CN101836117A - 用于检测生物靶点的快速和灵敏的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及通过自由基链式反应发生的生物标记方法。由于可检测的报道分子从包含含有至少两个过氧化物酶的底物部分的物质(本文中称为“交联剂”)的介质中沉积到包含过氧化物酶活性和生物标志的靶位点中，因此发生标记。本文中所述的标记反应可通常用于检测试验方案(其用于检测并使生物或化学靶可视化)的宿主中的靶，所述试验方案包括免疫组织化学法(IHC)，原位杂交法(ISH)例如ELISA、DNA印迹法、RNA印迹法和蛋白质印迹法的抗体基染色法，和其他方法。

Description

用于检测生物靶点的快速和灵敏的方法
技术领域
本发明涉及通过自由基链式反应发生的生物标记方法。本文中所述的标记反应可通常用于检测试验方案(其用于检测并使生物或化学靶可视化)的宿主中的靶，所述试验方案包括免疫组织化学法(IHC)、原位杂交法(ISH)、抗体基染色法(例如ELISA、DNA印迹法、RNA印迹法和蛋白质印迹法)和其他方法。
背景技术
使用可检测标记来检测样品中的生物靶或化学靶为处于多种生物诊断和检查方法的核心部分的过程。在一些情况下，所述靶可为原位或者在提取或分离后以DNA或RNA水平检测的特定聚核苷酸序列或基因、基因变体、基因表达谱。在其他情况下，所述靶可为原位或者在分离或实验室操作后再次检测的肽、蛋白、抗原或其他物质。所述靶还可以为有机来源物质的颗粒或碎片。
许多典型检测方法，例如IHC、ISH、ELISA或印迹法，使用标记方案来检测所需的靶。典型地，这些方案包括将潜在含有可检测的靶的试验样品和探针一起孵育，然后检测探针和具有可检测标记的靶之间的结合，例如可释放颜色、荧光信号或放射线。取决于使用方案的特异性，一个或多个探针分子可与各靶结合。在一些情况下，特别当存在的靶的浓度较低时，需要通过将一个或多个放大层加入系统中来放大来自靶-探针结合的信号。例如，如果探针为识别靶的第一抗体，可加入识别第一抗体探针的第二抗体，使得多个第二抗体与各第一抗体结合。如果第二抗体与可检测标记(例如荧光团或发色团)相连，那么通过放大，样品中的各靶分子可有效地与多个荧光团或发色团结合而不是仅与一个或几个荧光团或发色团结合。因此，靶在放大后将产生更强的检测信号。
然而，一些检测试验具有产生看起来相对扩散的信号的趋势，如果样品被允许在分析前静置一段时间尤其是如此。例如，与靶结合的一个或多个探针和/或可检测标记会随着时间缓慢地从所述靶扩散分开，或者彼此扩散分开。在一些情况下，影响靶、探针和放大层的结合亲和性的缓冲液的改变也可以引起信号扩散。许多可检测标记通过非共价相互作用(例如蛋白-配体结合或聚核苷酸杂交)而与靶结合。在标记后缓冲液的改变可降低靶、探针和可检测标记之间的亲和性，从而使各种组分解离。在一段时间(例如数日)内简单的扩散还可引起靶、探针和可检测标记之间的解离，从而引起信号扩散。
现有技术仅仅描述了非常少的允许克服上述问题的技术，但仍仅是部分的。这种技术的一个例子是US 5,863,748、5,688,966、5,767,287、5,731,158、5,583,001、5,196,306、6,372,937或6,593,100中所述的催化的报道子沉积(CARD)法。该方法使用所谓的“分析物依赖性酶活化系统”(ADEAS)来催化可检测标记沉积在分析平台的固相上。在分析方式中，ADEAS包含的酶与由对该酶具有特异性的可检测地标记的底物构成的偶联物发生反应。当酶和偶联物反应时，形成活化的偶联物，所述活化的偶联物共价沉积在固定活化的偶联物的特异性受体的位点处。因此，由于偶联物包含标记，其具有指示位点中靶的存在的报道子的作用。酶沉积的标记可被直接或间接检测。该方法导致信号放大和改善的检测限。
CARD法可用于分析方式中，其中待检测的靶为固定在固相载体(例如膜)上的受体。这种分析方式包括夹心免疫分析和膜基核酸杂交分析。如US6,593,100中所述，CARD法还适用于通过(例如)免疫组织化学法(IHC)来检测生物靶点。US6,593,100中所述的方法利用在增强剂存在的条件下、辣根过氧化物酶(HRP)和包含HRP底物的标记的偶联物之间的反应。HRP底物和增强剂都是酚的衍生物。在与HRP反应时，HRP底物被活化并且与样品(例如蛋白)的受体位点结合。
尽管具有一些有利的特征(例如增加的检测灵敏度)，但是该方法被限于报道分子，且所述报道分子为选自酪胺或对羟基肉桂酸、或它们的衍生物的标记的HRP底物。
本发明克服了上述CARD法的限制，并且提供一种用于快速和灵敏地检测生物和化学标志的新方法。该方法包括CARD法的有价值的特征和这样的新的特征，该新的特征使该方法适用于更宽范围的分析方式并且独立于报道分子的窄的选择，以及允许快速、精确和灵敏地检测多种生物或化学靶。
发明概述
本发明基于下列发现：多种分子可以从包含含有至少两个过氧化物酶的底物部分的物质(本文中称为“交联剂”)的溶液中沉积到具有过氧化物酶活性的位点，例如包含诸如HRP之类的过氧化物酶的部分的位点。沉积分子可以是可检测分子，例如本身可释放颜色、荧光信号或放射线的分子，或者包含可释放颜色、荧光信号或放射线的可检测标记的分子，因此，可以检测这种可检测分子的沉积位点，并且如果沉积位点包含生物或化学标志，也可以检测这种生物或化学标志的存在。因此，沉积分子将“报道”其沉积位点中生物标志的存在。因此，这种可检测的沉积分子在本文中被称为“报道子”。
报道分子在存在过氧化物酶活性的条件下从包含交联剂的介质中沉积的一种可能的原因为：在介质中发生由于过氧化物酶和交联剂之间的反应而引发的自由基链式反应。在该反应的过程中形成的交联剂分子的自由基可使相同介质中存在的报道分子准备启动(prime)；准备启动的报道分子可进一步互相反应并形成大的不溶性聚集体，所述聚集体沉积在具有过氧化物酶活性的位点(本文中称为“靶位点”)中或其周围。由于过氧化物酶活性严格地局限于靶位点，因此该链式反应的结果为：报道分子仅沉积在靶位点中，或仅沉积在与这些位点非常接近的区域。如果这种靶位点包含生物或化学标志(例如蛋白或核酸)，因此可以通过检测沉积的报道子来检测所述标志。
令人吃惊地发现包含至少两个过氧化物酶的底物部分的分子可在本发明的方法中起到交联剂的作用。因此，本文中使用的术语“交联剂”是指这样的分子，其包含可起到过氧化物酶(在本文中使用的术语“过氧化物酶”可与术语“过氧化物酶”或“过氧化物酶活性”互换)的底物作用的分子的至少两部分(或两种不同分子的至少两部分)，并且在被过氧化物酶活化时能够具有交联活性。本发明的交联剂能够使至少两种报道分子交联。
发现由交联剂和过氧化物酶的反应介导的报道子的沉积是非常快速和定向的，即报道子不是随机沉积而是特异性沉积到具有过氧化物酶活性(例如HRP部分)的靶位点。沉积的报道子与靶位点紧密连接，并且不随时间的消逝而从位点扩散。因此，与沉积的报道子有关的信号被精确定位并且随着时间的消逝而保持强烈。
因此，本发明的第一方面是一种用于靶定向沉积报道子的方法，所述方法包括在包含报道子和交联剂的介质中孵育靶位点，其中所述靶位点具有过氧化物酶活性，其中所述报道子为可检测分子，以及其中所述交联剂是包含至少两个过氧化物酶的底物部分的分子。
本发明的另一方面涉及用于定向报道子沉积的介质，其中所述介质为水缓冲化溶液(water buffered solution)，其pH为约4至约9，包含：
10-5-10-2M的交联剂，所述交联剂包含至少两个过氧化物酶的底物部分；
0.1-10mM的过氧化物化合物；
0-20％的有机改性剂；和
0-2M的盐。
本发明的另一方面涉及一种体外检测样品中的生物标志的方法，其中该方法包括本文中所述的定向沉积报道子的步骤。该方法可有利地用作生物标志的规程、自动检测过程。特别地，根据本发明的体外检测生物样品中的生物标志的方法，包括下列步骤：
a)将推测包含生物标志的样品和一种或多种探针进行孵育，其中所述一种或多种探针中的至少一种包含至少一个辣根过氧化物酶(HRP)部分，从而所述生物标志和包含至少一个HRP部分的至少一种探针形成络合物，即形成靶位点；
b)在包含报道子和交联剂的介质中孵育样品，所述样品包含步骤(a)的所述生物标志和包含至少一个HRP部分的至少一种探针形成的络合物，即含有靶位点的样品，从而使所述报道子沉积在靶位点中，即存在(a)的络合物的位点；
c)检测(b)所述沉积的报道子，从而检测所述生物标志。
本发明的另外方面涉及可有利地用于定向沉积报道子的交联剂分子，其中所述分子具有下式：
(R1)n-(X)q-R2(m)，
其中
R1和R2为过氧化物酶的底物的部分，
X为具有下式的连接基团：
Figure GPA00001109399300051
其中R3和R4为氨基酸赖氨酸的残基，和
m、n和q为1至10的整数。
附图说明
图1示出本发明的交联剂分子的例子。
图2示出本发明的报道分子的例子。
图3示出用于检测两种不同的标志的本发明的生物标志的检测方法的示意性显示。
具体实施方式
1.报道子的定向沉积方法
本发明的一个方面涉及一种在靶位点沉积报道子的方法，所述方法包括在包含报道子和交联剂的介质中孵育靶位点，其中所述靶位点具有过氧化物酶活性，其中所述报道子为可检测分子，以及其中所述交联剂是包含至少两个过氧化物酶的底物部分的分子。
交联剂
本文中使用的术语“交联剂”是指能够将至少两个分子(例如至少两个报道分子)连接在一起的分子。本发明的交联剂包含至少两个过氧化物酶的底物部分，其中所述两个部分可通过化学键彼此结合，或可通过连接分子或基团而连接。
因此，本发明涉及这样的交联剂，该交联剂为具有下式的化合物：
(R1)n-(X)q-R2(m)，
其中，
R1和R2为过氧化物酶的底物部分，
X为连接基团或化学键，以及
m、n和q为1至10的整数。
在一个实施方式中，本发明的交联剂可以为具有下式的化合物：
(R1)n-(X)q-R2(m)，
其中，
R1和R2为过氧化物酶的底物部分，
X为化学键，以及
m、n和q为1至10的整数。
这种交联剂的一种非限制性例子，例如其中X为共价键，m、n和q均为1)可以为3，3’-二氨基联苯胺(DAB)。DAB包含两个辣根过氧化物酶(HRP)的底物邻苯二胺(OPD)部分(即R1和R2为OPD部分)，它们通过一个共价键而彼此相连。
在另一个实施方式中，本发明涉及具有下式的交联剂：
(R1)n-(X)q-R2(m)，
其中R1和R2为过氧化物酶的底物部分，
X为连接分子或连接基团，以及
m、n和q为1至10的整数。
在这种交联剂中，X基团可以是任何连接分子或连接基团。在一个优选的实施方式中，X可以是具有下式的连接基团：
其中R3和R4为氨基酸赖氨酸的残基。这种连接基团在本文中称为L30。
在一些实施方式中，所述交联剂可包含多个过氧化物酶的底物部分(n和/或m大于2)和连接分子X的多个部分(即q＞1)。在其他实施方式中，交联剂可包含较少的过氧化物酶的底物部分(n和m均为1)和多个连接分子X部分(即q＞1)。在一些实施方式中，交联剂可以为这样的化合物，其中多个过氧化物酶的底物部分通过化学键直接彼此结合。在一个实施方式中，R1和R2部分可以是相同的过氧化物酶的底物部分。在另一个实施方式中，R1和R2可以是两种或多种不同的过氧化物酶的底物部分。
交联剂的例子(其中连接基团(X)由L30连接子的二聚体表示，并且R1和R2为多个HRP的底物部分)可以为化合物D17140，其示于图1中并在实施例1.8中有所描述。本发明的交联剂的另一个例子可以为化合物D17120，其在实施例1.5中有所描述。D17140分子包含6个HRP的底物阿魏酸部分，它们通过赖氨酸残基与由多个L30部分形成的聚合物连接。D17120分子也含有6个阿魏酸部分，它们与另外的L30聚合物连接。
通过改变过氧化物酶的底物部分的数量(连接基团重复)和/或将带电部分(例如D17140分子中的赖氨酸残基)引入交联剂分子中，可以使交联剂具有所需的特征，例如交联剂在包含报道子的介质中具有良好的溶解性。
