CN111286526B - 一种荧光检测信号放大体系 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种新型的信号放大体系和方法,可以用于化学生物医学检测。本发明利用过氧化物酶和G四链体过氧化物酶构建自由基引发体系,用于引发自由基聚合,并利用聚集诱导发光实现荧光信号放大。本体系可以实现对核酸的检测和适配体靶标的检测。本方法可以在荧光定量PCR仪上使用,通过荧光信号获得检测物浓度。相对于PCR、滚环扩增等核酸扩增的方法,本方法不涉及核酸扩增的过程,因而不需要DNA聚合酶等价格昂贵的试剂,也不存在核酸的非特异性扩增的问题。本方法还可以与酶联免疫法、ELISA和核酸扩增等方法联用,实现多轮信号放大,并用于抗体抗原的检测。
Description
本发明是申请号为CN201610122276.6,发明名称为:酶引发的自由基聚合反应及检测应用;申请日为2016年3月3日的发明专利的分案申请。
技术领域
本发明属于生物监测、荧光检测技术领域,尤其涉及一种荧光检测信号方法体系。
背景技术
荧光传感因为灵敏度高、样品用量少,在化学、生物检测及临床医学诊断方面应用非常广泛。荧光传感离不开荧光探针的设计与合成,荧光探针可以与样本中的目标分子结合或发生化学反应,从而使探针分子的荧光发生改变,再通过仪器或肉眼观察即可判断样本中目标分子的含量。
为了提高荧光信号的强度,一般将酶反应或者催化剂引入到检测体系中,使荧光信号放大,从而提高检测的灵敏度。由于酶的催化效率很高,故有信号放大的效果,从而使测定方法达到很高的敏感度。
核酸扩增是核酸聚合酶催化的特殊聚合反应,在检测信号放大中应用广泛。正因为PCR等核酸扩增技术的序列特异性及扩增的高效性,这些技术可以用于非常微量的核酸序列检测,已经在医学临床诊断和刑事侦查鉴定中有,例如传染病病原体的确认、亲子鉴定等。近些年结合核酸适配体技术,PCR等核酸扩增技术不仅用于序列特异性的检测,还用于各种适配体靶标的检测(如蛋白质、小分子、金属离子等)。然而,PCR等核酸扩增技术也存在各种问题,核酸扩增技术的序列特异性不是绝对的,样品易污染,不同的核酸序列存在扩增差异,还存在非特异性扩增、脱靶效应等,因而会造成假阳性的结果。
发明内容
本发明提供一种新型的荧光信号放大方法,不用DNA聚合酶,不涉及核酸扩增反应,该方法适用范围广泛,可以用于离子、小分子、生物大分子的检测,包括核酸序列的检测、适配体靶标的检测以及抗体抗原的检测。
为了实现上述目的,本发明利用过氧化物酶构建自由基引发体系,用于引发自由基聚合反应,并利用聚集诱导发光的荧光分子实现荧光信号放大。
该信号放大体系的必要组成包括:过氧化物酶、荧光分子、单体分子。其中荧光分子和单体分子可以是一个整体,也可以是分开的两类分子。该体系特征在于:在没有酶底物的时候,荧光分子分散游离,荧光很弱;当有底物时,过氧化物酶可以催化底物形成自由基,进而引发单体分子的聚合反应,进而使荧光基团聚集或者分子运动受限制,并导致荧光增强。
下面详细介绍上述体系的各种组分。
上述体系中,过氧化物酶选自蛋白质构成的过氧化物酶或核酸构成的过氧化物酶,使用不同的过氧化物酶,可以用来检测不同的物质。其中蛋白质构成的过氧化物酶通过从生物中提取获得,本发明的优选的过氧化物酶来源于植物中的过氧化物酶,其中优选的植物过氧化物酶为辣根过氧化物酶。
上述体系中,若采用核酸构成的过氧化物酶,则该过氧化物酶的特征在于:由配合物结合一条或多条核酸链构成。所用的核酸不论是一条还是多条,都可以形成G四链体结构,符合要求的核酸序列通式如下:
序列1:G(G)mG(X1……Y1)G(G)mG(X2……Y2)G(G)mG(X3……Y3)G(G)mG
序列2:G(G)mG(X1……Y1)G(G)mG(X2……Y2)G(G)mG
序列3:G(G)mG(X1……Y1)G(G)mG
序列4:G(G)mG
上述通式中,子序列G(G)mG被子序列(X1……Y1)、(X2……Y2)、(X3……Y3)隔开,其中子序列(X1……Y1)、(X2……Y2)、(X3……Y3)各自独立选自长度为1-20个碱基的核酸序列,其中的每个碱基各自独立选自核酸碱基A、T、G、C、U及其他可以形成氢键配对的修饰的碱基和非天然碱基,m选自0到10的整数。
