CN102325895A - 缀合物分子 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及两个或多个基团与一个或多个标记物缀合的化合物，所述基团能够作为具有过氧化物酶活性的酶的底物。使用很多检测和显影此类靶的实验方法，例如免疫组织化学(HIC)，原位杂交(ISH)、ELISA、DNA印迹、RNA印迹和蛋白质印迹等，本发明的缀合物分子可用于检测样品中的靶分子，例如，生物或化学分子，分子结构等。本发明也涉及包含缀合物分子的组合物。标记物与过氧化物酶底物的基团是不同的化学物质并通过接头连接在一起，其中所述接头是含有至少一条直链的化合物，直链有至少30个连续连接的原子，所述直链包含至少两个由至少30个连续连接的原子距离分开的分枝点，缀合物分子中的标记物和过氧化物酶底物基团由至少30个连续连接的原子分开，而两个相邻的过氧化物酶底物基团通过少于30个连续连接的原子相互分离。

Description

缀合物分子
技术领域
本发明涉及两个或多个基团与一个或多个标记缀合的化合物，所述的基团能够充当具有过氧化物酶活性的酶的底物。使用很多用于检测和显影此类靶的实验方法，例如免疫组织化学(IHC)、原位杂交(ISH)、ELISA、DNA印迹、RNA印迹和蛋白质印迹等，本发明的缀合物分子可用于检测样品中的分子靶，例如生物分子或化学分子、分子结构等。本发明也涉及包含缀合物分子的组合物。
背景技术
使用可检测标记物检测样品中的生物或化学靶标是作为许多生物学检测方法，包括医学诊断方法核心的方法。在某些情况下，所述靶标可以是特定的多核苷酸序列或基因、基因突变、基因表达模式，在原位或提取或分离后，在DNA或RNA水平被检测。在其他情况下，该靶可以是肽，蛋白质，抗原，或其他物质，再次在原位或在分离或实验室操作后被检测。所述靶也可以是有机来源的颗粒或残片。
许多标准的检测方法，例如IHC、ISH、ELISA、印迹法等，使用标记方法来检测想要的靶。通常，这些方法包括孵育潜在含有可检测靶的实验样品与探针，随后用可以产生例如颜色、荧光信号或放射性的可检测标记物检测结合剂与靶之间的结合。一个或多个结合剂分子可以与各个靶结合，取决于所采用方法的具体情况。在一些情况下，尤其当靶以低浓度存在时，通过添加一个或多个放大层至该系统放大来自靶-结合剂复合物的信号是必须的。例如，如果结合剂是识别靶的第一抗体，则可以添加识别第一抗体的第二抗体，从而许多个第二抗体与每个第一抗体结合。如果第二抗体与可检测标记物如荧光团或生色团连接，则通过放大作用，样品中的每个靶分子可以有效地与多个荧光团或生色团，而不是仅一个或几个荧光团或生色团结合。因此，该靶会在放大后产生更强的检测信号。
然而，一些检测实验具有产生相对类似弥散信号的倾向，尤其如果允许样品在分析之前停留一段时间。例如，与一个靶结合的一个或多个结合剂和/或可检测标记物可以随时间缓慢地弥散脱离靶或彼此脱离。在一些情况下，影响靶、结合剂和放大层的结合亲和力的缓冲液变化也可以造成信号弥散。许多可检测的标记物通过非共价性相互作用，如蛋白-配体结合作用或多核苷酸杂交，与靶结合。标记后的缓冲液变化可以降低靶、结合剂与可检测标记物之间的亲和力，造成多种组分解离。经历一段时间如几日的简单弥散也可以造成靶、结合剂与可检测标记物之间的解离，使得信号弥散。
与现有可用的检测方法、尤其免疫检测相关的其他问题是时间消耗。处理样品通常至少花费1至3小时，从标记靶至检测该标记物的步骤。
现有技术仅描述了能够克服上述问题的极少技术，但仍只是部分地克服。此类技术的一个例子是在US 5,863,748；5,688,966；5,767,287；5,731,158；5,583,001；5,196,306；6,372,937或6,593,100中描述的催化缀合物沉淀(CARD)法。该方法利用所谓的“分析物依赖性酶活化系统”(ADEAS)来催化可检测标记物沉积到分析平台的固相上。在此分析模式下，由ADEAS所包含的酶与缀合物反应，所述的缀合物包含对该酶特异的可检测标记的底物。当酶和缀合物反应时，形成活化的缀合物，其在针对活化缀合物的特异性受体被固定的位点处共价地沉积。故而，因为缀合物包含标记物，故该缀合物发挥了指示靶在位点存在的缀合物的作用。可以直接或间接地检测酶促沉积的标记物。该方法导致信号放大和改善的检测限。
CARD方法可以在这样的分析模式中使用，其中待检测的靶是固定在固体支持物，例如膜上的受体。这样的分析模式包括夹心免疫测定法和基于膜的核酸杂交测定法。CARD方法也适用于例如通过免疫组织化学法(IHC)检测生物学靶，如US 6,593,100中所述。US 6,593,100中所述的方法利用了辣根过氧化物酶(HRP)与包含HRP底物的标记缀合物在增强物存在下的反应。HRP底物和增强物均是酚的衍生物。一旦与HRP反应，HRP底物被活化并且与样品的受体位点结合，其中所述的受体位点一般由蛋白质的低丰度芳族氨基酸残基代表。
尽管与许多其他目前可用的方法，尤其免疫组织化学检测靶的方法相比较，CARD方法具有检测样品中靶分子相对良好的灵敏度，但是CARD方法没有完全解决其他方法的问题，例如强烈的背景染色、灵敏度仍然不够和耗时，这在染色前未正确处理组织标本或靶标表达低水平的情况下，影响该方法。
近来，已经描述另一种允许检测IHC样品中低丰度靶分子的基于HRP的放大方法(WO2009036760)。该方法不利用DAB作为HRP的生色底物，而利用其作为其他HRP底物的交联剂。根据WO2009036760，DAB介导了HRP介导的其它HRP底物的沉积，其本身不是沉积的DAB，即在所述沉积条件下，没有特征性可见的褐色沉积物形成。其他HRP底物的沉积物是可检测的，原因是它们包含与HRP底物分子结合的可检测标记物，例如可以在沉积步骤后的步骤中检测到它们。该方法提供了沉积的HRP底物的信号的强烈放大，这使该方法的灵敏度与CSA方法可比较，但是与后一种方法相比较，新方法有益地不产生背景标记。在这种新方法的其他优势当中，值得指出的是该检测方法的速度比传统的DAB或生物素-酪氨酰胺检测方法快得多。
发明简述
本发明涉及可以有益地改善对靶分子，尤其包含过氧化物酶活性的靶分子检测的化合物和组合物。尤其，本发明的化合物和组合物改善了通过WO2009036760中所述的方法进行的检测，从而获得了更快、更灵敏和更精确的靶分子检测。
在一个方面，本发明涉及包含水溶性聚合物的水溶性缀合物分子，所述的水溶性聚合物包含至少30个互连原子的直链，其中所述聚合物以至少一个可检测标记物和至少两个能够充当过氧化物酶底物的基团缀合，其中所述至少一个可检测标记物和所述至少两个基团以相应于至少30个互连原子的链间距彼此隔开，其中过氧化物酶底物的任意两个基团之间的距离少于具有30个互连原子的链。
在一个方面，本发明涉及水溶性缀合物分子，其包含
(i)一种或多种可检测物质，
(ii)至少2种物质，每种均能够充当具有过氧化物酶活性的酶的底物，
其中标记物(i)和过氧化物酶底物基团(ii)不是相同的化学物质；
其中
标记物(i)和过氧化物酶底物基团(ii)通过接头连接在一起，其中所述的接头是包含至少一条具有至少30个连续连接原子的直链的化合物，其中所述原子直链含有至少2个以至少30个连续连接原子的间距分开的分枝点；
其中
标记物(i)和过氧化物酶底物基团(ii)在缀合物分子中被至少30个连续连接的原子分隔，并且
其中
2个相邻的过氧化物酶底物基团被少于30个连续互连的原子彼此分开。
在一个实施方式中，能够充当具有过氧化物酶活性的酶底物的基团具有以下通式：
Figure BPA00001423039500031
其中
R1是-H、-O-X、N(X)2或-S-X；
R2是-H、-O-X、-N(X)2或-S-X；
R3是-H、-OH、-NH2或-SH；
R4是-H、-O-X、-N(X)2或-S-X；
R5是-H、-O-X、-N(X)2或-S-X，
R6是-CON(X)2或CO-X，
其中
H是氢；O是氧，S是硫，N是氮，并且X是H、烷基或芳基。
在一个实施方式中，过氧化物酶底物的基团是阿魏酸、肉桂酸、氨基肉桂酸、咖啡酸、芥子酸、或酪氨酸的残基。
在一个实施方式中，能够充当过氧化物酶底物的至少2个基团是酪氨酸残基。
在一个实施方式中，缀合物分子的至少30个连续连接原子的一条直链包含下式的2个重复
其中R1和R2选自NH和O，并且R3选自甲基、乙基、丙基、CH2OCH2和(CH2OCH2)2，以及不多于3个连续重复的乙氧基。
在一个实施方式中，缀合物分子包含2-4个能够充当过氧化物酶底物的基团和1个可检测标记物，其中所述的标记物和基团与包含上式化合物2至10个重复的线型聚合物连接，所述聚合物在聚合链的相向末端处的具有至少2个分枝点，其中所述的基团和所述的标记物在所述的相向分枝点处与该聚合物连接。
在一个实施方式中，缀合物分子包含与至少一个第一线型聚合物和至少一个第二线型聚合物缀合的葡聚糖聚合物，其中所述的至少一个第一聚合物与2至4个能够充当过氧化物酶底物的基团缀合，并且所述的至少一个第二聚合物与一个或多个可检测标记物缀合。在一个实施方式中，第二聚合物包含两个或多个标记物，其中2个相邻标记物之间的分子距离是至少30个连续连接的原子。
在一个实施方式中，可检测标记物是荧光物质或是特异性结合对的成员。
在一个实施方式中，具有过氧化物酶活性的酶是辣根过氧化物酶。
本发明也涉及包含本发明缀合物分子的组合物和用于检测样品中靶或过氧化物酶活性的成套试剂盒。
另外，本发明在一个方面涉及用于检测样品中过氧化物酶活性的方法，包括
I.在水溶液中孵育推测具有过氧化物酶活性的样品，所述水溶液包含：
a)根据权利要求1至10任一项的化合物，
b)3，3’-二氨基联苯胺，和
c)过氧化物化合物，
从而形成化合物沉淀；
II.检测样品中的化合物沉淀，从而检测样品中的过氧化物酶活性。
在一个实施方式中，本发明的方法是用于检测样品中的靶，例如靶分子。在一个实施方式中，辣根过氧化物酶直接或间接地与该靶连接。在一个实施方式中，样品是生物学样品、环境样品或化学样品。在一个实施方式中，样品或/和靶被固定在固相支持物上。
在一个实施方式中，本发明的方法使用本发明缀合物分子的水溶液，该水溶液包含多于5mM过氧化氢和0.25mM到6mM之间的3，3’-二氨基联苯胺，或其中3，3’-二氨基联苯胺的量在1.5mM以上的溶液。
本发明的缀合物化合物在一些实施方式中可互换地称为“缀合物”或报道分子”。
附图简述
图1(1)-(3)是合成本发明示例性缀合物分子的示意图(详见实施例)。
发明详述
缀合物分子
本发明涉及一大组共享以下特征的缀合物分子(可互换地称为“缀合物”)：
1.所述缀合物分子是水溶性分子，其包含两种或多种可以充当过氧化物酶底物、优选HRP底物的物质和一种或多种通过水溶性接头化合物连接在一起的标记物。
2.该缀合物分子中的过氧化物酶底物基团在所述分子的一个部分中是“浓缩的”，这是由于它们以不超过2,5nm的距离彼此分隔，例如在缀合物分子内部以少于30个相互连接的碳原子或杂原子如碳、氮、硫和/或氧，优选以多于5-20个原子的链分隔；
3.可检测标记物与过氧化物酶底物基团相距至少个30连续互连的原子，即相距超过2.5nm，优选地超过3nm；
4.接头优选地包含聚合物，其包含至少一条具有至少30个连续连接原子的直链；优选地，其中2个连续的碳后接一个氧或氮原子；
5.在环境中不存在具有过氧化物酶活性的酶时，所述缀合物不在含有过氧化物化合物和3，3’-二氨基联苯胺(DAB)的水溶液中沉淀；
6.在环境中存在具有过氧化物酶活性的酶时，所述缀合物不在含有过氧化物化合物但不含有3，3’-二氨基联苯胺(DAB)的水溶液中沉淀；
7.在环境中存在具有过氧化物酶活性的酶时，所述缀合物在含有过氧化物化合物和3，3’-二氨基联苯胺(DAB)的水溶液中沉淀；
这些特征在下文详细描述，并且一些具有这些特征的缀合物分子在实施例中示例。
本发明的一个方面涉及水溶性缀合物分子，其包含
(i)一种或多种可检测物质(可互换地称为“标记物”)
(ii)至少2种物质，它们能够充当具有过氧化物酶活性的酶的底物(此类物质称为“过氧化物酶底物”或“过氧化物酶底物基团”)，其中标记物(i)和过氧化物酶底物基团(ii)不是相同的化学物质，
其中
标记物(i)和过氧化物酶底物基团(ii)通过接头连接在一起，其中所述的接头是包含至少一条至少30个连续连接原子的直链的化合物，其中所述直链含有至少2个以至少30个连续连接原子的间距分隔的分枝点；
其中
标记物(i)和过氧化物酶底物基团(ii)在缀合物分子中被至少30个连续互连的原子分隔，并且
其中
2个相邻的过氧化物酶底物基团以少于30个的连续互连的原子彼此分隔。
术语“可检测物质”涉及这样的物质(i)能够产生可检测的发色、荧光、发光或放射性信号，或(ii)是特异性结合对的成员，例如抗体、核酸序列、核序列类似物序列、半抗原、抗原、受体、受体配体、酶等。从而可以检测信号。
在一些实施方案式中，本发明的水溶性缀合物分子可以进一步包含能增强其特征的基团，即作为标记物和/或过氧化物酶底物基团，或增加/减少该分子水溶性。
本发明的缀合物分子可以由下式(I)表示：
(Y)n-(B1)L(B2)-(Z)m，
其中
Y是能够充当具有过氧化物酶活性的酶的底物的基团；
Z是可检测标记物；
L是接头，
B1和B2是分枝点，
其中，n是一个从2至150的整数，并且m是一个从1至150的整数。
在一个优选的实施方式中Y具有下式(II)：
Figure BPA00001423039500061
其中
R1是-H、-O-X、N(X)2或-S-X；
R2是-H、-O-X、-N(X)2或-S-X；
R3是-H、-OH、-NH2或-SH；
R4是-H、-O-X、-N(X)2或-S-X；
R5是-H、-O-X、-N(X)2或-S-X，
R6是-CON(X)2或CO-X，
其中，H是氢；O是氧，S是硫，N是氮，并且X是H、烷基或芳基。
在一个优选的实施方式中，Y是肉桂酸的残基；在另一个优选的实施方式中，Y是阿魏酸的残基。在另一个优选的实施方式中，Y是咖啡酸的残基；在另一个优选的实施方式中，Y是氨基肉桂酸的残基。在另一个优选的实施方式中，Y是芥子酸的残基。在另一个优选的实施方式中，Y是阿魏酸、肉桂酸、咖啡酸、氨基肉桂酸或芥子酸的衍生物。
优选地，式(II)的残基Y通过R6基团与L连接。
在一个优选的实施方式中，所述缀合物可以包含2至4个相同或不同的残基Y。
在一个优选的实施方式中，一个缀合物分子可以包含式(II)的2个Y分子，例如2个阿魏酸残基、或2个肉桂酸残基、或2个氨基肉桂酸残基、或2个咖啡酸残基、或2个芥子酸残基和一个或多个可检测标记物；在另一个实施方式中，该缀合物可以包含式(II)的3个分子，例如3个阿魏酸、肉桂酸、咖啡酸、氨基肉桂酸或芥子酸残基和一个或多个可检测标记物；在另一个实施方式中，该缀合物可以包含式(II)的3或4个分子，例如4个阿魏酸、肉桂酸、咖啡酸、氨基肉桂酸或芥子酸残基和一个或多个可检测标记物。
在一些实施方式中，Y残基的数目可以高于4，例如，如5-10、10-15、15-20、20-50、50-100或100-150个分子。实施例中描述了此类缀合物分子的非限制性工作实例。优选地，此类缀合物包含多于一条的至少30个连续连接原子(例如30-150个原子)的直链，其中2至4个Y残基与每条链在该链的第一分枝点处连接(按照下述模式)，并且几条这样的直链通过这些链的第二分枝点与另一个水溶性聚合物(例如葡聚糖)连接。
在一个优选的实施方式中，一个缀合物分子可以包含两个或多个不同的式(II)分子。
在一个优选的实施方式中，Y可以是氨基酸酪氨酸的残基或其衍生物。一个缀合物可以包含2至4个酪氨酸残基或更多个酪氨酸残基。
根据本发明，2至4个Y残基优选地作为一组定位于缀合物分子中(即包含多于4个Y残基的缀合物包含几组2至4个Y残基，其在该缀合物分子中以某个间距，例如30个或更多连接原子分隔)。优选地，2至4个Y残基通过化合物(间隔)连接在一起，其中所述的化合物提供了2个相邻Y残基之间不长于5-30个，例如5-10、6-12、7-13、8-14、9-15、10-16、11-17、12-18、13-19、20、21、22、23个等互连原子的间距。例如，2-4个Y残基可以与包含2至4个氨基酸，例如赖氨酸残基的肽链连接，其中Y残基与该肽的氨基酸残基的侧链反应基团，例如赖氨酸残基的ε氨基残基连接。2至4个Y残基可以通过其他的短聚合物连接，所述的短聚合物包含很多分枝点，这些分枝点间的距离不超过3-5个原子，优选3个原子，其中Y残基可以与这些聚合物的侧链原子或化学基团连接。Y残基的这种分组定位在本文中称为缀合物分子的“Y-头部”。
在一个优选的实施方式中，Y-头部包含2至4个通过短聚合物，例如PNA或肽连接的Y残基，其中所述的肽优选包含赖氨酸、丝氨酸、谷氨酸或半胱氨酸残基。然而，能与至少2个Y残基和接头L缀合的任意其他短聚合物都可能是合适的。
在一个实施方式中，包含2至4个残基Y的Y-头部与包含下式(III)分子的2个或多个残基的聚合物连接
Figure BPA00001423039500081
其中R1和R2选自NH和O，R3选自甲基、乙基、丙基、CH2OCH2和(CH2OCH2)2，并且其中不超过3个连续重复的乙氧基。所得的缀合物可以进一步与一个可检测标记物(或多于一个可检测标记物，如下文所述)缀合，或它可以与一个水溶性聚合物(其可以与一个或几个这样的缀合物连接)缀合，例如葡萄糖。
本发明缀合物分子中Y残基的紧密间隔影响缀合物的特征(比较于仅包含Y残基或包含在该缀合物分子中不以Y-头部形式“浓缩”，即2个相邻Y残基之间的分子间隔大于上文所讨论距离的几个Y残基的缀合物)，从而在环境中不存在具有过氧化物酶活性的酶时，所述缀合物在含有过氧化物化合物和3，3’-二氨基联苯胺(DAB)的水溶液中是可溶的，但是在环境中存在具有过氧化物酶活性的酶时，其从这样的溶液中迅速且大量地沉淀。