因此，在一个优选的实施方式中，交联剂可以是这样的分子，其包含至少两个过氧化物酶的底物部分，其中它们通过共价键彼此结合，在另一个优选的实施方式中，交联剂可以是这样的分子，其包含多于两个过氧化物酶的底物部分，其中所述部分通过一个或多个连接基团而连接在一起。
特别地，在一个优选的实施方式中，过氧化物酶的底物部分为邻苯二胺部分，在另一个优选的实施方式中，所述部分为阿魏酸部分。在后面的实施方式中，优选的是阿魏酸部分通过一个或多个L30连接子分子而连接在一起。
报道子
本文中使用的术语“报道子”是指任何可检测分子，其中所述可检测分子为选自下列分子中的分子：该分子可释放颜色、荧光信号或放射线，或者其为特异性结合对的成分，或者其为包含可检测的部分(例如显色标记、荧光标记、化学发光标记、放射性标记、酶部分、酶的底物、可检测的颗粒等)的偶联物、或者其为这样的分子，该分子可在存在过氧化物酶活性的条件下从包含交联剂(交联剂的实施方式如上所示)的介质中沉积，并随着沉积而标记。
在一个实施方式中，根据本发明具有交联能力的物质可用作交联剂或报道子；然而，一个相同的分子不能在相同的实施方式中同时用作交联剂和报道子。
具有下式的交联剂在本发明的任何实施方式中都不可以用作报道子：
(R1)n-(X)q-R2(m)，
其中R1和R2为邻苯二胺部分，
X为共价键，以及
m、n和q为1。
在一个实施方式中可用作交联剂、在另一个实施方式中可用作报道子的分子的非限制性例子为上述分子D17120和D17140(还参见实施例1.1至1.8)。
根据本发明的报道分子为在缺乏过氧化物酶活性的条件下在包含交联剂的介质中可溶的分子。介质中报道子的浓度可从约10-9M变化至约10-4M，例如从约10-9M变化至约10-8M，例如从约10-8M变化至约10-7M，从约10-7M变化至约10-6M，或从约10-6M变化至约10-5M，或从约10-6M变化至约10-4M。
在一个实施方式中，报道子可为可检测的小分子，例如选自荧光或显色物质、半抗原、或酶的底物，或者在另一个实施方式中，报道子可为大分子，例如包含骨架聚合物和至少一种可检测物质的偶联物，其中所述可检测物质(即可检测标记)通过化学键或通过连接分子与骨架聚合物相连。因此，报道子可以为包含两种或多种分子的偶联物，其中至少一种是可检测的，或者报道子可以为小分子，例如分子量不大于500-2000Da(例如约1000Da)的分子。报道子-偶联物可以为大分子，通常为连接可检测标记的聚合物分子。这些报道分子的大小可差异很大，并且从3x103Da变化至3x106Da或更大。
根据本发明的报道子还可以是不“可检测的”的分子。这种分子不能产生可被检测(例如通过颜色、荧光或放射性检测)的信号。当沉积时通过应用第二种允许检测的手段，例如可与沉积的报道子特异性结合的可检测的非报道分子，这种报道分子可被检测，所述检测包括下列几个步骤：将一种或多种可检测物质用于与该沉积的“不可检测的”报道分子结合，因此使其可视化检测。
所述报道子为可检测分子。其可以是小的可检测分子，或者其可以是大的可检测分子。小的可检测分子通常为可直接检测的分子(小的可检测分子的一些实施方式在本部分和后续部分中有所描述)。大的可检测分子通常由大的、通常不可直接检测的分子来表示，在将这种分子与小的可直接检测的分子或另外的可检测标记偶联时，其变成可检测的。包含标记的大的报道分子本文中称为“可检测的偶联物”。根据本发明的可检测的偶联物可包含两种或多种不同的分子，其中的至少一种为可检测标记。
大的报道分子包含的小的可检测分子和标记可选自荧光物质、发光物质、生物发光物质、放射性物质或显色物质。
可使用多种荧光标记、发光标记、生物发光标记、放射性标记或显色标记。其中多种是市售的，例如荧光着色剂Alexa Fluors(Molecular Probes)和DyLight Fluors(Thermo Fisher Scientific)。标记和小的报道分子的其他非限制性例子可以为由下列基团构成的分子：5-(和6)-羧基荧光素、5-或6-羧基荧光素、6-(荧光素)-5-(和6)-甲酰氨基己酸、异硫氰酸荧光素、若丹明、四甲基若丹明、Cy2、Cy3、Cy5、AMCA、PerCP、R-藻红蛋白(RPE)、别藻红蛋白(APC)、德克萨斯红、普林斯顿红(Princeton Red)、包覆CdSe纳米晶的绿色荧光蛋白(GFP)、DNP、异羟洋地黄毒苷配基(digoxiginin)、钌衍生物、鲁米诺、异鲁米诺、吖啶酯、1，2-二氧杂环丁烷和吡啶并哒嗪、氢的放射性同位素、碳、硫、碘化物、钴、硒、氚或磷。
在另一个实施方式中，小的可检测分子或标记可以是这样的物质，该物质为酶的底物。酶的底物可选自下列物质：排除DAB、碱性磷酸酶(AP)、β-半乳糖苷酶(GAL)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、β-N-乙酰葡萄糖氨基转移酶、β-葡糖苷酸酶、转化酶、黄嘌呤氧化酶、萤火虫荧光素酶、葡萄糖氧化酶(GO)的辣根过氧化物酶(HRP)的底物。在一个优选的实施方式中，酶的底物标记可为HRP的底物，在另一个优选的实施方式中，酶标记可为AP的底物。
HRP的有用底物的例子包括3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)、盐酸联苯胺(BDHC)、Hanker-Yates试剂(HYR)、碘酚兰(IB)、四甲基联苯胺(TMB)、4-氯-1-萘酚(CN)、α-萘酚派若宁(α-NP)、邻联茴香胺(OD)、5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯(BCIP)、氮蓝四唑(NBT)、2-(p-碘苯基)-3-p-硝基苯基-5-苯基氯化四氮唑(INT)、四硝基四氮唑蓝(TNBT)、5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷/铁氰化铁(BCIG/FF)、5-氨基-2-[3-[5-氨基-1，3-二氢-3，3-二甲基-1-(4-磺基丁基)-2H-吲哚-2-亚基]-1-丙烯基]-3，3-二甲基-1-(4-磺基丁基)-3H-吲哚鎓。在一个优选的实施方式中，小分子可以是5-氨基-2-[3-[5-氨基-1，3-二氢-3，3-二甲基-1-(4磺基丁基)-2H-吲哚-2-亚基]-1-丙烯基]-3，3-二甲基-1-(4磺基丁基)-3H-吲哚鎓。
AP的有用底物的例子包括萘酚-AS-B1-磷酸酯/快红TR(NABP/FR)、萘酚-AS-MX-磷酸酯/快红TR(NAMP/FR)、萘酚-AS-B1-磷酸酯/快红TR(NABP/FR)、萘酚-AS-MX-磷酸酯/快红TR(NAMP/FR)、萘酚-AS-B1-磷酸酯/新品红(NABP/NF)、溴氯吲哚基萘酚/氮蓝四唑(BCIP/NBT)、5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-d-吡喃半乳糖苷(BCIG)。
标记或小的报道分子可以为酶。酶标记的非限制性例子可以为碱性磷酸酶(AP)、β-半乳糖苷酶(GAL)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、β-N-乙酰葡萄糖氨基转移酶、β-葡糖苷酸酶、转化酶、黄嘌呤氧化酶、萤火虫荧光素酶、葡萄糖氧化酶(GO)。在一个优选的实施方式中，酶标记为AP。
然而，偶联物报道分子的可检测标记或小的报道分子可以是特异性结合对的成分。适用于实施本发明的特异性结合对的成分可以是免疫或非免疫型。免疫型特异性结合对的例子为抗原/抗体体系或半抗原/抗半抗原体系。
半抗原为这样的小分子，如果报道子包含可检测标记和聚合物，该分子允许多个拷贝连接至单一聚合物分子。半抗原为这样的分析方式提供便利的靶分子，在所述分析方式中必须或有利地放大信号。因此，半抗原的结合的多个拷贝提供增强的灵敏度，例如增强的信号强度。合适的半抗原的例子包括FITC、DNP、myc、地高辛、硝基酷氨酸、生物素、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白(strepavidin)和抗-染料抗体，例如四甲基若丹明、德克萨斯红、丹磺酰、Alexa Fluor 488、BODIPY FL、萤黄和Alexa Fluor405/Cascade Blue荧光团。
结合对的抗体成分(无论其多克隆、单克隆还是免疫反应性片段)可通过本领域普通技术人员熟悉的普通方法来制备。术语免疫反应性抗体片段或免疫反应性片段是指含有抗体的结合域的片段。这种片段可以是Fab型片段(其定义为缺乏Fc部分的片段)，例如Fab、Fab’和F(ab’)2片段，或者可为所谓的“半分子”片段，该片段通过还原性切除连接完整抗体的重链组分的二硫键来获得的。如果特异性结合对的抗原成分是非免疫原性的(例如半抗原)，其可与载体蛋白共价连接以赋予其免疫原性。
非免疫型特异性结合对包括这样的体系，其中两种组分彼此具有天然亲和性，但不是抗体。非免疫型特异性结合对的例子为生物素-抗生物素蛋白、或生物素-链霉抗生物素蛋白、叶酸-叶酸结合蛋白、互补核酸、受体-配体等。本发明还包括彼此形成共价键的非免疫型结合对。示例性共价结合对包括：硫基反应基(例如马来酰亚胺和卤代乙酰类衍生物)、胺类反应基(例如异硫氰酸酯、琥珀酰亚胺酯、磺酰卤)、和偶合染料(例如3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙(MBTH)和3-(二甲基-氨基)苯甲酸(DMAB))等。
在一些实施方式中，可优选的是与聚合物分子连接的标记是不同的。在一些实施方式中，可优选使用包含两种或多种不同标记的报道子。可制备不同标记(所述标记选自上述鉴定的基团中的任意一种)的任意组合，例如报道子可包含荧光标记和酶标记的组合、特异性结合对的成分、酶和/或酶的底物的组合等。
在一个实施方式中，如果报道子由聚合物和一种或多种可检测分子的偶联物来表示，所述偶联物可包含至少一种聚合物和至少一种标记，其中至少一种标记通过化学键或通过连接基团(例如L30)与至少一种聚合物连接。这种报道子的非限制性例子在实施例中有所描述，例如参见实施例1.9。如果所述偶联物包含多于一种的聚合物，所述聚合物中的每一种可与一种或多种可检测标记连接。
标记可相同或不同。不同的标记可选自上述基团中的任一种，并且以任何所需组合的方式来使用。
包含聚合物的报道分子
大的报道分子可包含聚合物。大的报道分子包含的聚合物可为任何聚合物分子。其在水中本身可以是可溶性的或不溶性的，但当起到报道子偶联物部分的作用时，其在下文所述的本发明的水介质或至少介质中是可溶的，或可制成可溶的。聚合物优选选自这样的分子，该分子可在存在过氧化物酶活性的条件下从包含交联剂的介质中沉积。
合适聚合物的例子包括：多糖，例如葡聚糖、羧甲基葡聚糖、葡聚糖聚醛、羧甲基葡聚糖内酯、和环糊精；支链淀粉、裂裥菌素、硬葡聚糖、黄原胶、胞外多糖、O-乙基氨基瓜尔糖；甲壳素和壳聚糖，例如6-O-羧甲基甲壳素和N-羧甲基壳聚糖；纤维素衍生物，例如羧甲基纤维素、羧甲基羟乙基纤维素、羟乙基纤维素、6-氨基-6-脱氧纤维素和O-乙基氨基纤维素；羟基化淀粉、羟丙基淀粉、羟乙基淀粉、角叉菜胶、海藻酸盐、和琼脂糖；合成多糖，例如菲可和羧甲基化菲可；乙烯基聚合物，包括聚(丙烯酸)、聚(丙烯酰胺)、聚(丙烯酸酯)、聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(马来酸)、聚(马来酸酐)、聚(丙烯酰胺)、聚(乙基-co-乙酸乙烯酯)、聚(甲基丙烯酸)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯醇-co-氯代乙酸乙烯酯)、胺化聚(乙烯醇)、以及它们的共嵌段聚合物；含有聚乙二醇(PEG)、或聚丙二醇、或聚(环氧乙烷-co-环氧丙烷)的聚合物骨架，包括线性、梳型或超支化聚合物和树状大分子(包括支化PAMAM-树型化合物)；聚氨基酸，包括聚赖氨酸、聚谷氨酸、聚氨酯、聚(环乙亚胺)、pluriol；蛋白，包括白蛋白、免疫球蛋白和病毒样蛋白(VLP)；以及聚核苷酸、DNA、PNA、LNA、寡核苷酸和寡核苷酸树状大分子构建体。还涵盖使用混合的聚合物，即包含上述例子中的一种或多种的聚合物，包括聚合物、共嵌段聚合物和无规共聚物中的任一种。
