室温混合在一起时具有3周稳定性。
在一些实施方式中，生色组合物包含有机助溶剂，例如2-10％v/v的有机助溶剂，已经发现这会得到显著增强的染色强度。适宜的有机助溶剂是2-吡咯烷酮和NMP。
使用方法
作为另一个方面，提供在各种分析、技术和步骤中使用本申请所述生色缀合物和包含那些缀合物的组合物的方法，在所述分析、技术和步骤中将样品、组织、或其部分染色或着色。例如，本发明生色缀合物用于检测样品中的分子靶标例如生物或化学分子、分子结构等，其中使用用于检测和视觉化这些靶标的一系列实验方案，例如，免疫组织化学(IHC)，原位杂交(ISH)，ELISA，Southern印迹，Northern印迹，和Western印迹。通常，本发明生色缀合物可以用于其中DAB已经用作视觉化靶标的染剂的任何分析。与WO2009/036760、WO2010/094283、WO2010/094284、WO2011/047680和WO2012/143010中所述的缀合物相比，本发明生色缀合物不需要存在交联剂例如DAB、ACHC或阿魏酸来介导上述生色缀合物在过氧化物酶的存在下沉淀。生色缀合物可以用于检测固体或半固体样品好的分子靶标或固定在固体载体之上或之中的靶标，所述固体载体例如为显微镜载玻片，硝化纤维素膜，微阵列芯片，凝胶，和其它载体。
例如，本发明生色缀合物可以用于使福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织样品、中期分裂相或组织学"涂片"染色或着色。本发明生色缀合物可以用于免疫组织化学分析方法，其中通过颜色检测或识别有用的蛋白质。本发明生色缀合物可以用于生色原位杂交(CISH)，其中通过颜色检测或识别有用的核酸。
本发明方法如下进行：将靶标与分子或部分过氧化物酶活性(通常为辣根过氧化物酶(HRP)或具有该酶活性的片段)连接，然后催化在靶标的位置由本申请所述的任何可溶性生色缀合物形成不溶性有色沉淀物。
本发明缀合物优于用于具有棕色色彩的细胞、组织和其它类型样品色原体例如DAB。例如，黑色素瘤性质上已经是棕色的，与吸烟或城市空气污染造成的很多肺癌样本一样。对于这些样品，DAB特别不适用于染色来自罹患这两种主要类型癌症的患者的样本。因此，作为另一个方面，提供用于将具有天然棕色的样品染色的方法，这通过施用本发明缀合物、特别是红色、黄色或蓝色生色缀合物进行。在一些实施方式中，将本发明生色缀合物中的一种、两种或更多种与包括棕色组织的样品(例如，包括肺癌细胞、黑色素瘤细胞、生黑色素细胞、痣组织(mole tissue)、扁桃体组织、或肝组织的样品)接触。优选地，缀合物为化合物2。本发明缀合物也可以有利地用于检测样品中的多个靶标。
在本发明方法中，在将本发明缀合物施用于样品之前，可以将一种或多种结合剂施用于样品。术语"结合剂"是指能够直接或间接结合于靶标的分子，其中术语"直接"表示结合剂与靶标具有亲和性并且能够识别靶标和特异性地结合于靶标，其中术语"间接"表示结合剂与靶标不具有特异性亲和性但是与关联靶标的物质具有亲和性并且能够特异性结合于该物质。能够直接结合于靶标的结合剂有时称为"初级结合剂"。能够间接结合于靶标的结合剂有时称为"二级结合剂"。初级结合剂通常用于接触样品。其包括将特异性结合于推测存在于样品中的靶标的任何分子。二级结合剂可以是结合初级结合剂的任何分子。使用本发明缀合物来将靶标视觉化的检测系统可以包括其它结合剂，例如三级或四级结合剂；检测系统可以包括针对于检测样品中各种靶标例如两种或更多种不同分子(例如两种或更多种蛋白质，或一种蛋白质和一种核酸)的几种初级结合剂，或者包括针对于检测样品中同一靶标例如检测有用基因的多个分子探针的几种初级结合剂。检测系统也可以包括几种二级结合剂，其可以是相同种类的分子例如抗体，或不同种类的分子例如抗体和核酸。
在靶标不固有包括过氧化物酶活性的情况中，用于在本发明的视觉化系统中检测样品中的靶标的结合剂中的至少一种包括过氧化物酶活性，以便用过氧化物酶活性标记靶标在样品中的位置。
本发明缀合物分子可以特别有利地用于复用方法，在复用方法中需要染色或着色多于一个靶标。如上所述，本发明缀合物分子具有有利的光学特征，其允许以不同颜色染色的靶标之间具有清楚的差异，均是通过观察染色样品例如组织学样品的显微镜视野、和分析染色样品的捕获图像进行。另一个优点是，缀合物是同一酶(即，过氧化物酶)的底物，例如HRP或SP。这显著简化了染色样品中多个靶标的过程，提高了染色过程的鲁棒性，因为这一个相同的规程和相同的试剂可以通过利用不同缀合物来用于检测靶标。其也可以使总体检测过程较便宜且特别适于自动化染色、染色样品的成像和染色结果的分析。
本发明方法和成套用品可以包括能够监测固体样品中的靶标或固定在固体载体之上或之中的靶标的任何结合剂。例如，结合剂可以是免疫特异性结合对例如抗体和抗原，或非免疫特异性结合对例如核酸探针和互补序列，或另一种类型例如生物素和抗生物素蛋白。各种类型的结合剂是本领域的公知常识，对结合剂的描述可见Q.Ashton Acton，ed.，"Antigens—Advances in Research and Application:2013Edition"，ScholarlyEditions or Ralph Raply，ed，"The Nucleic Acid Protocols Handbook"，HumanaPress。
通常，在本发明的靶标检测方法中，将包含靶标的样品在一种或多种培育介质中相继培育。术语"培育介质"在本发明内容中表示包含特定化合物的含水介质，其中在一定时间段(本申请称为"培育时间")过程中维持样品，以便允许在溶液的特定化合物和样品之间的所需反应发生。培育介质可以是下述介质，在该介质中靶标由结合剂("结合剂介质")天然发现、或者其可以是本发明生色组合物(例如如以上部分所述的那些)之一。
用于在培育介质中维持和/或培育样品的时间，即培育时间，可以为约3秒至过夜，例如，约10秒，20秒，30秒，1分钟，2分钟等，例如，3-10分钟，10-20分钟，20-40分钟，40-60分钟，1-2小时或更长，例如，过夜。在一种实施方式中，在检测过程的所有步骤的培育时间可以具有相同的持续时间，即每次培育可以持续1分钟、2分钟、3分钟、5分钟、10分钟等。时间可以基于使用的实施方式选择。在另一种实施方式中，不同步骤之间的培育时间可以变化，例如，样品在在包含结合剂的介质中的培育可以持续1分钟至过夜，样品在生色缀合物和过氧化物化合物的介质中的培育可以持续1分钟至15分钟或更长。
根据靶标、结合剂、缀合物等的类型，培育可以在各种温度条件下进行。检测过程主要取决于温度，但是，如果期望，温度可以用于调节培育时间的持续时间，例如，较低的温度可以用于延长培育时间，反之亦然，较高的温度可以用于缩短培育时间。
从根本上说，结合剂介质是一种或多种结合剂的缓冲的水溶液，其pH为4至9。在一些实施方式中，第一培育介质可以包含有机或无机盐。无机盐可以选自，例如，氯化钠，氯化镁，氯化钾，氯化钙，磷酸钠，或硫酸铵。有机盐可以选自，例如，乙酸钠，乙酸铵或咪唑盐例如咪唑盐酸盐等。
盐在结合剂介质中的量可以为约10-3M至饱和度，例如，约20mM至约200mM，或约50mM至约500mM。在一些实施方式中，介质可以包含量为约10mM至500mM的盐。在其它实施方式中，介质可以不含盐。
正如所述，通常，结合剂介质的pH值可以为约4至约9，例如在pH 3.5和pH 9.5之间，例如，在pH 5和pH 7之间，在pH 5.5和pH 6.5之间或在pH 6.5和7.5之间，或在pH 7和pH8之间，或在pH 7.5和pH 8.5之间，或pH 8和pH 9。可以使用具有适宜缓冲能力的任何缓冲剂，例如，磷酸盐缓冲的盐水(PBS)和咪唑缓冲液。其它适宜的缓冲剂可见Good，NE.，et al(1966)Hydrogen ion buffers for biological research.Biochem.5(2)，467-477。介质的pH值可能对于结合剂与靶标的结合是必要的；其可以根据结合剂和靶标的性质优化。
在一些实施方式中，结合剂介质可以包括有机改性剂(术语"有机改性剂"表示任何非水溶剂)，例如，N-甲基吡咯烷酮(NMP)，二甲基亚砜(DMSO)，单乙二醇和二乙二醇，环丁砜，N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，聚乙二醇(PEG)，丙二醇等。有机改性剂的量可以在约1％至约20％(v/v或w/v)的范围内变化，或在一些实施方式中，高于20％。
在一些实施方式中，结合剂介质可以包括洗涤剂，例如，聚乙二醇-对-异丁基苯基醚(NP-40)，或表面活性剂例如选自以下的表面活性剂：基于单月桂酸聚乙二醇山梨醇酐酯的表面活性剂(Tween)，或基于嵌段共聚物的表面活性剂(pluronic等)等。洗涤剂的量可以为约0.001％至约5％，或基于v/v或基于w/v。在一些实施方式中，结合剂介质可以包括结合剂的稳定剂，例如，牛血清白蛋白或葡聚糖。稳定剂的量可以为0.01％至20％(w/v)。
在一些实施方式中，结合剂介质可以包括离子螯合剂(例如，乙二胺四乙酸(EDTA)或乙二胺羟基苯基乙酸类型螯合剂(EDHPA)等)。螯合剂的量可以从约10-9M至约10-6M变化。
在一些实施方式中，结合剂介质可以包含用于使非特异性结合位点饱和的一种或多种阻滞剂，所述位点即为不包含靶标的固体载体的位点。适于不同实施方式的阻滞剂的一些非限制性实例可以为Denhard溶液，牛血清白蛋白，脱脂乳等。
由于可以使用众多种类的靶标、结合剂和测定形式，因此结合剂介质的组成可以变化并且可以使用本领域的知识针对特定实施方式调整。
本发明方法也包括一个或多个洗涤步骤，其在使用洗涤介质培育样品之前或之后，例如，在用结合剂培育样品的步骤和用本发明生色缀合物中的一种或多种将样品染色的步骤之间。通常，洗涤介质将为与已经用于在洗涤步骤之前的步骤中培育样品或以其它方式处理样品的组合物相同或相似的组合物，其中洗涤介质缺少活性成分，即培育步骤的特定试剂，例如，结合剂，缀合物分子等。
本发明方法可以包括以下一个或多个步骤：在介质中培育样品，所述介质将淬灭任何不期望的过氧化物酶活性，例如样品中的内源性过氧化物酶活性或与靶标位点相关的残留过氧化物酶活性。通常，在过氧化物酶活性淬灭介质培育样品将在用结合剂培育样品的步骤之前，或者当检测样品中的几个靶标时，其将在用第一缀合物将第一靶标视觉化之后和在用涉及第二靶标的第二结合剂培育样品之前发生。过氧化物酶活性淬灭介质将通常包含一定量的过氧化物化合物，例如过氧化氢。过氧化物化合物在介质中的量可以为1％至10％(v/v或w/v)。
本发明方法和用途包括其中使用本发明生色缀合物的各种形式的测定。通常，其中可以使用缀合物的测定是其中可以使用DAB的那些测定中的任何测定。这样的测定形式的一些非限制性实施方式如下所述。
靶标或生物标志物可以存在于细胞或组织中，并且它们可以使用本申请所述的方法在任何适宜的测定形式中检测，例如在免疫组织化学(IHC)、或生色原位杂交(CISH)、或ELISA中。
在一些实施方式中，靶标可以是蛋白质，例如细胞膜受体或细胞质蛋白，在其它实施方式中，靶标可以是核酸，例如细胞质核酸。任何后者提及的靶标的衍生物，例如靶标蛋白质或核酸等的片段、前体、突变体，也可以是一些实施方式中的靶标。
因此，在各种实施方式中，靶标可以是生物或化学靶标分子，或颗粒，或分子或细胞络合物，或分子或细胞结构，或病毒，或微生物，或所述靶标分子、颗粒、络合物、结构、病毒或微生物的片段。在化学和环境样品中包含的靶标尤其可以是污染物质，毒素，战争物质，分子文库的成员，工业有害废物化合物等。
在一些实施方式中，生物样品可以是细胞或组织切片的悬浮液。在悬浮液中的靶标分子或细胞的结构可以使用ELISA、IHC或CISH检测。当ELISA、IHC或ISH用于检测悬浮液的细胞时，其连接于固体载体，例如，ELISA板或载玻片。
在IHC或CISH中用于细胞、组织或其它样品的制备和加工步骤是本领域公知的。对于各种步骤的描述，参见例如"Immunohistochemical Staining Methods"，Dako IHCGuidebook，6th Ed(2013)；van der Loos，"User Protocol:Practical Guide toMultiple Staining"，Cambridge Research&Instrumentation，Inc.(2009)；"Immunohistochemistry(IHC)an Application Guide"，Abcam，(2013)；"Handbook ofPractical Immunohistochemistry"，Lin&Prichard ed.(2015)；Immunohistochemistryand In Situ Hybridization of Human Carcinomas"，Hayat ed.(2005)。