以上序列均具有形成G四链体的潜力,其中序列1只需要一条就可以形成G四链体,序列2、3、4相互组合可以形成G四链体。在具体的实施方式中,可以根据检测体系中适配体的序列或者待测核酸序列的特点,设计合适的G四链体序列和使用的核酸链数,以达到最佳的检测效果。
上述核酸构成的过氧化物酶中,所用的配合物可以与G四链体结合,这些配合物或配体结构不一,具体化合物可以参考本领域的文献。根据配体结构不同,这些化合物有卟啉和类卟啉配合物,它们的结构通式如下:
上述所有通式中,n选自0-3的整数;
Xa,Xb,Xc,Xd各自独立,选自N、C-R、Si-R等;Xe,Xf各自独立,选自O、NR、CR1R2等;
R1,R2,……R7,R8,各自独立,选自H、F、Cl、Br、I、CN、硝基、亚硝基、R、OR、SR、NRaRb、NRaRbRc、醛基、羧基、酯基、酰胺、酰肼、肟、胍、磺酸基、磷酸基、R取代的烷基、芳香环及芳香环衍生物等;其中R,Ra,Rb,Rc,各自独立,选自H、F、Cl、Br、I、CN、硝基、亚硝基、饱和烷基、不饱和烷基、环烷基、含取代基的烷基、烷氧基、烷基取代的氨基、醛基、羧基、酯基、酰胺、酰肼、肟、胍、磺酸基、磷酸基、芳香环及芳香环衍生物等;
A1,A2,A3,A4各自独立,选自芳香环及芳香环衍生物等;芳香环选自苯环、呋喃、吡咯、咪唑、噻唑、噁唑、三氮唑、萘环、吡啶、嘧啶、喹啉、异喹啉、喹喔啉、薁等,以及上述芳香环的稠环化合物;芳香环衍生物选自含有取代基的上述芳香环化合物,芳香环的取代基参考R1,R2,……R9,R10的描述;
M选自Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Mo、Ru、Rh、Sn、Ce等金属离子。
上述通式中,一些卟啉和类卟啉配合物配体的优选结构如下:
除了上述几类配合物之外,还有很多配合物可以结合G四链体,见参考文献:Acc.Chem.Res.2014,47,3614-3631;Coordination Chemistry Reviews 2013,257,1764–1776;Spectrochimica Acta Part A,2014,132,84–90等。这些配合物及与其结构类似的配合物均可以结合G四链体,它们与G四链体形成的复合物均是潜在的自由基反应的引发剂。
上述配合物中的优选配合物有:
其中M选自:Mn2+、Fe2+、Co2+、Ni2+、Cu2+、Ru2+。
其中血红素结构为:
这些配体及配合物,有些通过化学合成获得,有些可以从生物体中提取获得,具体制备方法可以参考本领域已知的文献。
本发明所采用的配合物和配体不限于上述几类化合物,凡是与G四链体具有较高结合常数的配体或配合物都可以应用于本发明中。
这些G四链体与配合物的复合物与一些氧化剂联用(氧化剂选自氧气、过氧化氢、过氧化物、过硫酸盐等)可以作为引发剂引发烯烃、炔烃、环氧丙烷、环氧乙烷、苯酚、苯胺等物质的自由基聚合反应以及巯基-烯炔点击反应。除了应用于荧光信号放大之外,这类复合物还可以应用于有机合成或者高分子合成领域,其反应条件温和,适合于一些水溶性单体的自由基聚合,而且作为引发剂的核酸成分,毒性小,对环境不产生污染,相对于传统的自由基引发剂,具有明显的环保优势。
该信号放大体系使用一种自由基聚合反应就可以达到目的。
为了使聚合反应能够发生,该信号放大体系使用的单体需要含有能够发生自由基反应的官能团。符合该要求的反应官能团有烯、炔、呋喃、苯胺、苯酚、巯基、环烷、含杂原子的环烷等。它们的结构通式如下:
其中表示连接有取代基;X选自/>
J选自
除巯基之外,其它任意一种官能团均可以发生自由基聚合反应,其中一些反应通式如下:
上述官能团相互组合还可以发生共聚反应,不一一列举。
巯基在自由基引发条件下,可以与烯、炔发生下面的反应:
在一个单体中,反应官能团的个数可以不止一个,反应官能团的种类可以不止一种。单体中反应官能团的种类和个数不同,聚合反应可以是一种或者多种官能团的聚合反应,聚合产物可以是链状、网状、树枝状。