聚合物的选择可取决于使用本发明的方法的特定应用。可取决于所述方法的特定应用来选择聚合物的物理性能，从而优化性能。这些物理性能的例子包括聚合物的长度和支化度。另外，聚合物可具有各种取代基。所述取代基可被化学保护和/或活化，从而允许聚合物进一步衍生化。例如在一个实施方式中，聚合物可以是核酸，在另一个实施方式中，其可以是核酸类似物，在另一个实施方式中，其可以是多肽，在另一个实施方式中，其可以是多糖，在其他实施方式中，其可以是它们的任何变体。
术语“核酸”是指包含链式核苷酸单体的聚合物。最普通的核酸为脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。核苷酸是由杂环碱基(核碱基)、糖和一种或多种磷酸酯基团构成的化合物。在最普通的核苷酸中，碱基为嘌呤或嘧啶的衍生物，糖为戊糖(五碳糖)脱氧核糖或核糖。如所述，核苷酸为核酸的单体。核碱基为可参与使RNA和DNA分子配对的核苷酸的部分。核碱基包括胞嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶(DNA)、尿嘧啶(RNA)。
术语“核酸类似物”是指这样的聚合物，该聚合物为由核苷酸单体构成的均聚物，其中核碱基可为天然的、修饰的和/或合成的，或者该聚合物为由天然、修饰和合成的核碱基单体、氨基酸和其他类型的单体构成的杂聚物。聚合物中的“均”和“杂”是指聚合物由不同化学来源的单体构成，例如仅由核碱基单体构成的聚合物为均聚物，由核碱基和氨基酸单体构成的聚合物为杂聚物。均聚物的例子可为DNA或RNA分子，杂聚物的例子可为PNA分子。肽核酸(PNA)化学上类似于DNA或RNA。PNA为人工合成的化合物。DNA和RNA分别具有脱氧核糖和核糖的糖骨架，而PNA的骨架由通过肽键连接的重复N-(2-氨基乙基)-甘氨酸单元构成。各种嘌呤和嘧啶碱基通过亚甲羰基键与骨架连接。PNA被描述为肽那样，其中N-末端在第一(左边)位置，C-末端在右边。由于PNA的骨架不含带电的磷酸酯基团，PNA/DNA链之间的结合因为缺少静电排斥而强于DNA/DNA链之间的结合。就碱基对识别而言，混合的碱基PNA分子为DNA分子的真正模拟物。PNA/PNA结合强于PNA/DNA结合。
本文中使用的术语“蛋白”可与术语“多肽”互换，并且其是指由天然或人工氨基酸构成的至少一种聚合物。
报道分子包含的聚合物还可选自：多糖、支链淀粉、裂裥菌素、硬葡聚糖、黄原胶、胞外多糖、O-乙基氨基瓜尔糖、甲壳素、壳聚糖、纤维素衍生物、羟基化淀粉、角叉菜胶、海藻酸盐、琼脂糖、合成多糖、乙烯基聚合物、聚乙二醇(PEG)、或聚丙二醇、或聚(环氧乙烷-co-环氧丙烷)的聚合物骨架(包括线性、梳型或支化聚合物和树状大分子)、聚氨基酸、聚(环乙亚胺)、或pluriol。
在一些实施方式中，所述聚合物可以是包含上述两种或多种不同聚合物的混合聚合物。
在一些优选的实施方式中，聚合物可包含葡聚糖。在另一个优选的实施方式中，聚合物可包含至少一种核酸。在另一个优选的实施方式中，聚合物可包含至少一种核酸类似物。在另一个优选的实施方式中，聚合物可由L30分子构成或包含L30分子。在其他优选的实施方式中，聚合物可包含至少一种多肽。
如上所述，聚合物可偶联有可检测标记。在一些实施方式中，可检测标记可与聚合物直接偶联(即与聚合物共价连接)，在其他实施方式中，可检测标记可通过连接子与聚合物间接偶联。许多这样的连接子是本领域已知的。非限制性例子包括聚乙二醇和聚酰胺。在一个实施方式中，连接分子可包含5-15个原子，在另一个实施方式中，其可包含15-30个原子，在另一个实施方式中，其可包含超过35个原子(例如36-45个原子)，在一些实施方式中，连接子可包含大于45个原子。这种连接分子的一个优选实施方式为上述L30。
如上所述，在一些实施方式中，L30可起到报道子偶联物分子的骨架聚合物的作用。一些这样的实施方式将在下面提供的实施例(实施例1.1-1.8)和图3中有所描述。在其他实施方式中，L30可起到将可检测标记连接至聚合物的连接基团的作用。
在一些实施方式中，1-500个可检测标记分子可与聚合物分子直接或间接连接。在一些实施方式中，可检测标记为酶，并且与各聚合物分子连接的酶分子的数量为1-200、2-50、2-25。在一些实施方式中，可检测标记为金粒、染料、低分子量荧光染料，并且与各聚合物分子连接的可检测物质的数量为1-500、1-200、1-100、10-100、20-50、50-100、1-50、2-30、10-20。在一些实施方式中，可检测标记为蛋白荧光染料，并且与聚合物分子连接的可检测分子的数量为1-50、2-20。在一些其他的实施方式中，可检测标记为核酸或核酸类似物，例如寡核苷酸或PNA分子，并且与聚合物连接的可检测分子的数量为1-200、2-50、2-25。
许多形成聚合型偶联物的方法是本领域已知的，并且可用于制备本发明的聚合型偶联物。在一些实施方式中，如果需要，可检测物质可与聚合物骨架化学连接或偶联。在一些实施方式中，聚合型偶联物通过将氨基共价偶联至偶联双键而形成。骤合物可被乙烯基砜活化并和可检测物质混合，从而形成聚合型偶联物。在其他实施方式中，醛类被用于活化聚合物骨架(例如葡聚糖)，其然后与可检测物质混合。然而，另一种制备聚合型偶联物的方法是使用所谓的化学选择性偶联方案以将组分偶联在一起，例如在与巯醇修饰的聚合物载体或骨架共价偶联之前，酶或其他分子可与巯醇的反应性马来酰亚胺基团进行衍生化。下面所述其他实施方式允许试剂本身形成偶联物，例如可检测物质。
如上所述，聚合物本身可起到报道分子的作用而不包含任何可检测标记。这种聚合物的非限制性例子可为核酸、核酸类似物和蛋白。
小的报道分子
如上面已经讨论的，报道子可以是小分子。“小分子”是指不超过3000Da、通常为约200至约1000Da(例如约500Da)的非聚合物分子。通常，这种小的报道分子在本发明的包含交联剂的介质中是可溶的。本发明涉及任一种这样的小分子，该小分子可在存在过氧化物酶的条件下从介质中沉积。
所述小分子可以是可直接检测的物质。这些物质的例子包括(但不限于)：5-(和6)-羧基荧光素、5-或6-羧基荧光素、6-(荧光素)-δ-(和6)-甲酰氨基己酸、异硫氰酸荧光素、若丹明、四甲基若丹明、Cy2、Cy3、Cy5、AMCA、PerCP、R-藻红蛋白(RPE)、别藻红蛋白(APC)、德克萨斯红、普林斯顿红、包覆CdSe纳米晶的绿色荧光蛋白(GFP)、DNP、异羟洋地黄毒苷配基、鲁米诺、异鲁米诺、吖啶酯、1，2-二氧杂环丁烷和吡啶并哒嗪、以及氢的放射性同位素、碳、硫、碘化物、钴、硒、氚、和磷。显色物质可选自：3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)、10-乙酰基-3，7-二羟基吩嗪(ADHP)、3-氨基-9-乙基咔唑、4-氯-1-萘酚(AEC)、邻苯二胺(OPD)、2，2’-连氮基-双(3)-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸、5-氨基-2-[3-[5-氨基-1，3-二氢-3，3-二甲基-1-(4磺基丁基)-2H-吲哚-2-亚基]-1-丙烯基]-3，3-二甲基-1-(4磺基丁基)-3H-吲哚鎓。在一个实施方式中，可检测的小分子可为过氧化物酶、优选辣根过氧化物酶(HRP)的底物。在一个优选的实施方式中，可检测的小分子为5-氨基-2-[3-[5-氨基-1，3-二氢-3，3-二甲基-1-(4磺基丁基)-2H-吲哚-2-亚基]-1-丙烯基]-3，3-二甲基-1-(4磺基丁基)-3H-引哚鎓。
在一些实施方式中，小分子可以为不能直接检测的分子，例如不能着色、荧光或化学发光的物质，例如生物素或过氧化物酶的底物(例如阿魏酸或酪氨酸)。在这种实施方式中，可检测物质可与这种小分子偶联。例如，小分子和可检测物质可与(例如)乙烯基进行衍生化。通过引入自由基而产生聚合，这导致乙烯基的聚合，从而形成聚合型偶联物。因此，所述偶联物含有聚乙烯基骨架或聚乙烯基嵌段。活性丙烯酸酯可用于活化所述分子。自由基的产生可使衍生化的分子聚合。具有一个或多个乙烯基的小分子连接子可进一步引入以帮助形成小分子和可检测物质的聚合型偶联物。在一些其他实施方式中，小分子和可检测物质可用交联剂来进行衍生化。这种方法的例子包括使用：同双功能交联剂，例如戊二醛、己二异氰酸酯、己二酰亚氨酸二甲酯、1，5-二氟-2，4-二硝基苯；杂双功能交联剂，例如N-γ-马来酰亚氨基丁酰氧基琥珀酰亚胺酯；以及零长度交联剂，例如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺。通过选择正确的反应条件，交联剂可在(例如)可检测物质和可检测的试剂中的各种官能团之间形成桥，从而形成聚合型报道分子。
过氧化物酶
任何能够具有过氧化物酶活性的酶都适用于实施本发明。
根据本发明，过氧化物酶活性存在于靶位点中。术语“靶位点”是指沉积报道分子的位点，例如包含生物或化学标志的位点。根据本发明，过氧化物酶活性与靶位点中存在的至少一部分过氧化物酶有关。术语“一部分”是指过氧化物酶可为天然或重组蛋白、或它们的衍生物，例如能够具有过氧化物酶活性的片段。特别地，过氧化物酶可选自：辣根过氧化物酶(HRP)或大豆过氧化物酶(SP)、它们的片段、重组或融合蛋白。在一个优选的实施方式中，过氧化物酶为HRP。
在一个实施方式中，靶位点可以是具有过氧化物酶括性的任何固相载体的位点。合适的载体包括：合成聚合物载体，例如聚苯乙烯、聚丙烯、取代聚苯乙烯(例如胺化或羧化聚苯乙烯)、聚丙烯酰胺、聚酰胺、聚氯乙烯等；玻璃珠；琼脂糖；硝基纤维素；尼龙；聚偏二氟乙烯；表面改性的尼龙等。过氧化物酶可直接或间接固定在这些载体上。
靶位点可以是生物样品位点，例如在生物样品包含细胞的情况下为细胞膜、细胞器官位点，其还可以是无细胞的生物样品位点，例如固定在(例如)上述固相载体上的血浆样品、或细胞溶菌物或提取物。这种位点通常包含可为靶分子或结构的生物标志。过氧化物酶活性通常间接与靶分子有关，例如为与靶分子结合的特异性探针的一部分。
介质
本发明的介质是这样的介质，其中可溶性报道分子在存在过氧化物酶活性的条件下可从该介质中沉积。其为水缓冲化溶液，pH为约4至约9，基本上包含：
(i)能够在存在过氧化物酶活性的条件下使至少两种报道分子交联的化合物，其中所述化合物为包含至少两个过氧化物酶的底物部分的分子，并且其中所述两种报道分子中的至少一种为可检测分子，以及
(ii)过氧化物化合物。
介质中包含的合适的可溶性报道分子在上面已详细描述。
根据本发明，能够在存在过氧化物酶活性的条件下使至少两种报道分子交联的合适化合物也已在上详细讨论。在一个优选的实施方式中，交联化合物为DAB。
介质中交联化合物的量可从约10-5M变化至约10-2M，例如从约10-5M变化至约10-3M或从约10-4M变化至约10-2M，或从约10-5M变化至约10-4M，或从约10-4M变化至约10-3M，对于不同的实施方式(在浓缩不同报道子的沉积物时)可优化交联剂的浓度。
根据本发明的介质包含过氧化物化合物。过氧化物化合物可选自有机过氧化物，例如叔丁基过氧化物、二叔丁基过氧化物、过乙酸，或其可以是过氧化氢的加合物，例如过氧化氢脲加合物。在一些实施方式中，过氧化氢(H2O2)可以是优选的过氧化物。在不同的实施方式中，介质中过氧化物化合物的量从约10-4M变化至约10-2M。
介质还可包含有机改性剂和有机改性剂、以及有机或无机盐。