在CISH中，获取样品并使其暴露于核酸结合剂，其借助于靶标核酸的互补碱基对杂交。通常使样品中的靶标核酸变性以暴露结合位点。在本发明的测定中，结合剂已经连接于或连接于过氧化物酶，一种或多种本发明生色缀合物之后与样品接触。靶标核酸的存在或量通过手动或自动视觉识别色原体来检测。
在IHC中，获取样品并使其暴露于结合剂例如抗体或其片段，所述结合剂特异性结合靶标分子例如细胞表面蛋白。在本发明的测定中，结合剂例如经二级抗体经连接于或连接于过氧化物酶，一种或多种本发明生色缀合物之后与样品接触。靶标分子的存在或量通过手动或自动视觉识别色原体来检测。
在本发明的测定中，光镜通常称为光学显微镜，其使用可见光和透镜系统以放大包含生色缀合物的小样品的图像。明视场显微镜法是简单的光学显微镜照明技术。将样品用白光照明，样品中的反差通过样品的密集区中一些透射光的吸光度引致。明视场显微镜图像的典型外观是明亮背景上的生色着色的样品。
自动化染色和视觉化装置可以用于本发明方法的各种实施方式中，例如用于检测多个生物标志物。多个标志物的检测需要平衡原子不同生色部分的信号。自动化染色装置是本领域已知的，方法适用于这些装置。
在自动化分析方法中，计算机控制的自动测试仪器用于评价染色样品，其使用计算以从图像导出定量测量值。高性能电荷耦合装置(CCD)相机可以用于将具有一种或多种有色沉淀物的生色染色样品视觉化。图像获取可以与高级宽视野显微镜和用于图像修复的各种运算法则联用。颜色分离可以使用三-CCD装置(3CCD)和二色性分束棱镜获得，所述棱镜将图像拆分成红色、绿色和蓝色组分。三个CCD各自布置为对应于特定颜色。
本申请所述的分析方法可以包括以下步骤的一些或全部：(a)从诊断患有或怀疑患有癌症(特别是肺癌细胞、黑色素瘤细胞或肝癌细胞)的个体收集第一组织或细胞样品；(b)施用的靶标的结合剂，其中结合剂具有过氧化物酶活性；(c)用一种或多种本发明生色缀合物将第一组织或细胞样品染色；(d)测量来自步骤(c)的染色组织或细胞样品的光密度，其中用具有由一种或多种生色缀合物吸收的波长的光照明染色的组织或细胞样品。
在一些实施方式中，本发明方法用于检测样品中的靶标，例如，具有过氧化物酶活性、生物标志物等的对象，其中将所述靶标或样品固定在固体载体上，其中方法包括以下步骤：(a)培育样品，推测该样品包括具有包括过氧化物酶活性的一种或多种结合剂的靶标，其中所述一种或多种结合剂能够直接或间接结合于靶标，和形成包含靶标和具有过氧化物酶活性的一种或多种结合剂的络合物；(b)在包含一种或多种本发明生色缀合物的溶液中培育样品；(c)检测的沉淀的生色缀合物，和从而检测靶标。
本申请的再另一个方面为将样品染色的方法，该方法通过将本申请的生色缀合物与其它色原体混合进行。例如，可以将罗丹明6G-L12-Cou与荧光素色原体混合，以产生黄/橙色。该组合是有利的，因为没有单一色原体产生适宜的橙色。另外，罗丹明衍生物例如罗丹明101衍生物是昂贵且化学上麻烦的。将认为产生黄色的色原体对于人眼较弱，因为基于荧光素的黄色色原体具有尖锐的上吸光度峰且吸收极少的绿光，甚至在高浓度/强度染剂也是如此。换言之，黄色不变化；它们保持为黄色。另一方面，具有弱地延伸进绿色吸光度范围的较宽吸光度的黄色染料表现出二色性，表示它们产生两个颜色。在低浓度，这些染料显现出黄色，因为它们充分吸收蓝光；在较高浓度，随着绿光的吸收，颜色朝红色迁移。因此，通过将吸收绿色的罗丹明6G与黄色染料混合，混合物可以产生设计者二色性染料，其中色调随强度稍微变化，以产生扩大动态范围的颜色反差。
化合物2单独产生染剂，其从在低强度的亮洋红色朝在较高强度的全红色变化。在包含15mM咪唑中的0.6mM化合物2，pH 6.8，4％NMP，0.1％NP40-Nonidet(辛基苯氧基聚乙烯氧基乙醇)，0.01％苯扎氯铵，0.03％过氧化氢的混合物中，混合物的特征在于通过低表达靶标的等染色使DAB在低范围中的强度比得上。相反，该混合物从不过度染色，甚至是最高强度的靶标。这当使用各种主要抗体和各种类型的组织样品时可以看到。
如上所示，本申请的各种二色性染剂可以通过混合两种或更多种本申请生色缀合物制备。二色性效应取决于在眼睛看来颜色浓的优势波长的极高绝对吸光度和用于观察染色样品的二色性效应的仪器。如果优势色原体是洋红色，正如化合物2，则在增大强度的一些点必须基本上不存在留给人或甚至仪器的感知绿光。已经预料不到地发现，4μm厚组织样品切片可以用单个二色性色原体强烈地染色，使得颜色变化将由人眼观察。因此，可推理，从洋红色朝紫色的变化将是尤其可接受的，因为色调变化将和谐和逐渐地被感知，且通过使用均不吸收蓝色的化合物2和32，颜色将保持明了。另一个假设，即在棕色沉淀物上的反射由在溶液中呈现橙色的色原体产生，是二色性亮橙色，其吸光度最小值为约505nm，由绿黄色色原体再加洋红色色原体构成。因此，应该知道，二色性色原体提供扩大的动态范围；因为一个信息通道干涸，(即一种颜色的所有光均已在中等强度吸收)，然后光在其它波长的吸光度在较高的强度开始；因此，产生颜色变化。
制备两种有用的二色性染剂：在高强度转变为红色的二色性橙色染剂，和在高强度转变为蓝紫色的二色性红色染剂。这些化合物具有扩大的动态范围，关于强度和颜色变化具有更独特的界值。
二色性橙色染剂按以下方式制备：在50mM咪唑中，pH 6.8，10％NMP、0.1％NP40-Nonidet(辛基苯氧基聚乙烯氧基乙醇)、0.01％苯扎氯铵、0.03％过氧化氢、1mM化合物9和0.2mM化合物2制得具有清晰颜色的具有良好强度的二色性橙色。颜色变化是从低强度的暗淡的微鲑鱼橙色，经过中等强度的鲜明的深厚橙色，接近在最高强度的极亮红色。这是有价值的，因为当染色组织时没有单独的色原体可以产生良好的橙色，并且其为相对于苏木素的极好反差色。二色性效应进一步辅助确定强度差。颜色变化的程度是适度的，因为局部浅层最小值仅为72nm宽，但是关键点是该最小值为约505nm。二色性染剂充分吸收蓝光且极充分地吸收绿光，但仍比得上人体颜色接收器，在临界点正中间减少。因此，与单个橙色色原体相比，明亮和鲜明的颜色使眼睛看起来远更令人舒服和清晰。该二色性色原体在水中在pH 6.8测量，其在459和531nm之间具有局部浅层最小值，为72nm宽，且总体最小值在575nm以上基本上没有任何吸光度。
二色性红色染剂按以下方式制备：在50mM咪唑中，pH 6.8，10％NMP、0.1％NP40-Nonidet、0.01％苯扎氯铵、0.03％过氧化氢、1mM化合物2和0.2mM化合物35产生强烈和彻底改变的颜色。颜色变化从弱洋红色，经历低强度的亮红色。在中等强度，颜色明显朝红紫色迁移，最后为最高强度的深蓝紫色。该迁移在Her2对照细胞系上非常清晰。由于高强度，甚至一些+0细胞是弱染色的，+1细胞看起来为亮红色，+2细胞明晰染色为红紫色，+3细胞为深蓝紫色。
另一个显著的例子通过用抗CD21或抗CD20染色扁桃体产生。CD21是原型低表达标志物，而CD20标记最丰富蛋白质之一。
在用细胞角蛋白染色的肝组织，在极低表达膜和极高表达导管结构之间可以观察到近距离动态颜色变化，所述极低表达膜为弱的但是清晰的洋红色，所述极高表达导管结构具有从强烈红色到深紫色的颜色变化。
具有产生增大的吸光度的作为折叠的技术组织缺陷的面积证明朝蓝黑色的最终颜色变化。当在水中在pH 6.8测量时，该组合物在532nm和642nm之间具有局部浅层最小值，110nm宽，和基本上没有低于460nm的吸光度的总体最小值。
由这些二色性色原体和染剂证实的二色性效应提供了扩大的动态范围。另外，对于其中强度的临界点由颜色变化支持的那些二色性缀合物，那些缀合物提供了染色靶标的独特方法。在一些实施方式中，提供了生色HRP底物缀合物，其具有至少50nm宽的至少一个局部最小值和在390和700nm之间的总体最小值，在水中在pH 6和8之间测量。
虽然描述了本发明缀合物分子的生色性质，也可预期缀合物分子可以在检测荧光性的测定和方法中用作荧光分子。
作为再另一个方面，公开了缀合物，其在缀合物内提供荧光
共振能量转移(FRET)。这些FRET缀合物具有在不同波长(最大值)吸收和发射光的两种不同的生色部分，相互作用的半径小于发射的光的波长。激发的(第一)生色部分发射由接收(第二)生色部分吸收的能量，其然后在不同波长发射光。对于FRET缀合物，两个生色部分之间的距离和角度影响能量转移，因此期望固定距离和角度，至少因此绕键的任何旋转和翻转远比在光化学反应中慢。在本发明的FRET缀合物中，第一生色部分的发射谱和第二生色部分的吸光度应该重叠，因为增加的重叠产生较好的能量转移和较好的荧光。
适宜的FRET缀合物通过使罗丹明6G的哌嗪酰胺与羧基-荧光素反应制备(以下显示为式XV)：
另一种FRET缀合物通过使罗丹明B与羧基-荧光素反应制备。两种FRET缀合物都是荧光的，并且都能够
共振能量转移。这些FRET缀合物都吸收在荧光素部分最大值的光，但是发射在罗丹明6G和罗丹明B部分的发射最大值的不同光。
在一些实施方式中，根据式XIVa的FRET缀合物，其中R38是哌嗪或另一种5元至6元环。
为了能够FRET，两个色原体必须接近，但不接触。可以预期，如果在这些色原体之间使用灵活的连接基，则在它们之间将不存在能量传送，因为灵活的连接基将允许它们进行接触；哌嗪环提供足够的距离和刚性，预期其它4元至8元环或杂环基团也提供足够的距离和刚性。效果是，羧基-荧光素部分的荧光转移至罗丹明部分。虽然虽然这些生色部分保持两个激发最大值(对应于它们作为独立荧光团的性能)，但是还观察到对应于罗丹明部分的单个发射最大值。
罗丹明B-羧基荧光素缀合物可以在500nm激发和在585nm发射。本发明的FRET缀合物是极其有用的，因为它们允许几个荧光团在相同波长被激发，但可在不同波长被检测。可以预期本发明FRET缀合物可以用于复用流式细胞计数法和DNA测序。这些是结构类似的背靠背式荧光素-罗丹明缀合物，其进一步连接于三磷酸核苷酸。基于FRET的染料终止剂的另外的描述可见US2005/0255475。
缺点是量子产率有限。这与FRET理论一致：两种化合物的距离和角度相同但是在荧光素和罗丹明B之间的重叠小于在荧光素和罗丹明6G之间的重叠。但是缀合物是强烈发荧光的。
认为罗丹明B-羧基-荧光素缀合物可能潜在地是用于荧光显微镜法的长期寻求的第四颜色，即发射蓝色的荧光团。FITC(荧光素)已经用于提供绿色发射或信号，罗丹明或CyDyes用于已经用于提供红色发射或信号，但是在实践中难以获得黄色荧光团，而不会使黄色信号不可接受地溢出进入绿色或红色信号。这对黄色荧光信号的用途有限制。通常，发射红外线的荧光团用作第四颜色，但是它们的缺点是人眼不可见。基于罗丹明B和羧基-荧光素的FRET缀合物使用红色荧光团的一组激发和发射滤波器也将可见。通过使用绿色激发滤波器和红色发射滤波器，仅FRET荧光团将可见。数字图像处理可以用于将FRET图像从红色图像减去以显示所需的红色信号。
与过氧化物酶底物相连的连接基可以在酸连接点或酚连接点连接于FRET缀合物，如上式XV所示。预期将优选将连接基连接于酸位置，条件是可以制得这样的连接(参见图)而不会消除FRET能力。另外，作为色原体，这些缀合物具有高度期望的性质；例如，6G化合物是橙色的，而罗丹明B类似物是真红色。这些发现强调了罗丹明哌嗪酰胺的潜在价值，因为它们的颜色FRET能力是预料不到和有益的。
成套药盒
包括本发明生色缀合物或包含其的组合物中的任何的成套药盒在本申请描述，其用于检测样品中的靶标。例如，成套药盒包括作为实施方式以下作为A1至A19或K1至K5或在实施例中陈述的缀合物中的一种或多种，或者是那些缀合物中的两种、三种、四种或更多种，其在单一组合物或容器中或在独立的组合物或容器中。
因为本发明方法适于在各种测定形式中检测各种样品中的众多个靶标，成套药盒可以包括很多不同的项目，但是所有成套药盒都包括生色缀合物，其或为固体形式(粉末，冻干的等)或作为包含本申请所述生色缀合物分子的组合物或包含本申请所述生色缀合物分子的培育介质。以下是成套药盒的一些非限制性示例性实施方式。
在一种实施方式中，套装药盒可以包括：(i)本申请所述的生色缀合物，其或为固体形式(粉末，冻干的等)或在液体介质中；和(ii)能够直接或间接结合于靶标的一种或多种结合剂，其中结合剂可以是本申请所述的任何结合剂。
在另一种实施方式中，成套药盒可以包括：(i)本申请所述的第一生色缀合物的溶液，其中第一缀合物具有第一光谱特征；(ii)本申请所述的第二生色缀合物的溶液，其中第二生色缀合物的具有一个或多个光谱特征不同于第一生色缀合物的一个或多个光谱特征。第一缀合物或第二缀合物的任一种可以是以下作为A1至A19或K1至K5或在实施例中陈述的缀合物之一。
本发明成套药盒可以包括几个部件(1个，2个，3个，4个，5个，6个或更多个)，它们是任何以上定义的不同生色缀合物的溶液，其中不同缀合物各自具有独特的光谱特征，其不同于包括在成套用品中的其它缀合物的光谱特征。