当含有巯基的单体中还含有烯或者炔官能团时,该单体也可以通过均聚反应生成聚合物,其反应式可表示如下:
当单体含有多个巯基时,该单体可以与烯烃、炔烃单体通过共聚反应生成聚合物,其反应式可表示如下:
如果单体中只含有一个巯基,则多烯烃、多炔烃的化合物可以与很多这样的单体反应,形成低聚物,其反应式可表示如下:
上述类型的反应均可以应用在本荧光信号放大体系中。
聚合反应的产物可以为链式,也可以为树枝状聚合物,也可以为网状聚合物。
聚合反应的产物不一定是高分子,也可以是寡聚物、低分子量聚合物、树枝状分子,只要产物能够达到使荧光分子荧光增强的效果即可。
形成的聚合物可以通过非共价的分子间相互作用进一步形成超分子聚合物,从而诱导更多荧光分子荧光增强。
为了使单体分子能够在水溶液中发生聚合,所采用的单体应该有一定的水溶性。增强水溶性的方式就是在分子上修饰亲水性的官能团,如羟基、氨基、胺、铵、鏻、烷氧链、羧基、磺酸基、磷酸基、磷酸酯、烷基硼基、苯基硼等。
该信号放大体系使用的荧光分子的结构特征是分子通过单键连接多个芳香环,大多包含苯乙烯单元。这种分子的结构特点使得这类分子大多具有聚集诱导发光性质,即当分子以游离形式分散在溶液中时,分子内单键的旋转导致激发态以非辐射方式弛豫到基态,而当分子聚集或者其它原因使分子内旋转受阻时,导致非辐射弛豫渠道被抑制,辐射弛豫增强而发光。这类分子虽然大多是多芳环的共轭体系,但是由于空间位阻导致分子内的芳环不共平面,芳环之间存在较大的二面角,这种结构特点使其在聚集态中芳环不容易形成面对面的堆积,不会形成激基缔合物或激基复合物,因而这类分子在聚集态中分子的荧光不容易被猝灭。
荧光基团优先选自以苯乙烯为子单元的荧光基团,以及它们的衍生物,这类荧光基团种类繁多,可参考聚集诱导发光领域的已知文献选择合适的单元并设计、合成分子。其中一些优选的结构单元如下:
从这些单元衍生出的荧光分子,有的具有较好的水溶性,可以直接用于该信号放大体系,而有的需要在其结构基础上进行简单修饰或功能化,增强水溶性,以避免荧光分子在水溶液中发生自聚集而荧光增强。
一个荧光分子中所含荧光单元的种类不限于一种,荧光单元的个数也不限于一个,可以根据实际需要合理设计。
这些聚集诱导发光的分子溶解在溶液中,发光较弱甚至不发光。
为了使这种聚集诱导发光的荧光分子能够在聚合反应之后聚集而荧光增强,本发明采用两大类方式来实现:
第一类方式中,荧光分子不参与聚合反应,聚合反应后生成的聚合物的主链或者侧链含有具有结合功能的基团,这些具有结合功能的基团可以通过疏水作用、π-π作用、静电作用、配位作用、氢键作用、可逆共价键结合荧光分子使其聚集在聚合物周围而荧光增强;
第二类方式中,荧光分子参与聚合反应,聚合反应后,荧光分子通过共价键连接而聚集到一起,进而使荧光基团的分子运动受限制而荧光增强。
第二类方式中,荧光分子参与聚合反应,聚合反应后,荧光分子通过共价键连接而聚集到一起。因而这类荧光单体的设计思路是:将聚合反应官能团和荧光基团相互组合,通过共价键连接或者有机单元桥连可以构建无数符合要求的荧光单体分子,均可以应用于本发明中。反应官能团和荧光基团的设计参考前面的论述。
该方式中既可以采用均聚反应,也可以采用共聚反应,即使用的单体不限于一种,而且不需要每一种单体都符合上述要求,即不需要每个单体都是荧光单体。聚合反应后荧光增强的必要条件是,至少有一种单体分子的结构中含有至少一个荧光基团。荧光基团可以选自方式一中采用的荧光基团,具体结构参考前面的论述。
这种单体的结构通式为:
其中,RG为反应官能团,F为荧光基团,L为连接基团,x、z为非0的整数,y为0-20的整数。该通式表示一个分子中连接有x个反应官能团和z个荧光基团。即使x和z为1,y为0,荧光单元和反应官能团的排列组合仍然太多,不一一列举,只列出少数优选的荧光分子结构如下,这些结构并不限制本发明的保护范围,一些优选的荧光单体分子结构:
/>
上述荧光单体分子,有的可以发生均聚反应生成高分子,而有的不容易发生均聚反应,可以与其他单体共聚生成高分子,例如含呋喃的荧光单体分子可以与丙烯酸等缺电子烯烃发生共聚反应。