无机盐可选自(例如)氯化钠、氯化镁、氯化钾、氯化钙、磷酸钠、或硫酸铵。
在其他实施方式中，介质可包含有机盐，例如乙酸钠、乙酸铵、或咪唑盐(例如咪唑盐酸盐)。
介质中盐的浓度可从约10-3M变化至饱和，例如从约20mM变化至约200mM，或从约500mM变化至约500mM。在一个优选的实施方式中，介质可包含的盐的量从约10mM至500mM。在另一个优选的实施方式中，介质可不含盐。
通常介质的pH值可从约4变化至约9。可以使用任何具有合适的缓冲能力的缓冲剂，例如磷酸缓冲盐(PBS)、咪唑缓冲剂。其他合适的缓冲剂可在Good，NE.，et al(1966)Hydrogen ion buffers for biological research.Biochem.5(2)，467-477中找到。介质的pH值对于报道子的沉积是必须的；其可取决于报道子的性质而进行优化。
在不同的实施方式中，介质还可包含：
(i)有机改性剂；和/或
(ii)酶增效剂；和/或
(iii)铁螯合剂；和/或
(iv)去污剂；和/或
(v)抗微生物剂。
术语“有机改性剂”是指任何增强报道子的溶解性的非水溶剂。在这样的实施方式中，介质中存在的改性剂的量为约1％(v/v或w/v)是足够的，然而在一些实施方式中，可需要更高浓度的有机改性剂。例如，有机改性剂可以是聚乙二醇(PEG)。其他例子包括(但不限于)选自基本上由下列物质构成的有机改性剂：低级醇、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、二甲基亚砜(DMSO)、单和二乙二醇、环丁砜、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)。在一些实施方式中，可有利的是使用聚乙二醇(PEG)，例如PEG2000。在这些情况下介质中的聚乙二醇的浓度可从约0.1％(v/v)变化至约20％(v/v)，例如从约1％(v/v)变化至约15％，例如5-10％(v/v)。
术语“酶增效剂”是指任何增强过氧化物酶的催化活性的化合物。这种酶增效剂选自基本上由下列物质构成的组：苯硼酸衍生物和二价金属(例如镍或钙)离子。酶增效剂的浓度可从约10-7变化至约10-3M。
铁螯合剂可以是乙二胺四乙酸(EDTA)或乙二胺羟基苯乙酸(EDHPA)型螯合剂。铁螯合剂的浓度可从约10-6变化至约10-2M。
去污剂可选自：聚乙二醇异辛基苯基醚(NP-40)；选自基于下列物质的表面活性剂中的表面活性剂：聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯(Tween)；或基于嵌段共聚物的表面活性剂(pluronic等)。去污剂的浓度可从约0.001％变化至约5％。
根据本发明，介质组合物为稳定的溶液。在本发明的上下文中，术语“稳定”是指在大部分时间内，介质作为用于过氧化物酶介导的报道子沉积的反应介质的能力基本上保持不变；例如介质在室温下保持其反应能力至少4小时不受到影响。
介质还可保存较长时间。为了延长介质的保存期，可推荐将介质储存在20℃以下的温度(例如在4℃-10℃)，和/或将抗微生物化合物加入介质。抗微生物化合物可以是通常用于这种目的的任何抗微生物化合物，例如叠氮化钠、ProclinTM或Bronidox。
上述介质为在具有过氧化物酶活性的靶位点(例如包含生物标志的位点)沉积报道子的反应介质。
2.检测生物样品中的靶的方法
因为靶位点可以是生物样品位点，例如在生物样品包含细胞的情况下为细胞膜、细胞器官位点，或其还可以是位于固相载体上的无细胞的生物样品位点，例如固定在(例如)上述固相载体上的血浆样品、或细胞溶菌物或提取物，所以上述在靶位点沉积报道子的方法可有利地用于检测与该靶位点有关的生物标志，例如生物分子(例如核酸、蛋白等)。在本发明的上下文中，术语“生物标志”是指对于生物种类、细胞型、细胞室、生理条件等具有特异性的分子、分子复合物或结构。这种生物标志的非限制性例子包括(但不限于)特定基因序列、蛋白、或与特定疾病有关的另外的生物分子、染色体或膜结构、病毒等。生物标志在医学诊断中通常用作特定疾病和治疗剂的标志。
因此，本发明的另外方面涉及一种体外检测生物标志的方法，包括下列步骤：
a)将推测包含生物标志的生物样品和一种或多种探针进行孵育，其中所述一种或多种探针中的至少一种包含辣根过氧化物酶(HRP)的至少一部分，从而形成所述生物标志和包含HRP的至少一部分的至少一种探针的络合物，从而形成靶位点；
b)在包含报道子和交联剂的介质中孵育(a)的含有所述靶位点的样品，从而在靶位点(即存在所述生物标志和包含HRP的至少一部分的至少一种探针的络合物的位点)沉积所述报道子；
c)检测(b)的所述沉积的报道子，从而检测所述生物标志。
步骤(a)
包含生物标志的生物样品可以是包含完整或损坏的细胞的任何生物样品，例如机体组织样品或细胞溶菌物。
本发明的生物样品的非限制性例子包括：
-包含悬浮细胞的液体介质的样品，例如血液样品、克隆细胞悬浮液、或机体组织的解离细胞的悬浮液；
-机体组织的样品，例如活组织检查样品，组织的样品可以是新鲜组织的样品，或其可以是储存组织的样品，例如福尔马林固定和石蜡嵌入组织的样品。
-肿瘤样品；
-衍生自任何活体(例如动物、植物、细菌等)的样品。其可包含真核细胞或原核细胞、或两者。其可以是细胞涂片。
-包含颗粒或其碎片、或病毒产物(例如病毒核酸、蛋白、肽等)的样品。
根据本发明的方法，将推测包含生物标志的生物样品和至少一种探针进行孵育，其中所述至少一种探针包含至少一种HRP部分或其他过氧化物酶部分。
术语“孵育”是指样品在包含探针的介质(或包含交联剂和报道子的介质(步骤(b))中保持一定时间。该时间可从1-3分钟变化至1-2小时或更长，例如整夜。孵育可在不同温度下进行，这取决于不同的实施方式，例如待检测的生物标志分子的类型，或用于检测的探针和/或报道子的类型。
和样品孵育的一种探针或多种探针特异性识别样品中存在的生物标志并与其结合。
识别生物标志的探针能够与该标志特异性结合，并且仅与该标志特异性结合。通常，这种探针为特异性结合对的成分。
多种不同的特异性结合对是本领域已知的。在一个实施方式中，特异性结合对的成分可为两种抗体分子。在另一个实施方式中，特异性结合对的成分可为两种互补核酸。在另一个实施方式中，特异性结合对的成分可为两种核酸类似物分子。在另一个实施方式中，特异性结合对的成分可为特定受体-配体结合对的成分。
在本文中这样的探针被指定为第一探针，该探针能够与生物标志特异性结合，并且为特异性结合对的成分，例如第一抗体探针。可任选地，第一探针可标记过氧化物酶部分。
在一个实施方式中，第一探针可包含至少一种HRP或其他过氧化物酶(例如大豆过氧化物酶(SP))部分。这种探针的非限制性例子可以是HRP标记的第一抗体分子或其衍生物，或HRP标记的核酸探针。这种第一探针与相应的生物标志特异性结合并使这些生物标志标记有过氧化物酶活性，从而形成靶位点。
在另一个实施方式中，第一探针可未被标记，即不含过氧化物酶部分。在该实施方式中，过氧化物酶可通过第二探针与靶位点连接。第二探针为这样的探针，该探针能够与第一探针(例如为另一种特异性结合对的成分)特异性结合。这种探针的非限制性例子可以是第二抗体分子或其衍生物、核酸探针、或受体-配体结合对的成分。这种第二探针可包含至少一种HRP或其他过氧化物酶(例如大豆过氧化物酶(SP))部分。通过与第一探针结合，具有过氧化物酶活性的第二探针将标记位点(在该位点中生物标志被发现具有这种过氧化物酶活性)，从而形成靶位点。
在另一个实施方式中，第一和第二探针都可包含至少一种过氧化物酶部分，例如HRP和/或SP。
在一些实施方式中，步骤(a)可包括数个使用第三和第四探针的分步骤。例如，在进行该方法的步骤(b)之前，包含生物标志的样品可和多种探针依次进行孵育，其中第一探针能够与生物标志结合，而第二、第三和其他探针能够彼此结合，即第二探针与第一探针结合，第三探针与第二探针结合等，因此一种标志分子将与多种不同的探针有关。每种探针可包含一种或多种过氧化物酶部分。当在单一靶位点中需要高累积的过氧化物酶活性时，可使用这种单一生物标志的多探针标记。这对于报道子在单一靶位点中沉积的增强是有用的。
在进行该方法的步骤(b)之前，如果需要，步骤(a)可重复多次以增强过氧化物酶活性在靶位点中的累积。
步骤(b)：
根据本发明，在步骤(a)中形成的包含靶位点的样品在包含交联剂和报道子的介质中进一步孵育。
适于步骤(b)的孵育的介质组成的细节如上所述。介质组成可取决于下列因素而改变：使用的报道子和交联剂分子的种类和待检测的特定生物标志。例如，当报道子为包含连接有数种荧光标记的聚合物骨架的报道子(例如实施例6或7中所述的报道分子)时，介质可包含DAB作为交联剂。
根据本发明，步骤(b)的孵育导致孵育介质中存在的报道分子沉积在靶位点(即包含标记有过氧化物酶活性的生物标志的生物样品位点)中。因为报道子仅沉积在存在过氧化物酶活性的位点中或其附近，所述其沉积的位点为存在生物标志的位点。
在一个实施方式中，步骤(b)可包含至少两步孵育：
(i)在包含交联剂(即不含报道子)的介质中孵育样品；接着
(ii)在包含交联剂和报道子的介质中孵育样品。
步骤(b)可任选地重复进行。
步骤(c)：
如上所述，报道分子为可检测分子。可检测的报道分子的不同实施方式如上所示。
报道子的检测可以是“直接的”-在沉积的报道子可释放能够被合适方式检测的显色、放射线或荧光信号的情况下是一步检测的。
检测可以是“间接的”-例如当沉积的报道子为非标记的特异性结合对的成分(例如抗体或核酸探针)时，包括多个检测步骤。这种报道子可通过包括多个检测步骤的方法来检测，其中在所述步骤中可使用多种不同的可检测的探针。在任何步骤中使用的每种探针可包含多种可检测标记。标记还可以是酶标记，例如HRP部分。在一些实施方式中，例如当与靶位点中的沉积的报道子有关的信号需要进行放大时，这种沉积的报道子的间接检测法可能是优选的。
包含沉积的报道子(其与报道子识别用探针结合)的样品可在包含交联剂和另外报道子的介质中进一步孵育。在结合探针的报道子包含过氧化物酶部分的情况下，该进一步孵育可用于使另外报道子沉积在相同靶位点中；这可用于放大从靶位点发出的初始信号，并因此用于增强检测灵敏度，或其可用于使用可检测标记(其不同于初始沉积中使用的标记)来标记靶位点。这种进一步孵育可重复多次。
上述检测生物靶点的方法可用于多种分析方式中。这些分析方式的一些实施方式将在下面描述，并通过本发明的非限制性工作例来示出。
分析方式
细胞悬浮液的细胞所包含的靶分子可使用上述方法以合适的分析方式来检测，所述分析方式(例如)为流式细胞仪法(FC)、或ELISA、或免疫组织化学法(IHC)、或原位杂交法(ISH)。
在一个实施方式中，生物样品可以是细胞悬浮液。悬浮液中的细胞的靶分子或结构可使用FC、ELISA、IHC或ISH来检测。当ELISA、IHC或ISH用于检测悬浮液的细胞时，其可连接至固相载体，例如ELISA板或ICH玻片。
在另一个实施方式中，生物样品可以是机体组织的切片。这种样品的细胞的靶分子或结构通常使用IHC或ISH来检测。
IHC和ISH分析方式通常需要一系列这样的处理步骤，该步骤在组织切片(其设置在用于显微镜检测或制备显微照片的合适的固相载体(例如载玻片或其他平坦载体)上)上进行，从而通常选择染色来强调疾病状态的某些形态学指示剂或生物标志的检测。因此，例如，在IHC中，样品被从个体中取出、固定并暴露于与目标生物标志特异性结合的抗体。样品处理步骤可包括(例如)抗原修复、暴露于第一抗体、洗涤、暴露于第二抗体(可任选地与HRP部分偶联)、洗涤、和暴露于第三抗体(其连接至一种或多种HRP部分)。可使用任何合适的缓冲液或溶剂(例如磷酸盐缓冲盐水(PBS)、Tris缓冲盐水(TBS)、蒸馏水)来进行洗涤步骤。洗涤缓冲液可任选地含有去污剂，例如Tween 20。
如上所述，通常有两种组织学样品：(1)包含新鲜组织和/或细胞的标本，其通常不用醛基固定剂来固定，和(2)固定和嵌入的组织样本，通常为存档材料。