在另一种实施方式中，任何上述成套药盒可以进一步包括一种或多种能够直接或间接结合于靶标的结合剂，其中结合剂可以是任何本申请所述的结合剂。
在另一种实施方式中任何上述成套药盒可以进一步包括生色缀合物的使用说明，染色解释和/或得分方针。
在其它实施方式中，任何上述成套药盒可以进一步包括以下的一种或多种：包含DAB、ACHC或另一种过氧化物酶底物的含水组合物；能够特异性结合于缀合物的生色可检测标记的结合剂；用于将靶标染色、可视化和/或定量化的规程；一种或多种参比材料，例如包含染色靶标的样品；另外的染剂，例如组织学染剂或不同于过氧化物酶的另一种酶的底物溶液；封闭介质；培育介质，洗涤介质等。
在另一种实施方式中，套装药盒可以包括(i)以上实施方式的任何条目或所有条目；(ii)用于靶标可视化和/或图像捕获的工具，获这些工具的参考物；(iii)用于控制仪器的软件；(iv)用于图像分析的软件；(iv)锁定的图像分析运算法则。
本发明成套药盒的组成可以设计为适用本发明生色缀合物的任何上述应用。
制造方法
作为本申请的一个方面，提供制备本发明生色缀合物的方法。这样的方法在以下实施例中证实。
作为本申请的另一方面，提供用于制备罗丹明的哌嗪酰胺的高效方法。罗丹明和2-卤代乙酰基酯之间的反应得到式IV的2'-烷基羧基甲基衍生物：
其中R1至R10、Rx、Rxx、Rz、X和Y具有本申请陈述的定义。
这些2'-烷基羧基甲基衍生物与过量哌嗪在约100℃在无水溶剂例如乙腈或N-甲基吡咯烷酮中平稳反应，得到通式V和Va的相应哌嗪酰胺，它们用作合成生色缀合物的中间体，以及为色原体：
其中R1至R10、Rx、Rxx、RY和RYY具有本申请陈述的定义。过量哌嗪通过在减压下的蒸发移除，之后是用乙醚进行沉淀步骤，可以高收率和纯度分离哌嗪酰胺，观察到未形成罗丹明二聚物。
作为本申请的另一方面，提供制备罗丹明、荧光素及其衍生物的仲酰胺的方法。仲胺和罗丹明的各种酯之间的反应得到罗丹明的仲酰胺。例如，式VII或式VIIa的酯(其为罗丹明B)可以与胺反应，制得罗丹明的酰胺：
其中R35可以是以下化合物33R1-33R9之一：
在式VIIa中，R1至R10优选为H。式VIIa的各种酯(罗丹明B)列为33R1至33R9，测试它们与仲胺的反应性，并将它们按与那些仲胺的反应性增加的顺序列出，其中R1是反应性最小的化合物33R1，33R9是化合物33R1-33R9中反应性最大的。33R1和33R2与仲胺稍微反应或不反应。反应性可以通过使阳离子离去基团稳定来增强。苄基酯33R3，显示低但是一定的反应性。烷基-羧基-甲基衍生物33R4、33R5、和33R6较强地与仲胺反应。但是，33R4和33R5更倾向于副反应(即，水解)，33R6反应稍微较慢。4-硝基苄基酯33R7与仲胺反应但是也更倾向于水解，而乙基-羧基-甲基酯33R8适当地反应。33R8由由罗丹明B和乙酸2-溴乙基酯制备。33R8最多到约140℃保持稳定过夜。衍生物如33R9同样稳定，明显是本申请最终色原体的优选或合适的前体。化合物例如具有酯33R8或33R9的罗丹明B是稳定的。它们是稍微活性的酯，因为它们包括β-羰基，但是β-羰基是适宜的离去基团，其允许仲胺与这些罗丹明B缀合物反应。
作为本申请的另一方面，提供制备作为罗丹明的仲酰胺的方法。罗丹明酯例如化合物33R1-33R9的酯与各种仲胺之间的反应得到罗丹明的仲酰胺。各种仲胺可以是以下化合物34A至34L、或者化合物34G至34L、或者化合物34J至34L、或者化合物34G至34I之一：
仲胺可以是哌嗪、哌啶、吡咯烷、咪唑烷、吡唑烷、氮杂环丁烷、或其它4元至8元(或者为5元至7元)环或杂环基团，其任选具有胺、羧基或酯取代基。
出乎意料和预料不到的是，哌嗪(化合物34B)与这些酯反应(它们仅为稍有活性的)，并且N,N′-二甲基乙二胺(化合物34A)也反应。进一步的实验证明，化合物34C-L也出乎意料地与这些酯反应。化合物34A-L按照与酯的实验(或预期)反应性从反应性最大到反应性最小列出，其中化合物34A是反应性最大的，化合物34L预期是反应性最小的。化合物34A，即N,N’-二甲基乙二胺，是哌嗪的供替代的选择，并且在531nm吸收，这与酯的吸光度相同。当与罗丹明反应时，仲胺34B、34C、34D、34E、和34F将不会经历进一步的反应，所述反应用于制备具有连接于其的过氧化物酶底物的缀合物。观察到，从34C的5元环到34E的7元环反应性急剧下降，并且34C的罗丹明6G衍生物的吸光度在β-羰基酯(531nm)和其它仲酰胺(535nm)之间(533nm)。因此可预期的是，34L将以类似的方式反应。34G、34H和34I也反映出罗丹明的仲酰胺的羧酸衍生物的努力，34G可接受地反应。预期的是，氮杂环丁烷化合物例如34J、34K和34L将继续在反应性方面具有积极趋势。特别地，预期包括氮杂环丁烷-3羧基的化合物例如34K或34L反应以形成有用的合成前体，这由此可以包括所需罗丹明羧酸衍生物的新颖家族。34G、34H和34I也响应于对充分反应的罗丹明的仲酰胺的羧酸衍生物的需求。
因此，已经出乎意料地发现，类似的仲胺和罗丹明的β-羰基酯之间的反应性可能相差几个数量级。在一些情况中，位阻似乎会影响反应性。此外，这可影响这些仲酰胺的稳定性，其似乎对含水碱是异常不稳定的，因此在化合物34G和34H上使用酸不稳定的叔丁基保护基团。这种不稳定性/反应性也扩展至容易水解的β-羰基酯。
作为本申请的另一方面，公开了制备罗丹明的仲酰胺的方法。罗丹明的β-羰基酯和仲胺之间的反应得到通式VIII的罗丹明的仲酰胺：
其中R1至R10如本申请定义，但是优选为H，且优选取代有(烷基)羧酸或酯。在一些实施方式中，R36或R37包括另外的胺(其可以是保护的)、羧基或酯。在一些实施方式中，R36和R37可以形成哌嗪、哌啶、吡咯烷、咪唑烷、吡唑烷、氮杂环丁烷、或其它4元至8元(或者为5元至7元)环或杂环基团，其任选具有胺、羧基或酯取代基。这些仲酰胺可以按任何规模制备并通过结晶纯化。不包括进一步官能团的反应性较小的衍生物可以用作色原体；由于它们将颜色和荧光性与稳定和晶态的化学结构相结合，这些适宜用作染料/墨水/颜料/激光/LED和用于组合物和用途中。
再另一个方面是针对不存在靶标染色组织样品的方法。已经认识到，如果组织的某些部分用本申请的色原体或染色DAB，则该部分的组织不可用不同的颜色染色，除非第一染剂非常弱，且第二染剂非常强。应该知道，可以制备具有混合颜色的共同定位的靶标的双染剂。
但是，在共同定位的靶标的这样的情况中，第一色原体减少可用于识别第二抗体的抗原数目并且也减少可能在第二步骤中以不同颜色可视化的第一初级抗体(在第一步骤中未通过HRP可视化识别)的数目。
可以执行这种效果以针对不存在靶标例如标志物进行染色。这在使用两种本发明生色缀合物染色结肠癌中观察到。结肠组织对于细胞角蛋白18通常是阳性的。结肠组织使用下述方法染色：用具有第一颜色的生色缀合物将细胞角蛋白18染色，然后用具有第二颜色的生色缀合物染色，以将结肠组织中的所有细胞角蛋白染色。例如，第一和第二生色缀合物可以在相同的结合剂沉淀，它们可以同时或接连接触结肠组织。或者，这可以通过具有两种不同的结合剂完成，其中一种对于细胞角蛋白18是特异性的，另一种对于细胞角蛋白是泛特异性的(正常结肠和结肠癌都对于细胞角蛋白都是阳性的)，其中两种生色缀合物的第一种在第一结合剂沉淀，两种生色缀合物的第二种在第二结合剂沉淀。在用具有相异颜色的第一和第二生色缀合物将结肠癌组织染色之后，观察到在很多癌组织中，小面积区域由第二生色缀合物识别，即，它们以第二颜色染色。如果癌组织仅以第一颜色染色，则这些区域可能容易容易被忽视，且可能错误地认为样品对于细胞角蛋白18是阴性的，即使不存在染剂可能已经由很多因素引起，例如染色过程中的气泡，坏死组织，固定不良，或其它原因。因此，第二染剂的技术效果是其正面地证明不存在细胞角蛋白18，例如表明细胞已经突变并丧失它们产生细胞角蛋白18的能力。公知的是，结肠癌经历这样的突变。因此，这种染色方法允许使用第一和第二生色缀合物来识别具有这样的突变的癌组织。
本申请的再另一个方面是化合物22(式XIa)和式XI的其它化合物：
其中R18是卤素；R19是氮原子保护基团(例如叔丁氧基羰基(BOC)基团；p是0至4；q是0至4。
化合物22和罗丹明之间的反应提供罗丹明通式VI的衍生物：
类似的罗丹明衍生物可以用根据式XI的其它化合物制备。
在无水溶剂中在约100℃，反应进行至完成，几乎没有形成任何副产物。在单个步骤中，这些反应提供具有增强的水溶性、具有延长的连接基和适当保护的伯氨基的罗丹明衍生物，其然后用TFA脱保护，可以与HRP底物反应，仅在三个步骤中就得到有效的生色HRP底物。
超过20种不同的色原体由化合物22制备。化合物22与每种测试的罗丹明和荧光素的相对低反应性天然羧酸基团反应。其也与荧光素上的酚氧反应。其容易和选择性地与荧光素和罗丹明的哌嗪酰胺反应。如式X中所述，化合物22与专利蓝V中紧挨着两个磺酸基团的酚基团反应。
类似地，化合物22或其它式IX的化合物可以与荧光素反应得到荧光素衍生物。
代表性实施方式
A1.一种生色缀合物，其包括(a)生色部分和(b)过氧化物酶底物部分，其中生色部分和过氧化物酶部分经连接基连接在一起，
其中缀合物是式I化合物：
其中X是-OH，-ORX或-NRXRXX，
其中Y是＝O或＝N+RYRYY；
其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、RX、RXX、RY、和RYY独立地选自氢和具有小于40个原子的取代基；
L是连接基，其为包含至少5个连续连接原子(例如5至29个连续原子)的链的化合物；和
PS是过氧化物酶底物部分。例如，在一种实施方式中，X是-OH，-ORX，Y是＝O。在另一种实施方式中，X是-NRXRXX，Y是＝N+RYRYY。
A2.实施方式A1的生色缀合物，其中
R1选自氢，R11，任选取代有一个或多个相同或不同R14基团的(C1-C20)烷基或杂烷基，任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的(C5-C20)芳基或杂芳基，和任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的(C6-C40)芳基烷基或杂芳基烷基，或者，R1可以与R2一起形成任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的苯并、萘并或多环亚芳基并基团；
R2选自氢，R11，任选取代有一个或多个相同或不同R14基团的(C1-C20)烷基或杂烷基，任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的(C5-C20)芳基或杂芳基，和任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的(C6-C40)芳基烷基或杂芳基烷基，或者，R2可以与R1一起形成任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的苯并、萘并或多环亚芳基并基团，或者，当X是-NRXRXX时，R2可以与RX一起形成任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的5元或6元环；
RX当存在时选自氢，任选取代有一个或多个相同或不同R14基团的(C1-C20)烷基或杂烷基，任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的(C5-C20)芳基或杂芳基，和任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的(C6-C40)芳基烷基或杂芳基烷基，或者，RX可以与R2一起形成任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的5元或6元环；
RXX当存在时选自任选取代有一个或多个相同或不同R14基团的(C1-C20)烷基或杂烷基，任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的(C5-C20)芳基或杂芳基，和任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的(C6-C40)芳基烷基或杂芳基烷基，或者，RXX可以与R3一起形成任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的5元或6元环；
R3选自氢，R11，任选取代有一个或多个相同或不同R14基团的(C1-C20)烷基或杂烷基，任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的(C5-C20)芳基或杂芳基，和任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的(C6-C40)芳基烷基或杂芳基烷基，或者，当X是-NRXRXX时，R3可以与RXX一起形成任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的5元或6元环；