可检测标记物Z可以是能够肉眼检测的任何物质，例如荧光或发光物质，或可以通过使用一些检测手段检测的任意物质，例如放射性标记物、特异性结合对的成员，例如核酸序列、半抗原等。
任何的荧光、发光、生物发光或放射性分子可以用作标记物。它们中许多是市售的，例如荧光染色剂Alexa Fluors(Molecular Probes)和DyLightFluors(Thermo Fisher Scientific)。荧光标记物的其他非限制性实例可以是以下分子：5-(和6)-羧基荧光素、5-或6-羧基荧光素、6-(荧光素)-5-(和6)-酰胺基己酸、荧光素异硫氰酸酯、罗丹明、四甲基罗丹明、Cy2、Cy3、Cy5、AMCA、PerCP、R-藻红蛋白(RPE)、别藻红蛋白(APC)、德克萨斯红、德普林斯顿红、绿色荧光蛋白(GFP)涂敷的CdSe纳米微晶、钌衍生物、鲁米诺、异鲁米诺、吖啶酯、1，2-二氧杂环丁烷和吡啶并哒嗪、氢、碳、硫、碘、钴、硒、氚的放射性同位素或磷光体。
在一些实施方式中，可检测标记物可以是酶。合适酶标记物的非限制性实例可以是碱性磷酸酶(AP)、β-半乳糖苷酶(GAL)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、β-N-乙酰氨基葡糖苷酶、β-葡糖醛酸糖苷酶、转化酶、黄嘌呤氧化酶、萤火虫萤光素酶、葡萄糖氧化酶(GO)。
在其他实施方式中，可检测标记物可以是特异性结合对的成员，例如半抗原。作为合适半抗原的非限制性实例，可以提到2，4-二硝基酚(DNP)、地高辛、荧光素、德克萨斯红、四甲基罗丹明、硝基酪氨酸、乙酰氨基芴、三硝基苯酚汞(mercury trintrophonol)、雌二醇、溴脱氧尿苷、二基氨基萘磺酸酯(dansyl)；作为合适的特异结合对的实例、可以提到生物素、链霉亲和素、互补性天然和非天然的寡核苷酸序列、锌指结合结构域对等。特异性结合对的成员的其他实例在以上部分中讨论。
在一个优选的实施方式中，标记物是半抗原。在另一个优选的实施方式中，标记物是荧光物质。在另一个优选的实施方式中，标记物是特异性结合对的成员。
每个缀合物分子的可检测标记物数目可以变动。在一些实施方式中，可以优选每个缀合物分子1至3个，例如1、2或3个标记物。在一个优选的实施方式中，这种缀合物包含一个可检测标记物。在一个实施方式中，可以优选包含式(II)的2至4个残基Y或2至4个酪氨酸和一个单一标记物的缀合物分子。在一些实施方式中，该缀合物可以包含多于3个标记物，如每个缀合物分子4至150个标记物。
根据本发明，在缀合物分子中，标记物以多于2.5nm的距离与过氧化物酶底物基团，例如与Y-头部分隔，例如被至少30个连续原子，例如60、90或150个连续原子的链分隔。在其中所述缀合物包含一条连接Y-头部和1个(或多个)标记物的原子直链的实施方式中，Y-头部和标记物与该链在位于此链相向末端上的分枝点处连接。
在一些实施方式中，当缀合物包含多于1个标记物时，优选该标记物与接头(即连接一个分子中标记物和过氧化物酶基团的物质)如此缀合，从而在连接标记物的位点之间存在距离，所述的距离对应于具有至少30个连续连接原子(命名为“间隔基团”或“间隔子”)、优选60个连续连接原子或更多，例如90个连续互连原子的链。优选所连接标记物之间的间隔基团是亲水的。多个标记物在缀合物分子中的这种排列在本文中称为“Z-尾”。应当理解，包含多个标记物的Z-尾中最靠近于Y-头部的一个标记物与Y-头部的任意过氧化物酶基团相距至少30个相互连接的原子，即相距至少2.5nm的间距。
优选地，具有至少30个连续原子的间隔子是包含下式(II)分子的两个或多个残基的化合物
Figure BPA00001423039500091
其中R1和R2选自NH和O，R3选自甲基、乙基、丙基、CH2OCH2和(CH2OCH2)2，并且其中不超过3个连续重复的乙氧基。
与上述间隔子连接并且被其分隔的多个标记物可以通过合适接头，例如允许多重连接的水溶性聚合物，例如葡聚糖，与一个Y-头部或几个Y-头部缀合。在一些实施方式中，几个Y-头部可以通过这种聚合物与几个Z-尾缀合。
在一个实施方式中，与一个相同的缀合物分子连接的多个可检测标记物可以是相同的可检测物质，在另一个实施方式中，所述标记物可以是不同的可检测物质。
标记物的Z-尾排列具有以下优势：(1)包含被标记物之间亲水间隔分子分隔的多个疏水标记物的缀合物保持在水溶液中的良好溶解性，和(2)当使用结合剂来检测该缀合物时，所述标记物更易于接近结合剂。
根据本发明，接头L是这样的分子，其包含具有至少30个连续原子，如30-150个原子或更多个原子，例如30、45、60、90、150、300、500个或更多个原子的链。在一个优选的实施方式中，优选地，L包含150个连续原子。在一些实施方式中，接头分子包含其中每2个连接的碳原子后接一个氧或氮原子的原子直链。
在一个优选的实施方式中，L是单一的线型聚合物分子；在一个优选的实施方式中，L是包含几种缀合在一起的不同聚合物的缀合物分子。
在一个优选的实施方式中，所述线型聚合物包含其中2个连续碳原子后接一个选自氧或氮的杂原子的原子链，例如下文所述的接头或聚乙二醇等。
存在众多可以用作接头L的聚合物分子。实例包括聚糖类、如葡聚糖、羧甲基葡聚糖、葡聚糖聚醛、羧甲基葡聚糖内酯、和环糊精；支链淀粉、裂裥菌素、硬葡聚糖、黄原胶、胶凝糖、O-乙氨基半乳甘露聚糖、壳多糖和壳聚糖如6-O-羧甲基壳多糖和N-羧甲基壳聚糖；衍生纤维素如羧甲基纤维素、羧甲基羟乙基纤维素、羟乙基纤维素、6-氨基-6脱氧纤维素和O-乙胺纤维素；羟化淀粉、羟丙基淀粉、羟乙基淀粉、角叉菜聚糖、藻酸盐和琼脂糖；合成性聚糖如蔗聚糖和羧甲基化蔗聚糖；乙烯基聚合物，包括聚(丙烯酸)、聚(丙烯基酰胺)、聚(丙烯酸酯)、聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(马来酸)、聚(马来酸酐)、聚(丙烯酰胺)、聚(乙基-共-乙酸乙烯酯)、聚(甲基丙烯酸)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯醇-共-氯乙酸乙烯酯)、胺化聚(乙烯醇)及其嵌段共聚物；含有聚合物主链的聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇或聚(环氧乙烷-共-环氧丙烷)，所述的聚合物主链包括线型、梳型或高度分支的聚合物和树枝状聚合物，包括分枝的PAMAM-树枝状聚合物)；聚氨基酸，包括聚赖氨酸、聚谷氨酸、聚氨基甲酸酯类、聚(乙烯亚胺)、pluriol；蛋白质，包括白蛋白、免疫球蛋白和病毒样蛋白(VLP)，和多核苷酸、DNA、PNA、LNA、寡核苷酸及寡核苷酸树枝状聚合物构建体；混合型聚合物，即包含聚合物、嵌段共聚物和随机共聚物前述一种或多种例子的聚合物。
可以修饰所选择聚合物的特性以优化性能，例如，可以优化长度或分枝状况。另外，可以化学修饰该聚合物以携带多种取代基。取代基可以进一步被化学保护和/或活化，从而允许聚合物进一步衍生。
在一个优选的实施方式中，接头是葡聚糖或包含葡聚糖的混合型聚合物。
在另一个优选的实施方式中，接头是包含下式(II)分子的两个或多个残基的化合物
Figure BPA00001423039500111
其中R1和R2选自NH和O，R3选自甲基、乙基、丙基、CH2OCH2和(CH2OCH2)2，并且其中不超过3个连续重复的乙氧基。
优选地，接头L包含上式的至少2个残基，其中R1和R2均是NH并且R3是CH2OCH2。优选地，L包含下式(III)的一个或多个单元。
Figure BPA00001423039500112
其中n是从1至10的整数，并且(B)是分枝点。具有该式的L分子及它们的合成在通过引用方式并入本文的WO2007/015168中详细描述。
术语“分枝点”意指聚合物分子中可以连接分枝，例如同一聚合物的侧链或其他分子的一个点。在一个实施方式中，分枝点(B)可以是一个原子，在另一个实施方式中，它可以是分子Y和Z可以借此直接或间接缀合至L的官能团或分子，例如通过Y或Z的官能团(即直接)，或通过小的双功能分子(即间接)，例如氨基酸，比如半胱氨酸、赖氨酸等。
不同化学物质，例如标记物，与聚合物缀合的方法是本领域熟知的并且可以用来产生本发明的缀合物。例如，聚合物可以用乙烯砜活化并且与可检测标记物和式(II)分子混合以形成聚合物缀合物。在其他实施方式中，醛类可以用来活化聚合物，例如葡聚糖，其随后与可检测标记物及式(II)分子混合。又一种制备聚合的缀合物的方法是使用所谓的化学选择性偶联方法以将各组分偶联在一起，例如，分子可以在共价地偶联至巯基修饰的聚合物主链之前用巯基反应性马来酰亚胺基团衍生化。在一些其他的实施方式中，式(I)分子和可检测标记物可以通过接头基团与该聚合物连接。该方法的实施例包括使用同双功能接头基团如戊二醛、二异氰酸己酯、dimethylapimidate、1，5-二氟-2，4-二硝基苯、杂双功能交联剂例如N-gamma-maleimidobytyroloxy succinimide ester、和零长度交联剂如1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺。
在通过引用方式并入本文的WO2007/015168中详细描述了衍生化包含一个或多个L30单元分子的方法。
包含L30重复，如L60(2xL30重复)、L90(3xL30重复)、L150(5xL30重复)的示例性缀合物在实施例中描述并且在图1(3)中显示。
缀合物分子的用途
发明的缀合物分子可以有利地用于样品内过氧化物酶活性的检测。
过氧化物酶，如辣根过氧化物酶，使用本发明的缀合物分子作为底物，在另一种底物3，3’-二氨基联苯胺和一种过氧化物化合物存在下将水溶性缀合物分子转变成不溶于水的。这可以因缀合物沉淀(沉积物)在固体支持物上的形成而观察到，或它可以因清亮溶液浑浊而检测到，其中所述沉淀悬浮于溶液中。在过氧化物酶固定在固体支持物上的情况下，沉积物的形成将定向至这种支持物的包含过氧化物酶活性的部位。可以直接检测固体支持物上的沉积物或溶液中悬浮的沉淀，例如通过肉眼观察，或通过使用检测手段，例如通过检测沉淀缀合物分子的可检测标记物。
样品中存在的过氧化物酶活性本身可以是利用所述缀合物分子方法的检测靶。在一些实施方式中，检测靶可以是本身不具备过氧化物酶活性的目的分子。在这些实施方案式中，靶分子或目标应当首先用过氧化物酶活性标记从而变成根据本发明是可检测的。术语“靶”在本发明语境中的意思在下面部分中讨论。
1.检测的方法
在一个方面，本发明涉及检测样品中过氧化物酶活性的方法，包括
I.在水溶液中孵育推测具有过氧化物酶活性的样品，所述水溶液包含：
d)本发明的缀合物，
a)3，3’-二氨基联苯胺，和
b)过氧化物化合物，
从而形成化合物沉淀；
II.检测样品中的化合物沉淀，从而检测样品中的过氧化物酶活性。
在另一个方面，本发明涉及检测样品中的靶，例如具有过氧化物酶活性的目标物、生物学标记等的方法，其中所述的靶或样品被固定到固体支持物上，其中所述方法包括步骤
a.孵育推测包含靶的样品与一种或多种含有过氧化物酶活性的结合剂，其中所述的一种或多种结合剂能够直接或间接地与靶结合并且形成包含该靶和一种或多种结合剂的复合物，所述结合剂至少之一包含过氧化物酶活性；
b.在水溶液中孵育样品(i)，所述水溶液包含
i.3，3’-二氨基联苯胺，
ii.过氧化物化合物，和
iii.缀合物，
c.检测沉积的缀合物，从而检测到靶。
本发明检测方法的实施方式在下文讨论。
样品
术语“样品”意指大量的材料，其显示该材料的剩余部分是或应当是什么状况，例如生物材料、化学材料、环境材料的样品，例如身体组织样品、食物样品、土壤样品。在一个实施方式中，该样品是生物学样品。
生物学样品可以示例为：
1.包含悬浮细胞和/或细胞残片的样品，例如血样、克隆细胞悬液、身体组织匀浆液等；
2.含有动物身体的完整或受损细胞、体组织、涂片或流体或肿瘤的样品，例如活组织检查样品；它可以是新鲜的组织样品或保存的组织样品，例如福尔马林固定石蜡包埋的组织样品；
3.包含活生物的样品，例如包含动物、植物、细菌、真菌等的培养基的样品；
4.包含病毒颗粒、其残片或病毒产物的样品，例如，包含病毒核酸、蛋白质、肽等的身体涂片；
5.包含细胞器的样品；
6.包含天然或重组生物分子的样品，例如血浆样品、条件细胞培养的培养基等。
化学样品的实例包括但不限于化学化合物文库，例如肽文库的样品。环境样品的实例包括但不限于样品的实例包括但不限于土壤、水或空气样品和食物样品。
在一个实施方式中，样品可以固定到固体支持物上，例如，固定在玻璃或塑料载片上的身体组织样品；固定到硝酸纤维素膜上的包含生物分子的无细胞样品等。术语“固体支持物”意指一片任意固态的水不溶性材料，例如硝酸纤维素膜、玻璃载片等。在一个实施方式中，支持物可以是单分子层厚的膜或是多分子成层的材料片，例如塑料或玻璃。这个实施方式中的靶固定在支持物的表面上。在另一个实施方式中，固体支持物可以三维结构物，例如凝胶块或纤维网。在这个实施方式中，靶固定在该结构物内部。在一个实施方式中，固体支持物是细胞膜，例如胞浆膜。术语“被固定”意指样品或靶在支持物上或其内部是不可移动的或是在极有限程度上可移动。
适合固定样品的支持物的实例包括但不限于合成性聚合物支持物，如聚苯乙烯、聚丙烯、取代的聚苯乙烯，例如，胺化或羧化的聚苯乙烯；聚丙烯酰胺；聚酰胺；聚氯乙烯；玻璃；琼脂糖；硝酸纤维素；尼龙；聚偏二氟乙烯；表面改性尼龙等。本发明涉及在本文中所述条件下呈化学惰性的固体支持物，即选择的支持物不可以对本方法的检测结果产生任何重大影响。因此，可以选择适合固定样品或靶以适于所选择分析模式，例如IHC、ELISA、印迹法等的任意此种惰性支持物。
在一个实施方式中，样品本身可以是固体，例如福尔马林固定的固态组织样品(即不是血样)和/或石蜡包埋的组织样品，例如福尔马林固定的石蜡包埋的实体瘤样品、皮肤、肝脏、乳腺、肺的样品等。在这个实施方式中，样品本身可以算作包含固定靶的固体支持物。
靶
术语“靶”意指可以通过特定物理和功能特征予以表征的目的物(推测存在于样品中)。在本发明的上下文中，术语“靶”涉及存在于该样品中的这种目标物基本上相似实体的全部汇集物，但是不涉及该目标物每个单独的单一单元。术语“基本上相似”在本发明的上下文中意指汇集物的全部实体拥有使它们可识别为靶的特征。例如，在一个实施方式中，该靶可以是样品中存在的蛋白质，包括样品中这种蛋白质的全部分子；在另一个实施方式中，该靶可以是分子复合体或结构，包括样品中全部这种类型的分子复合体或分子结构；在另一个实施方式中，该靶可以是病毒颗粒或细菌，包括样品中所述病毒颗粒或细菌的全部群体。因此，术语“靶”涉及样品中一种特定类型的多个单位。因此，可以理解本文中所述的方法涉及观察分子靶的多个单一单元，即样品中靶分子的全体汇集物，但不观察这种靶单独的单一单元，例如单分子。
在医学诊断领域，生物学目标物如分子、分子复合物、结构、颗粒或器官经常与细胞类型、组织、细胞结构、生理状况等特征性特征相关，并且被命名为“生物学标记”以标识特定疾病的治疗靶标或特征性分子特征。在本发明的一些实施方式中，术语“靶”与术语“生物学标记”可互换地使用并且涉及对于特定细胞类型、组织、生理学状况等是特征性的分子、分子复合物、结构物或颗粒。此类生物学标记的非限制性实例包括但不限于特定的核苷酸序列、蛋白质或其他生物分子，例如碳水化合物或脂类、染色体或膜结构、病毒、细菌、微生物等。
在一个实施方式中，靶是多肽、核酸、碳水化合物、脂质或其衍生物、分子复合物、颗粒、真核或原核细胞或微生物。
在化学样品和环境样品的靶当中可以是不同的污染物、毒素、战争物质、分子文库成员、工业有毒废物等。
靶可以是细胞结构的一部分，例如胞浆膜的蛋白质。在这个实施方式中，靶被固定的细胞结构在本发明语境内可以视为一种类型的固体支持物。
在一个优选的实施方式中，靶是与癌相关的生物学标记，例如相关癌的基因或其产物，例如激素和生长因子及其受体、细胞黏附分子信号转导分子、细胞周期调节分子等的核酸和多肽，例如以下组的基因和蛋白质：PDGF、VEGF、TGF、HGF、FGF或EGF、其受体和信号转导分子、与JAK/STAT途径或Akt1/PKB细胞存活途径或5-FU途径相关的基因及其产物、雌激素受体ER及其基因(ERS1)等。
在一个实施方式中，靶是样品中存在的过氧化物酶。
靶位点
术语“靶位点”在本发明上下文中意指包含靶和过氧化物酶活性的固体支持物位点或固体样品，例如固体组织样品的位点。在一个实施方式中，靶位点可以是包含用过氧化物酶活性标记的靶，例如分子、病毒、微生物等的样品位点或固体支持物位点，即，靶本身不具有过氧化物酶活性，但是所述的活性直接或间接地与该靶相连。过氧化物酶活性可以通过过氧化物酶基团与所述靶的直接缀合作用与该靶相连，“基团”在本发明语境中意指分子的功能部分，例如具有所述过氧化物酶酶促活性的过氧化物酶的一部分。可选地，过氧化物酶活性可以间接地与靶相连，例如通过结合于包含结合剂的过氧化物酶活性的靶。
在一个实施方式中，靶可以是过氧化物酶本身，因而，包含这种酶的固体样品位点或固体支持物位点是本发明的靶位点。
根据本发明，缀合物分子允许这样检测靶，在本发明的条件下，缀合物通过直接或间接产生与其标记物相关的信号来报道该靶分子在环境中的存在。因此，本发明的缀合物分子在一些实施方式中命名为“缀合分子”或缀合物”。
孵育
在一些实施方式中，样品、靶、靶位点、沉积的缀合物可以在不同的介质中孵育。