在IHC分析方式中在进行检测靶之前进行预检测步骤。其可包括下列步骤：切削和修整组织、固定、脱水、石蜡渗透、切削成薄片、设置在载玻片上、烘焙、去石蜡、再水合、抗原修复、封闭步骤、施加第一抗体、洗涤、施加第二抗体-酶偶联物、和洗涤。
在ISH中，样品被从个体中取出、固定并暴露于核酸探针(其通过相对于目标核酸的互补碱基对而杂交)。生物样品通常包含可检测的核酸，例如DNA和RNA(包括信使RNA)。DNA/RNA水平的检测可指示特定基因的表达水平，因此可用于检测细胞、组织、器官或有机体的症状(例如疾病症状)。样品中的核酸通常被变性以暴露于结合位点。探针通常为双链或单链核酸(例如DNA或RNA)或核酸类似物(例如PNA)。然后由这种技术检测的相关靶蛋白或核酸的量被评价以确定其是否在某一预定的最小阈值之上或与已知标准相比较，因此进行相关诊断。如果需要，然后可计划个体的合适治疗。
许多固定和嵌入组织样品的方法是已知的，例如，醇类固定和福尔马林固定，随后进行石蜡嵌入(FFPE)。
需要固定剂以可重现和栩栩如生(life-like)的方式来保存细胞和组织。为了实现该目的，将组织块、切片或涂片浸渍在固定剂流体中，或在涂片的情况下干燥。固定剂稳定细胞和组织，从而保护它们避免受到处理和染色技术的苛刻条件的伤害。
可使用任何合适的固定剂，例如乙醇、乙酸、苦味酸、2-丙醇、3，3’-二氨基联苯胺四盐酸盐二水合物、3-羟基丁酮(单体混合物)和二聚体、丙烯醛、巴豆醛(顺式和反式)、甲醛、戊二醛、乙二醛、重铬酸钾、高锰酸钾、四氧化锇、多聚甲醛、氯化汞、2，4-甲苯二异氰酸酯、三氯乙酸、钨酸。其他例子包括福尔马林(甲醛水溶液)和中性缓冲福尔马林(NBF)、戊二醛、丙烯醛、碳二亚胺、亚氨酸酯、苯醌、锇酸和四氧化锇。
用于免疫组织化学分析的新鲜活组织检查样品、细胞学标本(包括印片(touch preparation)和血液涂片)、冷冻切片和组织通常固定于有机溶剂(包括乙醇、乙酸、甲醇和/或丙酮)中。
为了促进固定组织中的特异性识别，通常需要通过样品的预处理来修复或揭露(unmask)靶(即目标生物标志)，从而增加大部分靶的反应性。该步骤被称为“抗原修复”、“靶修复”、或“抗原表位修复”、“靶揭露”、或“抗原揭露”。抗原修复(抗原揭露)的深度综述可在Shi et al.1997，J HistochemCytochem，45(3)：327中找到。
抗原修复包括多种方法，其中通过这些方法靶与特定检测试剂的相互作用的适用性最大化。最普通的技术为：使用蛋白水解酶(例如蛋白酶、链霉蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰岛素或神经氨酸酶)在合适缓冲液中进行酶消化；或使用微波辐射、在水浴、气锅、常规烘箱、高压灭菌器或高压锅中、在合适pH稳定的缓冲液(通常含有EDTA、EGTA、Tris-HCl、柠檬酸盐、脲、甘氨酸-HCl或硼酸)中加热的热致抗原表位修复(HIER)。去污剂可加入HIER缓冲液中以增加抗原表位修复，或加入稀释介质和/或漂洗缓冲液中以降低非特异性结合。
抗原修复缓冲液最通常为水溶液，但也可以含有其他溶剂，包括沸点在水的沸点之上的溶剂。这允许在高于100℃、在常压下处理组织。
另外，信号噪音比可通过不同的物理方法来增加，包括在试剂孵育之前或过程中施加真空和超声、或切片的冷冻和融化。
内源性生物素结合位点或内源性酶活性(例如磷酸酶、过氧化氢酶或过氧化物酶)可作为检测过程中的步骤而除去，例如内源性生物素和过氧化物酶活性可通过使用过氧化物处理来除去。内源性磷酸酶活性可通过使用左旋咪唑处理来除去。内源性磷酸酶和酯酶可通过加热而破坏。
可以使用惰性蛋白(例如马血清白蛋白(HSA)、酪蛋白、胎牛血清白蛋白(BSA)和卵白蛋白、胎牛血清、或其他血清)或去污剂(Tween20、Triton X-100、皂角苷、Brii或Pluronics)来封闭非特异性结合位点。还可以使用未标记的和靶非特异性形式的特定试剂来封闭非特异性结合位点。
还可以使用自由漂浮技术来制备样品和检测靶分子。在该方法中，组织切片与悬浮或自由漂浮在合适容器(例如微量离心管)中的不同试剂和洗涤缓冲剂接触。
组织切片可在染色过程中使用(例如)“钓鱼钩状”装置、抹刀或玻璃环、利用不同的试剂和缓冲剂从管至管之间转移。不同的试剂和缓冲剂还可通过轻柔倾析或真空吸滤而改变。可选择地，在被转移回到管中以进行下一个染色步骤之前，含有组织切片的容器可流入特定染色网(例如Corning“Netwells”(Corning))中，并且将组织切片洗涤。
在组织切片自由漂浮或保留在网中的同时进行所有步骤，包括(例如)固定、抗原修复、洗涤、使用封闭剂、免疫特异性试剂进行孵育、和过氧化物酶介导的报道子沉积。在报道子沉积后，组织切片被置于玻片上，例如通过使用光学或荧光显微镜来检测报道子，在分析之前使用盖玻片来覆盖玻片。
在一些实施方式中，在本发明的步骤(a)之后使用免疫特异性试剂进行关键的孵育，之后将组织切片置于玻片上。然后，在设置组织切片的玻片上进行检测的其余步骤。
可检测的生物标志
可被所述方法检测的生物标志可以是样品中存在的任何分子或结构，其为脂质、糖脂或糖、多糖、或淀粉，所述样品优选为生物样品，例如蛋白、糖蛋白、脂蛋白、磷蛋白、甲基化蛋白或蛋白片段(例如肽)或核酸(例如DNA、RNA)。生物标志可表达在生物样品的表面上，例如膜结合。标志可包含在生物样品的内部，即在细胞膜内，例如在细胞质内、在细胞核内、在细胞内隔室或细胞器官内。生物标志可以为细胞状结构，例如膜微域、离子通道、染色体结构等，或其可以为分子复合体，例如RNA-蛋白复合体等。生物标志优选为特定生物标志，例如其为正常或病例状况的标志，或其对于特定细胞或组织是特异性的，或其对于特定生物种类是特异性的。
这种生物标志的检测可用于病例状况的诊断和治疗。
本发明涉及检测生物样品中的至少一种生物标志。因此，本发明还提供检测给定样品中的多种(例如两种、三种)生物标志，因此其提供获得数据的方法，所述数据(例如)为诊断信息、生物标志的相关表达、蛋白、基因、或一种或多种蛋白和一种或多种基因的组合的组(panel)的数据。作为例子(但非限制性的)，例如可在癌症诊断分析(例如乳腺癌分析)中同时筛选HER2蛋白和HER2基因。另一个非限制性例子包括(例如)筛选三种标志以检测子宫癌。标志可包括Ki67/mib-1和细胞增殖标志p16(INK4a)、以及诸如蛋白或核酸之类的用于人乳头瘤病毒的标志。然而另一个非限制性例子包括筛选与前列腺癌有关的多个标志。这些标志可包括AMACR P504S、聚合物量细胞角蛋白(HMW-CK)、和p63。筛选标志的这种组合提供了一种从恶性前列腺肿瘤中区别良性前列腺肿瘤的方法。
例如在检测多种标志时需要使交联剂之间的交叉反应性最小化。这可通过在检测步骤中使用不同探针和不同报道分子来实现。这种体系的例子示于图3中，其中使用下列步骤来检测两种不同生物标志，例如两种不同细胞受体：
(1)孵育样品和第一探针1(1P1)(例如HRP偶联的抗体AB1)；
(2)在存在交联剂(例如DAB)的条件下孵育样品(1)和报道子1(R1)(例如阿魏酸-PNA1偶联物)；
(3)孵育样品(2)和过氧化氢(＞3％v/v)；
(4)孵育样品(3)和第一探针2(1P2)(例如HRP-偶联的抗体AB2)；
(5)孵育样品(4)和报道子2(R2)(例如阿魏酸-PNA2偶联物)；
(6)孵育样品(5)和第二探针1(2P1)(例如PNA1’-FITC)以及第二探针2(2P2)(例如PNA2’-德克萨斯红)。
结果，从R1沉积的靶位点中检测到绿色荧光信号(从PNA1’-FITC发出)，从R2沉积的靶位点中检测到红色荧光信号(从PNA2’-德克萨斯红发出)，并且从R1和R2沉积的靶位点(即同时存在靶A1和A2的位点)中检测到黄色荧光信号。
该方法的所有步骤(从(a)至(c))可在2-20分钟内完成。这种快速检测可有利地用于自动或半自动检测靶生物标志。自动染色装置是本领域中已知的，并且该方法可适用于这些装置。
自动染色装置可用在本发明的多种实施方式中，例如用于检测多种生物标志。检测多种生物标志通常需要从不同可检测物质中发出的信号的平衡。自动步骤可包括多个将从靶生物标志中发出的信号放大的步骤。当检测多种标志时这是特别有利的。
抗体探针
术语“探针”是指可与靶特异性结合的物质，其中靶可以是生物标志、另外探针、报道子、或任何与所述生物标志、另外探针或报道子有关的分子。
在一个实施方式中，探针为抗体探针。
在本文中使用的抗体是指免疫球蛋白或其一部分，其包括任何包含抗原结合位点的多肽，而不论其来源、制备方法和其他特性如何。该术语包括(例如)多克隆、单克隆、单特异性、多特异性、人源化、单链、嵌合、合成、重组、杂交、变异和CDR移植的抗体。一部分抗体可包括任何仍能够结合抗原的片段，例如Fab、F(ab’)2、Fv、scFv。抗体来源通过基因组序列来限定，而不论制备方法如何。
本文中使用的第一抗体是指与生物样品内存在的目标生物标志特异性结合的抗体。在某些实施方式中，第一抗体可聚合。第一抗体可衍生自任何温血种类，例如哺乳动物、鸟。
本文中使用的第二抗体是指具有这样的抗原结合域的抗体，所述抗原结合域与第一探针(例如第一抗体)、或沉积在靶位点中的半抗原、或者直接或间接与第一探针连接的半抗原特异性结合。
本文中使用的第三抗体是指具有这样的抗原结合域的抗体，所述抗原结合域与第二探针(例如第二抗体)、或与第二探针连接的半抗原、或与偶联至第二探针的聚合物连接的半抗原、或沉积在靶位点中的半抗原特异性结合。
有时抗体可同时起到第二抗体和第三抗体的作用。
本发明中使用的抗体(包括第一抗体、第二抗体和第三抗体)可衍生自任何哺乳动物种类，例如小鼠、大鼠、山羊、豚鼠、驴、兔、马、羊驼(lama)、骆驼、或任何鸟类种类(例如鸡、鸭)。本文中使用的衍生自任何哺乳动物或鸟类种类是指编码特定抗体的至少一部分核酸序列源自特定哺乳动物(例如小鼠、大鼠、山羊、或兔)或特定鸟类(例如鸡、鸭)的基因组序列。抗体可以是任何同型，例如IgG、IgM、IgA、IgD、IgE、或任何亚类，例如IgG1、lgG2、lgG3、lgG4。
在某些实施方式中，第一抗体含有可与生物样品包含的细胞表达的生物标志特异性结合的抗原结合区域。所述标志可表达在细胞表面上，或在细胞膜内(即在细胞的内部，例如在细胞质内、在细胞核内、在内质网内)。在一些实施方式中，生物标志选自细胞，因此存在于溶液中，例如在细胞培养基中、在血液或血浆中。
在某些实施方式中，第二抗体含有与第一抗体特异性结合的抗原结合区域，例如第一抗体的恒定区域。在某些实施方式中，第二抗体与聚合物偶联。在一些实施方式中，聚合物与2-20种第二抗体偶联。在其他实施方式中，聚合物与2-10种第二抗体偶联。
在某些实施方式中，第三抗体含有与第二抗体特异性结合的抗原结合区域，例如第二抗体的恒定区域、或与第二抗体连接的半抗原、或与第二抗体偶联的聚合物。在某些实施方式中，第三抗体与聚合物偶联。在一些实施方式中，聚合物与1-20种第三抗体偶联。在其他实施方式中，聚合物与1-5种第三抗体偶联。
本发明的方法和组合物中可使用的抗体包括单克隆和多克隆抗体、工程化抗体，包括使用噬菌体展示技术或可选择的技术制备的嵌合、CDR移植和人工选择的抗体。
已经公开了多种制备抗体的技术，例如参见：Kohler和Milstein，(1975)Nature 256：495、Harlow和Lane，Antibodies：a Laboratory Manual，(1988)(Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY)，其通过引用的方式并入本文。制备重组抗体分子的技术在上述参考文献中有所公开，此外还在(例如)EP 0623679、EP 0368684和EP 0436597中有所公开。