R4选自氢，R11，任选取代有一个或多个相同或不同R14基团的(C1-C20)烷基或杂烷基，任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的(C5-C20)芳基或杂芳基，和任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的(C6-C40)芳基烷基或杂芳基烷基，或者，当Y是-N+RYRYY时，R4可以与Ryy一起形成任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的5元或6元环；Ryy当存在时选自任选取代有一个或多个相同或不同R14基团的(C1-C20)烷基或杂烷基，任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的(C5-C20)芳基或杂芳基，和任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的(C6-C40)芳基烷基或杂芳基烷基，或者Ryy可以与R4一起形成任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的5元或6元环；
RY当存在时选自氢，任选取代有一个或多个相同或不同R14基团的(C1-C20)烷基或杂烷基，任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的(C5-C20)芳基或杂芳基，和任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的(C6-C40)芳基烷基或杂芳基烷基，或者，RY可以与R5一起形成任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的5元或6元环；
RYY当存在时选自任选取代有一个或多个相同或不同R14基团的(C1-C20)烷基或杂烷基，任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的(C5-C20)芳基或杂芳基，和任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的(C6-C40)芳基烷基或杂芳基烷基，或者，RXX可以与R6一起形成任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的5元或6元环；
R5选自氢，R11，任选取代有一个或多个相同或不同R14基团的(C1-C20)烷基或杂烷基，任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的(C5-C20)芳基或杂芳基，和任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的(C6-C40)芳基烷基或杂芳基烷基，或者，R5可以与R6一起形成任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的苯并、萘并或多环亚芳基并基团，或者，当Y是-N+RYRYY时，R5可以与Ry一起形成任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的5元或6元环；
R6选自氢，R11，任选取代有一个或多个相同或不同R14基团的(C1-C20)烷基或杂烷基，任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的(C5-C20)芳基或杂芳基，和任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的(C6-C40)芳基烷基或杂芳基烷基，或者，R6可以与R5一起形成任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的苯并、萘并或多环亚芳基并基团；
R7、R8和R9各自彼此独立地选自氢，R11，任选取代有一个或多个相同或不同R14基团的(C1-C20)烷基或杂烷基，任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的(C5-C20)芳基或杂芳基，和任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的(C6-C40)芳基烷基或杂芳基烷基；
R10选自氢，R11，任选取代有一个或多个相同或不同R14基团的(C1-C20)烷基或杂烷基，任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的(C5-C20)芳基或杂芳基，和任选取代有一个或多个相同或不同R13或合适R14基团的(C6-C40)芳基烷基或杂芳基烷基，卤素，卤代烷基，-OR12，-SR12，-SOR12，-SO2R12，和腈；
R11选自-NR15R15，-OR16，-SR16，卤素，卤代烷基，-CN，-NC，-OCN，-SCN，-NO，-NO2，-N3，-S(O)R16，-S(O)2R16，-S(O)2OR16，-S(O)NR15R15，-S(O)2NR15R15，-OS(O)R16，-OS(O)2R16，-OS(O)2NR15R15，-OP(O)2R16，-OP(O)3R16R16，-P(O)3R16R16，-C(O)R16，-C(O)OR16，-C(O)NR15R15，-C(NH)NR15R15，-OC(O)R16，-OC(O)OR16，-OC(O)NR15R15和-OC(NH)NR15R15；
R12选自任选取代有亲脂性取代基的(C1-C20)烷基或杂烷基，任选取代有亲脂性取代基的(C5-C20)芳基或杂芳基和任选取代有亲脂性取代基的(C2-C26)芳基烷基或杂芳基烷基；
R13选自氢，(C1-C8)烷基或杂烷基，(C5-C20)芳基或杂芳基，和(C6-C28)芳基烷基或杂芳基烷基；
R14选自-NR15R15，＝O，-OR16，＝S，-SR16，＝NR16，＝NOR16，卤素，卤代烷基，-CN，-NC，-OCN，-SCN，-NO，-NO2，＝N2，-N3，-S(O)R16，-S(O)2R16，-S(O)2OR16，-S(O)NR15R15，-S(O)2NR15R15，-OS(O)R16，-OS(O)2R16，-OS(O)2NR15R15，-OS(O)2OR16，-OS(O)2NR15R15，-C(O)R16，-C(O)OR16，-C(O)NR15R15，-C(NH)NR15R15，-OC(O)R16，-OC(O)OR16，-OC(O)NR15R15和-OC(NH)NR15R15；
R15各自独立地为氢或R16，或者，R15各自与其所键接的氮原子一起形成5元至8元饱和或不饱和环，所述环可以任选包括一个或多个相同或不同的另外的杂原子并且可以任选取代有一个或多个相同或不同R13或R16基团；
R16各自独立地为R13，或取代有一个或多个相同或不同R13或R17基团的R13；和
R17各自选自-NR13R13，-OR13，＝S，-SR13，＝NR13，＝NOR13，卤素，卤代烷基，-CN，-NC，-OCN，-SCN，-NO，-NO2，＝N2，-N3，-S(O)R13，-S(O)2R13，-S(O)2OR13，-S(O)NR13R13，-S(O)2NR13R13，-OS(O)R13，-OS(O)2R13，-OS(O)2NR13R13，-OS(O)2OR16，-OS(O)2NR13R13，-C(O)R13，-C(O)OR13，-C(O)NR13R13，-C(NH)NR15R13，-OC(O)R13，-OC(O)OR13，-OC(O)NR13R13和-OC(NH)NR13R13。
A3.实施方式A1和A2任一项的缀合物，其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、和R10独立地选自-H，-卤素，-甲基，-乙基，-丙基，-异丙基，-乙烯基，-SO3H，-PO3H，-NO2，-COOH，-NH2，-CN，-OH，-OMe和-OEt。
A4.实施方式A1-A3任一项的缀合物，其中生色部分选自罗丹明和荧光素，及其盐。
A5.实施方式A1-A4任一项的缀合物，其中生色部分中的一种或多种选自罗丹明，罗丹明6G，四甲基罗丹明，罗丹明B，罗丹明101，罗丹明110，荧光素，和O-羧基甲基荧光素。
A6.实施方式A1-A5任一项的缀合物，其中所述部分选自罗丹明116，罗丹明123，罗丹明19。
A7.实施方式A1-A6任一项的缀合物，其中所述部分是罗丹明盐且包括选自以下的阴离子：Cl-，Br-，TFA-，和ClO4 -。
A8.实施方式A1-A7任一项的缀合物，其中生色部分是2'-哌嗪酰胺衍生物。
A9.实施方式A1-A8任一项的缀合物，其中R10选自烷基，杂烷基，烷氧基，卤素，卤代烷基，氨基，烷基硫基，氰基，异氰基，氰氧基，巯基氰氧基，硝基，和亚硫酰基。
A10.实施方式A1至A9任一项的生色缀合物，其中生色缀合物选自表1中所示的分子和＝N基团的盐。
A11.根据实施方式A1-A10任一项的缀合物，其中过氧化物酶部分具有下式：
R21是-H，
R22是-H，-O-X，或-N(X)2；
R23是-OH；
R24是-H，-O-X，或-N(X)2；
R25是-H，-O-X，或N(X)2；
R26是-CON-(X)2，-CONH(X)，或COO(X)；
其中H是氢；O是氧；N是氮；X是H，烷基或芳基或与L连接的键。
A12.实施方式A1至A11任一项的缀合物，其中R23是-OH，R24是-H。
A13.实施方式A1至A12任一项的缀合物，其中R21或R25的任一是-OH，R22和R24是-H，R23是-OH。
A14.实施方式A1至A13任一项的缀合物，其中过氧化物酶底物是阿魏酸、肉桂酸、咖啡酸、芥子酸、2,4-二羟基肉桂酸或4-羟基肉桂酸(香豆酸)的残基。
A15.实施方式A1至A14任一项的缀合物，其中连接基是包括1或2个式III的重复单元的化合物：
其中R31选自甲基，乙基，丙基，OCH2，CH2OCH2，(CH2OCH2)2，NHCH2，NH(CH2)2，CH2NHCH2，环烷基，烷基-环烷基，烷基-环烷基-烷基，杂环基(例如具有4至8个原子的含氮环)，烷基-杂环基，烷基-杂环基-烷基，和其中不多于3个连续重复的乙氧基，R32和R33独立地选自NH和O。
A16.实施方式A1-14任一项的缀合物，其中连接基选自：
A17.根据式IX的生色缀合物：
其中X是-OH，-ORX或-NRXRXX，
其中Y是＝O或＝N+RYRYY；
其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、RX、RXX、RY、和RYY独立地选自氢和具有小于40个原子的取代基；
L是包含5至29个连续连接原子的直链的连接基；和
PS是过氧化物酶底物部分。
A18.实施方式A17的缀合物，其中所述缀合物具有式IXa的结构：
A19.实施方式A17的缀合物，其中所述缀合物具有式IXb的结构：
B1.用于检测样品中具有过氧化物酶活性或连接于过氧化物酶的靶标的成套用品，所述成套用品包括根据前述实施方式或实施方式K1至K5任一项的生色缀合物或实施例的缀合物的任一种的至少一种溶液。术语"具有过氧化物酶活性"表示靶标或具有固有过氧化物酶活性或具有化学连接于(即经化学键)靶标的过氧化物酶活性，例如将不具有固有过氧化物酶活性的靶标加工和使其化学偶联于过氧化物酶活性；本发明上下文中的术语"连接的"表示过氧化物酶活性间接与靶标连接，例如经由包括/具有过氧化物酶活性的靶标结合剂，例如抗体/核酸探针-HRP缀合物进行。
B2.根据实施方式B1的成套用品，其中所述成套用品包括两种或更多种水溶液，其中所述溶液各自包含根据实施方式A1-A19或K1至K5中任一项实施方式的生色缀合物，其中两种或更多种溶液各自的生色缀合物彼此的不同之处在于它们的光谱特征中的一个或多个。
B3.根据实施方式B1的成套用品，其中所述溶液包含至少两种实施方式A1-A19或K1至K5的生色缀合物。
C1.通过生色检测法来检测样品中的靶标的方法，其包括：
(i)在足以形成生色缀合物的有色沉淀物的时间和温度培育推测包含在水溶液中的靶标的样品，其中靶标包括过氧化物酶活性，或者靶标直接或间接连接于过氧化物酶，其中所述水溶液包含：
a)至少一种(或者至少两种、或者至少三种、或者至少四种、和/或不多于四种、三种或两种)根据实施方式A1至A19或K1至K5任一项的生色缀合物，
b)过氧化物化合物，
和
(ii)检测样品中的生色缀合物的有色沉淀物，从而检测样品中的靶标。