术语“孵育”意指将样品或靶或者靶与结合剂的复合物在介质中维持一段时间，例如在包含与靶特异性相互作用的特定试剂，例如能够直接或间接地与该靶结合的结合剂等的介质中。时间段可以从10秒变动至3分钟或持续更长的时间段，例如5-10分钟、10-20分钟、20-40分钟、40-60分钟、1-2小时或更长，例如过夜。可以在不同的温度条件下进行孵育，这取决于不同的实施方式，例如待检测的靶分子的类型或用于此检测的结合剂和/或缀合物的类型等。在一些实施方式中，术语“孵育”可以与术语“洗涤”可互换地使用，其中“洗涤”通常使用的条件是样品在缺少特异性结合剂并起到从样品中去除特定试剂作用的介质中孵育。
本发明在大多数实施方式中涉及在10秒至20分钟范围内的孵育时间。
结合剂
术语“结合剂”表示能够直接或间接与靶结合的分子，其中术语“直接地”意指结合剂针对该靶具有亲和力并且能够特异性识别该靶并与之相互作用及结合，其中术语“间接地”意指结合剂不具有针对该靶的特异性亲和力，但是具有对靶结合物质的此种亲和力并且能够与该物质特异性结合。能够直接与靶结合的结合剂在本文中命名为“第一结合剂”。能够间接与靶结合的结合剂在本文中命名为“第二结合剂”。第一结合剂一般用来接触样品。它可以包含与样品中推测存在的靶特异性结合的任意分子。第二结合剂可以是，例如，结合第一结合剂的任意分子。
本发明的检测系统可以包含其他结合剂，例如，第三、第四结合剂等。这些结合剂可以用于识别沉积的缀合物分子所包含的标记物。当想要增强与靶相关的信号时，例如靶在样品中的量相对低的情况下，使用此类结合剂是特别有利的。
本发明的第一、第二和其他结合剂可以是特异性结合对的成员。
众多不同的特异性结合对是本领域已知的，它们是彼此具有相互亲和力并且能够彼此特异性结合的成对的2种不同分子。合适用于实施本发明的特异性结合对的成员可以是免疫型或非免疫型的。
非免疫特异性结合对包括其中彼此特异性结合的组分共享针对彼此的相互亲和力的系统，但是它们不是抗体。示例性非免疫结合对是生物素-抗生物素蛋白或生物素-链霉抗生物素蛋白、叶酸-叶酸结合蛋白、互补性核酸、受体-配体等。本发明也包括彼此形成共价键的非免疫结合对。示例性共价结合对包括硫氢基反应基团如马来酰亚胺和卤代乙酰基衍生物和胺反应基团如异硫氰酸酯、琥珀酰亚胺基酯、磺酰卤和偶合染料如3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙(MBTH)和3-(二甲基-氨基)苯甲酸(DMAB)等。
免疫特异性结合对可以由抗体/抗体系统或半抗原/抗半抗原抗体或抗原/抗体系统示例。在一个实施方式中，免疫特异性结合对可以是包含具有彼此亲和力的两种或多种抗体分子，例如第一抗体和第二抗体对的抗体/抗体结合对，其中第一抗体代表第一结合剂并且第二抗体代表第二结合剂，或是包含3或4种或更多种抗体成员的抗体系统。在其他实施方式中，免疫特异性结合对可以由半抗原/抗半抗原系统代表。例如，第一结合剂可以由包含半抗原的分子例如半抗原标记的第一抗体代表，并且第二结合剂可以由抗半抗原抗体代表。
术语“半抗原”表示一种小分子，其可被视为针对其能够产生抗体的分离表位，虽然如果注射至动物体内，半抗原单独将不诱导免疫应答，它必须与载体(通常是蛋白质)缀合。由于半抗原是小分子，故多个拷贝的半抗原可以接合至一个大分子，例如聚合物分子，如蛋白质、核苷酸序列、葡聚糖等。半抗原可以为这样的分析模式充当便利的标记物分子，其中它对于放大信号是必需或有利的。因此，结合的多个拷贝的半抗原提供了增强的灵敏度，例如增加的信号强度。合适半抗原的非限制性实例包括FITC、DNP、myc、地高辛配基、硝基酪氨酸生物素、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白和针对例如四甲基罗丹明、德克萨斯红、dansyl、Alexa Fluor488、BODIPY FL、荧光黄(Lucifer yellow)和Alexa Fluor 405/Cascade Blue荧光团或在US20080305497中所述那些染料的抗染料抗体。
本文中所用的术语“抗体”表示免疫球蛋白或其部分，并包括含有抗原结合位点的任意多肽，而不论其来源、产生方法和其他特征。该术语包括例如多克隆的、单克隆的、单特异性、多特异性、人源化单链的、嵌合的、合成的、重组的、杂交的、突变的及CDR移植的抗体。抗体的一部分可以包括仍能够结抗原的任意片段，例如Fab、F(ab’)2、Fv、scFv。抗体的来源由基因组序列定义，与产生方法无关。
本文中使用的第一抗体指与样品的靶分子特异性结合的抗体。在某些实施方案中，第一抗体可以聚合化。第一抗体可以获取于任何温血物种，例如哺乳动物、鸟类。
本文中使用的第二抗体指具有抗原结合结构域的抗体，其中所述的抗原结合结构域与第一抗体或沉积在靶位点中的半抗原或直接或间接地同第一抗体或另一种结合剂连接的半抗原特异性结合。
本文中使用的第三抗体指具有抗原结合结构域的抗体，其中所述的抗原结合结构域与第抗体或与第二抗体连接的半抗原或与缀合于第二抗体的聚合物连接的半抗原或沉积在靶位点中的半抗原特异性结合。
有时，抗体可以同时发挥第二和第三抗体的作用。
本发明中所用的抗体，包括第一抗体、第二抗体和第三抗体，可以获取于任何哺乳动物物种，例如大鼠、小鼠、山羊、豚鼠、驴、兔、马、美洲驼、骆驼，或任何禽物种，例如鸡、鸭。如本文中所用，获取于任何哺乳动物物种或禽物种意指编码特定抗体的核酸序列的至少一部分源自特定哺乳动物，例如大鼠、小鼠、山羊或兔，或特定禽类，例如鸡、鸭的基因组序列。抗体可以是任意同种型，例如IgG、IgM、IgA、IgD、IgE，或任意亚型，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。
在某些实施方式中，第一抗体含有可以与由包含生物学样品的细胞表达的生物学标记特异性结合的抗原结合区。该标记可以表达在细胞表面上或在细胞膜内部，即，在细胞的内部，例如，在细胞浆内部、在细胞核内部、在内质网内部。在一些实施方式中，生物学标记从细胞中分泌并且因此在溶液中，例如在细胞培养基中、在血液或血浆中存在。
在某些实施方式中，第二抗体含有与第一抗体，例如，第一抗体的恒定区特异性结合的抗原结合区。在某些实施方式中，第二抗体与聚合物缀合。在一些实施方式中，该聚合物与2-20个第二抗体，例如5-15个第二抗体缀合。在其他实施方式中，该聚合物与1-10个第二抗体，例如2、3、4、5、6、7、8或9个第二抗体缀合。
在某些实施方案中，第三抗体含有与第二抗体，例如，第二抗体的恒定区或与第二抗体连接的半抗原或与第二抗体缀合的聚合物特异性结合的抗原结合区。在某些实施方式中，第三抗体与聚合物缀合。在一些实施方式中，该聚合物与1-20个第三抗体缀合。在其它实施方式中，该聚合物与1-5个第三抗体，例如2、3或4个第三抗体缀合。
可以在本发明的方法和组合物中使用的抗体包括单克隆和多克隆抗体、工程化抗体，包括使用噬菌体展示或可替代技术产生的嵌合、CDR移植和人工选择的抗体。
已经描述了多种用于产生抗体的技术，见，例如Kohler和Milstein，(1975)Nature 256：495；Harlow和Lane，Antibodies：a Laboratory Manual，(1988)(Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY)，所述文献通过引用的方式并入本文。用于制备重组抗体分子的技术在以上参考文献中描述，并且还在例如EP 0623679；EP 0368684；和EP 0436597中描述。可以重组或合成地产生抗体。编码抗体的核酸可以从cDNA文库分离。编码抗体的核酸可以从噬菌体文库分离(见例如McCafferty等人1990，Nature348：552，Kang等人1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：4363；EP 0589 877 B1)。编码抗体的核酸可以通过已知序列的基因改组法获得(Mark等人1992，Bio/Technol.10：779)。编码抗体的核酸可以通过体内重组法分离(Waterhouse等人1993，Nucl.Acid Res.21：2265)。在本发明的方法和组合物中使用的抗体包括人源化免疫球蛋白(美国专利号5,585,089，Jones等人1986，Nature 332：323)。
所述抗体可以是改变的抗体，例如，包含效应蛋白，如毒素或标记物，如可检测物质的抗体。
在本发明的一个实施方式中，抗体由抗体的Fab区代表。
在另一个实施方式中，结合剂可以是非免疫特异性结合对的成员，例如互补性核苷酸序列对，或具有相互亲和力的成对的2种核酸类似物分子。
包含核酸或核酸类似物分子，例如DNA分子、RNA分子、PNA分子的结合剂可以用于，例如核酸靶的检测。
核酸序列可以化学地合成或在细胞中重组地产生(见例如Sambrook等人(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，，第2版Cold SpringHarbor Press)。在一些实施方式中，结合剂包含肽核酸(PNA)。肽核酸是一种核酸分子，其中通常在DNA和RNA中存在的脱氧核糖或核糖主链用肽主链替换。制备PNA的方法是本领域已知的(见例如Nielson，2001，CurrentOpinion in Biotechnology 12：16)(通过引用的方式并入本文)。在其他实施方式中，结合剂包含锁核酸(LNA)(Sorenson等人2003，Chem.Commun.7(17)：2130)。
一些实施方式中，结合剂可以包含在特定严格性条件下与生物学样品中的靶序列特异性杂交的至少一种序列，例如核酸序列，如基因组DNA序列或mRNA序列。如本文中所用，术语“严格条件下杂交”意图描述杂交和洗涤的条件，在所述条件下彼此显著互补的核苷酸序列保持彼此结合。所述条件是这样的，使至少70％、至少80％、至少85-90％互补的序列保持彼此结合。互补性百分数如Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-3402(通过引用的方式并入本文)中所述那样确定。
指定的严格性条件是本领域已知的并且可以在Current Protocols inMolecular Biology，，John Wiley & Sons，Inc.(Ausubel等人1995年编著)，第2、4和6部分(通过引用的方式并入本文)中找到。另外，指定的严格性条件在Sambrook等人(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版Cold Spring Harbor Press，第7、9和11章(通过引用的方式并入本文)中描述。在一些实施方式中，杂交条件是高度严格性条件。高度严格性杂交条件的实例是在4X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中于65-70℃杂交或在4XSSC外加50％甲酰胺中于42-50℃杂交，随后在1X SSC中，于65-70℃洗涤一次或多次。可以理解的是，额外的试剂可以添加至杂交和/或洗涤缓冲液，例如，封闭剂(BSA或鲑精DNA)、去垢剂(SDS)、螯合剂(EDTA)、Ficoll、PVP等。
在一些实施方式中，结合剂可以与样品中的靶序列在中等严格的条件下杂交。本文中使用的中等严格性包括可以由本领域普通技术人员基于，例如DNA的长度轻易确定的条件。示例的条件由Sambrook等人在Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，第1卷，第1.101-104页，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)中(通过引用的方式并入本文)描述，包括使用5X SSC、0.5％SDS、1.0mM EDTA(pH 8.0)的预洗涤液，50％甲酰胺、6X SSC在42℃的杂交条件(或其他的相似杂交液，如Stark溶液，在50％甲酰胺中在42℃)，和60℃、0.5X SSC、0.1％SDS的洗涤条件。
在一些实施方式中，结合剂与样品中的靶序列在低严格条件下杂交。如本文中所用，低严格条件可以包括可以由本领域普通技术人员基于，例如DNA的长度轻易确定的条件。低严格性可以包括，例如，在40℃在含有35％甲酰胺、5x SSC、50mM Tris HCl(pH 7.5)、5mM EDTA、0.1％PVP、0.1％Ficoll、1％BSA和500μg/ml变性鲑精DNA的溶液中预处理DNA 6小时。杂交在相同溶液中实施，伴有以下修改：使用0.02％PVP、0.02％Ficoll、0.2％BSA、100μg/ml鲑精DNA、10％(wt/vol)硫酸葡聚糖和5-20x106CPM结合剂。样品在40℃在杂交混合液中孵育18-20小时，随后在55℃在含有2xSSC、25mM Tris HCl(pH 7.4)、5mM EDTA和0.1％SDS的溶液中洗涤1.5小时。将洗涤液用新鲜的溶液替换并且在60℃孵育额外1.5小时。
本发明的其他实施方式可以涉及作为或可以包括肽序列，例如衍生自不同蛋白质的肽序列，如，不同蛋白质的核酸结合结构域、不同细胞受体和核受体的配体片段及其衍生物的结合剂。此类结合剂的一些实例可以是可以与抗体恒定区结合的补体级联经典途径c1q蛋白；MHC分子，例如，I类MHC和II类MHC和非常规MHC；具有特异性结合伴侣的分子，如参与细胞信号途径的分子，比如具有亮氨酸拉链结构域的分子，例如fos/jun、myc、GCN4；具有SH1或SH2结构域的分子，比如Src或Grb-2；免疫球蛋白受体，例如，Fc受体；嵌合蛋白，即，工程化以联合两个或多个特异性结合伴侣之特征的蛋白质，例如，亮氨酸拉链可以被工程化到抗体的Fc区中，SH2结构域可以被工程化以在抗体的Fc区中表达。在其他实施方式中，可以工程化融合蛋白，其包含抗体的Fc部分和替换的可变区。然而，这仅是出于本发明目的可以用作结合剂物质的非限制性实例的名单。结合剂也可以是可与大生物分子的某些结构单元特异性结合的小分子。
在一个实施方式中，结合剂由抗体衍生物、优选地由抗原结合结构域Fab代表。在一些实施方式中，与至少一个HRP基团缀合的第一和/或第二抗体的Fab区所代表的结合剂可以先于相应的完整抗体结合剂成为优选。此类结合剂是比完整抗体结合剂更紧密的分子，并且这对于靶位点附近实现缀合物的更浓密沉积是有利的。这可能有益于靶检测的精确性。当本发明的方法用于免疫组织化学检测包含细胞的生物学样品中的靶分子、结构物或颗粒时，这可能是特别有利的。当所用的结合剂是与HRP基团缀合的Fab分子或者它们包含Fab区和HRP时，这些样品中靶分子的免疫染色是特别鲜明的。使用HRP缀合的Fab结合剂的另一个优势是这些结合剂在尺寸方面相对小，因而更好地接近生物学样品中隐藏或遮蔽的靶，当使用基于较大抗体的结合剂时，所述隐藏或遮蔽的靶一般难以接近。
由于本发明提供了与靶相关的可检测信号的强烈放大，故与现有技术的方法中常规使用的量相比较，在使用本发明方法的测定法中为检测该靶所用的结合剂的量可以显著地降低，例如100-1000倍降低。
为检测样品中的靶所用的抗体的量很大程度上依赖于抗体、靶或样品。因此，应当在每种具体情况下分别定义这个量，这是本领域技术人员已知的常规流程。然而，当定义时，与大多数现有免疫检测方法所要求的量相比，通过本发明方法检测靶所用的抗体量可以是提高到1000倍。多重放大与靶相关的信号的可能性，即首先在沉积本发明缀合物的步骤中，随后在标记沉积缀合物的步骤中，使得通过本发明方法的检测还更少依赖于第一结合剂的亲和力，即对靶的亲和力，因为即使该结合剂与靶微弱结合，也可以检测到。
可以通过重复沉积步骤和增加靶位点中沉积缀合物的量进一步增加特定信号即靶相关信号的放大。例如，在本发明方法的步骤(ii)中沉积的缀合物可以包含能够被含有过氧化物酶活性的结合剂特异性识别的可检测标记物；可以在包含相同或另一种缀合物分子的沉积介质中再孵育这种样品，从而增加位点相关的沉积物。引人注意地，以这种方式，可以进行高达50轮次的相同靶位点定向缀合物沉积，而无任何显著的非特异性沉积，例如在没有非靶位点的样品区域或固体支持物上。如所提到，待在第二轮次和进一步轮次沉积时沉积的缀合物分子可以是相同的缀合物，即如第一轮次时所使用，或它可以是不同的缀合物分子。这种第二或进一步缀合物分子可以是可产生更强烈信号或包含增加量的可检测标记物的分子；以这种方式，靶位点相关信号是可选地或/和进一步增强的。
因此，该方法也提供了检测方法的灵活性，并且提供对固定到固体支持物上的庞大种类样品中靶的可重复检测。该方法极有利于免疫化学检测有挑战性的样品，比如组织学样品中的靶，因为它提供了对分子靶极鲜明和特异的免疫化学标记并且因此有助于解释和量化样品含量。
过氧化物酶活性
术语“过氧化物酶活性”涉及催化以下形式反应的酶活性：
ROOR′+电子供体(2e-)+2H+→ROH+R′OH
具有过氧化物酶活性的酶在本文中命名为“过氧化物酶”或“具有过氧化物酶活性的酶”。对于许多过氧化物酶，最适底物是过氧化氢，但是其他过氧化物酶在有机氢过氧化物如有机过氧化物的情况下更活跃。电子供体的本质极依赖于该酶的结构，例如辣根过氧化物酶(HRP)/EC 1.11.1.7)可以使用多种有机化合物作为电子供体和受体。HRP具有可接近的活性部位，并且许多化合物可能抵达该反应部位。
过氧化物酶活性可以由直接或间接与结合剂分子连接的过氧化物酶分子或合并有酶活性，例如完整过氧化物酶分子酶活性的51％至99.9％或少于51％的酶片段来代表。