可以以重组或合成的方式来制备抗体。编码抗体的核酸可分离自cDNA库。编码抗体的核酸可分离自噬菌体库(例如参见McCafferty et al.1990，Nature 348：552，Kang et al.1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：4363、EP 0 589877 B1)。编码抗体的核酸可通过已知序列的基因改组来获得(Mark et al.1992，Bio/Technol.10：779)。编码抗体的核酸可通过体内重组来分离(Waterhouse et al.1993，Nucl.Acid Res.21：2265)。本发明的方法和组合物中使用的抗体包括人源化免疫球蛋白(美国专利No.5,585,089，Jones et al.1986，Nature 332：323)。
所述抗体可以是包含效应子蛋白(例如毒素或标记(例如可检测物质))的改变抗体。
抗体可得自动物血清，或在单克隆抗体或其片段的情况下在细胞培养基中制得。根据建立的方法，重组DNA技术可用于在细菌、酵母菌、昆虫或哺乳动物细胞培养基中制备抗体。在某些实施方式中，选择的细胞培养基体系优选分泌抗体产物。
核酸探针
在另一个实施方式中，第一探针可以是或包含核酸或核酸类似物分子(例如DNA分子、RNA分子、PNA分子)以用在原位杂交中。核酸探针可以化学合成，或在细胞中重组制备(例如参见Sambrook et al.(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd ed.Cold Spring Harbor Press)。在一些实施方式中，探针包含肽核酸(PNA)。肽核酸为核酸分子，其中通常存在于DNA和RNA中的脱氧核糖或核糖骨架被肽骨架取代。制备PNA的方法是本领域已知的(例如参见Nielson，2001，Current Opinion inBiotechnology 12：16)(通过引用的方式并入本文)。在其他实施方式中，探针包含锁核酸(LNA)(Sorenson et al.2003，Chem.Commun.7(17)：2130)。在一些实施方式中，核酸探针与生物标志(例如生物样品中所含的核酸分子)特异性结合。
在特定实施方式中，核酸探针至少包含与生物样品中的靶序列(例如核酸序列(例如基因组DNA序列或mRNA序列))在特定严格条件下特异性杂交的序列。在本文中使用的术语“在特定严格条件下杂交”旨在描述在彼此显著互补的核苷酸序列保持彼此结合的情况下杂交和洗涤的条件。该条件为使得至少70％、至少80％、至少85-90％互补的序列保持彼此结合。互补百分率按照下列文献所述来测定：Altschul et al.(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-3402(通过引用的方式并入本文)。
具体的严格条件是本领域已知的，并且可在下列文献中找到：CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，Inc.(Ausubel et al.1995eds.)，第2、4和6章(通过引用的方式并入本文)。另外，具体的严格条件在下列文献中有所描述：Sambrook et al.(1989)Molecular Cloning：ALaboratory Manual，2nd ed.Cold Spring Harbor Press，第7、9和11节(通过引用的方式并入本文)。在一些实施方式中，杂交条件为高度严格条件。高度严格杂交条件的例子为在4X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中在65-70℃下杂交或在4X SSC和50％甲醛中在42-50℃下杂交，然后在1X SSC中在65-70℃下进行一次或多次洗涤。应理解另外试剂可加入杂交和/或洗涤缓冲液中，例如封闭剂(BSA或鲑鱼精子DNA)、去污剂(SDS)、螯合剂(EDTA)、Ficoll、PVP等。
在一些实施方式中，核酸探针与样品中的靶序列在中度严格条件下杂交。本文中使用的中度严格杂交条件包括本领域普通技术人员基于(例如)DNA的长度可以容易地确定的条件。示例性条件在下列文献中有所阐述：Sambrook et al.Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2d ed.Vol.1，pp.1.101-104，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)(通过引用的方式并入本文)，并且包括使用预洗涤液(5X SSC、0.5％ SDS、1.0mM EDTA(pH 8.0))，杂交条件为50％的甲醛、6X SSC、在42℃下(或其他类似的杂交溶液，例如在50％甲醛中的Stark’s溶液、在42℃下)，洗涤条件为60℃、0.5X SSC、0.1％SDS。
在一些实施方式中，核酸探针与样品中的靶序列在低度严格条件下杂交。本文中使用的低度严格杂交条件可包括本领域普通技术人员基于(例如)DNA的长度可以容易地确定的条件。低度严格杂交条件可包括(例如)在40℃下、在含有35％甲酰胺、5x SSC、50mM Tris-HCI(pH 7.5)、5mMEDTA、0.1％PVP、0.1％Ficoll、1％BSA和500μg/ml变性鲑鱼精子DNA的溶液中预处理DNA6小时。在相同溶液中进行杂交，不同之处在于进行下列改变：0.02％PVP、0.02％Ficoll、0.2％BSA、100μg/ml变性鲑鱼精子DNA、10％(wt/vol)硫酸葡聚糖，并使用5-20x106 CPM探针。将样品在杂交混合物中在40℃下孵育18-20小时，然后在55℃下在含有2x SSC、25mMTris-HCI(pH 7.4)、5mM EDTA和0.1％SDS的溶液中洗涤1.5小时。将洗涤液用新鲜溶液取代，并在60℃下另外孵育1.5小时。
探针的其他实施方式包括肽序列，例如所述肽序列衍生自不同蛋白的蛋白或核酸结合域、不同细胞和细胞核受体以及它们的衍生物的配体、可与大的生物分子的某些结构单元特异性结合的小分子，然而这仅仅列出了可用作本发明的目的的探针的物质的非限制性例子。
实施例
1.本发明的报道子和交联剂分子的实施例
缩写
MBHA   4-甲基二苯甲基胺
NMP    N-甲基吡咯烷酮
HATU   2-(1h-7-叠氮苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸盐；
       甜菜碱
DIPEA  二异丙基乙胺
DCM    二氯甲烷
TFA    三氟乙酸
TFMSA  三氟甲基磺酸
Fer    阿魏酸
FLU    荧光素
Tyr    酪氨酸
Lys    赖氨酸
Dex    葡聚糖
HPLC   高效液相色谱法
equi.  当量
1.1.Fer-L30-Lys(Flu)-NH2(D17158)
使用Fmoc-Lys(ivDDE)来卸载MBHA树脂至负载量为150微摩尔/g。使用在NMP中的20％的哌啶使200mg树脂去Fmoc化，并用Boc-L30-OH(1.5mL，在NMP中0.26M，使用0.9当量的HATU、2当量的DIPEA预活化2分钟)进行一次20分钟的偶联。使用NMP中的5％的肼来除去ivDDE基团，用羧基荧光素(Flu)(1.5mL，在NMP中0.2M，使用0.9当量的HATU、2当量的DIPEA预活化2分钟)标记赖氨酸侧链2x20分钟。使用在NMP、NMP、DCM、然后DCM中20％的哌啶处理树脂。使用TFA∶TFMSA∶间甲酚(7∶2∶1，1.5ml，1小时)将中间产物H-L30-Lys(Flu)-NH2从树脂上分开，使用二乙基醚沉淀，重新悬浮在TFA，使用二乙基醚沉淀，重新悬浮在NMP，再次使用二乙基醚沉淀。使用100微升DIPEA将其制成碱性，并直接溶解在用0.9当量的HATU和2当量的DIPEA预活化的0.5mL 0.3M的阿魏酸中。在25分钟后，将粗产物用二乙基醚沉淀，并溶解在450微升NMP和50微升乙二胺中。在5分钟后，将产物用二乙基醚沉淀，并溶解在水中的15％乙腈(8mL)中，使用100微升TFA进行酸化，并进行RP-HPLC纯化。
1.2.Fer-L150-Lys(Flu)-NH2(D17157)
使用Boc-Lys(Fmoc)来卸载MBHA树脂至负载量为100微摩尔/g。用Boc-L30-OH对100mg树脂进行5次偶联循环(a.如1中那样使用Boc-L30-OH进行偶联。b.使用在NMP∶吡啶1∶1中2％的乙酸酐封端2分钟。c.使用在TFA中的5％的间甲酚去Boc化2x5分钟)。将赖氨酸侧链去Fmoc化，并如1中那样使用羧基荧光素标记。将中间产物H-L150-Lys(Flu)-NH2从树脂上分开，并用阿魏酸标记N末端，然后如1.1那样进行纯化。
1.3.βα-L90-Lys(Flu)-L90Lys(Flu)-L90-Lys(Flu)-NH2(D16127)
使用标准固相化学法(如1.1和1.2)在0.5g的MBHA树脂上制备Boc-L90-Lys(Fmoc)-L90-Lys(Fmoc)-L90Lys(Fmoc)。使用在NMP中的20％的哌啶从赖氨酸侧链中除去Fmoc基团，然后使化合物进行重复的羧基荧光素标记(3x30分钟)。在使用TFA除去Boc基团后，在固相上使用β-丙氨酸-N，N-二乙酸(βα)叔丁基酯标记N末端。在从树脂上分开并进行HPLC纯化后，分离βα-L90-Lys(Flu)-L90Lys(Flu)-L90-Lys(Flu)-NH2。
1.4.H-Cys-L90-Lys(Flu)-L90Lys(Flu)-L90-Lys(Flu)-NH2(D16126)
制备Boc-L90-Lys(Fmoc)-L90-Lys(Fmoc)-L90Lys(Fmoc)树脂，并使用1.3中所述的方法利用荧光素来标记。在除去Boc基团后，使用N-Boc-S(4-甲氧基苄基)-Cys-OH来标记N末端。将化合物从柱上分开，并通过HPLC纯化。
分子1.1、1.2、1.3和1.4为包含荧光素残基的报道子的非限制性实施方式。
1.5.Fer-Lys(Fer)-L30-Lys(Fer)-L30-Lys(Fer)-L30-Lys(Fer)-L30-Lys(Fer)-L30Lys(NH2)-NH2(D17128)
将Boc-Lys(Fmoc)(2个循环)、Boc-L30-OH(5个循环)和Boc-Lys(2CIZ)-OH依次偶联至MBHA树脂。在存在10％的茴香硫醚清除剂的条件下将中间产物从树脂分开，从而除去2CIZ基团。如1.1那样使用阿魏酸标记N末端和5个脱保护的赖氨酸侧链(2x30分钟)。然后在纯化之前使用在NMP中的10％的乙二胺除去C末端赖氨酸残基中的N上的Fmoc基团。
1.6.Fer-(Lys(Fer)-L30)5-Lys(NH-βα((L90-Lys(Flu))3-NH2)-NH2(D17134)
将500nmol的βα-L90-Lys(Flu)-L90Lys(Flu)-L90-Lys(Flu)-NH2(化合物1.4)溶解在88微升NMP和2微升吡啶中，并通过与10微升二异丙基碳二亚胺反应10分钟来转化成环状酸酐。将该酸酐用二乙基醚沉淀，然后将小球溶解在包含250nmol的Fer-(Fer-L30)5-Lys(NH2)-NH2的100微升NMP中。在20分钟后，加入5微升乙二胺，在5分钟后将产物用二乙基醚沉淀，酸化，然后进行HPLC纯化。
1.7.Ac-(Tyr(OH)-L30)6-L90-Lys(Flu)-L90-Lys(Flu)-Lys(Flu)-NH2(D18044)
在MBHA树脂上制备Ac-(Tyr(2BrZ)-L30)6-L90-Lys(Fmoc)-L90-Lys(Fmoc)-Lys(Fmoc)。在固相上除去Fmoc基团，并且使用羧基荧光素来标记赖氨酸侧链。在从树脂上分开后，将产物进行HPLC纯化。
1.8.