C2.实施方式C1的方法，其中有色沉淀物使用光学显微镜检测。
C3.实施方式C1-C2任一项的方法，其中有色沉淀物通过由人类观察者进行的视觉观察检测。
C4.实施方式C1-C3任一项的方法，其中有色沉淀物由自动成像仪检测。
C5.实施方式C1-C4任一项的方法，其中水溶液包含0.001％至0.005％的过氧化氢和0.1mM至10mM的至少一种生色缀合物。
C6.实施方式C1-C5任一项的方法，其中至少一种生色缀合物的量为约0.01mM至约10mM，例如约0.05mM至约5mM，例如约0.2至约2mM，例如约0.4至约1mM。
C7.实施方式C1-C6任一项的方法，其中过氧化物酶活性与辣根过氧化物酶有关。
C8.实施方式C1-C7任一项的方法，其中辣根过氧化物酶直接或间接连接于靶标。
C9.实施方式C1-C8任一项的方法，其中靶标是多肽，核酸，碳水化合物，脂质或其衍生物，分子络合物，颗粒，真核细胞或原核细胞或微生物。
C10.实施方式C1-C9任一项的方法，其中样品是生物样品，环境样品，或化学样品。
C11.根据实施方式C10的方法，其中将样品固定在固体载体上。
C12.实施方式C1-C11任一项的方法，其进一步包括将靶标直接或间接于与过氧化物酶相连的抗体。
C13.实施方式C1-C12任一项的方法，其包括一个或多个另外的步骤，例如洗涤步骤；淬灭不期望的过氧化物酶活性的步骤；用一种或多种另外的结合剂培育样品的步骤，例如能够结合于样品中另一个靶标的结合剂，或能够结合于生色缀合物的色原体的结合剂。
C14.实施方式C1-C13任一项的方法，其中样品包括至少两种不同的靶标、或同一靶标的至少两个不同的亚群，其中所述至少两种靶标或同一靶标的至少两个不同的亚群包括过氧化物酶活性或直接或间接连接于过氧化物酶，所述方法包括
(i)在足以形成第一生色缀合物的有色沉淀物的时间和温度将样品在水溶液中培育，其中所述水溶液包含：
a1)实施方式A1至A19或K1至K5任一项的第一生色缀合物；
b1)过氧化物化合物；
(ii)在足以形成第二生色缀合物的有色沉淀物的时间和温度将样品(i)在水溶液中培育，其中所述水溶液包含：
a2)实施方式A1至A19或K1至K5任一项的第二生色缀合物；
b2)过氧化物化合物；
其中第一生色缀合物具有第一生色特征，第二生色缀合物具有第二生色特征，并且其中第一和第二生色特征具有一个或多个不同的光谱特征；
(iii)任选地，用生色缀合物的又一种水溶液培育样品，以将样品中的第三、第四等靶标染色，其中所述又一种水溶液包括具有下述生色特征的生色缀合物，所述生色特征允许通过颜色将第一、第二、第三、第四等靶标彼此进行区分染色
(iv)通过检测样品中相应生色缀合物的有色沉淀物，检测第一、第二、第三、第四等靶标。
C15.实施方式C1-C14任一项的方法，其中过氧化物酶活性经包括过氧化物酶例如一个或多个HRP部分的靶标特异性结合剂连接于靶标。
C16.实施方式C1-C15任一项的方法，其中靶标是蛋白质或核酸。
C17.实施方式C1-C16任一项的方法，其中将样品手动、自动或半自动染色。
C18.实施方式C1-C17任一项的方法，其中染色通过图像分析评价。
C19.实施方式C1-C18任一项的方法，其中靶标是核酸，培育样品产生生色原位杂交。
C20.实施方式C1-C19任一项的方法，其中所述方法包括通过包括以下步骤的过程检测一个或多个靶标：
在样品中的第一靶标处提供过氧化物酶活性；
使所述样品与具有第一颜色的第一生色缀合物接触；
在所述第一靶标处形成第一有色沉淀物；
从所述第一靶标除去所述过氧化物酶活性；
从所述样品除去未沉淀的第一生色缀合物；
在样品中的第二靶标处提供过氧化物酶活性；
使所述样品与具有第二颜色的第二生色缀合物接触；
在所述第二靶标处形成第二有色沉淀物；和
检测所述第一有色沉淀物和所述第二有色沉淀物，从而检测所述样品中的第一靶标和第二靶标。
D1.进行生色原位杂交的方法，所述方法包括：
使核酸靶标与探针接触，所述探针与所述核酸靶标在杂交条件下杂交，其中所述探针包括(1)至少部分与所述核酸靶标互补的核酸序列，和(2)过氧化物酶，或特异性结合对的第一成员；其中所述靶标和探针形成络合物；
当所述探针包括(2)时，使所述络合物与所述特异性结合对的第二成员接触，其中所述第二成员直接或间接连接于过氧化物酶、并且特异性结合于所述第一成员；
用至少一种实施方式A1至A19或K1至K5任一项的生色缀合物培育所述络合物；所述培育进行足以在所述靶标形成有色沉淀物的时间和温度；和
检测所述有色沉淀物。
D2.实施方式D1的方法，其中特异性结合对的第一成员是抗原或半抗原，第二成员是抗体或抗体片段。
D3.实施方式D1或D2任一项的方法，其中靶标核酸存在于核酸双链中，并且进一步包括使核酸双链变性的步骤。
D4.实施方式D1-D3任一项的方法，其进一步包括用一个或多个FITC标记的PNA探针进行变性的步骤。
D5.实施方式D1-D4任一项的方法，其进一步包括用非特异性染剂例如苏木素进行复染色。
D6.实施方式D1至D5任一项的方法，其进一步包括以下步骤中的一个或多个：脱石蜡；在接触步骤之前用缓冲剂洗涤；在杂交之后严格洗涤；封闭内源性过氧化物酶；在培育步骤之后洗涤和脱水。
D7.根据实施方式D3的方法，其中探针是包括肽-核酸(PNA)骨架的核酸类似物片段。
E1.使实施方式A1至A19或K1至K5任一项的生色缀合物在包括过氧化物酶活性的靶标位点中沉淀的方法，所述方法包括在包含所述生色缀合物和过氧化物化合物的溶液中培育所述靶标位点，和由此使所述缀合物分子在所述靶标位点沉淀。
E2.根据实施方式E1的方法，其中过氧化物酶活性与存在于靶标位点的辣根过氧化物酶(HRP)相关。
E3实施方式E1或E2任一项的方法，其中靶标位点包括靶标和直接或间接连接于靶标的过氧化物酶。
E4.实施方式E1或E3任一项的方法，其中靶标位点包括生物标志物。
E5.实施方式E1或E4任一项的方法，其包括使至少两种根据实施方式A1至A19或K1至K5任一项的生色缀合物在靶标位点沉淀。
F1.检测样品中一个或多个靶标的方法，所述方法包括：
在样品中的第一靶标处提供过氧化物酶活性；
使所述样品与第一生色缀合物接触；
在所述第一靶标处形成第一有色沉淀物；
从所述第一靶标除去所述过氧化物酶活性；
从所述样品除去未沉淀的第一生色缀合物；
在样品中的第二靶标处提供过氧化物酶活性；
使所述样品与第二生色缀合物接触；
在所述第二靶标处形成第二有色沉淀物；和
检测所述第一有色沉淀物和所述第二有色沉淀物，从而检测所述样品中的所述第一靶标和第二靶标，
其中第一生色缀合物或第二生色缀合物中的至少之一选自实施方式A1-A16任一项的任何生色缀合物，并且其中第一生色缀合物和第二生色缀合物具有一个或多个彼此不同的光谱特征。
F2.实施方式F1的方法，其中所述方法进一步包括：从所述第二靶标除去所述过氧化物酶活性；从所述样品除去未沉淀的第二生色缀合物；在所述样品中的第三靶标处提供过氧化物酶活性；使所述样品与第三生色缀合物接触，所述第三生色缀合物具有一个或多个与所述第一生色缀合物和第二生色缀合物的每一种都不同的光谱特征。
F3.实施方式F1至F2任一项的方法，其中第一生色缀合物和第二生色缀合物各自为实施方式A1至A19或K1至K5任一项的缀合物。
F4.实施方式F1至F3任一项的方法，其进一步包括实施方式C1-C13或C15-C19任一项记载的要素。
G1.生色介质，其包含：实施方式A1至A19或K1至K5任一项的生色缀合物；包含有机阳离子、阴离子或两者的盐；非离子、非变性的洗涤剂；其中介质的pH为约3至约9。
G2.实施方式G1的介质，其中有机盐选自：取代和未取代的咪唑的盐，取代和未取代的吡啶的盐，取代和未取代的嘧啶的盐，取代和未取代的吡嗪的盐，取代和未取代的哒嗪的盐，和叔胺和季胺的盐。
G3.实施方式G1或G2的介质，其中有机盐是咪唑盐。
G4.实施方式G1、G2或G3的介质，其中洗涤剂是4-壬基苯基-聚乙二醇。
G5.实施方式G1-G4任一项的介质，其中pH为约3至约6，或约4至约7，或约5至约8。
G6.实施方式G1-G5任一项的介质，其中所述介质包含1mM至100mM的咪唑，或者为10mM至75mM，或者为15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM、55mM、60mM、65mM、70mM的咪唑。
G7.实施方式G1-G6任一项的介质，其中所述介质包含N-甲基吡咯烷酮(NMP)或吡咯烷酮。
G8.实施方式G1-G7任一项的介质，其中所述介质包含0.1至2mM的生色缀合物、10至50mM的咪唑1％至10％的NMP、和0.01％至1％的辛基苯氧基聚乙烯氧基乙醇。
H1.制备罗丹明的仲酰胺(例如哌嗪酰胺)的方法，所述方法包括：
使根据式IV的2'-烷基羧基甲基衍生物与过量(优选为适度过量)的仲胺例如哌嗪，在适宜的温度(例如，约90℃至约110℃)在无水溶剂(例如乙腈或NMP)中反应，形成式Va的仲酰胺：
其中R1至R10、RX、RXX、RY和RYY具有本申请陈述的定义。过量的哌嗪通过减压蒸发移除，然后是用乙醚进行沉淀的步骤，哌嗪酰胺可以按高收率和纯度分离，并且未观察到有罗丹明二聚物形成。
H2.实施方式H1的方法，其中使2'-烷基羧基甲基衍生物和仲胺在约100℃的温度在乙腈或N-甲基吡咯烷酮中反应。
H3.根据实施方式H1或H2的方法，其进一步包括以下步骤：通过在减压下蒸发除去过量的仲胺，和用乙醚使仲酰胺沉淀。仲酰胺可以按高收率和纯度分离。
H4.实施方式H1至H3任一项的方法，其中仲酰胺基本上不含罗丹明二聚物。
H5.实施方式H1至H5任一项的方法，其进一步包括通过使罗丹明和2-卤代乙酰基酯反应制备式IV的2'-烷基羧基甲基衍生物。
H6.实施方式H1至H5任一项的方法，其中仲胺是哌嗪、哌啶、吡咯烷、咪唑烷、吡唑烷、氮杂环丁烷、或其它4元至8元环或杂环基团，其任选具有胺、羧基或酯取代基。
H7.实施方式H1至H5任一项的方法，其中2'-烷基羧基甲基衍生物的烷基选自化合物33R1至33R9，或者化合物33R4至33R9，或者化合物33R7至33R9。
H8.实施方式H1至H5任一项的方法，其中仲胺选自化合物34A至34L，或者化合物34G至34L，或者化合物34J至34L，或者化合物34G至34I。
I1.用二色性染剂将样品染色的方法，所述方法包括：
在样品中的第一靶标处提供过氧化物酶活性；
使样品与第一生色缀合物在第一浓度(例如，为0.1mM至10mM，或1mM)接触，其中第一生色缀合物选自实施方式A1-A19或K1-K5任一项的生色缀合物；
在第一靶标处形成第一生色缀合物的沉淀物；
检测沉淀物的颜色；
通过检测的颜色测量样品中的靶标，其中第一检测的颜色指示较低量的靶标，第二检测的颜色指示较高量的靶标。
I2.实施方式I1的方法，其中第一生色缀合物是化合物2。
I3.实施方式I1至I2任一项的方法，其进一步包括使样品与第二生色缀合物在第二浓度(例如，0.03mM至10mM，或0.3mM或1mM)接触，其中第一生色缀合物和第二生色缀合物具有一个或多个彼此不同的一个或多个光谱特征。
I4.实施方式I2至I3任一项的方法，其中第二生色缀合物选自实施方式A1-A16任一项的任何生色缀合物。
I5.实施方式I3至I4任一项的方法，其中第一生色缀合物是化合物9，第二生色缀合物是化合物10。
I6.根据实施方式I5的方法，其进一步包括使样品与第三生色缀合物在第三浓度(例如，0.03mM至10mM，或0.3mM或1mM)接触，其中第三生色缀合物可以是化合物35。
I7.实施方式I3至I4任一项的方法，其中第一生色缀合物是化合物35，第二生色缀合物是化合物10。
I8.实施方式I3至I4任一项的方法，其中第一生色缀合物是化合物5，第二生色缀合物是化合物35。
J1.式XI的化合物：
式XI
其中R18是卤素；R19是氮原子保护机体(例如叔丁氧基羰基(BOC)基团；p是0至4；q是0至4。
J2.实施方式J1的化合物，其中R18是溴；R19是BOC基团；p是1至3；q是1至3。
J3.实施方式J2的化合物，其具有式XIa的结构：
J4.制备色原体的方法，其包括：使罗丹明(例如罗丹明6G或罗丹明B)、荧光素(例如荧光素异硫氰酸酯，NHS-荧光素，或O-羧基荧光素)、或罗丹明或荧光素的2'酯或酰胺衍生物与实施方式J1至J3任一项的化合物反应，得到式XII的中间体化合物：
其中R19是氮原子保护基团(例如叔丁氧基羰基(BOC)基团；R20是O或NH；p是0至4；q是0至4。
J5.用于合成生色化合物的中间体，其中中间体是根据式XII的化合物：
其中R19是氮原子保护基团(例如叔丁氧基羰基(BOC)基团；R20是O或NH；p是0至4；q是0至4。
J6.用于合成生色化合物的中间体，其中中间体是根据式V或Va的化合物：
其中R1至R10、RX、RXX、RY和RYY具有本申请陈述的定义。
J7.用于合成生色化合物的中间体，其中中间体是根据式XIII的化合物：