本发明的结合剂可以直接或间接地与一个或多个过氧化物酶基团缀合(术语“基团”在本发明语境中意指过氧化物酶的完整分子，或具有过氧化物酶促活性的所述分子的一部分)。第一结合剂和/或第二结合剂的分子可以与过氧化物酶的一个或几个功能活性基团缀合。在一个实施方式中，至少一个分子的第一结合剂可以与一个或多个过氧化物酶基团缀合；在另一个实施方式中，至少一个分子的第二结合剂可以与一个或多个过氧化物酶基团缀合。第三或其他结合剂的分子也可以与过氧化物酶缀合。术语“直接缀合”意指酶基团通过化学键与结合剂的分子连接。术语“间接缀合”意指过氧化物酶通过连接分子与结合剂的分子连接，其中所述的连接分子与结合剂具有一个化学键并且与过氧化物酶具有另一个化学键。下文讨论连接分子的实施例。缀合酶基团的方法是本领域熟知的。
在一个实施方式中，过氧化物酶的基团是HRP的基团，例如完整HRP分子、具有HRP酶活性的其片段，其也可以是包含拥有酶活性的HRP部分的重组蛋白等。在另一个实施方式中，过氧化物酶可以是大豆过氧化物酶(SP)。
包含具有过氧化物酶活性的酶的结合剂的非限制性实例可以是与全长HRP的一个或多个基团缀合的第一或第二抗体分子或其衍生物，例如Fab，以及与HRP缀合的核酸结合剂。此类结合剂可以直接或间接地与靶结合并且因而形成复合物，所述的复合物各自包含靶和一个或多个结合剂分子，所述结合剂分子包含具有过氧化物酶活性的酶。
在一个实施方式中，结合剂是包含一个或两个或多个直接与该结合剂连接的过氧化物酶基团的缀合物，例如，与一个或多个HRP基团连接的抗体分子。在另一个实施方案中，结合剂是包含两个或多个间接与该结合剂连接的过氧化物酶基团的缀合物，例如其中抗体的一个或多个分子和一个或多个HRP基团与主链聚合物独立连接的缀合物，即，其中具有过氧化物酶活性的酶与结合剂即抗体间接连接的结合剂。每个结合剂分子的HRP数目可以从1变动至10或是甚至更高，例如20-50或是甚至更高。
在一些实施方式中，优选结合剂的小缀合物分子，例如与1个或2至10个过氧化物酶基团，例如HRP缀合的单个抗体分子或其Fab区。这样的结合剂是相对紧密的分子，并且这个特征可以有利于检测隐藏的靶，例如在包含细胞的复杂生物学样品中各个单一靶分子、结构或颗粒。在其他实施方式中，优选包含一个结合剂和数十至数百个酶基团的大缀合物。此类结合剂在例如关注快速靶检测或希望在每个分别的靶位点获得大量沉积物的情况下可能是有利的。
包含过氧化物酶活性的固体支持物位点在本文中命名为“靶位点”。在一个实施方式中，靶位点包含直接固定到固体支持物上或其内部的过氧化物酶活性，例如过氧化物酶的基团。在另一个实施方式中，靶位点包含间接固定到固体支持物上或其内部的过氧化物酶活性，即过氧化物酶基团连接至能够直接或间接与固定到固体支持物上或其内部的靶结合的结合剂。后者是本发明靶位点的非限制性实例。
孵育介质
包含靶的样品可以在不同的孵育介质中孵育。
术语”孵育介质”在本发明语境中意指包含特定化合物的溶液，样品在其中维持某个时间段(在本文中命名为“孵育时间”)，旨在允许溶液的特定化合物与样品之间希望的反应发生。
在孵育介质中维持/孵育样品的时间，即孵育时间，可以根据实施方案从大约3秒变动至大约3分钟、例如约10秒、20秒、30秒、1分钟、2分钟等，例如3-10分钟、10-20分钟、20-40分钟、40-60分钟、1-2小时或更长，例如过夜。在一个实施方式中，孵育时间在检测方法全部步骤中可以具有相同的持续期，即每次孵育可以持续1分钟、2分钟、3分钟、5分钟、10分钟等。在另一个实施方式中，孵育时间从一个步骤至另一个步骤可以变化，例如，在包含结合剂的介质中孵育样品可以持续1分钟，在包含3’，3-二氨基联苯胺(DAB)、缀合物和过氧化物化合物的介质中孵育样品可以持续2分钟，在用于检测缀合物沉积物的介质中孵育样品可以持续5分钟等。
孵育可以在多种温度条件下进行，这取决于靶、结合剂、缀合物等的类型。检测方法主要是温度非依赖性的，然而，如果需要，温度可以用于调节孵育时间的持续期，例如较低的温度可以用来延长孵育时间，并且反之，较高的温度可以用来缩短用于孵育的时间。
根据该方法，包含靶的样品依次与不同物质孵育，其中所述物质溶解于含水介质中。根据每次孵育的目的调节孵育介质的组成。
在本发明方法的步骤(i)中，样品与一种或多种结合剂孵育。因此，在一个方面，本发明涉及包含结合剂的介质，其中所述的结合剂包含能够与靶的单个单位直接或间接结合从而形成靶位点的具有过氧化物酶活性的酶。这种介质在本文中命名为“第一孵育介质”或“靶孵育介质”。
第一孵育介质可以是任何液态介质，优选水介质，其中所选择的结合剂是可溶的并且能够与靶单位结合。基本上，第一孵育介质是一种或多种结合剂的缓冲水溶液，其具有从4至9范围内的pH。在一些实施方式中，第一孵育介质可以包含有机或无机盐。无机盐可以选自例如氯化钠、氯化镁、氯化钾、氯化钙、磷酸钠或硫酸铵。有机盐可以选自例如乙酸钠、乙酸铵或咪唑盐，例如盐酸咪唑，等。
盐在第一孵育介质中的量可以从大约10-3M至饱和，例如从大约20mM至大约200mM，或从大约50mM至大约500mM变动。在一个优选的实施方式中，该介质包含盐的量可以从大约10mM至500mM。在另一个优选的实施方式中，该介质可以无盐。
如所提到，一般地，第一孵育介质的pH值可以从约4变动至约9，如在pH 3.5和pH 9.5之间，例如在pH 5和pH 7之间，在H 5.5和pH 6.5之间p或在pH 6.5和7.5之间，或在pH 7和pH 8之间，或在pH 7.5和pH 8.5或者pH 8和pH9之间。可以使用具有合适缓冲能力的任何缓冲液，例如磷酸盐缓冲盐水(PBS)和咪唑缓冲液。其他的合适缓冲液可以在Good，NE.等人(1966)Hydrogen ion buffers for biological research.Biochem.5(2)，467-477中找到。介质的pH值对结合剂与靶结合可能是重要的；它可以根据结合剂和靶的性质进行优化。
在一些实施方式中，第一孵育介质可以包含有机改性剂(术语“有机改性剂”意指任何非水溶剂)、例如N-甲基吡咯烷酮(NMP)、二甲基亚砜(DMSO)、单乙二醇和二甘醇、环丁砜、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、聚乙二醇(PEG)、丙二醇等。有机改性剂的量可以从约1％变动至约20％(v/v或w/v)，或在一些实施方式中高于20％。
在一些实施方式中，第一孵育介质可以包含去垢剂，例如壬基酚聚氧乙烯醚(NP-40)或表面活性剂(例如选自基于聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯(Tween)的表面活性剂，或基于嵌段共聚物(pluronic等)的表面活性剂等。去垢剂的量可以从约0.001％变动至约5％/v/v或w/v)。
在一些实施方式中，第一孵育介质可以包含结合剂的稳定剂，例如牛血清白蛋白或葡聚糖。稳定剂的量可以从0.01％到20％(w/v)变动。
在一些实施方式中，第一孵育介质可以包含离子螯合剂(例如乙二胺四乙酸(EDTA)或乙二胺羟基苯乙酸型螯合剂(EDHPA)等)。螯合剂的量可以从约10-9M变动至约10-6M。
在一些实施方式中，第一孵育介质可以包含一种或多种用于饱和非特异性结合位点，即不包含靶的固体支持物位点的封闭剂。合适于不同实施方案的封闭剂的一些非限制性实例可以是Denhard溶液、牛血清白蛋白、脱脂乳等。
因为本发明预期涉及众多种类的靶、结合剂和分析模式，故第一孵育介质的组成可以变动并且应当利用本领域知识针对每个具体的实施方案调整。第一孵育介质的一些非限制性实例在实施例中描述。
在一些实施方式中，本发明涉及用于在靶位点处沉积缀合物分子的介质，其中沉积的缀合物充当告知靶在这些位点中存在的缀合物。这种介质在本文中可互换地称为“沉积介质”或“第二孵育介质”。
本发明的沉积介质是液体介质，优选地是含水介质。
在一个实施方式中，沉积介质是具有pH范围从约4至约9的缓冲水介质，包含
(i)缀合物；
(ii)过氧化物化合物，和
(iii)3，3′-二氨基联苯胺(DAB)。
在另一个实施方式中，沉积介质是具有pH范围从约4至约9的缓冲水介质，包含
(i)缀合物和
(ii)过氧化物化合物。
可以使用具有合适缓冲能力的任何缓冲液，例如磷酸盐缓冲盐水(PBS)和咪唑缓冲液。其他的合适缓冲液可以在Good，NE.等人(1966)Hydrogen ion buffers for biological research).Biochem.5(2)，467-477中找到。介质的pH值可能对沉积缀合物是重要的；它可以根据缀合物的性质进行优化。
沉积介质还可以包含有机或无机盐。
无机盐可以选自例如氯化钠、氯化镁、氯化钾、氯化钙、磷酸钠或硫酸铵等。
有机盐可以选自例如乙酸钠、乙酸铵或咪唑盐，例如盐酸咪唑，等。
盐在沉积介质中的量可以是从大约10-3M至饱和，例如从大约20mM至大约200mM，或从大约50mM至大约500mM。在一个优选的实施方式中，该介质可以包含盐的量从大约10mM至500mM。在另一个优选的实施方式中，该介质可以无盐。
在不同的实施方式中，沉积介质还进一步包含：
(i)有机改性剂，和/或
(ii)酶增强物，和/或
(iii)离子螯合剂，和/或
(iv)去垢剂，和/或
(v)抗微生物剂。
有机改性剂可以在该介质中以约1％至约20％(v/v或w/v)的量存在，然而在一些实施方式中，可能需要更高浓度的有机改性剂。有机改性剂可以是例如聚乙二醇(PEG)。其他实例包括但不限于选自基本上由C1-C4(即低级)醇、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、二甲基亚砜(DMSO)、单乙二醇和二甘醇、环丁砜、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)组成的组中的有机改性剂。在一些实施方式中，使用聚乙二醇(PEG)，例如PEG2000或丙二醇可能是有利的。在这些情况下，聚乙二醇在该介质中的量可以从约0.1％(v/v)变动至约20％(v/v)，例如从约1％(v/v)至约15％，如5-10％(v/v)。
术语“酶增强物”意指增强过氧化物酶催化活性的任何化合物。此类酶增强物可以选自基本上由苯基硼酸衍生物和二价金属离子如镍或钙组成的组。酶增强物的量可以从约10-7M变动至约10-3M。
离子螯合剂可以是乙二胺四乙酸(EDTA)或乙二胺羟基苯乙酸型螯合剂(EDHPA)。离子螯合剂的浓度可以从约10-9M变动至约10-6M。
去垢剂可以选自壬基酚聚氧乙烯醚(NP-40)、选自基于聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯(Tween)的表面活性剂或基于嵌段共聚物(pluronic等)的表面活性剂中的表面活性剂。去垢剂的浓度可以从约0.001％变动至约5％。
根据本发明，沉积介质是稳定的溶液。术语“稳定的”在本发明语境中意指该介质充当过氧化物酶介导缀合物沉积的反应介质的能力在大部分时间段期间保持基本上不变；例如使用前该介质可以在室温被制备和保存至少4小时。沉积介质也可以制备并保存更长的时间段。为延长该介质的保质期，可能有用的是在20℃以下的温度，例如在4-10℃储藏该介质，和/或添加抗微生物化合物至该介质。抗微生物化合物可以是通常用于此目的的任何抗微生物化合物，例如叠氮钠、ProclinTM或Bronidox
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缀合物在该介质中的浓度可以从约10-10M变动至约10-2M，这取决于缀合物的性质。例如当缀合物是有放射性的、酶或特异性结合对的成员时，从约10-10M至约10-6M；例如当缀合物是有荧光的或特异性结合对的成员时，从约10-9M至约10-5M；例如当缀合物是生色原时，从约10-5M至约10-2M。
本发明的介质包含过氧化物化合物。过氧化物化合物可以选自有机过氧化物如叔丁基过氧化物、二叔丁基过氧化物、过乙酸，或它可以是过氧化氢的加合物，如过氧化氢脲加合物。在一些实施方式中，过氧化氢(H2O2)是优选的过氧化物化合物。在不同实施方式中，H2O2在该介质中的量可以从1.5mM变动至150mM，例如从约6mM至约100mM，从约5mM至约50mM，从约10mM至约15mM等。
在一个优选的实施方式中，H2O2在沉积介质中的量多于5mM，例如从5.1mM至65mM，如在5.2mM和55mM之间，如从5.3mM至45mM，如在5.4mM和35mM之间，如从5.5mM至25mM，如从5.6mM至15mM。
DAB在沉积介质中的量可以根据H2O2在沉积介质中的量变动。在一些实施方案中，DAB可以在沉积介质中以小于1mM，例如0.25mM和0.85mM之间的量存在，条件是H2O2在该沉积介质中的量高于5.5mM，例如从5.6mM至56mM。
优选地，DAB在沉积介质中的量多于1.4mM，例如在1.5mM和6mM之间。这个量的DAB导致缀合物分子从包含其最宽浓度范围，即从1.5mM至159mM的H2O2的沉积介质中特异且大量地沉积。从3mM至6mM的DAB量引起缀合物分子最特异且最大量地沉积，这确保对缀合物沉积物最终染色的鲜明性和强度，例如在免疫组织化学检测中。然而，也可以使用范围从1.5mM至3mM的DAB量，这个量比范围从3mM至6mM的量提供了更模糊但仍旧强烈的信号，这可以在一些实施方式中有利地用于低丰度靶的检测中。在这样的实施方式中，为增加具有沉积缀合物的靶位点的饱和，与较高的DAB量下1分钟孵育相比，可以延长样品在沉积介质中的孵育时间，例如至3-5分钟。然而，如所提到，靶的最终染色的鲜明性会显著降低。
可以直接检测沉积的缀合物，例如通过观察颜色或从靶位点发射的荧光，或可以通过使用检测介质间接地检测沉积物。因此，在一个方面，本发明涉及作为下述介质的检测介质，在所述介质中孵育包含沉积缀合物的样品，旨在检测该沉积缀合物的可检测标记物。
检测介质可以是任意介质，其允许检测和/或观察样品中缀合物沉积物的标记物，尤其不能直接看到的标记物，例如通过显微镜观察，比如作为特异性结合对的成员的标记物。此类缀合物沉积物的可视化可以在沉积后使用一个或多个步骤进行，其中第一步骤可以包括将(包含沉积缀合物的)样品与能够同沉积物的可检测标记物特异性结合的试剂，例如与(上文所述的)第三或其他结合剂孵育。
对缀合物检测介质的组成的要求与靶检测介质相同：所选择的结合剂应当可溶于该介质中并且能够与沉积的缀合物/靶结合。因此，检测缀合物的孵育介质可以具有与上文描述了其实施方式的靶孵育介质相同或相似的组成。一般地，它是缓冲的水溶液，其包含能够结合沉积缀合物的可检测标记物的结合剂和上文所讨论的一种或多种成分。
在一个实施方式中，检测介质是用于缀合物沉积物可视化的介质，例如酶底物溶液或显色溶液。这种类型的检测介质可以是按照本领域的教导，针对每种具体实施方式(即与沉积物缔合的可检测标记物的性质)选择的本领域已知的任何适用介质。
本发明也涉及洗涤介质，例如所述方法的步骤(i)和(ii)之间、步骤(ii)和步骤(iii)之间的洗涤介质。通常，洗涤介质会是这样的介质，其与在洗涤步骤之前的步骤中已经用于孵育样品的介质具有相同相似的组成，其中所述的洗涤介质缺少活性成分，即孵育步骤的特定试剂，例如结合剂、缀合物分子等。
在一个实施方式中，本发明涉及用于猝灭内源过氧化物酶活性的介质。这种类型的介质可以是本领域常规使用的适于此目的的任何介质。
组合物
在一个实施方式中，本发明涉及包含本发明缀合物分子的组合物。应当理解术语”包含本发明缀合物分子的组合物”也包括了包含本发明缀合物分子合成的中间体的组合物，例如实施例表1中所提到的那些。
在一个实施方式中，该组合物是包含本发明缀合物分子的水溶液。包含本发明缀合物分子的水溶液的非限制性实例可以是上文所述的实施例中的介质。
在一个实施方式中，包含本发明缀合物的组合物是本发明的成套试剂盒的一部分。
成套试剂盒
本发明的组分试剂盒是用于检测样品中靶的成套试剂盒。
因为本发明的方法适于在多样分析模式下检测多种样品中庞大种类的靶，故本发明的成套试剂盒可以包含许多不同的物品，然而本发明的全部成套试剂盒均包含了含有本发明缀合物分子的组合物。以下是本发明成套试剂盒的一些非限制示例性实施方式。
在一个实施方式中，该成套试剂盒可以包含：
(i)包含如上文所定义的任意缀合物的组合物；和
(ii)一种或多种能够直接或间接与靶结合的结合剂，其中结合剂可以是本文中描述的任何结合剂。
在另一个实施方式中，该成套试剂盒可以包含：
(i)上文所定义的任意缀合物；和
(ii)包含DAB的水组合物。
在另一个实施方式中，该成套试剂盒可以包含：
(i)缀合物或包含缀合物的组合物；可选地
(ii)包含DAB的水组合物；
(iii)能够与该缀合物的可检测标记物特异性结合的结合剂。
在另一个实施方式中，该成套试剂盒可以包含：
(i)以上实施方式的任意物品或全部物品；
(ii)用于可视化缀合物沉积物的物质。
上文详细描述了合适的结合剂。尤其，在一个实施方式中，该结合剂是或包含氨基酸序列、核酸序列或核酸类似物序列。
尤其在一个实施方式中，本发明成套试剂盒的结合剂可以是或可以包含抗体或其衍生物。在一个实施方式中，抗体结合剂可以是或可以包含抗体的F(ab)’1片段。F(ab)’1可以在一个实施方时中是小鼠抗体的，在另一个实施方式中，它可以是兔抗体的，在另一个实施方式中，它可以是猪抗体的或山羊抗体的。提到的抗体种类仅是用作本发明结合剂的合适抗体的非限制性实例。在一个实施方式中，该抗体用一种酶基团，或上文所述的任意可检测标记物标记，例如半抗原。该结合剂可以包含辣根过氧化物酶(HRP)或大豆过氧化物酶(SP)的至少一个基团。在一个实施方式中，该结合剂包含HRP或SP的2个基团。
在另一个实施方式中，该结合剂可以是或可以包含标记的或未标记的核酸序列或核酸类似物序列。
用于可视化缀合物沉积物的手段是适于可视化与沉积的缀合物缔合的特定可检测标记物的任何手段。用于可视化缀合物沉积物的手段的实施方式括用于酶促标记靶的试剂，例如酶，比如HRP或碱性磷酸酶、其底物和底物溶液，用于增强与缀合物的标记物相关的信号的手段，例如非本文中所述的放大溶液。