Fer-Lys(Fer)-L60-Lys(Fer)-Lys(Fer)-L60-Lys(Fer)-Lys(Fer)-L30Lys(NH2)-NH2(D17140)
在MBHA树脂上制备Boc-Lys(2CIZ)-L60-Lys(2CIZ)-Lys(2CIZ)-L60-Lys(2CIZ)-Lys(2CIZ)-L30-Lys(Fmoc)。在从树脂上分开后，通过沉淀来分离中间产物H-Lys(NH2)-L60-Lys(NH2)-Lys(NH2)-L60-Lys(NH2)-Lys(NH2)-L30-Lys(Fmoc)，并如1.1那样用阿魏酸标记。通过HPLC来分离最终产物。
例子1.5.-1.8.是具有下式的交联剂分子的例子：
(R1)n-(X)q-R2(m)，
其中
R1和R2为不同的HRP的底物部分(例如Fer或Tyr)，
X为具有下式的连接分子：
Figure GPA00001109399300341
其中R3和R4为Lys的残基，并且m、n和q为1至6。
具有荧光素、阿魏酸(1.6)和/或酪氨酸(1.7)的数个残基的线性聚合物交联剂(例如上述分子1.6.和1.7.)也是可在存在另外交联剂(例如DAB)的条件下被HRP沉积的报道子的实施方式。当HRP酶部分与不容易在(例如)细胞核(例如DNA)中受到影响或暴露的靶位点结合时，这种线性、相对低分子量(MW＜15kDa)的交联剂/报道子可以是特别有用的。当过氧化物酶部分位于更容易受到影响的靶位点中时，可使用大的报道分子，例如含有与数十和数百个标记(例如Flu和/或Fer和/或Tyr)偶联的葡聚糖分子(例如下述分子1.9.)的报道子。
1.9.与交联剂1.5.和交联剂1.4.偶联的Dex70(D17130)
使10nmol的葡聚糖(MW 70kDa，用二乙烯基砜活化)与500nmol的Fer-(Fer-L30)5-Lys(NH2)-NH2(化合物1.5)在总体积300微升的0.16M的NaHCO3(pH9.5)中在40℃下反应30分钟。在观察到少量沉淀后，进一步加入100微升的水，并使反应进行另外30分钟。进一步加入200微升的0.15M的NaHCO3和500nmol的H-Cys-L90-Lys(Flu)-L90Lys(Flu)-L90-Lys(Flu)-NH2(化合物1.4)。在40℃下1小时后，通过加入50微升的0.165M的半胱氨酸使反应混合物淬火30分钟，将溶液过滤，将产物通过FPLC在superdex200上用在含有10mM CHES、pH 9.0和0.1M NaCl的水溶液中的20％EtOH进行纯化。洗脱产物为包含约56个荧光素和113个阿魏酸残基的葡聚糖偶联物。
1.10.山羊-抗-小鼠-Dex70-HRP(D18033)
将葡聚糖(70kDA MW)用13.7nmol的二乙烯基砜活化，并在600微升缓冲液(100mM NaCl、25mM NaHCO3、pH 9.5)中和602nmol HRP在30℃下反应3小时。然后加入在105微升水中的41.1nmol的山羊-抗-小鼠F(ab)2抗体，继续反应另外16小时。通过加入70微升的0.165M的半胱氨酸来使反应混合物淬火30分钟，将产物在superdex 200上在100mM NaCl、10mM HEPES(pH 7.2)中纯化。洗脱产物为包含山羊-抗-小鼠(GaM)和HRP的葡聚糖偶联物(dex∶GaM∶HRP的比＝1∶1∶1)。
1.11.抗-FITC-Dex70-HRP(D18058)
将葡聚糖(70kDA MW)用10nmol的二乙烯基砜活化，并在400微升缓冲液(100mM NaCl、25mM NaHCO3、pH 9.5)中和440nmol的HRP在30℃下反应3小时。然后，加入在80微升水中的30nmol的抗-小鼠F(ab)2抗体，在40℃下继续反应另外90分钟。通过加入50微升的0.165M的半胱氨酸来使反应混合物淬火30分钟，将产物在superdex 200上在100mM NaCl、10mM HEPES(pH 7.2)中纯化。洗脱产物为具有抗-FITC和HRP的葡聚糖偶联物(dex/抗-FITC/HRP比＝1/2/9)。
1.12.抗-FITC-Dex70-HRP(D17030)
将葡聚糖(70kDA MW)用10nmol的二乙烯基砜活化，并在374微升缓冲液(100mM NaCl、25mM NaHCO3、pH 9.5)中和440nmol HRP以及25nmol F(ab)2抗-FITC在30℃下反应16。通过加入50微升的0.165M的半胱氨酸来使反应混合物淬火30分钟，将产物在superdex 200上在100mMNaCl、10mM HEPES(pH7.2)中纯化。洗脱产物为包含抗-FITC和HRP的葡聚糖偶联物(比为1∶1∶1)。
分子1.10、1.11和1.12表示可用作检测沉积的报道分子的探针的抗体-葡聚糖-HRP偶联物的实施方式。偶联物1.10.还可用作检测与沉积的报道子结合的探针的另外的探针(例如上述在检测靶位点中的标志的方法中的步骤(b)中)。
3.使用本发明的方法进行IHC染色的实施例
在福尔马林固定、石蜡嵌入的扁桃体上进行IHC。将3-5个微切片切削、烘烤并储存在4℃下直到使用为止。然后通过二甲苯(2x5分钟)、99％乙醇(2x2分钟)、70％乙醇(2x2分钟)、并最终通过水来除去石蜡。将玻片置于靶修复溶液(pH 9)(DAKO S2367)中，然后在微波炉中加热(沸腾10分钟)。此后，使玻片冷却，然后转移至洗涤缓冲液(DAKO S3006)。该步骤后面是使用3％过氧化氢封闭内源性过氧化物酶活性5分钟的步骤，然后再次将玻片转移至洗涤缓冲液中，然后进行染色。为了使玻片与玻片之间差异最小化，在相同日子使用连续切片进行各种比较试验。使用从0至4的评分等级来对具体和背景信号进行评分，其中0表示根本没有染色，1表示较弱程度染色，2表示中等程度染色，3表示较强程度染色，4表示过度染色。
IHC试验1.
将细胞角蛋白、山羊-抗-小鼠-HRP和抗-FITC-HRP分别稀释在BCPT-缓冲液(2％BSA、0.2％酪蛋白、2％PEG、0.1％Tween20、0.1M NaCL、10mM HEPES、pH 7.2)中。将报道子D17128和DAB(DAKO K5007C)稀释在DAB的底物缓冲液(DAKO K5007 B)中。所有孵育持续5分钟，接着在DAKO洗涤缓冲液中洗涤2分钟，除了在孵育后使用D17128的情况以外，在该情况中在10mM CHES(pH 9)+0.1％Tween20中进行洗涤。下表和描述概括了试验的实施方式：
  第一抗体探针   第二抗体探针   交联剂和报道子   报道子检测探针   交联剂和报道子   报道子检测探针   显影液
  玻片1   细胞角蛋白(DAKOM5315)15nM   GaM-HRP，D18033，125nM   DAB(DAKOK5007C)没有报道子
  玻片4   如玻片1那样   GaM-HRP，D18033，5nM   D17128100nM+DAB  1∶150   D1703050nM   DAB
  玻片7   如玻片1那样   GaM-HRP，D18033，0.5nM   如玻片4那样   如玻片4那样   D17128100nM+DAB1∶150   D1703050nM   DAB
  第一抗体探针   第二抗体探针   交联剂和报道子   报道子检测探针   交联剂和报道子   报道子检测探针   显影液
  玻片9   如玻片1那样   GaM-HRP，D18033，0.5nM   D1712820nM+DAB 1∶150   如玻片4那样   如玻片7那样   如玻片7那样   DAB
玻片1-标准DAB-HRP染色(没有放大)。标准DAB DAKO试剂(K7005C)含有3mM DAB。
玻片4-在存在1mM DAB-GaM-HRP偶联物D18033(与玻片1相比其稀释25倍)的条件下沉积报道子D17128-一步放大。
玻片7和玻片9-与玻片1相比进一步稀释GaM-HRP偶联物D18033，并且进行另外的报道子沉积步骤。
玻片1、4和7都具体染色评分为2.5至3。由于在存在DAB的条件下沉积报道子D17128、接着通过抗-FITC-HRP探针D17030来识别该报道子，因此获得放大250倍的信号(与玻片1相比的玻片9)。玻片7和9的明显染色保持鲜明(即非扩散的)，其中染色和未染色区域之间的强烈边界表明在沉积位点发生非常少的扩散。
IHC试验2.
将细胞角蛋白、GaM-HRP和抗-FITC-HRP都稀释在BCPT-缓冲液(2％BSA、0.2％酪蛋白、2％PEG、0.1％Tween20、0.1M NaCL、10mM HEPES、pH 7.2)中。将D17128和DAB(DAKO K5007 C)稀释在DAB的底物缓冲液(DAKO K5007 B)中。所有孵育持续5分钟，接着在DAKO S3006中洗涤2分钟，除了在孵育后使用D17128的情况以外，在该情况中在10mMCHES(pH 9)+0.1％Tween20中进行洗涤。
下表和描述概括了试验的实施方式：
  第一和第二抗体探针   交联剂和报道子   报道子探针   显影液
  玻片9   细胞角蛋白DAKO M531515nM+GaM-HRPD18033 10nM   D17128 25nM没有交联剂   D18058抗-FITC-HRP25nM   DAB(DAKOK5007C)
  玻片12   如玻片9那样   D17128 25nM+D17140 100μM   如玻片9那样   DAB(DAKOK5007C)
  玻片14   如玻片9那样   D17128 25nM++DAB 1∶150   如玻片9那样   DAB(DAKOK5007C)
玻片12和14强烈和特异性地染色(评分都为2)，而玻片9未被染色(评分为0)。结果表明在没有交联剂(例如DAB(玻片14)或D17140(玻片12))的情况下HRP不会引起报道子沉淀。
试验进一步示出减少预孵育(10分钟)第一抗体和第二抗体-HRP偶联物的步骤次数的可能性。
IHC试验3.
将细胞角蛋白、GaM-HRP和抗-FITC-HRP分别稀释在BCPT-缓冲液(2％BSA、0.2％酪蛋白、2％PEG、0.1％Tween20、0.1M NaCL、10mM HEPES、pH 7.2)中。将D17128和DAB(DAKO K5007C)稀释在DAB的底物缓冲液(DAKO K5007B)中。所有孵育持续5分钟，接着在DAKO S3006中洗涤2分钟，除了在孵育后使用D17128和D18044的情况以外，在该情况中在10mM CHES(pH 9)+0.1％Tween20中进行洗涤。当具有DAB的玻片(玻片3和5)在底物缓冲液中进行第三孵育步骤时，孵育时间为1分钟。
下表和描述概括了试验的实施方式：
  第一抗体探针  第二抗体探针   交联剂和报道子   交联剂和报道子   报道子探针   显影液
 玻片2   细胞角蛋白DAKO M531515nM  GaM-HRP，D18033，3nM   D1712850nM+DAB 1∶150   D18058抗-FITC-HRP50nM   DAB
 玻片3   如玻片2那样  如玻片2那样   DAB，没有报道子   D1712850nM+DAB 1∶150   D18058抗-FITC-HRP50nM   DAB
 玻片4   如玻片2那样  如玻片2那样   D1712850nM没有交联剂   D18058抗-FITC-HRP50nM   DAB
 玻片5   如玻片2那样  如玻片2那样   DAB，没有报道子   D1712850nM没有交联剂   D18058抗-FITC-HRP50nM   DAB
玻片2是染色密度最高的玻片(评分3)，这表明第三步骤的对于玻片3(评分2，5)特别施加1分钟的DAB不是很大改善，而是相当轻微降低染色密度。在缺乏交联剂的条件下对于缺乏对于玻片4(评分0)的染色符合IHC试验2(上述)中获得的结果。在玻片5(其中在施加报道子偶联物D17128之前施加DAB)上观察到染色(评分2)，尽管这些染色不如玻片3上的染色那样密度高。
该结果表明在孵育具有报道子和交联剂的玻片(即预孵育步骤)之前可以首先在单独步骤施加交联剂。所观察到的在沉积标记的报道子前施加DAB的另一种积极作用是明显降低背景染色(玻片2评分为0.5-1，玻片3评分为0)，尽管特定信号强度并没有降低太多。在许多情况下通过在沉积前1分钟的额外DAB步骤，实质上消除了与山羊-抗-小鼠-HRP偶联物的非特异性结合有关的特别弱的扩散背景染色。
IHC试验4.