这类方式中,为了降低荧光单体分子的自身荧光,可以连接一些缺电子的反应官能团,这类官能团有可能通过电子转移作用猝灭分子的荧光,而加成聚合反应之后,这些官能团共轭结构被打断,因而不再猝灭荧光,结合聚集诱导发光的作用,荧光显著增强。
以上内容已经说明了该荧光信号放大体系的必要组成,按照上述要求选择或设计试剂可以构建自由基聚合反应的荧光信号放大体系。为了增强荧光放大的效果,还可以添加一些物质,这些物质根据具体情况添加,也可以不加。根据功能不同,这些物质有自由基引发剂、链转移剂、稳定自由基、稳定自由基前体、荧光猝灭剂等。
下面分别介绍这几种物质:
自由基引发剂:用于加速自由基引发过程。一些单体的聚合活性可能不高,单纯靠G四链体与配合物的复合物难以引发,适当添加这类物质,这些物质通过与G四链体复合物发生氧化还原或者自由基转移反应形成初期的自由基,用于引发自由基聚合。
这类物质有偶氮化物、叔胺、过氧化物、过氧酸、过氧酸酯、过硫酸盐等。这类物质种类繁多,可参考自由基聚合领域的相关文献选择或设计合适的物质用于本发明中。简单列举几种分子,不作为本发明保护范围的限制,结构如下:
链转移剂:用于转移活性自由基,抑制活性自由基的链终止反应,增加单体反应的转化率。这类物质有巯基化合物、β-二酮等。这类物质种类繁多,可参考自由基聚合领域的相关文献选择或设计合适的物质用于本发明中。简单列举几种分子,不作为本发明保护范围的限制,结构如下:
稳定自由基或稳定自由基前体:用于增加聚合度。这些物质或者这些物质形成的自由基可以与链增长的自由基发生可逆的链终止或加成消除反应,用于抑制链转移和链终止反应,实现活性自由基聚合,提高聚合反应的聚合度。这类物质有胺氧自由基、烷氧胺、黄原酸酯、碘化物、碘等。其具体的反应原理,参考自由基聚合领域的文献可知。这类物质种类繁多,可参考自由基聚合领域的相关文献选择或设计合适的物质用于本发明中。简单列举几种分子,不作为本发明保护范围的限制,结构如下:
荧光猝灭剂可以在聚合反应前与荧光分子形成非共价的超分子复合物,通过能量共振转移或者电子转移机理猝灭荧光分子的荧光,从而降低本底荧光;而聚合反应之后,荧光分子与聚合物结合力高于与单体的结合,或者荧光基团被包裹在聚合物中,使得猝灭剂与荧光分子解离,不再猝灭荧光。这类试剂的运用可以提高荧光增强倍数和检测信噪比。这类物质种类繁多,可参考分子染料和荧光领域的相关文献选择或设计合适的物质用于本发明中。简单列举几种分子,不作为本发明保护范围的限制,结构如下:
其中有一些是常用的酸碱指示剂,如甲基橙、酚酞、酚红、邻苯二酚紫等,可以直接从市面上购得。
以上内容已经说明了该荧光信号放大体系的各种主要成分,下面详细介绍上述信号放大方法的原理。
若使用蛋白质构成的过氧化物酶,则该体系用于荧光检测,主要包含两个过程:一、过氧化物酶催化底物形成自由基,并引发自由基反应;二、自由基聚合的产物使聚集诱导发光的分子聚集而荧光增强。
若使用核酸构成的过氧化物酶,则该体系用于荧光检测,主要包含三个过程:一、靶标分子与核酸结合形成G四链体结构,并结合配合物,形成过氧化物酶;二、核酸构成的过氧化物酶引发自由基反应;三、自由基聚合的产物使聚集诱导发光的分子聚集而荧光增强。
不管使用哪一种过氧化物酶,最后两过程都类似。下面以核酸构成的过氧化物酶的体系为例,分别叙述每个过程的原理。
第一过程的原理:
选择并设计合适的核酸链,当没有检测物存在时,核酸游离在溶液中自然卷曲,或者通过互补配对,形成一定的二级结构,但是不形成G四链体,因而就不能结合配合物,不会产生自由基;当有检测物时,核酸与检测物结合折叠形成四链体结构,或者原先的二级结构解离,结合检测物并形成G四链体结构,然后即可结合配合物。
如果检测物是一段核酸序列,则利用该核酸的互补序列设计检测体系。作为检测物的核酸可以与检测体系中的核酸通过碱基配对形成更加稳定的二级结构,这个新形成的二级结构与溶液中钾离子进一步作用,并折叠形成G四链体。
如果检测物不是核酸,是其它小分子、大分子、病毒或细胞,则利用该小分子、大分子、病毒或细胞的适配体序列设计检测体系。体系中所使用的核酸含有适配体序列,该序列在没有靶标存在的情况下自然卷曲,或者通过互补配对,形成一定的二级结构,但是不形成G四链体,当靶标即检测物存在时,靶标结合适配体序列,形成新的二级结构,并折叠形成G四链体。