分析模式
本发明的方法可以在众多的分析模式下进行。下文描述这些分析模式的一些非限制性实施方式。
可以使用上述方法以任意合适的分析模式，例如以流式细胞术(FC)、或ELISA、或免疫组织化学(IHC)或原位杂交(ISH)方式检测细胞悬液中的细胞所包含的靶分子。
在一个实施方式中，生物样品可以是细胞悬液。悬液中细胞的靶分子或结构可以使用FC、ELISA、IHC或ISH检测。当ELISA、IHC或ISH用于检测时，细胞悬液会与固体支持物，例如ELISA平板或ICH载片结合。
在另一个实施方式中，生物样品可以是体组织切片。此类样品的细胞的靶分子或结构一般会使用IHC或ISH检测。
IHC和ISH分析模式通常要求一系列在组织切片上实施的处理步骤，从而通过选择性染色法突显疾病状态的某些形态学指示物或检测生物学标记，其中所述的组织切片封装在用于显微镜检查或产生显微照的合适的固体支持物上，例如，玻璃载片或其他平面支持物。这样，例如在IHC中，样品从个体取得、固定并且暴露于特异性结合目的生物学标记的抗体。样品处理步骤以包括，例如，抗原修复、暴露于第一抗体、洗涤、暴露于第二抗体(可选地与HRP基团偶联)，洗涤和暴露于同一个或多个HRP基团连接的第三抗体。洗涤步骤可以任何适宜适的缓冲液或溶剂进行，例如磷酸盐缓冲盐水(PBS)、Tris缓冲盐水(TBS)、蒸馏水。洗涤缓冲液可选地含有去垢剂，例如，Tween 20。
如上文提到，通常存在两类组织学样品：(1)包含新鲜组织和/或细胞的制备物，其通常不用基于醛的固定剂固定，和(2)固定并包埋的组织标本，经常是归档材料。
以IHC分析模式进行靶的检测之前，将进行检测前流程。它可以包括步骤：切割和裁切组织、固定、脱水、石蜡浸润、以簿切片方式切割、封装在玻璃载片上、烘烤、脱蜡、再水化、抗原修复、封闭步骤、施加第一抗体、洗涤、施加第二抗体-酶缀合物和洗涤。
在ISH中，样品从个体取得、固定并且暴露于以互补碱基配对性质与目的核酸杂交的核酸结合剂。生物学样品一般包含可检测的核酸，如DNA和RNA，包括信使RNA。对DNA/RNA水平的检测可以指示特定基因表达的水平，因而可以用来检测细胞、组织、器官或生物的状况，例如疾病状况。样品中的核酸一般被变性以暴露结合位点。结合剂一般是双链或单链核酸，如DNA或RNA，或核酸类似物如PNA。随后评估通过此类技术检测的相关靶蛋白质或核酸的量以确定它是否高于某个预定的最小阈值或与已知标准比较，从而是诊断相关的。如果需要，可以随后为该个体计划合适的疗法。
固定和包埋组织标本的许多方法是已知的，例如，醇固定法和福尔马林固定及后续石蜡包埋法(FFPE)。
需要固定剂以可重复和生活样方式保存细胞和组织。为实现这个目的，将组织块、切片或涂片浸泡在固定液中，或在涂片的情况下，将其干燥。固定剂使细胞和组织稳定，从而保护它们免遭处理和染色技术的苛刻作用。
可以使用任何适宜的固定剂，例如，乙醇、乙酸、苦味酸、2-丙醇、二水合四盐酸3，3′-二氨基联苯胺、3-羟基丁酮(单体混合物)和二聚体、丙烯醛、巴豆醛(顺式+反式)、甲醛、戊二醛、乙二醛、重铬酸钾、高锰酸钾、四氧化锇、多聚甲醛、氯化汞、甲苯-2，4-二异氰酸酯、三氯乙酸、钨酸。其他实例包括福尔马林(含水的甲醛)和中性缓冲的福尔马林(NBF)、戊二醛、丙烯醛、碳二亚胺、亚胺类、苯醌、锇酸和四氧化锇。
新鲜的活组织检查标本、细胞学制备物(包括触片制备物和血液涂片)、冰冻切片和用于免疫组织化学分析的组织通常在有机溶剂中固定，所述有机溶剂包括乙醇、乙酸、甲醇和/或丙酮。
为促进固定组织中的特异性识别经常需要修复或暴露靶，即，感兴趣的生物学标记，其是通过标本预处理而增加大部分靶的反应性。这个过程称作“抗原修复”、“靶修复”或“表位修复”、“靶暴露”或“抗原暴露”。可以在Shi等人1997，J Histochem Cytochem，45(3)：327中找到抗原修复(抗原揭露)的多方面综述。
抗原修复包括多种方法，通过所述方法使靶与特定检测试剂相互作用的有效性最大化的。最常见的技术是在适宜缓冲液中采用蛋白水解酶，例如蛋白酶、链霉蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶或神经氨酸酶的酶消化法，或使用微波照射、于适宜pH稳定化的缓冲液在水浴、蒸气发生器、常规烤炉、高压锅或加压蒸煮器中加热的热诱导表位修复法(HIER)，所述缓冲液通常含有EDTA、EGTA、Tris-HCl、柠檬酸盐、脲、甘氨酸-HCl或硼酸。去垢剂可以添加至HIER缓冲液以增加表位修复或添加至稀释介质和/或淋洗缓冲液以降低非特异性结合。
抗原修复缓冲液最经常是含水的，但也可以含有其他溶剂，包括沸点高于水的溶剂。这允许在正常压力下高于100℃处理组织。
另外，可以通过不同的物理方法增加信噪比，包括施加真空和超声波或在试剂孵育之前或期间冰冻和融化切片。
作为检测方法中的一个步骤，可以除去内源生物素结合位点或内源酶活性(例如磷酸酶、过氧化氢酶或过氧化物酶)，例如，可以通过用过氧化物处理除去内源生物素和过氧化物酶活性。可以通过用左旋咪唑处理除去内源磷酸酶活性。可以通过加热法破坏内源磷酸酶和酯酶。
可以使用惰性蛋白质如马血清白蛋白(HSA)、酪蛋白、牛血清白蛋白(BSA)、和卵白蛋白、胎牛血清或其他血清、或去垢剂如Tween20、TritonX-100、皂苷、Brij或Pluronics封闭非特异性结合位点。也可以使用未标记的和靶非特异性形式的专用试剂封闭组织或细胞中的非特异性结合位点。
使用自由漂浮技术，也可以制备样品并检测靶分子。在这种方法中，使组织切片与悬浮液或在适宜容器，例如微量离心管中自由漂浮的不同试剂和洗涤缓冲液接触。
使用例如“鱼钩样”装置、铲或玻璃环，组织切片可以在染色过程中在具有不同试剂和缓冲液的管之间转移。也可以通过柔和倾析或真空抽吸更换不同的试剂和缓冲液。可选地，可以排空带有组织切片的容器至专用染色网中，如Corning“Netwells”(Corning，)，并且在转移组织切片返回管中用于下一个染色步骤之前洗涤组织切片。
全部步骤，包括例如固定、抗原修复、洗涤、与封闭试剂、免疫特异性试剂孵育和过氧化物酶介导的缀合物沉积，均在组织切片正在自由悬浮或保留在网上时进行。在缀合物沉积后，在载片上封装组织切片，检测缀合物并且在分析之前，例如通过光学显微镜或荧光显微镜分析之前，用盖玻片覆盖载片。
在一些实施方式中，按照本方法的步骤，与免疫特异性试剂关键孵育之后，组织切片可以在载片封装。随后在载片封装的组织切片上实施检测的其余过程。
本方法可检测的生物学标记可以是样品中优选生物学样品中存在的任意分子或结构，例如蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、磷蛋白、甲基化蛋白、或蛋白质片段，例如肽或核酸，例如，DNA，RNA，或脂质、糖脂或糖、多糖或淀粉。生物学标记可以表达在生物学样品的表面上，例如是膜结合的。该标记可以包含在生物学样品的内部，即，细胞膜内部，例如，细胞浆内部、细胞核内部、细胞内小室或细胞器内部。生物学标记可以是细胞结构，如膜微域、离子通道、染色体结构等，或它可以是分子复合物，例如RNA-蛋白质复合物等。生物学标记优选地是特异性生物学标记，例如它是正常或病理状况的标志，或它是特殊细胞或组织特异性的或是特定生物物种特异性的。对此类生物学标记的检测可以用于病理状况的诊断与治疗。
本发明的方法可以用于检测样品中的一种或多种靶，例如生物学样品中的一种或多种生物学标记。因此，本发明也提供了诊断和治疗关联性的数据获取，例如关于存在诊断关联性的蛋白质标记和基因标记的信息。作为实例，但不作为限制，可以在癌诊断测分析，例如乳腺癌分析中同时筛查HER2蛋白和HER2基因。另一个非限制性实例可以包括筛查3个标记，例如，以检测宫颈癌。所述标记可以包括Ki67/mib-1，以及细胞增殖标记，p16(INK4a)，连同人乳头瘤病毒的标记，例如蛋白质或核酸。再一个非限制性实例包括筛查与前列腺癌相关的多种标记。这些标记可以包括AMACR P504S、高分子量细胞角蛋白(HMW-CK)和p63。筛选这种标记组合提供了区分良性前列腺肿瘤与恶性前列腺肿瘤的方法。
希望最小化结合剂之间的交叉反应性，例如在检测多种标记的情况下。这可以通过例如在检测方法中使用不同的结合剂和不同的缀合物分子实现。检测2种不同生物学标记的系统可以包括以下步骤：
a)使用对第一生物学标记特异的第一结合剂和包含第一可检测标记物的第一缀合物进行步骤(i)和(ii)；
b)使用对第二生物学标记特异的第二结合剂和包含第二可检测标记物的第二缀合物进行步骤(i)和(ii)；
c)检测沉积的第一缀合物，从而检测到第一生物学标记；
d)检测沉积的第二缀合物，从而检测到第二生物学标记。
在一个实施方式中，本发明方法的每个步骤(包括每个洗涤步骤)可以执行相同的孵育时间，例如每个步骤30秒、每个步骤1分钟、每个步骤2分钟、每个步骤3分钟、每个步骤4分钟等。在另一个实施方式中，进行每个步骤所用的时间间隔可以变动。本方法的全部步骤(从(i)至(iii)，包括洗涤步骤)可以在2-20分钟内完成。这种快速检测可以有利地用于靶生物学标记的自动化或半自动化检测。在一个实施方式中，本方法用于手工、自动化或半自动化检测。
自动化染色装置可以在本发明的不同实施方案中使用，例如用于多种生物学标记的检测。多种标记的检测经常要求平衡从不同可检测标记物发出的信号。自动化方法可以包括放大从靶生物学标记发射的信号的多个步骤。当欲检测多种标记时，这是特别有利的。自动化染色装置是本领域已知的并且可以调整所述方法用于这些装置。
本方法可以在宽的温度范围内进行，例如从+4℃至+60℃的区间，比如从+10℃至+40℃，如室温。
实施例
1.缀合物
缩写
MBHA 4-甲基二苯甲基胺
NMP N-甲基吡咯烷酮
HATU 2-(1h-7-氮杂苯并三唑-1-基)-1，1，3.3-四甲基脲六氟磷酸盐；甲烷鎓(methenamminium)
DIPEA二异丙基乙胺
DCM二氯甲烷
TFA三氟乙酸
TFMSA三氟甲磺酸
Fer阿魏酸
Flu荧光素
Tyr酪氨酸
Lys赖氨酸
Dex葡聚糖
HPLC高效液相色谱
equi.当量
L30 1，10，16，25-四氮杂-4，7，13，19，22，28-六氧杂-11，15，26，30-四氧代-三十烷L60、L90、L120、L150-式(L30)q的聚合物，其中q是2、3、4或5
CIZ 2-氯代Z＝2氯代苄氧羰基
FITC荧光素异硫氰酸酯
HRP辣根过氧化物酶
PNA-X不同取代基与中心氮偶联的PNA主链(N-(2-氨乙基)-甘氨酸)
A腺嘌呤-9-乙酸
C胞嘧啶-1-乙酸
D.2，6-二氨基嘌呤-9-乙酸
G鸟嘌呤-9-乙酸
Gs 6-硫鸟嘌呤-9-乙酸
P 2-嘧啶酮-1-乙酸
T胸腺嘧啶-1-乙酸
Us 2-硫尿嘧啶-1-乙酸
Dpr 2，3-二氨基丙酸，
Caf咖啡酸
Sin芥子酸
DNP二硝基苯基
Acin 4-氨基-肉桂酸，
Phe苯丙氨酸，
Tyr酪氨酸，
Trp色氨酸，
Lys赖氨酸，
Cys半胱氨酸，
betaalaβ-丙氨酸，N，N-二乙酸
缀合物
表1：缀合物分子、合成它们的中间产物和对照结构体
Figure BPA00001423039500321
Figure BPA00001423039500331
Figure BPA00001423039500351
本表的不同缀合物和中间体根据其合成方法，大致以复杂性递增的顺序在列3中分类。
1.仅固相化学。
2.固相，随后1个溶液相步骤。
3.固相，随后2个溶液相步骤。
4.固相，随后2个溶液相步骤。
5.固相，随后4个溶液相步骤。
6.偶联于氨基和β氢化丙氨酸中间体之间的溶液相。
7.具有1个取代基葡聚糖缀合物。
8.具有2个取代基葡聚糖缀合物。
1.该组包括从三荧光素标记的4种天然碱基和另外4种非天然碱基的PNA-五聚体制备的8种缀合物。(D18007-D18014)。存在4种带有5-6个酪氨酸和3个荧光素的酪氨酸缀合物，D18044、D18049、D18137和D18138，具有替代荧光素标记物的3个DNP。D18128和D18132各自具有5个酪氨酸和3个荧光素，因而它们是潜在的缀合物，尽管它们还包括用于进一步葡聚糖偶联的N端半胱氨酸残基，其使它们归入“中间体”组中。中间体进一步包括重要的半胱氨酸(D17127)和β丙氨酸(D17126)三荧光素接头，以及带有7个酪氨酸(D18084)或3个荧光素(D18085)的二氨基丙酸接头。最后，也仅通过固相合成制备了用作对照的二荧光素小接头(D17161)。全部这些化合物背后的合成策略是简单的：Boc-保护的单体是市售的或已经自行制备，所述缀合物和中间体通过直链固相合成法制备，随后通过6∶2∶1∶1的TFMSA∶TFA∶间甲酚∶茴香硫醚的混合物从树脂切下。为了最好结果，随后使用全部单体的双重偶联法。在固相上Fmoc脱保护之后，将荧光素导入赖氨酸侧链(和N-端，D17161)上。HATU活化的羧基荧光素(混合的异构体)用于荧光素标记(0.2M在NMP中，持续3x20分钟)。DNP标记用2，4-二硝基氟苯(0.5M在含有DIPEA的NMP中，持续2x10分钟)实现。
2.该组包括在固相合成携带游离N端氨基和游离赖氨酸侧链氨基的中间体后，在溶液相中用肉桂酸衍生物标记的庞大数目的缀合物。α-N-Boc-(ε-N-2-Cl-Z)-赖氨酸用来导入赖氨酸残基，从而从树脂切下后产生游离ε-N-氨基。溶液相标记基本上是固相技术的延续，其利用相对高分子量的中间体可以从TFA或NMP溶液中用二乙醚几乎定量沉淀的事实。
3.从合成观点看，该组中间体代表仍较高程度的复杂性。固相合成和溶液相标记如1和2中那样进行，随后是溶液相Fmoc脱保护的额外步骤。通过将Boc-L30接头与Boc-2ClZ和Boc-Fmoc-赖氨酸联合，获得具有受保护(Fmoc)赖氨酸侧链和游离N-端及其他赖氨酸侧链游离氨基(来自树脂剪切期间的N端Boc和2-ClZ赖氨酸残基)组合的中间体。这些中间体可以如2中那样在溶液中用阿魏酸标记。然而，在采用乙二胺的清洗步骤之前，以5％乙醇胺额外清洗5分钟的步骤被采用。在借助乙二胺的Fmoc脱保护之前，这个额外的清洗步骤失活氨基反应性种类。没有这个额外步骤的情况下，乙二胺脱保护Fmoc基团快于它失活HATU活化的阿魏酸，从而Fmoc“保护的”氨基会用阿魏酸标记。带有游离氨基的这个组包含D17120(6个阿魏酸)、D17093(5个与PNA主链连接的阿魏酸)、D17138(在阿魏酸之间的L90-接头)、D17139(处于3个密切对中的6个阿魏酸)，D17104(在阿魏酸之间的甘氨酸间隔物)、D17192(具有替代阿魏酸的6个7-羟香豆素)、D18019(最近的阿魏酸和游离氨基之间的延长L270接头)、D18080(伴有L90间隔的3个游离氨基)。
4.从具有6个阿魏酸和3个游离氨基的中间体D18080中，通过进一步溶液相标记制备了2种缀合物。具有3个德克萨斯红-X的D18081和具有3个7-羟香豆素的D18096。这说明了在溶液中如何用2种不同的取代基标记缀合物。其优势是中间体D18080可以在最终标记前纯化，这是使用不稳定或昂贵标记物如德克萨斯红时的优势。
5.D17152的合成说明了固相合成化学的范围，其可以用于溶液中的接头，随后通过二乙醚反复沉淀以除去低分子量反应物和溶剂。在固相上制备NH2-Lys(NH2)-(L30-Lys(NH2))4-L30-Lys(Fmoc)并将其从树脂切下。Boc-L30接头随后在溶液中与6个游离氨基偶联。将该中间体沉淀并且溶解于TFA内的5％间甲酚中两次。随后，阿魏酸标记如2中那样在现在L30延伸的氨基上进行，然后如3中那样进行乙醇胺和乙二胺清洗，最后如1中那样3次TFA沉淀。
6.在氨基取代的中间体和“β丙氨酸氢化物”活化的中间体之间实施片段偶联。带有3个荧光素的D17126还携带一个N端β丙氨酸-N，N-二乙酸。通过活化(NMP∶二异丙基碳二亚胺∶吡啶：88∶10∶2)10分钟，形成可以用于偶联至氨基的环状“β丙氨酸氢化物”。这产生来自D17120的D17134(伴有L30间隔的6个阿魏酸)、来自D17139的D17148(伴有L30间隔的处于3个密切对中的6个阿魏酸)、来自D17152的D17156(6个L30延长的阿魏酸)和来自D17192的D18003(具有6个7-羟香豆素)。这种片段偶联的优势是中间体能在偶联之前作HPLC纯化，从而提供庞大且复杂、然而相当纯的缀合物。另一个优势是单一中间体如D17126可以用来制备一系列相关但不同的缀合物。
7.具有单一取代基的葡聚糖缀合物包括仅有对照荧光素的缀合物D17132、D18130与D18088(均是通过半胱氨酸偶联而来自D17127的Dex70缀合物)、D17162(来自D17127的dex270缀合物)和D18086(借助二氨基丙酸的更低效偶联来自D18085)。这些缀合物用作对照以说明仅有荧光素的缀合物不起作用。缀合物也可以这样制备，即通过偶联多种中间体缀合物至葡聚糖。这些缀合物包括D18133(dex 70伴随L30间隔的酪氨酸-荧光素缀合物D18132)和D18130(dex 70伴随酪氨酸-荧光素缀合物D18128)。单一缀合物与HRP底物和标记物偶联的优势是确保2种取代基之间的固定比率。
8.具有2种不同取代基的聚糖缀合物包括D17130、D18077、D18079、D18090、D18122和D21008、它们均是dex70伴6个阿魏酸的接头D18074和三荧光素接头D17127(或接头的重复物)。在具有约100个阿魏酸和70个荧光素的D17130、D18077、D18079和D21008之间存在良好的重复性、而D18122与进一步过量的荧光素接头偶联以产生各具有约100个阿魏酸和约100个荧光素的缀合物。D17128类似于D17130，但是所用的阿魏酸接头(D17093)具有与PNA主链而非赖氨酸侧链连接的阿魏酸。缀合物D18031也带有D17127，但是具有L270延长的阿魏酸接头D18019。这种缀合物是使阿魏酸更轻易接近于HRP酶的一种尝试。