将细胞角蛋白、GaM-HRP和抗-FITC-HRP全部稀释在BCPT-缓冲液(2％BSA、0.2％酪蛋白、2％PEG、0.1％Tween20、0.1M NaCL、10mM HEPES、pH 7.2)中。将D17128、D18044和DAB(DAKO K5007C)稀释在DAB的底物缓冲液(DAKO K5007B)中。所有孵育持续5分钟，接着在DAKO S3006中洗涤2分钟，除了在孵育后使用D17128和D18044的情况以外，在该情况中在10mM CHES(pH9)+0.1％Tween20中进行洗涤。
下表和描述概括了试验的实施方式：
  第一和第二抗体探针   和交联剂的预孵育   交联剂(DAB)和报道子
  玻片8   细胞角蛋白DAKO M531515nM+GaM-HRPD1803310nM   在底物缓冲液中的DAB1∶50(DAKOK5007C)，1分钟   D1712850nM+DAB 1∶50(DAKOK5007C)   50nM D18058   DAB
  玻片9   如玻片9那样   如玻片9那样   D1712850nM+DAB 1∶150   如玻片9那样   如玻片9那样
  玻片10   如玻片9那样   如玻片9那样   D1712850nM+DAB 1∶150   如玻片9那样   如玻片9那样
  玻片11   如玻片9那样   如玻片9那样   D180445μM+DAB 1∶50   如玻片9那样   如玻片9那样
  玻片12   如玻片9那样   如玻片9那样   D180445μM+DAB 1∶150   如玻片9那样   如玻片9那样
  玻片13   如玻片9那样   如玻片9那样   D180445μM+DAB 1∶500   如玻片9那样   如玻片9那样
该试验示出了交联剂浓度对于两种不同类型的报道子沉积的影响。玻片9是染色浓度最高的玻片(评分4)。以稀释度1∶150将作为交联剂的DAB(1mM)施加在玻片9上。DAB的更高(1∶50(3mM)，玻片8)或更低(1∶500(30mM)，玻片10)浓度产生密度稍低的染色(评分3.5)。和DAB的预孵育的背景降低效果也是可见的；6个玻片(上表)中没有一个具有明显的背景染色。
低分子量报道子(例如上述报道子18044)在较低浓度的DAB(玻片13；评分3)下被更好地沉积，随着DAB浓度的增加(玻片12，评分2.5；玻片11，评分2)，染色密度降低。
该试验还示出为了获得相同或甚至更好的染色结果，与包含相同但更少的过氧化物酶的底物部分的小的报道分子(例如D 18044，t 5μM)相比，可以使用更少量的包含多个过氧化物酶的底物部分的大的报道分子(例如荧光素-阿魏酸葡聚糖偶联物D17128，50nM)。
4.使用本发明的方法放大核酸探针信号的实施例
通过在Chromogen溶液和信号增强溶液中使用和不使用DAB来试验样品，可以示出DAB的沉淀效果。通过进一步稀释探针、抗体或通过省略第二过氧化物酶-封闭步骤，可以获得本发明信号放大的进一步解释。
组织：福尔马林-固定石蜡嵌入的扁桃体。
荧光素标记的探针靶向于染色体11的着丝粒。
在实施例中使用下列溶液：
抗原修复/预处理(Dako K 5599)
洗涤缓冲液1(Dako K5331)
洗涤缓冲液2(Dako S 3006)
胃蛋白酶RTU(Dako K 5331)
严格的洗涤缓冲液(Dako K 5331)
R-a-Fitc/HRP，F(ab)(Dako P 5100)
抗体稀释液(Dako S 2022)
探针(Dako Y 5505)
过氧化物酶-封闭液(Dako S 2023)
核快红(Dako S1968)
Chromogen缓冲液(Dako K5007)
杂交剂(Dako S2451)被用于杂交探针。
Chromogen溶液和信号增强溶液的制备：
溶液A：
将102.5mg的5-氨基-2-(3-[5-氨基-1，3-二氢-3，3-二甲基-1-(4磺基丁基)-2H吲哚-2-亚基]-1-丙烯基]-3，3二甲基-1-(4磺基丁基)-3H-吲哚鎓三氟乙酸盐溶解在4,525mL的丙二醇/水(8∶2)中。
溶液B：
将59,6mg的3，3’-二氨基盐酸联苯胺溶解在5,96mL的丙二醇/水(8∶2)中。加入13,7μL 12M的盐酸。
溶液C：
按照1mL A∶9mL B的比混合溶液A和溶液B。
Chromogen溶液：
为了染色，将这些储存液稀释成试剂盒(得自Dakocytomation code#K5007)的chromogen缓冲液。
将1mL的溶液C与19mL的Chromogen缓冲液混合。
溶液D：
将1mL的溶液B用499mL的Chromogen缓冲液稀释。
信号增强溶液：
其为在20％的乙醇中的D1734、0,1M NaCl、10mM CHES(pH 9,0)的溶液，用溶液D稀释至Fer-L30-FITC浓度为250nM或50nM。在溶液中没有DAB的情况下，直接在Chromogen缓冲液中进行稀释。
组织染色过程
将人扁桃体组织玻片去石蜡化、洗涤并在微波炉中进行10分钟的抗原修复。在另一次洗涤后，在37℃下进行胃蛋白酶处理，洗涤，使玻片脱水并和PNA探针孵育。在85℃下使样品变性5分钟后，将探针在45℃下杂交1小时。将玻片在65℃下严格洗涤10分钟。将过氧化物酶封闭3分钟，将玻片洗涤并和兔-抗-FITC/HRP(以1∶20稀释)孵育。在30分钟后，将玻片洗涤并和信号增强溶液孵育。在30分钟后，将玻片洗涤，并将过氧化物酶封闭3分钟，再次洗涤，将玻片和兔-抗-FITC/HRP(以1/20稀释)孵育。在30分钟后，将玻片洗涤并和Chromogen溶液孵育。在使用水洗涤后，将玻片用核快红复染，洗涤和设置。
试验建立和染色结果示于下表中：
Figure GPA00001109399300421
玻片1为示出探针需要获得信号的对照。
玻片2示出在信号增强溶液中没有交联剂，无法获得特定信号。
玻片3示出向信号增强溶液中加入交联剂(DAB)导致高的信号放大。这仅是chromogen溶液中没有DAB的玻片。
玻片4示出向chromogen溶液中加入交联剂进一步增强了信号(与玻片3相比)。
玻片6示出通过增加信号增强剂(D17134)的浓度，可以在没有交联剂的情况下获得弱的信号。然而，加入交联剂导致该信号更强的放大(如玻片5所示)。

Claims (39)

1.一种在靶位点沉积报道子的方法，所述方法包括在包含报道子和交联剂的介质中孵育靶位点，其中所述靶位点具有过氧化物酶活性，其中所述报道子为可检测分子，以及其中所述交联剂是包含至少两个过氧化物酶的底物部分的分子。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述过氧化物酶活性与所述靶位点中存在的至少一个过氧化物酶部分有关。
3.权利要求2所述的方法，其中所述过氧化物酶选自辣根过氧化物酶(HRP)或大豆过氧化物酶(SP)。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述交联剂为具有下式的分子：
(R1)n-(X)q-R2(m)，
其中
R1和R2为过氧化物酶的底物的部分，
X为连接基团或化学键，以及
m、n和q为1至10的整数。
5.根据权利要求4所述的方法，其中
R1和R2为邻苯二胺的部分，
X为共价键，以及
m、n和q为1。
6.根据权利要求4所述的方法，其中
R1和R2为阿魏酸的部分，
X为具有下式的连接基团：
Figure FPA00001109399200011
其中R3和R4为氨基酸赖氨酸的残基，和
m和n为2至10的整数，
以及q为1至10的整数。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述交联剂在所述介质中的存在量为约10-5至约10-2M。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述报道子为包含骨架聚合物和至少一种可检测物质的分子，其中所述至少一种可检测物质通过化学键或通过连接基团与所述骨架聚合物相连。
9.根据权利要求9所述的方法，其中所述报道子包含至少两种相同或至少两种不同的可检测物质。
10.根据权利要求9或10所述的方法，其中所述可检测物质选自：荧光标记、发光标记、生物发光标记、放射性标记或显色标记、酶、酶的底物、半抗原或特异性结合对的成分。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述报道子是小分子。
12.根据权利要求12所述的方法，其中所述小分子选自：荧光或显色物质、半抗原、特异性结合对的成分或酶的底物。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶位点包含生物标志。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述介质包含过氧化物化合物。
15.一种具有下式的化合物：
(R1)n-(X)q-R2(m)，
其中
R1和R2为过氧化物酶的底物的部分，
X为连接基团，以及
m、n和q为1至10的整数。
16.根据权利要求16所述的化合物，其中
R1和R2为阿魏酸的部分，
X为具有下式的连接基团：
Figure FPA00001109399200021
其中R3和R4为氨基酸赖氨酸的残基，和
m和n为2至10的整数，
以及q为1至10的整数。
17.一种水缓冲化介质，包含：
(i)能够在存在过氧化物酶活性的条件下使至少两种报道分子交联的化合物，其中所述化合物为包含至少两个过氧化物酶的底物部分的分子，并且其中所述两种报道分子为可检测分子，以及
(ii)过氧化物化合物，
所述介质的pH为约4至约9。
18.根据权利要求17所述的介质，其中所述能够在存在过氧化物酶活性的条件下使至少两种报道分子交联的化合物为具有下式的分子：
(R1)n-(X)q-R2(m)，
其中
R1和R2为过氧化物酶的底物的部分，
X为连接基团或化学键，以及
m、n和q为1至10的整数。
19.根据权利要求18所述的介质，其中所述化合物为二氨基联苯胺。
20.根据权利要求18所述的介质，其中所述化合物为权利要求15或16中所限定的化合物。
21.根据权利要求17至20中任一项所述的介质，其中所述介质中所述化合物的量为约10-5至约10-2M。
22.根据权利要求17至21中任一项所述的介质，其中所述介质中所述过氧化物化合物的量为约10-4至约10-2M。
23.根据权利要求22所述的介质，包含0-20％的有机改性剂和0-2M的有机盐或无机盐。
24.根据权利要求23所述的介质，还包含过氧化物酶活性增强剂。
25.根据权利要求23或24所述的介质，还包含铁螯合剂。
26.根据权利要求23、24或25任一项所述的介质，还包含去污剂。
27.根据权利要求17所述的介质，其中所述报道子为包含骨架聚合物和至少一种可检测物质的分子，所述至少一种可检测物质通过化学键或通过连接基团与所述骨架聚合物相连，其中所述至少一种可检测物质选自：荧光标记、发光标记、生物发光标记、放射性标记或显色标记、酶、酶的底物、半抗原或特异性结合对的成分，或其中所述报道分子为选自荧光或显色物质、半抗原、特异性结合对的成分或酶的底物的小分子。
28.一种体外检测生物样品中的生物标志的方法，包括下列步骤：
d)将推测包含生物标志的生物样品与一种或多种探针进行孵育，其中所述一种或多种探针中的至少一种包含辣根过氧化物酶(HRP)的至少一个部分，从而所述生物标志与包含HRP至少一个部分的至少一种探针形成络合物；
e)在包含报道子和交联剂的介质中孵育样品，所述样品含有步骤(a)的所述生物标志与包含HRP至少一个部分的至少一种探针形成的络合物，从而使所述报道子沉积在存在步骤(a)的络合物的位点中；
f)检测(b)的所述沉积的报道子，从而检测所述生物标志。
29.根据权利要求24所述的方法，其中所述生物标志为选自蛋白、核酸、脂质、碳水化合物中的生物分子，或者为包含两种或多种所述生物分子或其衍生物的分子络合物或聚合物，或者为细胞状结构。
30.根据权利要求24所述的方法，其中所述探针为特异性结合对的成分，或为包含特异性结合对的成分的偶联物，其中所述特异性结合对的成分能够与所述生物标志特异性结合。
31.根据权利要求26所述的方法，其中所述探针选自核酸、核酸类似物、肽或蛋白。
32.根据权利要求24所述的方法，其中步骤(b)的所述孵育介质为权利要求18至23中任一项所限定的介质，其中所述介质还包含报道子。
33.根据权利要求24或28所述的方法，其中孵育步骤(b)包括至少如下两个步骤：
(iii)在根据权利要求22或23所述的介质中孵育所述样品；然后
(iv)在包含报道子的根据权利要求22或23所述的介质中孵育所述样品。
34.根据权利要求24、28或29任一项所述的方法，其中所述报道子如权利要求9至13中任一项所限定。
35.根据权利要求29所述的方法，其中所述步骤(i)和(ii)重复进行。
36.根据权利要求24所述的方法，其中步骤(c)包括下列步骤：将所述样品和能够与所述沉积的报道子特异性结合的物质进行孵育。
37.根据权利要求32所述的方法，其中所述物质被可检测地标记。
38.根据前述权利要求24至33中任一项所述的方法，其中所述方法在2至20分钟内进行。
39.根据权利要求24至34中任一项所述的方法，其中所述方法用于生物标志的自动、半自动或人工检测。
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