其中R19是氮原子保护基团(例如叔丁氧基羰基(BOC)基团；R20是O或NH；p是0至4；q是0至4。
J8.实施方式J7的中间体，其中中间体是根据式XIIIa的化合物：
其中R19是氮原子保护基团(例如叔丁氧基羰基(BOC)基团；R20是O或NH；p是0至4；q是0至4。
K1.根据式XIV的具有两个色原体部分的缀合物：
其中X1和X2选自-OH，-ORX和-NRXRXX，X1和X2优选为不同，
其中Y1和Y2选自＝O或＝N+RYRYY，Y1和Y2优选为不同，
其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、RX、RXX、RY、和RYY独立地选自氢和具有小于40个原子的取代基，或者如本申请别处所定义；和
其中R34选自甲基，乙基，丙基，OCH2，CH2OCH2，(CH2OCH2)2，NHCH2，NH(CH2)2，CH2NHCH2，环烷基，烷基-环烷基，烷基-环烷基-烷基，杂环基(例如具有4至8个原子的含氮环)，烷基-杂环基，或烷基-杂环基-烷基，优选为哌啶基或哌嗪基。
K2.式XIVa的FRET缀合物：
其中X1和X2选自-OH，-ORX和-NRXRXX，X1和X2优选为不同，
其中Y1和Y2选自＝O或＝N+RYRYY，Y1和Y2优选为不同，
其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、RX、RXX、RY、和RYY独立地选自氢和具有小于40个原子的取代基，或者如本申请别处所定义；和
其中R38是4元至8元环烷基或4元至8元杂环基(例如具有4至8个原子的含氮环)，优选为哌啶基或哌嗪基。
优选的式XIVa的化合物是其中第一生色部分(例如，荧光素衍生物)的发射和第二生色部分(例如，罗丹明衍生物)的吸收重叠的那些。
K3.根据实施方式K1或K2的缀合物，其中所述缀合物包括第一生色部分和第二生色部分，第一生色部分是羧基-荧光素，第二生色部分选自罗丹明6G和罗丹明B。
K4.根据实施方式K1至K3任一项的缀合物，其中X1选自-OH和-ORX，X2是-NRXRXX，Y1是＝O，Y2是＝N+RYRYY。
K5.根据实施方式K1至K4任一项的缀合物，其中R1至R10中的一个或多个(优选为R10)任选连接于连接基(L)，且连接基任选连接于过氧化物酶底物(PS)。
K6.通过荧光检测来检测样品中的靶标的方法，所述方法包括：
(i)培育推测包含水溶液中的靶标的样品，其中靶标包括过氧化物酶活性或靶标直接或间接连接于过氧化物酶，其中所述水溶液包含：
根据实施方式K2至K5任一项的FRET缀合物，其中所述FRET缀合物包括第一生色部分第二生色部分，第一生色部分(例如，荧光素衍生物)具有吸收光谱，第二生色部分(例如，罗丹明衍生物)具有发射光谱，且光吸收光谱和光发射光谱重叠，
(ii)激发FRET缀合物的沉淀物；
(iii)检测来自样品中的发射光谱的荧光，从而检测样品中的靶标。
K7.根据实施方式K6的方法，其中在足以形成FRET缀合物的沉淀物的的时间和温度培育样品。
K8.根据实施方式K6的方法，其中其进一步包括用至少至少两种、或至少三种其它荧光分子培育样品。其它荧光分子具有与FRET缀合物不同的颜色或吸收最大值。
L1.通过生色检测来检测包括棕色组织的样品中的靶标的方法，所述方法包括：
(i)在足以形成生色缀合物的有色沉淀物的时间和温度培育推测包含水溶液中的靶标的样品，其中靶标包括过氧化物酶活性或靶标直接或间接连接于过氧化物酶，
其中所述水溶液包含：
a)实施方式A1至A17、或K1至K5任一项的生色缀合物，
b)过氧化物化合物；
其中所述癌细胞是染色的(slecand)，
(ii)检测样品中的生色缀合物的有色沉淀物，从而检测样品中的靶标。
L2.根据实施方式L1的方法，其中棕色组织选自扁桃体，肝，黑色素瘤，细胞，肺癌，或其它。
实施例
实施例1至26是缀合物和用于制备一些所选的生色缀合物的中间体的合成方法的非限制性例证，以及它们在IHC和ISH测定形式中检测分子靶标中的实际应用。
实施例1
N-[2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙基]氨基甲酸叔丁酯(化合物20)根据WO2007/015168制备。
实施例2
"Boc-L15"(化合物21)根据US20100055761制备。
实施例3
N-[2-[2-[2-[(2-溴乙酰基)氨基]乙氧基]乙氧基]乙基]氨基甲酸叔丁酯(化合物22)如下制备：在约700mL二氯甲烷(DCM)中的214mmol 2-溴乙酸酐如下制备：使214mmol二环己基碳二亚胺(DCC)和428mmol溴乙酸在600mL DCM中在4℃反应20h，和用DCM洗涤物滤除二环己基脲(DCU)。
向如上制备的经冰冷却的在约700mL DCM的214mmol 2-溴乙酸酐中添加321mmol二甲基吡啶，然后历时30分钟逐滴添加溶解于106mL DCM中的214mmol化合物20。在另外10分钟之后，将冰冷的反应混合物用400mL萃取，然后用50mL 1M柠檬酸盐(pH 4.5)的萃取，最后用50mL水萃取。在低于40℃将DCM蒸发掉，再蒸发掉另外两部分200mL DCM，得到84g油，向油中添加170mL乙醚，使得DCU进一步沉淀，将其滤除。在-18℃过夜产生稠密的微晶灰白色沉淀物，将其滤除，用乙醚洗涤并真空干燥。收率为60g，76％的22。单一纯产物通过TLC分析为在乙酸乙酯中的5％甲醇中rf.值为0.5，具有弱的UV活性，具有强的茚三酮反应。质谱分析提供的数据与溴同位素模式一致。纯度为>99％，通过HPLC@210nm测得。
实施例4
罗丹明6G盐酸盐(化合物23)如下制备：50g罗丹明6G乙酯盐酸盐(Sigma-Aldrich目录#R4127)通过在320mL水、30mL 10M氢氧化钠和350mL乙醇中回流45分钟来水解。将反应混合物冷却并用75mL 4M HCl酸化，制得强烈红色的沉淀物，将其滤除，用水充分洗涤，并在真空中在90℃用氢氧化钠小粒干燥。收率为46g罗丹明6G盐酸盐，99.3％纯度，通过HPLC@260测得。
名称"罗丹明6G"是乙酯的俗名和商业名。游离酸作为高氯酸盐从Sigma Aldrich以名称"罗丹明19"购得。为避免与可能随取代类型改变的俗名、缩写名和/或商业名混淆，该母体结构将在本申请通篇称为"罗丹明6G"，而不管该俗名用于具体衍生物。
实施例5
四甲基罗丹明如下制备：以类似于现有技术方法进行邻苯二甲酸酐和3-(二甲基氨基)-苯酚的硫酸催化的缩合。在萃取后处理之后，通过色谱用在DCM中的25％甲醇将其进一步纯化，得到17g的98％HPLC纯产物@260nm。罗丹明B碱#234141、罗丹明101内盐#83694和罗丹明110氯化物#83695得自Sigma-Aldrich。
实施例6
该实施例描述合成乙基-羧基甲基罗丹明B溴化物(化合物24)的示例性方法。
将4.42g(10mmol)罗丹明B碱(Sigma Aldrich)添加到含有9mL乙腈和3.5mL N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)(20mmol)的250mL烧瓶中。将溶液在90℃搅拌，直到所有均已溶解，然后添加1.67mL溴乙酸乙酯(15mmol)。在90℃进一步反应1小时之后，将反应混合物冷却至室温，逐滴添加100mL乙醚，产生细的深色粉末沉淀物。将其滤除，用2x 20mL乙醚洗涤，并在真空中干燥过夜。这得到6.93g(98％)的深紫色粉末，具有99％的HPLC纯度@260nm。
实施例7
该实施例描述合成罗丹明B哌嗪酰胺溴化物(化合物25)的示例性方法。
将10g化合物24(16mmol)和10g哌嗪溶解于40mL乙腈中，并使其在氮气下在搅拌下在90℃反应11/2小时。在70-80℃在旋转蒸发仪上蒸发掉乙腈和过量哌嗪。添加另外两份25mL乙腈，再次蒸发掉乙腈，以驱除剩余的哌嗪。最后，将产物溶解于25mL乙腈中，在搅拌下逐滴添加100mL乙醚，产生细的深色粉末。将其滤除，并在带有油泵的干燥器中干燥过夜，得到紫-金色固体。收率为7.64g(82％)，纯度为98％，通过HPLC@260nm测得。
罗丹明6G和四甲基罗丹明的哌嗪酰胺按照化合物25、经由相应的乙基-羧基甲基酯制备，然后将其与哌嗪反应。
实施例8
该实施例描述合成四甲基罗丹明-Pip-L12-Cou(化合物7)的示例性方法。使100mg四甲基罗丹明哌嗪酰胺氢溴化物(参见实施例7)和100mg化合物22在1mL NMP和50微升DIPEA中悬浮。在80℃悬浮4小时之后，将反应混合物用乙醚沉淀，得到中间体四甲基罗丹明-Pip-L12-Boc。将其溶解于1.5mL TFA中并保持30分钟，从而移除Boc-group，用乙醚沉淀，使其与COMU((1-氰基-2-乙氧基-2-氧代亚乙基氨基氧基)二甲基氨基-吗啉代-碳
六氟磷酸盐)活化的香豆酸反应10分钟，然后进行HPLC纯化。收率为73mg(50％)。
实施例9
该实施例描述合称罗丹明6G-Et-Pip-L12-Cou(化合物14)的示例性方法。使100mg罗丹明6G与3当量N-羟基-琥珀酰亚胺、3当量二异丙基碳二亚胺和3当量N-Boc-N’-[2-羟基乙基]-哌嗪在NMP中在80℃反应过夜。这得到中间体罗丹明6G-Et-Pip-Boc：
该粗制中间体通过用乙醚沉淀来分离，然后用TFA进行脱保护，用乙醚沉淀，用化合物22烷基化，Boc脱保护，最后使其与COMU活化的香豆酸反应，并经HPLC纯化。收率为7mg化合物14，对于合并的所有步骤为约5％。
实施例10
该实施例描述合称罗丹明6G-L12-Boc(化合物26)的示例性方法。
在100℃将2.07g罗丹明6G内盐和5.0mmol化合物23溶解于15mL无水NMP和1.7mLDIPEA(2当量)中。一旦所有均已溶解，添加2.76g化合物22(1.5当量)，将反应混合物在100℃搅拌3小时。将反应冷却至室温，并在剧烈搅拌下逐滴添加200mL乙酸乙酯，在已经添加约一半的乙酸乙酯之后开始沉淀。将混合物在4℃温和搅拌过夜，得到亮红色沉淀物，将其滤除，用少量冷乙酸乙酯洗涤，并在真空中干燥过夜。这产生3.4g化合物26，其收率为99％，纯度为97％，通过HPLC@260nm测得。
实施例11
该实施例描述合称罗丹明6G-L12-TFA盐(化合物27)的示例性方法。
在室温将2g化合物26(罗丹明6G-L12-Boc)溶解于12mL TFA中。在30分钟之后，伴随冰冷却，首先添加100mL乙酸乙酯，然后添加100mL乙醚。这产生深红色的极其吸湿的沉淀物，将其滤除，用少量乙醚洗涤，并立即在真空中干燥。收率为1.05g(50％)，纯度为97％，通过HPLC@260nm测得。
实施例12
该实施例描述合成罗丹明6G-L12-Cou(化合物2)的示例性方法。将100mg化合物27溶解于1mL NMP中。将41mg香豆酸和100mg COMU(0.95当量)溶解于0.5mL NMP中，并通过43微升DIPEA(1当量)活化30秒。将活化的混合物添加到化合物27的溶液中，然后立即添加另外100微升DIPEA。使反应在10分钟内完成，将产物用15mL乙醚沉淀。将其部分溶解于50mL的在水中的2％TFA和25％乙腈，并通过RP-HPLC纯化。通过质谱分离每个含有产物的级分，收集纯级分并将其冷冻干燥。收率为40mg(38％)。已经测试了化合物2的诱变，结果表明其不具有显著的诱变。将化合物2在LD50实验中在大鼠上测试，预期其具有低毒性，尤其是与DAB相比。
实施例13
化合物1(罗丹明110-L12-Cou)；化合物3(TetraRhodamine-L12-Cou)；化合物4(罗丹明B-L12-Cou)和化合物5(罗丹明101-L12-Cou)按照与化合物2(参见实施例12)相同的方式制备，其通过将起始罗丹明化合物用化合物22在NMP和过量的DIPEA中在100℃烷基化3-4h进行，然后将其用乙醚沉淀。将中间体在纯的TFA中Boc-脱保护30-60分钟，通过添加乙醚使其作为TFA盐沉淀。使其与COMU(活化的香豆酸)反应，然后进行HPLC纯化，得到最终的生色缀合物。
实施例14
在该实施例中，罗丹明6G的其它4-羟基-香豆酸衍生物(化合物16-19)按照与制备化合物2的方法(实施例12)类似的方式通过COMU介导的与TFA盐化合物27的偶联制备。化合物16(罗丹明6G-L12-Caf)由化合物27和COMU活化的咖啡酸制备；化合物17(罗丹明6G-L12-2,4-OH-Cin)由化合物27和COMU活化的2,4-二羟基肉桂酸制备；化合物18(罗丹明6G-L12-Fer)由化合物27和COMU活化的阿魏酸制备；化合物19(罗丹明6G-L12-Sin)由化合物27和COMU活化的肉桂酸制备。在所有制备中，肉桂酸衍生物的COMU活化在NMP中用稍微过量的游离肉桂酸和精确一当量的DIPEA进行。正如与在化合物2的制备中所进行的一样，将化合物27溶解于NMP，添加活化的肉桂酸，然后添加过量的DIPEA。这使在未保护的羟基上的副反应最少。