用于所选择化合物合成方法的实施例
D19185：在固相上制备Boc-(Lys(2-Cl-Z))3-L150-Lys(Fmoc)。除去Fmoc基团，随后如上所述进行荧光素标记。中间体NH2-((Lys(NH2))3-L150-Lys(Flu)从树脂切下而产生。该中间体用二乙醚沉淀，溶解于TFA中，沉淀，随后溶解于NMP中并且用DIPEA调节为碱性。该溶液与NMP中被HATU和DIPEA活化的等体积0.2M阿魏酸混合。在10分钟后，标记完成并且通过添加乙二胺至10％浓度进一步“清洗”粗产物5分钟。用二乙醚沉淀后，该产物进一步溶解于TFA中并且用二乙醚沉淀3次以除去低分子量残片。在用乙二胺“清洗”之前，质谱法显示2种加合物(及其组合)：指示额外阿魏酸的+(176)n(在其他阿魏酸和荧光素上的酚酯)和+98(N，N’-四甲基脲鎓加合物，同样在未保护的酚基团上)。通过乙二胺处理彻底除去这些加合物，活性酯和阿魏酸寡聚物也同样被分解。
D19185的合成在图1中说明
以下的荧光素-阿魏酸缀合物根据该方法制备：D17157、D17158、D19112、D19185、D18015、D20086、D20118、D20120、D19037和D18157(下文描述这些缀合物中一些缀合物的详细合成)。带有其他标记物的阿魏酸缀合物包括：D19048(丽丝胺标记)；D19059、D18141和D19040(DNP标记)。芥子酸替代阿魏酸的缀合物由相同的方法学制备并且包括带有荧光素标记物的0328-018和D21028以及DNP标记的D21048。带有3个咖啡酸和一个荧光素的D21020和带有个4-氨基-肉桂酸和3个荧光素的D18146均通过相同的策略制备。
D17158 MBHA树脂以Fmoc-Lys(ivDDE)装载至150微摩尔/g载量。200mg树脂在NMP中用20％哌啶去Fmoc化，与Boc-L30-OH(1.5mL，0.26M，在NMP中，用0.9当量HATU、2当量DIPEA预活化2分钟)偶联20分钟。ivDDE基团用NMP中的5％肼除去，并且赖氨酸侧链用羧基荧光素(Flu)(1.5mL，0.2M，在NMP中，用0.9当量HATU、2当量DIPEA预活化2分钟)标记2x20分钟。该树脂用在NMP、NMP、DCM随后DCM中的20％哌啶处理。中间产物H-L30-Lys(Flu)-NH2用TFA∶TFMSA∶间甲酚(7∶2∶1，1.5ml，持续1小时)从树脂切下，用二乙醚沉淀，重悬于TFA中，用二乙醚沉淀，重悬于NMP中并且再次用二乙醚沉淀。该中间产物用100微升DIPEA调节为碱性并且直接溶解于用0.9当量HATU和2当量DIPEA预活化的0.5mL 0.3M阿魏酸中。25分钟后。粗产物用二乙醚沉淀，溶解于450微升NMP和50微升乙二胺中。5分钟后，产物用二乙醚沉淀，溶解于水(8mL)中的15％乙腈中并用100微升TFA酸化并进行RP-HPLC纯化。
D17157 MBHA树脂以Boc-Lys(Fmoc)装载至100微摩尔/g载量。100mg树脂与Boc-L30-OH进行5个偶联循环(a.如1中那样与Boc-L30-OH偶联，b.用NMP∶吡啶1∶1中的2％乙酸酐加帽2分钟；c.用TFA中的5％间甲酚脱Bc2x5分钟)。.赖氨酸侧链如1中那样脱Fmoc并且用羧基荧光素标记。将中间产物H-L150-Lys(Flu)-NH2从树脂切下，并且如1.1中那样用阿魏酸进行N-端标记并纯化。
D16127 Boc-L90-Lys(Fmoc)-L90-Lys(Fmoc)-L90Lys(Fmoc)在0.5gMBHA树脂上以标准固相化学(如1.1和1.2中那样)制备。Fmoc基团用NMP中的20％哌啶从赖氨酸侧链中除去，并且该化合物进行反复羧基荧光素标记(3x30分钟)。用TFA除去Boc基团后，N端在固相上用β丙氨酸-N，N-二乙酸(βala)叔丁酯标记。从树脂切下和HPLC纯化后，βala-L90-Lys(Flu)-L90Lys(Flu)-L90-Lys(Flu)-NH2被分离。
D17127 使用1.3中所述的方法制备并荧光素标记Boc-L90-Lys(Fmoc)-L90-Lys(Fmoc)-L90Lys(Fmoc)树脂。在除去Boc基团后，N端用N-Boc-S(4-甲氧苄基)-Cys-OH标记。将此化合物从柱中切下并且通过HPLC纯化。
D18074/ D17128 对MBHA树脂依次地偶联Boc-Lys(Fmoc)(2个循环)、Boc-L30-OH(5个循环)和Boc-Lys(2ClZ)-OH。在10％茴香硫醚清除剂存在下从该树脂切下中间产物以除去2ClZ基。N端和5个脱保护的赖氨酸侧链如1.1中那样用阿魏酸标记(2x30分钟)。纯化之前，C端赖氨酸残基的N上的Fmoc基团随后用NMP中的10％乙二胺除去。
D17134 500nmol的βala-L90-Lys(Flu)-L90Lys(Flu)-L90-Lys(Flu)-NH2(D16126)(见上文1.4)溶解于88微升NMP和2微升吡啶中，并且通过与10微升二异丙基碳二亚胺反应10分钟转化成环状酐。该酐用二乙醚沉淀，并且该沉淀物溶解于100微升包含250nmol Fer-(Fer-L30)5-Lys(NH2)-NH2的NMP中。20分钟后，添加5微升乙二胺，又5分钟后，产物用二乙醚沉淀、酸化并且进行HPLC纯化。
D18044 在MBHA树脂上制备Ac-(Tyr(2BrZ)-L30)6-L90-Lys(Fmoc)-L90-Lys(Fmoc)-Lys(Fmoc)。在固相上除去Fmoc基团，赖氨酸侧链用羧基荧光素标记。从树脂切下后，产物进行HPLC纯化。
D17140 在MBHA树脂上制备Boc-Lys(2ClZ)-L60-Lys(2ClZ)-Lys(2ClZ)-L60-Lys(2ClZ)-Lys(2ClZ)-L30-Lys(Fmoc)。从树脂切下后，中间产物H-Lys(NH2)-L60-Lys(NH2)-Lys(NH2)-L60-Lys(NH2)-Lys(NH2)-L30-Lys(Fmoc)通过沉淀法分离，并且如1.1中那样用阿魏酸标记。终产物由HPLC分离。
D18090 用二乙烯砜活化的10nmol葡聚糖MW 70kDa与500nmolFer-(Fer-L30)5-Lys(NH2)-NH2(D18074)，总体积300微升，0.16MNaHCO3，pH 9.5(见上文1.4)在40℃反应30分钟。在观察到轻微沉淀后，添加另外的100微升水并且允许该反应继续进行另外30分钟。连同500nmolH-Cys-L90-Lys(Flu)-L90Lys(Flu)-L90-Lys(Flu)-NH2(D17127)(见上文1.5)一起再添加200微升0.15M NaHCO3。在40℃1小时后，通过添加50微升0.165M半胱氨酸30分钟猝灭反应混合物，将溶液过滤，并且通过在Superdex 200上采用含有10mM CHES，pH 9.0和0.1M NaCl的水溶液中20％EtOH的FPLC纯化产物。洗脱的产物是包含约56个荧光素和113个阿魏酸残基的葡聚糖缀合物。
D19112 使用标准固相Boc化学，在固相MBHA树脂上制备Boc-Lys(2Clz)-Lys(2ClZ)-L150-Lys(Fmoc)。使用NMP中的20％哌啶除去Fmoc基团(2x5分钟)，并且游离的氨基用羧基荧光素标记(0.2M羧基荧光素用NMP中的0.9当量HATU和1当量DIPEA活化3次20分钟)。该树脂随后用NMP中的20％哌啶处理2x5分钟。从树脂中切下是在TFA∶TFMSA∶间甲酚∶苯甲硫醚(6∶2∶1∶1)混合物中实施1小时并且产生中间产物H2N-Lys(NH2)-Lys(NH2)-L150-Lys(Flu)。该产物溶解于TFA中，用二乙醚沉淀，并随后溶解于NMP中并且再次用二乙醚沉淀。沉淀物随后溶解于用0.9当量HATU和2当量二异丙基-乙胺活化的0.3M阿魏酸中。10分钟反应后，产物用二乙醚沉淀并且随后在NMP内的10％乙二胺中溶解2分钟。终产物随后用二乙醚沉淀，溶解于水中的30％乙腈中并且在C18柱上进行HPLC纯化。
D19185、D20068和D20171按照与D19112相同的方式制备，同时添加额外的Lys(Fer)基团。
D21020：Caf-Lys(Caf)-Lys(Caf)-L150-Lys(Flu)如D19185那样制备。在固相合成后，在溶液中进行咖啡酸标记。
0328-018：Sin-Lys(Sin)-Lys(Sin)-L150-Lys(Flu)如D19185那样制备。在固相合成后，在溶液中进行芥子酸标记。
D20118：使用L60接头，按照与D19112相同的方式制备。
D20086：
使用L30接头，按照与D19112相同的方式制备。
D21020：使用L30接头并且额外地使用谷氨酸残基，按照与D19112相同的方式制备。Boc-Glu(O-benzyl)用于固相合成以嵌入谷氨酸残基中。
D19048：在0.5g MBHA树脂上制备Boc-L150-Lys(Fmoc)。除去Fmoc基团并且使用添加了80微升DIPEA的2mL NMP中的100mg丽丝胺(Molecular Probes产品号L20，罗丹明B磺酰氯)标记赖氨酸侧链氨基3次10分钟。用TFA除去Boc基团，并且Boc-Lys(2ClZ)与N端偶联。将中间产物H2N-Lys(NH2)-L150-Lys(丽丝胺)用TFA∶TFMSA∶间甲酚∶苯甲硫醚(6∶2∶1∶1)从树脂切下并且用阿魏酸标记，如由D19112产生Fer-Lys(Fer)-L150-Lys(丽丝胺)所述那样。产物用RP-HPLC纯化，分裂成代表不同丽丝胺异构体的2个独立峰。第一异构体在碱性水溶液中变得几乎无色并且被排放。第二异构体在碱性水溶液中保持颜色和荧光并且被收集。
D19059：按照与D19112相同的方式制备，但是在固相上使用添加了50微升DIPEA的1.5mL NMP中的100mg 2，4-二硝基氟苯对C端赖氨酸侧链氨基以二硝基苯基标记2次20分钟。
D18126：Fer-Lys(Fer)-L30-Lys(Fer)-L30-Lys(Fer)-L30-Lys(Fer)-L30-Lys(Fer)-L120-Lys(Flu)-L90-Lys(Flu)-L90-Lys(Flu)＝Fer-(Lys(Fer)-L30)5-(L90-Lys(Flu))3。这种延长的缀合物通过与D19112相同的途径制备：在固相上制备Boc-(Lys(2ClZ)-L30)5-(L90-Lys(Fmoc))3。用NMP中的哌啶除去3个Fmoc基团，并且如D19112中那样导入3个羧基荧光素。将中间产物NH2-(Lys(NH2)-L30)5-(L90-Lys(Flu))3从树脂切下并且用阿魏酸在N端和5个游离赖氨酸侧链处标记，用NMP中的10％乙二胺洗涤，因TFA而沉淀并且进行HPLC纯化。
D18146：在与D18126相同的赖氨酸-接头骨架上制备ACim-(Lys(ACim)L30)5-(L90-Lys(Flu))3。从固相切下后，荧光素标记的接头中间体溶解于NMP中并且用DIPEA调节为碱性。NMP中0.1M的4-氨基-肉桂酸用0.9当量HATU和3当量DIPEA活化30秒，并且添加至该接头。2分钟后通过添加乙二胺至终浓度10％将反应猝灭。沉淀后，产物通过RP-HPLC纯化。
D18074：Fer(Lys(Fer)-L30)5-Lys(NH2)。使用C端Boc-Lys(Fmoc)，然后与Boc-L30接头和Boc-Lys(2ClZ)交替偶联，通过固相化学制备这种具有6个阿魏酸和一个游离赖氨酸侧链氨基的中间体。从树脂切下后，中间产物NH2(Lys(NH2)-L30)5-Lys(Fmoc)在溶液中用阿魏酸标记，如对D19112所述那样。在用10％乙二胺最终处理中，也除去Fmoc基团。这种同阿魏酸寡聚物在葡聚糖缀合物D21008的制备中使用。
D18118：NH2-Cys-(L90Lys(Flu))。这种中间体三荧光素接头直接在固相上制备，使用Boc-Lys(Fmoc)来导入除去Fmoc后用羧基荧光素标记的赖氨酸。使用Boc(S-p-甲氧苄基)半胱氨酸导入N端半胱氨酸。
D18044：如D18126那样在固相上制备Fer-(Tyr-L30)5-(L90-Lys(Flu))3。N-Boc-O-2BrZ酪氨酸用来导入酪氨酸。从树脂切下后，产物进行HPLC纯化。
D21008：Dex70与D18074和D18118缀合。140微升水中10nmol乙烯砜活化的70kDa葡聚糖与另外200微升水和60微升0.8M碳酸氢钠，pH9.5混合。该混合物用来溶解500nmol冻干的D18074。反应混合物在40℃维持60分钟，随后将溶解于250微升水中的另外500nmmol D18118连同另外的50微升0.8M碳酸氢钠，pH 9.5一起添加至该反应混合物。在40℃反应另外60分钟后，添加在0.8M碳酸氢钠，pH 9.5中的70微升0.165mM半胱氨酸终止该反应。使用水中20％乙醇中的10mM CHES pH 9.0，100mM NaCl作为洗脱液，在superdex 200上纯化缀合物。这产生含有该缀合物的第一峰，随后是未缀合的接头。基于荧光素和阿魏酸81％的总回收率，假定葡聚糖缀合物具有相同的回收率(81％)，计算出每个葡聚糖111个阿魏酸对83个荧光素的比率，其对应于(D18074)18.5-Dex70-(D18118)27.7
D19059：在0.1g的MBHA树脂上用标准固相化学制备Boc-Lys(2ClZ)-Lys(2ClZ)-L150-Lys(Fmoc)。Fmoc保护的赖氨酸侧链用NMP中的20％哌啶脱保护(2x5分钟)，并用溶解于1.5ml NMP 1.5mL和50μL DIPEA中的150mg 2，4-二硝基氟苯标记2x20分钟。该树脂用NMP、NMP和DCM中的20％的哌啶处理。
中间产物用TFA∶TFMSA∶茴香硫醚∶间甲酚(6∶2∶1∶1，1.5ml，持续1小时)从树脂切下，用二乙醚沉淀，重悬于TFA中，用二乙醚沉淀，重悬于NMP中并且再次用二乙醚沉淀。该中间产物用100μL DIPEA调节为碱性并且直接溶解于用0.9当量HATU和2当量DIPEA预活化的0.5mL 0.3M阿魏酸中。10分钟后。粗产物用二乙醚沉淀，再溶解于900μL NMP和100μL乙二胺中。2分钟后，产物用二乙醚沉淀，重悬于TFA中，用二乙醚沉淀，溶解于水(8.2mL)中的22％乙腈中并且进行RP-HPLC纯化。
产量8μmol，Fer-Lys(Fer)-Lys(Fer)-L150-Lys(DNP)的MS测定值3582(M+Na)，计算值3558,784。
D19112：在1g的MBHA树脂上用标准固相化学制备Boc-Lys(2ClZ)-Lys(2ClZ)-L150-Lys(Fmoc)。Fmoc保护的赖氨酸侧链用NMP中的20％哌啶脱保护(2x5分钟)并且进行反复羧基荧光素标记(NMP中的3mL，0.2M，用0.9当量HATU，1当量DIPEA预活化2分钟)3x20分钟。该树脂用NMP中的20％哌啶处理，随后用NMP、DCM和TFA洗涤。中间产物用TFA∶TFMSA∶茴香硫醚∶间甲酚(6∶2∶1∶1，3ml，持续1小时)从树脂切下，用二乙醚沉淀，重悬于TFA中，用二乙醚沉淀，重悬于NMP中并且再次用二乙醚沉淀。该中间产物用200μL DIPEA调节为碱性并且直接溶解于用0.9当量HATU和2当量DIPEA预活化的2mL 0.3M阿魏酸中。10分钟后，粗产物用二乙醚沉淀，重溶解于900μL NMP中并且添加150μL乙二胺。2分钟后，产物用二乙醚沉淀，重悬于TFA中，用二乙醚沉淀，溶解于水(24mL)中的25％乙腈中并且进行RP-HPLC纯化。
产量19μmol，Fer-Lys(Fer)-Lys(Fer)-L150-Lys(Flu)的MS测定值3749(M+Na)，计算值3750.998
D19185：D19185通过固相合成以类似于D19112的方式制备，随后用阿魏酸在溶液中标记。MS测定值4054
D19037：D19037通过固相合成以类似于D19112的方式制备，随后用阿魏酸在溶液中标记。MS测定值3447
D18126：在MBHA树脂上用标准固相化学制备Boc-(Lys(2ClZ)-L30)5L90-Lys(Fmoc)-L90Lys(Fmoc)-L90Lys(Fmoc))。Fmoc保护的赖氨酸侧链用NMP中的20％哌啶脱保护(2x5分钟)并进行反复羧基荧光素标记(NMP中的3mL，0.2M，用0.9当量HATU，1当量DIPEA预活化2分钟)3x20分钟。该树脂用NMP中的20％哌啶处理，随后用NMP、DCM和TFA洗涤。中间产物用TFA∶TFMSA∶茴香硫醚∶间甲酚(6∶2∶1∶1，3ml，持续1小时)从树脂切下，用二乙醚沉淀，重悬于TFA中，用二乙醚沉淀，重悬于NMP中并且再次用二乙醚沉淀。该中间产物用200μL DIPEA调节为碱性并且直接溶解于用0.9当量HATU和2当量DIPEA预活化的2mL 0.3M阿魏酸中。10分钟后，粗产物用二乙醚沉淀，重溶解于1350μL NMP中并添加150μL乙二胺。2分钟后，产物用二乙醚沉淀，重悬于TFA中，用二乙醚沉淀，溶解于水(24mL)中的25％乙腈中并且进行RP-HPLC纯化。
产量2μmol，MS测定值10666
1.结合剂
山羊-抗小鼠-Dex70-HRP(D18033/D18175)