上述过程在核酸检测和适配体传感器的文献中已经有详细论述,根据这些文献,可以选择合适的策略设计相应的核酸序列。
第二过程是本发明的关键过程。
一些金属配合物在一定条件下可以催化一些物质,如氧气、双氧水等过氧化物产生自由基,一些金属配合物与G四链体结合后,可使上述催化速率提高很多倍,这些自由基可以引发其它的自由基反应,如巯基与烯炔的加成反应、烯烃或苯酚等化合物的自由基加成反应。
为了增强自由基的引发速率,可以适当添加自由基引发剂、链转移试剂、自由基稳定剂等。其作用是使G四链体复合物周围的自由基更快传递到单体分子上。一旦反应被引发,就不再需要G四链体复合物的参与,在自由基聚合反应中,一个自由基可以与无数个单体加成反应形成聚合物,因而该过程是信号放大的关键过程。
传统基于G四链体-血红素复合物的检测中,每消耗一分子双氧水,只产生一分子羟基自由基,只能使一分子的染料分子的颜色或发光等性质发生变化。而本发明中,G四链体复合物每消耗一分子双氧水,虽然也只产生一分子羟基自由基,但是可以引发无数的单体聚合形成一条聚合物链,并诱导无数荧光分子的聚集,相比传统基于G四链体复合物的检测具有信号放大的效果,聚合度越大,则可以诱导聚集的荧光分子越多,信号放大效果越明显,荧光信号也越强。
由于增长的自由基链之间可以通过链终止反应而终止加成反应,所以聚合度不可能无限大。但是通过向体系中加入一些稳定自由基或稳定自由基前体,就可以利用引发转移终止剂(iniferter)法、稳定自由基聚合(stable free radical po1ymerization,SFRP)、氮氧自由基调控聚合(nitroxide-mediated po1ymeIization,NMP),可逆加成断裂链转移聚合(reversible addition-fragmentation chain transfer,RAFT),原子转移自由基聚合(Atom Transfer Radical Polymerization,ATRP)等方法降低自由基链的浓度,以抑制不可逆的链终止反应,达到增加聚合度的目的。这些方法都是自由基聚合领域常用的方法,具体原理和具体的试剂参考该领域的文献即可选择和设计。
第三过程分两类方式论述:
第一类方式中,荧光分子不参与聚合反应,聚合反应形成的聚合物中含有单体的残基,这些残基通过分子相互作用结合荧光分子,一条聚合物含有多个残基,因而可以结合多个荧光分子,由于聚集诱导发光的基团主要由芳环等疏水性官能团构成,因而这些荧光分子可以通过疏水作用发生进一步的聚集,从而限制分子单键的旋转,使荧光增强。
第二类方式中,荧光分子参与聚合反应,聚合产物中含有多个或许多荧光分子,这些聚合物中,荧光分子通过共价键连接在一起,相对于单体,其分子单键的旋转受一定阻碍,而且这些聚合物还可以通过分子内的疏水作用发生折叠,进一步限制单键旋转,使荧光增强。
除此之外,一些连接有强吸电子基的双键可以猝灭荧光基团的荧光,而发生聚合反应之后,这些双键转变成单键,使荧光恢复。
为了降低聚合反应前的背景荧光,可以添加荧光猝灭剂,其作用是与游离的荧光分子用过弱的分子相互作用结合,通过能量转移猝灭荧光分子的自荧光。而聚合反应之后,荧光分子优先与聚合物结合,或者荧光分子被聚合物包裹,从而使猝灭基团远离荧光分子,因而使荧光分子荧光恢复。
经过上述三个过程,本发明的荧光信号放大体系可以实现对核酸序列的检测和适配体靶标的检测。由于适配体靶标范围广泛,可以是离子、小分子、蛋白质、病毒、细菌、细胞等,因而该方法可以检测上述各种靶标,具有广泛的适用性。在具体的检测应用中,可以进行对照实验以排除假阳性,对照实验与检测实验的区别在于:对照实验不含G四链体序列,其余成分和条件与检测实验相同。相对传统基于G四链体检测的方法,该方法具有信号放大的作用,因而更高的灵敏度。