实施例15
该实施例描述合成具有缩短和延长的连接基的生色缀合物的示例性方法。化合物15(罗丹明101-L27-Cou)通过增加偶联步骤用化合物21(Boc-L15-OH)进行。向70mg悬浮于0.5mL NMP的约0.1mmol化合物27中添加用0.95当量COMU和1当量DIPEA活化的0.13mmol化合物21(Boc-L15-OH)。在10分钟之后，中间体罗丹明6G-L27-Boc用15mL乙醚沉淀；然后将其溶解于纯的TFA并保持30分钟，从而移除Boc基团，然后进行乙醚沉淀，最后使其与COMU活化的香豆酸反应。化合物13按照与化合物2类似的方式如下制备：用N-(2-溴乙酰基)-N'-Boc-乙二胺将罗丹明6G烷基化，然后进行TFA介导的Boc脱保护和与COMU活化的香豆酸的偶联。
实施例16
该实施例描述合成基于荧光素的生色缀合物的示例性方法。基于2,7-二氯荧光素的化合物9、化合物10和化合物11按照与制备罗丹明(参见实施例12-13)类似的方式通过用化合物22将母体荧光素烷基化制备。
实施例17
该实施例描述合成化合物28(Flu-L12-Boc)的示例性方法。将1.66g荧光素和1.85g化合物22(1当量)溶解于3mL NMP和1.3mL DIPEA(1.5当量)中并在100℃搅拌过夜。使反应混合物吸收进50mL DCM中，并用5mL饱和NaHCO3和45mL水萃取两次。将DCM相减少到呈现为强烈红色油，将其通过色谱法在100mL硅胶上纯化。所需产物化合物28(Flu-L12-Boc)作为最后一种主产物用15％MeOH在DCM中洗脱。收率为465mg(15％)。与单醚化合物29相比，具有相同质量的化合物28即使在酸性条件下也保留独特吸收约460nm，而化合物29折叠成无色的螺内酯。两种双烷基化的产物(即有色的醚-酯化合物30，和基本上无色的二醚螺内酯31)可以通过质量和颜色表征。
实施例18
该实施例描述合成化合物10(Flu-L12-Cou)的示例性方法。在室温将62mg化合物28(Flu-L12-Boc)溶解于0.5mL TFA中。30分钟之后，脱保护的中间体Flu-L12通过用8mL乙醚沉淀来分离。将其溶解于0.3mL NMP中，并使其与2当量COMU-活化的香豆酸在0.4mL NMP中反应。在10分钟之后，将粗产物用乙醚沉淀，并经HPLC纯化。收率为40mg(60％)。
化合物11(2,7-二氯-Flu-L12-Cou)按照与化合物10相同的方式从2,7-二氯荧光素和化合物22开始制备。正确异构体的分离和表征通过质谱/UV进行，进行Boc-脱保护，并将其与香豆酸偶联。
实施例19
该实施例描述合成化合物9((O-羧基甲基)-Flu-L12-Cou)的示例性方法。使310mg化合物28在100℃在1mL NMP和170微升DIPEA中与111微升溴乙酸叔丁酯(1.5当量)反应4小时。将反应混合物直接施加到小硅胶柱上，中间化合物用10％MeOH在DCM中洗脱。收率为220mg(60％)。
将73mg化合物32溶解在0.5mL的TFA中。1小时后，质谱显示Boc基团和叔丁酯已经干净地除去。将中间体用乙醚沉淀，并使其与COMU活化的香豆酸反应，经HPLC纯化，得到29mg化合物9(40％)。
实施例20
该实施例描述合成化合物12(Flu-Pip-L12-Cou)的示例性方法。荧光素哌嗪酰胺根据参考文献3制备。将400mg荧光素哌嗪酰胺和370mg化合物22(1当量)溶解于2mL NMP和340微升DIPEA中，使其在60℃反应1小时。柱色谱使得分离240mg的Flu-Pip-L12-Boc(35％)。69mg该中间体用TFA进行Boc-脱保护，使其与COMU活化的香豆酸反应，然后HPLC纯化得到40mg(55％)的化合物12(Flu-Pip-L12-Cou)。
实施例21
该实施例描述使用很多本申请所述生色缀合物进行的IHC测试。IHC测试使用Dako试剂和仪器并根据制造商说明进行。最初将化合物1-19经HPLC纯化至+98％纯度，然后在这些IHC测试中进行测定。
作为预处理，将含有FFPE人类组织(包括10种不同类型的正常组织和癌组织)的多样品载玻片、和含有表达5种不同水平的Her2蛋白质的Her2对照细胞系的FFPE载玻片在二甲苯和醇中脱石蜡，然后将靶标在Dako PT-Link模块中根据制造商说明取回并在DakoAutostainer Link上染色。
靶标取回也在微波炉(10分钟煮沸，在HEPES pH 8中，靶标取回)中测试，与在Autostainer Plus上染色组合。Autostainer染色通过在室温水平放置载玻片施用试剂进行。
或者，所有预处理和染色都在机载Dako Omnis上自动进行。Omnis染色如下进行：将试剂施用在载玻片和盖子之间的毛细管间隙中，摇动盖子以将试剂混合。这在32℃进行。
将样品使用以下规程染色。Dako RTU初级抗体(FLEX-IR系列)根据制造商说明使用。对于HER2染色，单克隆兔抗HER2以1mg/L使用。为使初级抗体视觉化，使用DakoEnvision+Dual link HRP视觉化(K4061)，其包括山羊-抗-小鼠-HRP和山羊-抗-兔-HRP缀合物两者。用DAB作为参比物使染色逐渐展开，在这些样品上测试作为DAB替代物的化合物1至19。
示例性染色规程包括：(1)用Dako(S2023)过氧化物封闭剂封闭内源性过氧化物酶，5分钟。(2)初级RTU抗体，20分钟。(3)Envision+Dual Link HRP，20分钟。(4)DAB(DakoK3468)，或本发明生色缀合物之一，5分钟。(5)用苏木素(Dako S3301)复染色5min。在各步骤之间，洗涤用洗涤液缓冲剂(Dako S3006)进行。将载玻片在Sakura TissueTech Film盖片机上脱水和盖片。
观察到，通常用于DAB的色原体底物缓冲剂用本发明生色缀合物给出不令人满意的结果。较好的结果用包含50mM咪唑:HCl pH 6.8与0.1％NP40-Non-idet作为洗涤剂的缓冲剂组合物获得。用过氧化氢进行的广度滴定显示宽浓度范围，在0.002％、0.003％和0.004％之间没有可见的差异。
制备和测试罗丹明6G的几种不同衍生物。化合物2和化合物16-19与五种不同的4-羟基肉桂酸衍生物之间的比较表明，具有咖啡酸的化合物16和具有芥子酸的化合物19性能较差。具有阿魏酸的化合物18性能可接受，具有2,4-二羟基肉桂酸的化合物17给出强染色，但是也有一些背景。具有4-羟基肉桂酸的化合物2是五种生色缀合物中性能最好的，给出强染色和脆染色两者，没有背景。其它生色部分之后用4-羟基肉桂酸作为过氧化物酶底物部分制备。
在0.5mM，在多种初级抗体染色之中，化合物2在强度和脆度上完全比得上DAB，都作为细胞膜、细胞质和细胞核标志物，具有与DAB基本上相同的形式具有相同的高表达/低表达平衡。在陈述DAB在强度上匹敌方面，限制条件是这是指低表达靶标和中等表达靶标的染色和检测。这是主要确定临床效用之物。
在很多情况中极高表达靶标用DAB几乎显现为黑色，而本发明的生色缀合物在光谱上窄，仍允许具有波长为它们不吸收波长的光通过。为此，包括执业病理学家的几位受训观察者发现，化合物2实际上在高表达范围内性能较好且较动态地执行性能，而DAB往往会过度染色和将形态学细节"晕染"。这在图1-3的显微照片中反映出来。图1是Ki67染色的扁桃体组织的显微照片。左边的照片用化合物2(以下所述)染色；右边的照片用DAB染色。图2是CK-PAN染色的肝组织是显微照片。左边的照片也用DAB染色；右边的照片用化合物2染色。图3是CDX-2染色的正常结肠组织的显微照片。左边的照片用DAB染色；右边的照片用化合物2染色。
化合物2与在罗丹明6G和香豆酸之间具有不同连接基的其它罗丹明6G衍生物的比较显示在光谱性质上大的相似性。仅是具有哌嗪酰胺的化合物6通过吸收536nm的光而相较于其他凸显出，这比包含酯的化合物2、13、14和15的吸收波长高约5nm，其最大吸光度均在531-533nm内。化合物6、14和15相对于化合物2具有显著增加的在底物缓冲剂之中的溶解度，而化合物13具有缩短的连接基，具有减小的溶解度。在所有情况中将NMP添加到缓冲剂中均增大色原体溶解度。参见下表结果，其为2、13和15的溶解度与作为有机助溶剂的NMP的百分比的函数关系，0％代表纯的含水缓冲剂50mM咪唑:HCl，pH 6.8，3％和10％代表所述百分比的缓冲剂。
表3
| 化合物 | 连接基 | 0％ | 3％ | 10％NMP |
| 13 | L6 | 0.5mM | 0.9mM | 1.8mM |
| 2 | L12 | 1.0mM | 1.2mM | 3.6mM |
| 15 | L27 | 1.7mM | 1.9mM | 6-7mM |
实施例22
该实施例描述由本发明生色缀合物的不同实施方式提供的不同颜色。当在0.4至1mM测试时，以下色原体有效工作：化合物2(0.5mM)，化合物13(1mM)和化合物14(1mM)产生的红色染色在强度和脆度上比得上DAB。化合物6产生稍微紫红色染色，其在强度和脆度上比得上DAB。化合物4(0.4mM)产生紫色染色，其在强度和脆度上比得上DAB。化合物3(1mM)产生稍微红紫色染色，其在强度和脆度上较比得过DAB。化合物8(1mM)产生稍微蓝紫色染色，其在强度和脆度上较比得过DAB。化合物15(1mM)产生深蓝色染色，其在强度和脆度上优于匹敌的DAB。化合物9(1mM)产生稍微绿黄色染色，其在强度上最比得过DAB。
实施例23
该实施例证明使用本发明缀合物免疫组织化学染色三种不同靶标的方法。示例性的三重染色方法使用DAB与化合物2和8的组合，在Dako Autostainer上在室温进行。方法的步骤包括：
1.用过氧化物封闭剂(Dako S2023)封闭内源性过氧化物酶，5分钟。
2.抗Ki67 RTU抗体(Dako IR626)，20分钟
3.Envision+dual Link HRP(Dako K4061)，20分钟
4.DAB(Dako K3468)5分钟。
5.用过氧化物封闭剂(Dako S2023)进行HRP淬灭，添加5mg/mL的α氰基肉桂酸，5分钟。
6.抗CD20cy RTU抗体(Dako IR604)，20分钟
7.Envision+dual Link HRP(Dako K4061)，20分钟
8. 0.5mM化合物2在50mM咪唑:HCl pH 6.8中，0.003％过氧化氢和2.5％NMP，5分钟。
9.用过氧化物封闭剂(Dako S2023)进行HRP淬灭，添加5mg/mL的α氰基肉桂酸，5分钟。
10.抗Her2(Dako vial ST301 from HercepTest kit SK001)20分钟。
11.Envision+dual Link HRP(Dako K4061)，20分钟
12. 0.5mM化合物8在50mM咪唑:HCl pH 6.8中，0.003％过氧化氢和2.5％NMP，5分钟。
13.用苏木素(Dako S3301)复染色
该染色规程产生：棕色ki67细胞核染色(DAB)，在所有组织中都有一些细胞染色；紫色CD20细胞膜染色(化合物8)，主要在扁桃体中；和Her2细胞膜染色(化合物2)与蓝色细胞核(苏木素)组合，在乳癌和结肠中。具有单一染色和双染色的对照实验证明，三重染色正确地产生与单一染色观察到一样的图案。发现将α氰基肉桂酸添加到过氧化物酶封闭剂中极大地增强其HRP淬灭效率；即根本没有显著的颜色溢出，DAB不会以任何方式由之后的紫色和红色染色污染，紫色染色也不会以任何方式由之后的红色染色污染。包括蓝色苏木素的所有四种颜色彼此的反差明确。
本申请的生色缀合物与棕色DAB反差充分，除了基于罗丹明101的两种蓝色缀合物(化合物5和化合物15)之外，但它们也与苏木素反差充分。与非常有效地淬灭HRP活性的可能性和它们的窄吸收光谱组合，这使得本申请公开的本发明生色缀合物格外适于多重染色和分析。
实施例24
该实施例描述本发明生色缀合物的不同实施方式在色原体原位杂交(CISH)中的用途。这些生色缀合物以及它们是HRP底物而非碱性磷酸酶底物的事实表现为特别可用于CISH应用。
使载有多个人类组织样品的载玻片进行以下快速CISH规程：
1.在二甲苯、然后在乙醇中脱石蜡
2.在微波炉中沸腾10分钟。
3.用缓冲剂、水洗涤，然后在乙醇中脱水。
4.使IQFISHHER2(DakoGM333，包括FITC-标记的PNA中心体17探针)在66℃变性10分钟
5.在45℃杂交15分钟。
6.在63℃严格洗涤10分钟。
7.在室温洗涤缓冲剂。
8.用Dako(S2023)过氧化物封闭剂封闭内源性过氧化物酶，5分钟。
9.a.20nM抗FITC-HRP或b.20nM抗FITC-碱性磷酸酶，进行20分钟。