二乙烯砜活化的13.7nmol的70kDA分子量葡聚糖与600微升缓冲液(100mM NaCl，25mM NaHCO3，pH 9.5)中的602nmol HRP在30℃反应3小时。随后添加105微升水中的41.1nmol山羊-抗小鼠F(ab)2抗体，该反应继续另外16小时。通过添加70微升0.165M半胱氨酸30分钟猝灭反应混合物并且产物在100mM NaCl，10mM HEPES pH 7.2中于superdex 200上纯化。洗脱的产物是包含山羊-抗小鼠(GaM)和HRP的葡聚糖缀合物(比例dex∶GaM∶HRP＝1∶1.1∶7.5)。
抗FITC-Dex70-HRP(D18058/D18144)
二乙烯砜活化的10nmol的70kDA分子量葡聚糖和400nmol HRP在400微升缓冲液(100mM NaCl，25mM NaHCO3，pH 9.5)中于30℃反应3小时。随后，添加80微升水中的30nmol抗小鼠F(ab)2抗体，并且该反应在40℃继续另外90分钟。通过添加50微升0.165M半胱氨酸30分钟猝灭反应混合物并且产物在100mM NaCl，10mM HEPES pH 7.2中于superdex 200上纯化。洗脱的产物是带有抗FITC和HRP的葡聚糖缀合物(Dex/抗FITC/HRP比例＝1/2/9)。
抗FITC-Dex70-HRP(D17030)
二乙烯砜活化的10nmol的70kDA分子量葡聚糖；440nmol HRP和25nmol F(ab)2抗FITC在374微升缓冲液(100mM NaCl，25mM NaHCO3，pH9.5)中于30℃反应16小时。通过添加50微升0.165M半胱氨酸30分钟猝灭反应混合物并且产物在100mM NaCl，10mM HEPES pH 7.2中于superdex 200上纯化。洗脱的产物是包含抗FITC和HRP的葡聚糖缀合物(比例1∶1∶1)。
兔-抗FITC F(ab’) 1 -HRP缀合物(D19142)
多克隆兔抗FITC IgG抗体用胃蛋白酶在37℃消化4小时并在superdex200上进行纯化以去除胃蛋白酶和Fc片段。
F(ab’)2片段进一步对0.2M磷酸钠，pH 6.0中的5mM EDTA透析。该溶液用Amicon超滤离心柱浓缩至蛋白质浓度25g/L。向6.0mL所述溶液(150mg F(ab’)2)添加487微升50mg/mL DTT和423微升56mM的2-巯基乙醇，二者均在水中。反应混合物在室温下温和地搅拌40分钟，并且用0.2M磷酸钠，pH 6.0中的5mM EDTA于PD-10柱上纯化后立即在8.0mL缓冲液中回收到118mg F(ab’)1。
HRP(Servac)250mg溶解于2.5mL 0.15m NaCL，0.05M磷酸钾pH 8中并且对相同的缓冲液透析。透析后，将酶溶液浓缩并调节至浓度40mg/mL。向3.21mL，128.6mg HRP溶液添加860微升15mg/mL SMCC，并且允许该反应在黑暗下于室温继续进行30分钟。SMCC活化的HRP酶在PD-10柱上用0.15m NaCL，0.05M磷酸钾pH 8纯化。在7.9ml中回收了126.9mg。
向8.0mL的F(ab’)1添加6.25mL的SMCC活化的HRP溶液，并且用0.15m NaCL，0.05M磷酸钾pH 8调节总体积至43.8mL。抗体片段和酶之间的反应在黑暗下于室温进行210分钟。该反应随后通过添加水中的343微升25mg/mL半胱胺在室温猝灭15分钟，并且反应混合物冷藏过夜待纯化。将样品浓缩至8mL，并且以4份施加至superdex 200柱并且用150mM NaCL，50mM Tris，pH 7.6洗脱。产物在第一峰中洗脱，随后是未反应的抗体和酶的峰。在几个级分中分离到100mg缀合物。在280nm/403nm处的UV检测显示抗体∶酶比例在0.8和1.2之间。
山羊抗小鼠F(ab’)1-HRP(D19150)
如兔抗FITCF(ab’)1-HRP那样，通过用DTT和巯基乙醇还原F(ab’)2并偶联至SMCC活化的HRP制备山羊抗小鼠F(ab’)1-HRP。如兔抗FITCF(ab’)1-HRP那样，将12当量的SMCC用于HRP活化并且使用F(ab’)1和HRP之间的1∶1摩尔比。
山羊抗兔F(ab’) 1 -HRP(AMM 279.168)
如兔抗FITCF(ab’)1-HRP那样，通过用DTT和巯基乙醇还原F(ab’)2并偶联至SMCC活化的HRP制备山羊抗兔F(ab’)1-HRP。如兔抗FITCF(ab’)1-HRP那样，将12当量的SMCC用于HRP活化并且使用F(ab’)1和HRP之间的1∶1摩尔比。
2.通过本发明方法的IHC染色
IHC在玻璃载片上所载的福尔马林固定石蜡包埋的组织样品上实施。切出3-5微米组织切片、焙烘并贮藏在4℃直至使用。随后通过二甲苯(2x5分钟)；99％乙醇(2x2分钟)；70％乙醇(2x2分钟)，最后是水除去石蜡。载片置于靶修复溶液，pH 9，(DAKO S2367)中，随后在微波炉中加热(沸腾10分钟)。此后，将载片冷却，随后转移至洗涤缓冲液(DAKO S3006)。此过程后是用3％过氧化氢阻断内源过氧化物酶活性5分钟的步骤，随后再次将载片转移到洗涤缓冲液中，之后在不同的条件下染色。染色方法及其结果在下文详细描述(实验1-10)。为了最小化载片间变异，同同一天的连续切片实施每个对比实验。使用从0至4的评分表给特异性信号以及背景信号评分，其中0代表根本无染色，1-弱染色，2-中等染色，3-强烈染色，4-过度染色。作为评价本发明染色方法结果的相对“标准”的染色，根据制造商推荐进行Envision Flex(DAKO K8010)参照染色，简而言之：载片依次地与以下试剂孵育
2.稀释于S0809(DAKO)中的第一抗体(见下文的抗体表)20分钟；
3.Envision Flex HRP(DAKO DM807)20分钟，或EnvisionFlex小鼠接头(DAKO DM804)15分钟(仅表1中带有“link”的抗体)
4.1∶50稀释于DM803(DAKO)中的Envision Flex DAB生色原(DAKO DM807)，2x5分钟
抗体(表2)
  抗体   DAKO目录编号   稀释度
  人Ki67，克隆MIB1   M7240   1∶100
  雌激素受体，克隆1D5   M7047   1∶35
  BCL6蛋白，克隆PG-B6p   M7211   1∶75(link)
  CD20cy，克隆L26   M0755   1∶200
  CD5，克隆CD5754/F6   M7194   1∶50
  癌胚抗原，克隆II-7   M7072   1∶200
  前列腺特异性抗原，克隆ER-PR8   M0750   1∶100
  细胞角蛋白克隆AE1/AE3   M3515   1∶50
  细胞角蛋白5/6克隆D5/16   M7237   1∶40
  突触囊泡蛋白，克隆Sy38   M0776   1∶50
  CD31，内皮细胞，克隆JC70A   M0823   1∶100(link)
  CD68，克隆PG-M1   M0876   1∶100
  平滑肌肌动蛋白，克隆1A4   M0851   1∶165
  CD21，克隆1F8   M0784   1∶50(link)
  神经丝蛋白，克隆2F11   M0762   1∶400
使用实验1的方法测试表1的全部缀合物和对照化合物至少一次，某些缀合物也使用其他下文所述实验的方法测试。在用确定为“对照”的化合物所处理的载片中没有观察到染色。全部其他化合物(不包括在大缀合物合成中作为中间构建体的标注“中间体”)以强度等级+1至+4显示靶标记作用。下文实验描述了用选自表1的缀合物实施IHC方法的不同实施方式。
实验1
载片依次地与以下试剂孵育
1.第一抗体80秒(对于“Link”抗体，300秒)；
2.山羊抗小鼠F(ab’)-HRP，20nM，80秒；
3.1200nM缀合物D19185+5.6mM DAB 200秒；
4.抗FITC F(ab’)-HRP，100nM，140秒；
5.5.6mM DAB，200秒。
如抗体表(上文)中所示，第一抗体稀释于抗体稀释剂S0809(DAKO)中。
山羊抗小鼠-HRP和抗FITC-HR稀释于含有0.4％酪蛋白、2％BSA、2％PEG 3000、0.1％Proclin、0.05％4-氨基安替比林、0.1％Tween-20、100mM NaCl、10mM Tris pH 8.0的缓冲液(ABCPT缓冲液)中。
步骤3的缀合物D19185(Fer4-L305-Flu1)与DAB和步骤5的DAB稀释于50mM咪唑-HCl pH7.4、5.6mM过氧化氢、0.1％Tween-20的水溶液中。
诸步骤之间的洗涤在室温于S0809(步骤3后在S0809或10mM CHES pH9，0.1％Tween-20中)中进行，每次2分钟。
使用该表的15种不同抗体在12种不同的人组织上测试所述方法：扁桃体、肝、乳癌、类癌、结肠癌、黑色素瘤、前列腺、小脑、肾脏、胰腺。由本发明方法和Envision Flex方法对相应组织的组织染色的总体强度是相同的；高表达靶和低表达靶(高/低平衡)的色调以及染色强度也是相同的，然而，本发明方法的染色似乎更鲜明(即更分明和清晰)。在含有微小细胞结构物的一些组织，例如结肠癌中，当使用本发明方法时，细胞浆染色是略微较不鲜明的。单用抗体稀释剂，即不用抗体处理的载片不显示染色，即借助两种方法的染色均是特异性的。
实验显示，在相同的稀释度使用相同抗体但孵育时间显著缩短(即缩短15倍)时，本发明的染色方法产生与Envision Flex染色法具有相同模式和品质的染色。
实验2
载片依次地与以下试剂孵育
1.第一抗体，140秒，(对于“Link”抗体，300秒)；
2.山羊抗小鼠F(ab’)-HRP(D19150)，30nM，200秒；
3.1200nM缀合物D19059+2.8mM DAB 200秒；
4.抗FITC F(ab’)-HRP(D19142)，150nM，140秒；
5.2.8mM DAB，200秒。
第一抗体比上文抗体表中所示高10倍(对于“Link”抗体，高5倍)地稀释于抗体稀释剂S0809(DAKO)中。
用于第二抗体、缀合物和DAB的溶剂和洗涤缓冲液如实验1中所述。
使用比Envision Flex的孵育时间短约9倍的孵育时间，以同样的15种不同抗体在同样的12种不同人组织上(上文)测试所述方法。染色模式和品质均基本上与实验1的染色相同。在步骤1中单用抗体稀释剂处理的对照载片上不存在背景。
该实验表明通过本发明方法检测特定靶的灵敏度至少高于EnvisionFlex方法10倍(Envision Flex方法如实验1中那样进行，即不作任何修改)。该实验也表明在步骤2的沉积溶液中和步骤5的染色溶液中降低DAB浓度(以2.8mM替代5.6mM)不影响染色结果。
实验3
载片依次地与以下试剂孵育：
1.比抗体表中所示多稀释45倍的抗细胞角蛋白(克隆AE1/A3，Dako货号M3515)，20分钟；
2.山羊抗小鼠F(ab’)-HRP(D19150)，30nM，5分钟；
3.1200nM缀合物D19185+2.8mM DAB 200秒；
4.抗FITC F(ab’)-HRP(D19142)，150nM，140秒；
5.2.8mM DAB，200秒。
第一抗体比所述表(上文)中所示高45倍(对于“Link”抗体，高5倍)地稀释于抗体稀释剂S0809(DAKO)中。用于第二抗体、缀合物和DAB的溶剂和洗涤缓冲液如实验1中所述。
获得的染色基本上与采用45x较高浓度的抗细胞角蛋白(使用相同的孵育时间)的Envision Flex染色相同。在用步骤1中的S0809(无抗体)处理的对照载片上不存在背景。
该实验表明所述抗体的45倍额外稀释度(与上表中推荐相比较)就染色的强度而言是优选的，即本发明方法的灵敏度比Envision Flex方法的灵敏度高至少45倍。该实验还证实在步骤2的沉积溶液中和步骤5的染色溶液中降低DAB浓度(2.8mM替代5.6mM)不影响染色结果。
实验4
载片依次地与以下试剂孵育：
1.比所推荐(见上表)多稀释1000倍的抗细胞角蛋白(克隆AE1/A3，Dako货号M3515)，20分钟，
2.山羊抗小鼠F(ab’)-HRP(D19150)，30nM，5分钟；
3.1200nM缀合物D19185+(1.4至2.8mM DAB)200秒；
4.抗FITC F(ab’)-HRP(D19142)，150nM，140秒；
5.2.8mM DAB，5分钟；
6.2.8mM DAB，5分钟。
用于第二抗体、缀合物和DAB的溶剂和洗涤缓冲液如实验1中所述。
在步骤3的沉积缓冲液中用2.8mMDAB的染色强度比Envision Flex染色弱得多。然而，在扁桃体和结肠上皮、乳癌细胞浆、肝胆管和肾细胞中高度表达的靶用这个操作方案仍中度地(+2)染色。步骤3中沉积溶液内的DAB浓度从2.8mM降到1.4mM显著提高染色强度，但以鲜明性降低为代价。高表达样品被强烈地染色(+3)并且大部分中等表达的样品被中度地染色(+2)。然而低表达组织被微弱地染色或根本不染色(0至+1)。
步骤3中2.8mMDAB时，用步骤1中无抗体的缓冲液处理的对照载片上不存在背景，但是随着与步骤4中1.4mM DAB相关的放大水平增加，导致一些背景染色出现在用步骤1中S0809处理的对照载片上。进一步的对照实验，其中从步骤2中的处理溶液中省略山羊抗小鼠-HRP，显示该背景主要与这种缀合物相关，而不与后续步骤即该缀合物在DAD存在下沉积和终末DAB染色相关。
本实验表明本发明方法的信号放大系统是如此强烈，从而它允许稀释抗体试剂直到高于推荐1000倍且仍保持染色的质量。
实验5
载片依次地与以下试剂孵育
1.第一抗体(根据该表稀释)，80秒，(对于“Link”抗体，300秒)；
2.山羊抗小鼠F(ab’)-HRP(D19150)，50nM，140秒；
3.1000nM缀合物D19185+5.8mM DAB 80秒；
4.抗FITC F(ab’)-HRP(D19142)，150nM，140秒；
5.5.6mM DAB，80秒。
步骤3的缀合物D19185+DAB和步骤5的DAB均稀释于50mM咪唑-HClpH 7.4，56mM H2O2，0.1％Tween的水溶液中(即H2O2的浓度与实验1-4相比高10倍)。
以15种不同的抗体在12种不同的人组织上实施该方法(如实验1那样)。
染色的结果就强度而言与Envision Flex染色相似，尽管低表达靶的染色强度稍弱。在步骤1中不用抗体处理的对照载片上不存在背景。色调略微不同的：通常是灰色至黑色，而非Envision FLEX的亮棕色至深棕色。步骤5中时间增加(200秒)、DAB降低(2.8mM)和过氧化氢降低(5.8mM)的对照实验产生典型的棕色色调，显示该色调主要由终末(染色)步骤决定。
该操作方案产生具有巨大鲜明性的染色：结肠样品和结肠癌样品中的微小细胞结构物因极醒目和清晰而被见到；膜染色分明；带有强烈染色的细胞浆区域被清晰地限定，与极清晰的蓝色细胞核形成对比；中度染色的细胞核显示出用Envision FLEX所产生的均一染色看不到的精细核内细节。
步骤3和5中孵育时间减少的手工对照实验显示当过氧化氢浓度高(56mM)时，染色的强度不因这些步骤中延长孵育时间超过30秒而增加。
实验6
载片依次地与以下试剂孵育
1.第一抗体80秒(对于“Link”抗体，300秒)；
2.山羊抗小鼠F(ab’)-HRP(D19150)，50nM，140秒；
3.1000nM缀合物D19185+5.8mM DAB 80秒；
4.抗FITC F(ab’)-HRP(D19142)，150nM，140秒；
5.2.8mM DAB，300秒；
缀合物和DAB(步骤3)稀释于50mM咪唑-HCl pH7.4、5.6mM过氧化氢、0.1％Tween-20的水溶液中。在步骤5中，DAB稀释于50mM咪唑-HClpH7.4、5.6mM过氧化氢、0.1％Tween-20中。
以15种不同的抗体在12种不同的人组织上实施该方法(如实验1那样)。
高表达靶染色的结果与Envision Flex染色相似(就强度而言)，但是低表达靶明显更强烈地染色，并且用Envision FLEX不着染(+0)的细胞结构被中度染色：抗BCL-6中度地着染乳癌中细胞核的大部分，相比而言，用Envision FLEX对这些区域的染色微弱；与Envision FLEX相比，抗雌激素受体的染色水平在乳癌中显著增加；结肠上皮细胞的抗癌胚抗原染色比用Envision FLEX方法更强烈和稳固；在全部12种组织中观察到抗突触囊泡蛋白微弱到中度的染色，而用Envision FLEX时观察到极微弱染色或无染色。高表达结构通常强烈地染色，但是没有过度着染，是分明的。未用第一抗体的对照载片根本无染色。
本实验显示沉积溶液中高(56mM)浓度过氧化氢与染色溶液中的“正常”(5.6mM)浓度过氧化氢的组合提供一种有力的信号放大系统，其允许极快、灵敏和特异地检测以广阔动态范围表达的抗原。
实验7
载片依次地与以下试剂孵育
1.第一抗体80秒(对于“Link”抗体，300秒)；
2.山羊抗小鼠F(ab’)-HRP(D19150)，20nM，80秒；
3.3.0微摩尔缀合物D19059+2.8mM DAB 200秒；
4.抗DNP F(ab’)-AP，100nM，5300秒；
5.LPR液体永久红(DAKO K3468)，300秒。
全部步骤中的溶剂和洗涤缓冲液如实验1所述。
以15种不同的抗体在12种不同的人组织上实施该方法(如实验1那样)。
尽管为红色色调，染色的外观与采用DAB的Envision Flex染色相似。色调的范围是从深粉(低表达靶)至富贵红(中等表达靶)至酒红(高表达靶)和近乎黑色的红(极高表达靶)，从而产生优良的动态范围。在步骤1中无抗体的对照载片上不存在背景。