本方法也可以在实验室常用的荧光定量PCR仪上使用,即将各种需要的试剂配置成溶液放置于PCR管中,按照常规PCR过程操作PCR仪即可。在每一轮变性退火过程中,温度的升高有利于自由基扩散,同时G四链体与配合物形成的复合物解离后又在降温时重新复合,引发新一轮自由基聚合反应和荧光信号的增强,经过多轮循环,荧光信号随之得到极大的放大,因而从PCR仪读取荧光信号强度就可以获得检测物浓度。相对于PCR、滚环扩增等核酸扩增以放大信号的方法,本发明的方法不需要DNA聚合酶、核苷酸单体等价格昂贵的试剂,所用的主要试剂都是有机小分子,可以大规模合成,有的是低廉的化工原料,如丙烯酸、丙烯酰胺等,不仅成本低,而且易于保存。由于本方法不涉及核酸扩增的过程,因而不存在核酸的非特异性扩增的问题,不会有新的核酸序列产生,因而在PCR仪器上使用时,每一轮变性退火都依靠原本的核酸序列引发自由基聚合,即具有更高的准确度。
本发明的信号放大体系可以用于过氧化物酶底物的检测,还可以与其他酶反应联用,用于检测酶或酶的底物。例如氧化酶在氧气存在下可以催化底物生成过氧化氢。而过氧化氢可以在过氧化物酶或G四链体复合物存在下催化生成羟基自由基,并引发自由基聚合反应和荧光信号的放大。这些氧化酶有葡萄糖氧化酶、尿酸氧化酶、氨基酸氧化酶等,它们底物分别是葡萄糖、尿酸、氨基酸等。因而向本发明的体系加入这些酶,可以检测它们各自的底物;或者向本发明的体系加入底物,可以检测相应的酶及酶的活性。
在上述基础上,本发明的信号放大体系还可以结合酶联免疫法,用于抗体或抗原的检测信号放大。酶联免疫法的关键是利用酶标记的抗原或者抗体催化底物来实现信号放大,其中常用的标记酶为氧化酶和辣根过氧化物酶。
针对不同酶标记的酶联免疫法,本发明可以有不同的联用方法。
联用方法一:若酶联免疫法使用氧化酶标记的抗体或抗原,则在检测过程中或者检测的最后一步加入本发明前面所述的体系中除过氧化氢之外的物质即可,包括过氧化物酶、单体分子、荧光分子等。
该联用方法所需的材料为:酶联免疫法的所有试剂,以及本发明前面所述的体系中除过氧化氢之外的组分。
联用检测过程为:在酶联免疫法中的氧化酶催化底物产生过氧化氢之后,本发明体系的过氧化物酶接着催化过氧化氢产生自由基,之后是自由基引发单体分子的聚合反应,进而通过溶液粘度、颜色变化或荧光增强判断抗体、抗原等物质的存在。
联用方法二:若酶联免疫法使用过氧化物酶标记的抗体或抗原,则在检测过程中或者检测的最后一步加入本发明前面所述的体系中除过氧化物酶之外的物质即可,包括过氧化氢、单体分子、荧光分子等。
该联用方法所需的材料为:酶联免疫法的所有试剂,及本发明前面所述的体系中除过氧化物酶之外的组分。
联用检测过程为:在酶联免疫法中的过氧化物酶催化过氧化氢产生羟基自由基之后,羟基自由基接着引发本发明体系的单体分子的聚合反应,进而通过溶液粘度、颜色变化或荧光增强判断抗体、抗原等物质的存在。
上述联用方法中使用的过氧化物酶可以来源于酶联免疫法常用的过氧化物酶,也可以使用核酸构成的过氧化物酶。其中核酸构成的过氧化物酶与抗体或抗原的连接方式可以是共价键,也可以是非共价键的特异结合方式。非共价键的特异结合方式主要有适配体靶标的结合,在这种结合方式中,构成过氧化物酶的核酸的序列特征是:一条核酸链,包含G四链体序列和适配体序列,适配体为需要标记的抗体或抗原的适配体;适配体与抗体或抗原特异结合的同时,也使G四链体序列附着在抗体或抗原的表面,结合配合物后就具有了过氧化物酶活性。
酶联免疫法中应用较多的是酶联免疫吸附测定法(Enzyme-LinkedImmunoSorbent Assay,ELISA)。ELISA测定方法中有3种必要的试剂:固相的抗原或抗体、酶标记的抗原或抗体、酶作用的底物。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件,可设计出各种不同类型的检测方法。具体原理和设计方法可以参考ELISA检测相关的文献。与酶联反应法一样,本发明的信号放大体系也可以与ELISA检测联用,联用方法与前面一致,都是利用酶联免疫检测中产生的过氧化氢或自由基引发单体分子的聚合反应和荧光增强。