10.a.1mM 2在底物缓冲剂pH 6.8中，0.003％过氧化氢，进行5分钟；或b.LiquidPermanentRed(Dako K0640)，进行10分钟。
11.用苏木素(Dako S3301)复染色，5min。
12.用水洗涤，在无水乙醇中脱水1分钟。
在步骤9中用抗FITC-HRP培育的载玻片在步骤10中用化合物2染色，用抗FITC-碱性磷酸酶培育的载玻片用LiquidPermantRed染色。染色的载玻片显示于图1。该规程未根据制造商说明，因为培育时间减少，且未使用蛋白水解预处理。
结果：用抗FITC-AP和LiquidPermanentRed染色的载玻片在用福尔马林固定的6小时的扁桃体组织中显示小但是清晰和独特的点状信号，在固定24小时的扁桃体组织的一些区域中具有非常小的点。没在其它类型的组织中检测到一致的信号。
用抗FITC-HRP和化合物2染色的载玻片在两种扁桃体组织中都产生大和独特的点，且预期在所有其它组织中存在1-2个独特点，所述其它组织包括正常肝组织，胰腺组织，肾脏组织，结肠组织和小脑，以及在乳腺癌组织、黑色素瘤组织和良性肿瘤。仅在一种组织(恶性结肠癌组织)中，点非常小。
虽然用Ki67检测到相同数目的细胞核，且同样地用DAB和化合物2均等地染色弱的肝膜，肝中的小的高表达结构、尤其是CDX-2结肠结构用DAB过染色，通常覆盖整个细胞，而细胞核当用化合物2染色时明显地凸显。
该实施例说明本发明生色缀合物与适当HRP缀合物的组合在通过CISH进行的分析方法中高度有用的性质。由于HRP是显著较小的酶(40kDa相比于碱性磷酸酶的140kDa)，其较好地穿透进、甚至深入到细胞核中，并且与本申请公开的强烈色原体共同甚至用非常短的杂交和培育步骤也具有非常好的性能。
实施例25
制备新的色原体以进一步制备二色性色原体。该新的色原体称为化合物35并且具有下式IX：
化合物35由专利蓝V钠盐和本申请的化合物22制备。使专利蓝V钠盐(116mg，0.2mmol)和化合物22(154mg，0.4mmol)一起在1mL NMP和170微升DIPEA(1mmol)中在100℃反应16小时。将中间体产物用7mL乙醚沉淀，并将其溶解于1mL TFA。在1小时之后，用7mL乙醚使中间体再次作为细的蓝色粉尘沉淀，用乙醚洗涤几次。将其干燥并溶解于3mL NMP，同时添加600微升DIPEA，使其与600微升0.5mM香豆酸酐反应。
在10分钟的反应之后，将混合物用25mL乙醚沉淀，并通过制备HPLC作为TFA盐纯化。三个步骤的收率(假设摩尔萃取系数为80.000@640nm)为46mg，26％s。C44H54N4O12S2(阳离子盐)，计算值896.0565，实测值895.91。化合物35在中性水中的最大吸光度在640nm。
以下合成方案说明由式X的中间体和中间化合物22制备化合物35：
实施例26
该实施例证明化合物35可以与其它色原体混合，这包括但不限于本申请公开的其它生色缀合物。黄色和青色色原体的这些混合物在黄色、蓝色或纯平衡绿之间产生阴影。黄色和洋红色的混合物允许制备橙色和红色的中间颜色。洋红色和青色的混合物在渐增的蓝紫色、蓝色和蓝青色之间产生阴影。因此，化合物35和其它青色色原体可以与其它颜色的色原体混合以产生纯色(彩虹颜色)以及居于红色和蓝色之间的紫色系的所有颜色的染色。
该实施例也描述将二色性色原体混合以制备色原体的几个实施例(称为实例二色性橙和二色性红)，所述色原体随着下述浓度改变色调。在这样的实施例中，色原体缓冲剂由以下组成：50mM咪唑，pH 6.8，10％NMP，0.1％NP40-Nonidet，0.01％苯扎氯铵，0.03％过氧化氢。实施例也包括实例黄、实例绿、实例蓝，其也是产生所需颜色的混合物。
实例黄：1mM化合物9与0.3mM化合物10混合，产生低强度的清晰亮黄色染色，在高强度产生深的向日葵黄染色，其与蓝苏木素的反差极好。避免单独的化合物10在高浓度的棕色色调，正如单独的化合物9的令人不舒服的绿黄色。因为这些色原体光谱上如此窄，两种色原体的组合较好地匹配宽视网膜颜色接收器的吸光度。换言之，色原体按该比率混合在一起的组合产生染色和沉淀物，沉淀物在430至500nm具有几乎恒定的吸光度和在较高波长经历急剧的下降。
实例绿：1mM化合物9与0.3mM化合物10+0.3mM化合物35(青色)混合，产生在低强度看起来有些模糊但非常亮的漂亮的亮绿色。在较高强度，饱和度增加，得到非常强而又饱满的绿色。组合的黄色色原体峰在487nm，青色峰在642nm。在低强度，一些蓝色和红色光也被传送，但是以平衡的方式传送。随着强度增加以及黄色和青色的和饱和度降低，绿色的感知饱和度增加较少，但是成比例地更多绿色光被传送。
实例蓝：1mM化合物5与1mM化合物35(青色)混合，产生亮但是极强的天空蓝染色。同样，与用实例黄一样，效果是，通过将光谱上间距窄的两种色原体混合，用吸收红光和绿光的人眼视锥细胞产生最优选的匹配，留下几乎优选的蓝光。其与蓝苏木素的反差不是最好，但是苏木素染色的细胞核与该蓝色对比突然看起来有些发红。这是因为，苏木素也具有红色传送的小要素，其当与该纯蓝色对比时突然变得明显。
实例青：完美的蓝色和绿色可以用包括化合物35的混合物制得，新的青色色原体显示其巨大的效用。但是与单独的绿黄色一样，单独的青色在低强度感知的稍弱，而在高强度使人眼不舒服。甚至在色原体缓冲剂中单独的1-2mM化合物32也不能产生令人信服的结果。这是可以理解的，因为两种色原体都仅在我们的色觉附近吸收，使得大多数光以低强度自由传送。
可以明确地预期，本申请中的任何生色缀合物可以用于本申请中的任何使用方法、组合物、和成套药盒。
在本申请中，数值范围包括限定范围的数字。在本申请中，无论何处发现措辞"包含"，预期措辞"基本上由…组成"或"由…组成"可以用在适当位置。应该认识到，化学结构和化学式可以针对说明的目的延伸和扩大。
除非相反定义，否则本申请使用的所有技术和科学术语都具有与本申请所属技术领域技术人员通常理解的一致的含义。
引用的任何公开仅针对申请日之前的公开内容，不应该认为是承认了本发明权利要求不享有先于这些公开的资格。此外，提供的公开日可能不同于可以独立证实的实际公开日。
鉴于本申请内容，应该注意方法和设备均按照本发明教导执行。此外，各种组分、材料、结构和参数仅作为例证和实施例包括，不含有任何限制的含义。鉴于本申请公开内容，本发明教导可以在其它应用中执行，可以确定执行这些应用的其它组分、材料、结构和仪器，而保持在所附权利要求的范围内。
Claims (16)
1.一种生色缀合物，其包含：
(a)生色部分，和
(b)过氧化物酶底物部分PS，
其中所述生色缀合物为式I的化合物：
其中所述生色部分和所述过氧化物酶底物部分经连接基L连接在一起，所述连接基L包含5至29个连续连接原子的直链，其中所述连接基L为水溶性分子部分，
其中所述生色部分
选自罗丹明和荧光素，及其盐。
2.根据权利要求1所述的生色缀合物，其中所述生色部分选自罗丹明，罗丹明6G，四甲基罗丹明，罗丹明B，罗丹明101，罗丹明110，荧光素，和O-羧基甲基荧光素。
3.根据权利要求1或2所述的生色缀合物，其中所述连接基是包含1或2个式III的重复单元的化合物：
其中R31选自甲基，乙基，丙基，OCH2，CH2OCH2，(CH2OCH2)2，NHCH2，NH(CH2)2，CH2NHCH2，环烷基，烷基-环烷基，烷基-环烷基-烷基，杂环基，烷基-杂环基，烷基-杂环基-烷基，并且其中不多于3个连续重复的乙氧基，R32和R33独立地选自NH、CH2NH和O。
4.根据权利要求3所述的生色缀合物，其中所述杂环基为具有4至8个原子的含氮环。
5.根据权利要求1或2所述的生色缀合物，其中所述连接基选自式IIIa、IIIb、或IIIc：
6.一种组合物，其包含至少一种根据权利要求1至5中任一项所述的生色缀合物和溶剂以及任选的以下物质中的一种或多种：(i)有机改性剂；(ii)酶增强剂；(iii)铁螯合剂；(iv)洗涤剂；(v)抗菌剂；(vi)有机或无机盐；或(vii)酶底物，
其中所述有机改性剂选自聚乙二醇、C1-C4醇、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、二甲基亚砜(DMSO)、单乙二醇、二乙二醇、环丁砜、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)及其组合；且
其中所述酶增强剂选自苯基硼酸衍生物和二价金属离子。
7.用于检测样品中的具有过氧化物酶活性或连接于过氧化物酶的靶标的成套用品，所述成套用品包括至少一种根据权利要求1至5中任一项所述的生色缀合物。
8.根据权利要求1至5中任一项所述的生色缀合物在制备成套用品中的用途，所述成套用品用于通过生色检测来检测样品中的靶标，其中所述检测包括：
在足以形成生色缀合物有色沉淀的时间和温度，培育推测在水溶液中包含靶标的样品，其中所述靶标包含过氧化物酶活性，或者所述靶标直接或间接连接于过氧化物酶，其中所述水溶液包含：
a)至少一种权利要求1至5中任一项的生色缀合物；
b)过氧化物化合物；
检测所述样品中的所述生色缀合物的有色沉淀物，由此检测所述样品中的靶标。
9.根据权利要求8所述的用途，其进一步包括用具有式IX或式XIV的第二生色缀合物培育所述样品：
其中X为-OH，-ORX或-NRXRXX，
其中Y为＝O或＝N+RYRYY；
其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、RX、RXX、RY、和RYY独立地选自氢和具有小于40个原子的取代基；
L是包含5至29个连续连接原子的直链的连接基；和
PS为过氧化酶底物部分；
其中X1和X2选自-OH，-ORX和-NRXRXX，X1和X2优选为不同，
其中Y1和Y2选自＝O或＝N+RYRYY，
其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、RX、RXX、RY、和RYY独立地选自氢和具有小于40个原子的取代基；和
其中R34是甲基，乙基，丙基，OCH2，CH2OCH2，(CH2OCH2)2，NHCH2，NH(CH2)2，CH2NHCH2，环烷基，烷基-环烷基，烷基-环烷基-烷基，杂环基，烷基-杂环基，或烷基-杂环基-烷基。
10.根据权利要求9所述的用途，其中Y1和Y2不同。
11.根据权利要求9或10所述的用途，其中R34为具有4至8个原子的含氮环。
12.根据权利要求1至5中任一项所述的生色缀合物在制备成套用品中的用途，所述成套用品用于进行生色原位杂交，其中所述生色原位杂交包括：
使核酸靶标与探针接触，所述探针与所述核酸靶标在杂交条件下杂交，其中所述探针包括(1)至少部分与所述核酸靶标互补的核酸序列，和(2)过氧化物酶和任选的特异性结合对的第一成员；其中所述靶标和探针形成络合物；
当所述探针包括(2)的特异性结合对的第一成员时，使所述络合物与所述特异性结合对的第二成员接触，其中所述特异性结合对的第二成员直接或间接连接于过氧化物酶、并且特异性结合于所述第一成员；
用至少一种根据权利要求1至5中任一项所述的生色缀合物培育所述络合物；所述培育进行足以在所述靶标形成有色沉淀物的时间和温度；
检测所述有色沉淀物。
13.根据权利要求1至5中任一项所述的生色缀合物在制备成套用品中的用途，所述成套用品用于检测两个或更多个靶标，其包括：
通过结合剂将过氧化物酶分子或含有酶活性的酶片段与第一靶标结合，在样品中的第一靶标处提供过氧化物酶活性；
使所述样品与第一生色缀合物接触；
在所述第一靶标处形成第一有色沉淀物；
从所述第一靶标除去所述过氧化物酶活性；
从所述样品除去未沉淀的第一生色缀合物；
通过结合剂将过氧化物酶分子或含有酶活性的酶片段与第二靶标结合，在样品中的第二靶标处提供过氧化物酶活性；
使所述样品与第二生色缀合物接触；
在所述第二靶标处形成第二有色沉淀物；和
检测所述第一有色沉淀物和所述第二有色沉淀物，从而检测所述样品中的所述第一靶标和第二靶标，
其中所述第一生色缀合物和第二生色缀合物中的至少之一是根据权利要求1至5中任一项所述的缀合物，并且其中所述第一生色缀合物和所述第二生色缀合物具有一个或多个彼此不同的光谱特征。
14.根据权利要求13所述的用途，其进一步包括：从所述第二靶标除去所述过氧化物酶活性；从所述样品除去未沉淀的第二生色缀合物；通过结合剂将过氧化物酶分子或含有酶活性的酶片段与第三靶标结合，在所述样品中的第三靶标处提供过氧化物酶活性；使所述样品与第三生色缀合物接触，所述第三生色缀合物具有一个或多个与所述第一生色缀合物和第二生色缀合物不同的光谱特征。
15.制备罗丹明或荧光素的仲酰胺的方法，所述方法包括：
使罗丹明或荧光素的2'-烷基羧基甲基衍生物与过量的仲胺在90℃至110℃的温度在无水溶剂中反应，形成仲酰胺。
16.根据权利要求15所述的方法，其进一步包括以下步骤：通过使罗丹明和2-卤代乙酰基酯反应制备2'-烷基羧基甲基衍生物。
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