本实验显示本发明的放大系统提供了“较不灵敏的”生色原如LPR检测以广阔动态范围表达的抗原的有益用途。
实验8
载片依次地与以下试剂孵育
1.1∶1稀释于抗体S0809(DAKO)中的预混合第一抗体和山羊-抗小鼠F(ab’)-HRP(D19150)，30秒；
2.10微摩尔缀合物D19185+280微摩尔DAB+56mM H2O2，30秒。
步骤2中的溶剂是50mM咪唑-HCl pH7.4、5.6mM过氧化氢、0.1％Tween-20的水溶液。
以15种不同的抗体在12种不同的人组织上实施该方法(如实验1那样)。
这个操作方案产生抗原的特异性亮绿荧光染色，表明根据本发明本身的缀合物沉积机制提供了与靶相关的信号的有力和特异性放大。
实验9
实验9评价本发明的不同缀合物分子和结合剂。
操作方案：
全部载片进行相同的操作：
1.1∶50稀释于S0809中的抗细胞角蛋白(克隆AE1/A3，Dako货号M3515)，1分钟；
2.ABCPT缓冲液*)中的山羊-抗小鼠结合剂(表3)，2分钟；
3.50mM咪唑-HCL、pH 7.4、58mM过氧化氢、5.8mM DAB中的缀合物(表3)，1分钟；
4.ABCPT缓冲液*)中的抗FITC-HRP结合剂(表3)，2分钟；
5.50mM咪唑-HCL、pH 7.4、58mM过氧化氢中的5.8mMDAB，1分钟；
6.苏木精复染色，5分钟。
*)ABCPT缓冲液：0.1％4-氨基安替比林，0.2％Procline 2％BSA，0.2％酪蛋白，2％PEG，0.1％Tween20，0.1M NaCL，10mM HEPES，pH 7.2
Table 3
Figure BPA00001423039500501
Figure BPA00001423039500511
在包含细胞角蛋白阴性组织以及细胞角蛋白低表达和高表达组织的6种不同组织(肝、胰腺、乳腺、扁桃体、阑尾和结肠癌)的样品上检验本操作方案。
结果：
山羊抗小鼠-HRP缀合物：F(ab)1-HRP1缀合物D19150(载片1和29)与平均每个缀合物具有1.4个抗体和10个HRP酶的抗体-葡聚糖-HRP缀合物D18175(载片2-6)比较。尽管HRP酶在缀合物D18175中的数目高得多，载片2的染色强度仅在边缘比载片1和29更强烈。载片3与载片1和27的染色强度相同，降低D18175的浓度，导致逐渐强度变弱的染色。非特异性背景染色在载片2-5上于阑尾平滑肌组织样品中存在，但是它没有在载片1和29上观察到。同样，在载片2-6上观察到了在载片1和29上不存在的褶皱组织非特异性染色。
这表明每个与靶结合的结合剂的HRP丰度不增加特异性信号的放大，反而产生噪声信号。
抗FITC-HRP缀合物：F(ab)1-HRP1缀合物D19142(载片1和29)与平均具有1.4个抗体和10个HRP酶/缀合物的抗体-葡聚糖-HRP缀合物D18144(载片7-11)比较。尽管HRP酶在缀合物D18144中的数目高得多，载片7的染色强度仅在边缘比载片1和29更强烈。载片8与载片1和29染色强度相同，降低D18175的浓度(载片9-11)时，导致逐渐强度变弱的染色。。在载片7-11上，载片1和29上观察不到的严重非特异性背景染色在阑尾平滑肌组织中存在，并且在载片7-9上，扁桃体生发中心中也存在背景。同样，在载片7-11上观察到了在载片1和29上不存在的褶皱组织非特异性染色。
这表明与沉积的缀合物结合的每个结合剂中的HRP丰度不增加特异性信号的放大，反而产生噪声信号。
缀合物：比较了6种不同缀合物：
D17157(1个阿魏酸，1个荧光素，载片12-14)；
D19037(2个阿魏酸，1个荧光素，载片15-17)；
D19112(3个阿魏酸，1个荧光素，载片18-20)；
D19185(4个阿魏酸，1个荧光素，载片1，29和21-23)；
D18126(6个阿魏酸，3个荧光素，载片24-26)；和
D18090(具有101个阿魏酸和72个荧光素的葡聚糖缀合物)。
染色强度随每个缀合物中阿魏酸残基(Fer)数目而逐步增加并且清晰地证明以下趋势：1个Fer(D17157)＜＜2个Fer(D19037)＜＜3个Fer(D19112)＜4个Fer(D19185)。D19185提供了与浓度加倍(与D19185相比)的D19112大约同样强烈的染色，即载片19和21与载片20和22具有相似的强度。
具有6个阿魏酸和3个荧光素的D18126产生强度与D19185相似的染色；然而采用D18126的染色较不鲜明得多，这在小细胞的组织如结肠癌中特别明显。D18126的另一个缺点是强烈染色的区域，即扁桃体中，显示相邻细胞中的非特异性染色晕圈。
非常大的葡聚糖缀合物D18090显示与上述较小缀合物不同的染色模式。尽管靶高表达的样品显示极强烈的染色(+3-+4)(例如载片28在此方面与载片1和29相似)，靶低表达的样品样(例如在胰腺并且尤其肝中)几乎根本不染色(+0-+0.5)。
实验10
实验10显示缀合物沉积介质中DAB和H2O2浓度的影响。
操作方案：
全部载片进行相同的操作：
1.1∶200稀释于S0809中的抗细胞角蛋白(克隆AE1/A3，Dako货号M3515)，1分钟；
2.ABCPT缓冲液中的山羊-抗小鼠(D19150)，2分钟；
3.50mM咪唑-HCL，pH 7.4，具有变化的DAB和H2O2(表4)中的1微摩尔缀合物D19185，，1分钟或3分钟，
4.ABCPT缓冲液中的150nM抗FITC-HRP(D19142)，2分钟；
5.50mM咪唑-HCL、pH 7.4、58mM过氧化氢中的5.8mMDAB，1分钟；
6.苏木精复染色，5分钟。
表4
Figure BPA00001423039500521
Figure BPA00001423039500531
在包含细胞角蛋白阴性组织以及靶低表达和高表达组织的6种不同组织(肝、胰腺、乳腺、扁桃体、阑尾和结肠癌)上检验本操作方案。
结果：
染色的强度：就染色的强度而言，观察到清晰趋势：缀合物沉积溶液中的较高DAB浓度导致较不强烈的染色，即5.5mM DAB＜2.8mM DAB＜1.4mM DAB。然而，增加的强度也与降低的染色鲜明性相关联。这在结肠癌的小细胞结构中是特别显见的。遍及全部组织，复染的蓝色细胞核在用较高DAB浓度处理的载片上，比用较低浓度处理的载片更醒目和清晰地突出。
缀合物沉积溶液中的15mM过氧化氢对产生最强烈染色是优选的，然而它是一个宽泛的最适范围，在5.8、15和58mM之间仅有微小差异。H2O2在该溶液中增加至147mM在全部情况下导致强度显著下降的染色。在1.5mM过氧化氢情况下，如果孵育时间是1分钟，则染色也较不强烈，然而在这种情况下，强度可以通过增加孵育时间至3分钟略微地提高。
当DAB的浓度和过氧化氢浓度降低时，染色的强度取决于孵育时间持续期，而当所述浓度高时，它与孵育时间无关。在高DAB和高H2O2(载片1-3(1分钟)和载片6-8(3分钟))下孵育的载片看上去相同，载片11和12相应地看上去与载片16和17相同。在其他载片上，载片28-30(低DAB，低H2O2，3分钟)比载片23-25(低DAB，低H2O2，1分钟)显著更强烈地染色。这种随时间递增的增强对于肝和胰腺中的低表达靶最明显。
结论：
实验10和11表明可以使用种类宽泛的结合剂、缀合物和反应条件。所谓“优选”取决于预期用途，然而为了获得具有典型模式、即类似于Envision Flex系统(DAKO，K8010)所产生典型染色的快速且鲜明的IHC染色，可以推荐以下组合：
(1)当其在步骤2中实现第一抗体(D19150)的识别时，以及在步骤4中实现缀合物的识别(D19142)时，较小的F(ab)1-HRP1缀合物都提供比较大葡聚糖缀合物更好的信噪比。
(2)本发明最有效的缀合物，即其在靶位点周围精确沉积，即避免了导致后续背景染色和/或降低鲜明性的任何非特异性沉积，是这样的缀合物，其在分子内部具有包含2至4个过氧化物酶底物的第一区域，所述过氧化物酶底物在该区域内部紧密间隔，即2个相邻过氧化物酶底物之间的距离少于2.5nm，例如等于2个并列赖氨酸的尺寸，以及包含单个可检测基团的第二区域，这2个区域在所述的缀合物分子内部被超过2.5nm，例如3-20nm的距离分隔。此类缀合物的实例可以是包含由L150接头分隔的4个阿魏酸残基、1个荧光素的D19185(D19185的结构在图1(3)中显示)。
(3)使用与高效缀合物D19112和D19185组合的低背景结合剂D19150和D19142可以在宽泛条件范围内提供极强烈快速且无背景的特异性信号放大。
(4)取代任何传统IHC染色的IHC染色(总之)可以这样制备，通过在步骤3中使用高浓度过氧化氢和高浓度DAB，刻意牺牲高丰度信号强度从而有利于提高鲜明性，，即所述方法提供了更短的操作时间，量更少的结合剂、靶检测的更广阔动态范围、更好的信噪比、高表达靶和极低表达靶的更高信号强度和提高的染色鲜明性。
(5)对于一些特殊应用，可以使用其他缀合物或孵育条件(而非如上文(1)至(3)那样)。这可以由实验10中使用大葡聚糖缀合物D18090染色的载片27和28说明：这些载片是具有高表达靶的组织并且它们过度染色(+4)。如果想要是非结果或如果想要抑制微弱背景，即因第一抗体所致的微弱背景，可以使用这种条件。相反，如实验11的载片28-30所说明，低DAB(1.4mM)，低过氧化氢(5.8mM和15mM)(联合1.5mM过氧化氢情况下延长反应时间，载片30)可以有利地用于增强对低表达靶的染色，而不过度染色高表达靶。
实验12
已经报道(Volante M等人(2000)J Histochem Cytochem 48：1583-1585)孵育后加热显著地改善酪氨酰胺信号放大(在US 5,863,748；5,688,966；5,767,287；5,731,158；5,583,001，5,196,306，6,372,937或6,593,100中所述(上文讨论的)，以及由Bobrow MN等人(1989)J Immunol Methods 125：279-285；和Bobrow MN等人(1992)J Immunol Methods 150：45-49描述)。实验12评价了沉积后加热对根据本发明方法用液体永久红(LPR)染色的结果的影响。
12张载片用所述表的3种不同抗体(见实验1)根据下文操作方案A或B处理：
1.小鼠抗细胞角蛋白(稀释度1∶50)；
2.小鼠抗CD20(稀释度1∶200)；
3.小鼠抗BCL6(稀释度1∶75)。
操作方案A
1.第一抗体，1分钟(1、2)或5分钟(3)，
2.ABCPT缓冲液中的山羊抗小鼠F(ab’)-HRP(D19150)，40nM，1分钟；
3.在室温于S3006(DAKO)中洗涤2分钟；
4.沉积介质：100nM缀合物D21030+0.8mM DAB+5.8mMH2O2，1分钟
5.在室温于S3006中洗涤2分钟，或在微波炉中煮沸5分钟；
6.ABCPT缓冲液中的抗FITC F(ab’)-AP，100nM，3分钟；
7.在室温于S3006中洗涤2分钟；
8.LPR，5分钟。
操作方案B
1.第一抗体，1分钟(1、2)或5分钟(3)，
2.ABCPT缓冲液中的山羊抗小鼠F(ab’)-HRP(D19150)，40nM，1分钟；
3.在室温于S3006(DAKO)中洗涤5分钟；
4.1μM缀合物D21030+2.8mM DAB+5.8mM H2O2，1分钟
5.在室温于S3006中洗涤5分钟，或在微波炉中煮沸5分钟；
6.ABCPT缓冲液中的抗FITC F(ab’)-AP，100nM，3分钟；
7.在室温于S3006(DAKO)中洗涤5分钟；
8.LPR，5分钟。
结果
用3种不同抗体处理的全部12张载片以+0.5至+3的范围染色。对于高表达标记CD20的“高”对“低”DAB操作方案结果和“高温”对“低温”操作方案结果的评价揭示了在高DAB(+2,5)或低DAB(+3)和室温洗涤，或高DAB与高温(+2)对低DAB与高温(+1.5)存在下染色强度的明显但微小的差异。对于样品中的细胞角蛋白，其中靶是低表达的(尤其在肝样品和肾脏样品中)，观察到了相同但显著得多的差异(高DAB+2，低DAB+3；室温洗涤)。煮沸洗涤的影响被发现甚至比DAB浓度的影响更加清晰，因为它引起细胞角蛋白低表达的这些组织染色强度的明显下降(从+1.5(低DAB)至+0.5(高DAB))。
就BCL6而言，在高操作方案和低操作方案之间几乎没有差异，但是再次地，接受煮沸洗涤的载片比那些在室温洗涤的载片明显强度降低。
本实验表明沉淀步骤后的煮沸洗涤引起染色强度的下降，这在灵敏的低表达靶的情况下清晰显见。这些研究结果与Volante M等人(2000)(上文参考文献)的研究结果相反，其中已经报道了作为缀合物，即生物素-酪氨酰胺沉积步骤后的煮沸洗涤的结果，染色强度大幅提高。
不受理论约束，我们推测本文中描述的缀合物沉积主要与水不溶性沉淀物的形成有关，所述水不溶性沉淀物包含本发明的缀合物分子(彼此共价结合的)和/或包含DAB和缀合物分子的沉淀。当样品在沉淀步骤后进行煮沸时，可以部分地洗去此类沉淀物，因为所述沉淀物不与样品的靶蛋白形成牢固的共价键。相反，生物素-酪氨酰胺缀合物分子沉积在芳族氨基酸上，在那里它们形成共价键。芳族氨基酸一般隐藏在蛋白质结构内部。引起蛋白质变性的孵育后加热可以促进与酪氨酰胺结合的芳族残基暴露并且因而增加其特异性信号，同时除去非特异性生物素-酪氨酰胺沉淀物。

Claims (21)

1.一种水溶性缀合物，其包含
(i)一种或多种可检测物质，
(ii)至少两种物质，每种均能够作为具有过氧化物酶活性的酶的底物，其中标记物(i)和过氧化物酶底物基团(ii)不是相同的化学物质；
其中
标记物(i)和过氧化物酶底物基团(ii)通过接头连接在一起，其中所述接头是包含至少一条具有至少30个连续连接原子的直链的化合物，其中所述直链含有以至少30个连续连接原子的间距分隔的至少两个分枝点；
其中
标记物(i)和过氧化物酶底物基团(ii)在缀合物分子中被至少30个连续连接的原子分隔，并且
其中
两个相邻的过氧化物酶底物基团通过少于30个连续连接的原子彼此分隔。
2.根据权利要求1所述的缀合物，其中能够作为具有过氧化物酶活性的酶的底物的基团具有下式：
Figure FPA00001423039400011
其中
R1是-H、-O-X、N(X)2或-S-X；
R2是-H、-O-X、-N(X)2或-S-X；
R3是-H、-OH、-NH2或-SH；
R4是-H、-O-X、-N(X)2或-S-X；
R5是-H、-O-X、-N(X)2或-S-X；
R6是-CON(X)2或CO-X；
其中
H是氢；O是氧，S是硫，N是氮，并且X是H、烷基或芳基。
3.根据权利要求2所述的缀合物，其中所述基团是阿魏酸、肉桂酸、氨基肉桂酸、咖啡酸、或芥子酸的残基。
4.根据权利要求1所述的缀合物，其中至少两个能够作为过氧化物酶底物的基团是酪氨酸残基。
5.根据权利要求1、2、3或4所述的缀合物，其中能够作为过氧化物酶底物的基团的数目是从2至4。
6.根据权利要求1、2、3、4或5所述的缀合物，其中至少一条直链是包含下式2至10个重复的聚合物
Figure FPA00001423039400021
其中R1和R2选自NH和O，并且R3选自甲基、乙基、丙基、CH2OCH2和(CH2OCH2)2，其中不超过三个连续重复的乙氧基。
7.根据权利要求1至6任一项所述的缀合物，其中缀合物包括2-4个能够作为过氧化物酶底物的基团和1个可检测标记物，所述基团和标记物通过一个线型聚合物彼此连接，其中所述基团和所述标记物与该聚合物的两个分枝点连接，所述两个分枝点被聚合物链的至少30个连续连接原子彼此分隔。
8.根据权利要求1至6任一项所述的缀合物，其中接头包含葡聚糖聚合物和至少一个第一线型聚合物和至少一个第二线型聚合物，其中所述至少一个第一聚合物与二至四个能够作为过氧化物酶底物的基团缀合，并且其中至少一个所述第二聚合物与一个或多个可检测标记物缀合，并且其中所述至少一个第一聚合物和至少一个第二聚合物与葡聚糖缀合。
9.根据权利要求8所述的缀合物，其中至少一个第二聚合物包含两个或多个标记物，其中所述两个或多个标记物各自之间的分子距离是至少30个连续连接的原子。
10.根据前述权利要求任一项所述的缀合物，其中可检测标记物是荧光物质或是特异性结合对的成员。
11.根据前述权利要求任一项所述的缀合物，其中具有过氧化物酶活性的酶是辣根过氧化物酶。
12.一种组合物，包含根据权利要求1至10任一项所述的缀合物。
13.一种用于检测样品中具有过氧化物酶活性的靶的成套试剂盒。
14.一种检测样品中具有过氧化物酶活性的靶的方法，包括
III.在水溶液中孵育推测包括具有过氧化物酶活性的靶的样品，所述水溶液包含：
e)根据权利要求1至10任一项所述的缀合物，
f)3，3’-二氨基联苯胺，和
g)过氧化物化合物，
从而形成缀合物沉淀；
IV.检测样品中化合物的沉淀，从而检测样品中过氧化物酶活性。
15.根据权利要求14所述的方法，其中水溶液(i)包含多于5mM过氧化氢和0.25mM与6mM之间的3，3’-二氨基联苯胺。
16.根据权利要求14所述的方法，其中3，3’-二氨基联苯胺的量在1.5mM以上。
17.根据权利要求14所述的方法，其中过氧化物酶活性与辣根过氧化物酶相关。
18.根据权利要求17所述的方法，其中辣根过氧化物酶是靶或直接或间接与靶相连。
19.根据权利要求18所述的方法，其中靶是多肽、核酸、碳水化合物、脂质或其衍生物、分子复合物、颗粒、真核或原核细胞或微生物。
20.根据权利要求14至19任一项所述的方法，其中样品是生物学样品、环境样品或化学样品。
21.根据权利要求20所述的方法，其中样品固定在固体支持物上。
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