本发明与ELISA法联用的一种方法是,使用亲和素标记抗原或抗体,并使用生物素标记的G四链体核酸,还需要加入本发明所采用的配合物、单体分子、荧光分子、引发剂等,以引发聚合反应和荧光增强。使用该方法设计一种抗体的检测,其过程和原理为:将这种抗体的抗原固定在固相薄膜上,再浸入待测溶液,该薄膜可以特异吸附待测溶液中的抗体,然后清洗薄膜,去除非特异吸附,再加入亲和素标记的第二抗体,使之与吸附在薄膜上的第一抗体结合,然后清洗薄膜,去多余的亲和素标记的抗体,再加入生物素标记的G四链体核酸,生物素与亲和素结合,使G四链体固定在薄膜上,然后清洗薄膜,去除多余的G四链体,最后将薄膜浸入含有配合物、单体分子、荧光分子、引发剂等物质的溶液中。如果待测溶液含有抗体,则会引发单体分子的聚合和荧光的增强。如果将抗体固定于固相薄膜上,按上述类似的原理设计检测试剂,就可以用于检测抗原。
本发明与ELISA法联用的另外一种方法是,使用氧化酶类标记抗原或抗体,除了酶相应的底物之外,还需要加入本发明所采用的单体分子和荧光分子等,以引发聚合反应和荧光增强。例如:使用该方法设计一种抗体的检测,其过程和原理为:将这种抗体的抗原固定在固相薄膜上,再浸入待测溶液,该薄膜可以特异吸附待测溶液中的抗体然后清洗薄膜,去除非特异吸附,再加入氧化酶标记的第二抗体,使之与吸附在薄膜上的第一抗体结合,然后清洗薄膜,去多余的氧化酶标记的抗体,最后将薄膜浸入含有氧化酶底物的本发明体系的溶液中。如果待测溶液含有抗体,则会引发单体分子的聚合和荧光的增强。如果将抗体固定于固相薄膜上,按上述类似的原理设计检测试剂,就可以用于检测抗原。其中使用的氧化酶可以是葡萄糖氧化酶、尿酸氧化酶、氨基酸氧化酶等。
本发明的荧光信号放大体系与酶联免疫法的联用方法不限于以上两种方法,酶联免疫检测领域的文献中所使用方法(包括双抗体夹心法、双位点一步法、间接法测抗体、竞争法等)都可以与本发明的体系联用,并且用于相关物质的检测。
传统ELISA方法和其它酶联免疫法的信号放大是基于酶催化底物反应的高效性,而上述改进的ELISA方法是利用酶反应的自由基产物引发聚合反应,即酶反应和自由基聚合反应联用,实现两轮的信号放大,因而该方法具有更高的灵敏度。同时将检测的底物范围扩大到抗体抗原,具有更广泛的适用性。
本发明的信号放大体系还可以与核酸扩增反应联用,实现信号的两轮放大。以滚环扩增为例,与本发明联用的过程和原理为:设计环状核酸模板序列,其子序列含有G四链体的互补序列,将该环状核酸、核苷酸单体和DNA聚合酶代替G四链体核酸加入到本发明的体系中,除不含G四链体序列之外,体系中含有能够与G四链体结合的配合物,还含有单体分子、荧光分子、引发剂等,具体试剂参考之前的叙述。
该体系中,为了引发核酸扩增,还需要引物序列。
如果将该体系用于核酸的检测,则可以将靶标核酸序列作为引物序列,设计相应的环状模版序列,当体系中存在靶标序列时,靶标序列与模版配对,然后DNA聚合酶催化核酸扩增反应,扩增产物中含有许多G四链体序列的重复片段,因而该扩增产物与配合物结合形成多个G四链体复合物,进而引发单体分子的聚合和荧光分子的聚集荧光增强。
如果将该体系用于核酸适配体靶标的检测,则可以设计合适的引物序列和模版序列,其中引物序列包含适配体序列,序列特征是3’端一段子序列可以与环模版配对。在没有靶标分子时,引物序列通过自身碱基配对形成一种二级结构,该结构中3’段子序列不被暴露,因而不能作为模版的引物,当靶标分子存在时,靶标分子与引物序列结合,形成另外一种二级结构,该结构中3’端子序列游离出来,因而可以与模版配对,并相继引发核酸扩增、聚合反应、荧光增强。
本发明的荧光信号放大体系与核酸扩增的联用方法不限于以上两种方法,核酸扩增领域的文献中所使用核酸扩增方法都可以与本发明的体系联用,并且用于相关的物质的检测。
本发明的信号放大体系还可以与酶联免疫法和核酸扩增同时联用,应用于相关物质的检测。该联用方法需要:酶联免疫法中除了酶标记的抗体抗原之外的试剂和材料,还需要本发明体系中除过氧化物酶之外的组分,同时还包含适配体序列、模版序列,以及核酸聚合酶和核苷酸单体。
联用检测过程中,靶标物质通过特异的结合方式(如抗体抗原结合或适配体-靶标结合等)富集到固相载体上,富集到固相上的靶标物质特异结合其适配体,之后含有适配体序列的核酸的3’末端可以与模版序列配对,在核酸聚合酶作用下发生核酸扩增,扩增的产物富含G四链体结构,结合配合物后可催化底物产生自由基,并引发单体分子的聚合反应,进而通过溶液粘度、颜色变化或荧光增强判断物质的存在。
本发明的荧光放大体系以及上述的各种改进方法都可以做成试纸或试剂盒应用于环境监测、医学诊断等领域。
附图说明
图1为G四链体酶引发丙烯酸聚合的示意图;
图2为凝血酶检测的示意图,101为DNA序列,102为血红素,103为凝血酶;
图3为DNA检测的示意图,201为DNA探针序列,202为靶标序列,203为配合物;
图4为DNA配对的示意图,301为DNA探针序列1,302为DNA探针序列2,303为靶标序列,304为血红素;
图5为汞离子检测示意图,401为DNA序列,402为汞离子,403为血红素;
图6为蛋白质检测示意图,501为适配体序列,502为G四链体序列,503为靶标蛋白质,504为血红素;
图7为ELISA联用法检测蛋白质示意图,601为固相薄膜,602为抗体,603为靶标蛋白,604为适配体序列,605为环模版,606为DNA聚合酶,607为血红素。
具体实施方式
为了说明本发明的原理以及其优势,下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明,其目的在于帮助更好的理解本发明的内容,但这些具体实施方案不以任何方式限制本发明的保护范围。在实际应用中,可以根据具体情况实施最合适的方案。
实施实例3,烯烃类荧光单体应用于凝血酶的检测。
配置25mM的HEPES缓冲液,pH=8,含有:KCl,1mM;血红素,浓度0.001mM;乙酰丙酮,0.001mM;过氧化氢,0.001mM;G四链体序列的DNA,序列:5’-GGTTGGTGTGGTTGG-3’(SEQ IDNO.2),浓度0.0005mM,该序列同时是凝血酶适配体序列;荧光单体,0.1mM,荧光单体为:
上述溶液可以用于凝血酶的检测。加入凝血酶0.0005mM,混匀,20分钟后,荧光增强十几倍。
检测原理如附图2所示:在没有凝血酶103的时候,DNA序列101难以形成稳定的G四链体,因而不能结合血红素,当有凝血酶时,DNA序列101与凝血酶103结合,形成稳定的G四链体结构,并结合血红素102,进而可以催化过氧化氢生成羟基自由基,并引发荧光单体的自由基聚合反应,生成的聚合物中,侧链的四苯乙烯分子通过疏水聚集使荧光增强。
聚合反应方程式为:/>
聚合反应机理与实施实例1类似。
上述体系中,各种物质的浓度、反应温度和时间可以进一步优化,以提高检测灵敏度。
上述体系中,血红素可以用其他金属配合物代替。
上述体系中,乙酰丙酮可以用其它β-二酮代替,也可以用其它自由基转移试剂代替,如巯基化合物等。
上述体系中,还可以加入黄原酸酯、碘化物等,用于抑制链转移和链终止反应,实现活性自由基聚合。
上述体系中,还可以加入丙烯酰胺单体,使聚合产物形成共聚物。
上述体系中,荧光分子可以用其他荧光分子代替,这类荧光分子的设计思路参考发明内容的叙述。
上述体系中,荧光分子还可以不止含有一个反应官能团,例如以下分子:
上述分子可以发生交联聚合反应,形成网状聚合物,因而相对于线性聚合物,分子内旋转更加受限制,更利于荧光增强。
上述各种分子都可以参考本领域已知的文献使用已知的合成方法进行合成制备。
实施实例4,巯基烯炔点击反应应用于DNA检测。
巯基烯炔点击反应与烯烃聚合反应稍有不同,巯基在反应过程中起自由基转移作用,因而极少量的自由基可以引发大量官能团的反应,直到巯基消耗完为止。
配置25mM的HEPES缓冲液,pH=7,含有:100mM的KCl;配合物,浓度0.001mM;巯基化合物单体,0.05mM;烯烃荧光单体,0.05mM;DNA探针序列:5’-GGGTAGGGCGGGTTGGGAGTTAGCACCCAACCC-3’(SEQ ID NO.3),浓度0.0005mM。
其中,配合物为酞菁锰,结构为
巯基化合物单体结构为:
荧光单体为:
上述溶液可以用于靶标DNA检测,靶标序列:5’-TGGGTGCTAACT-3’(SEQ ID NO.4),与探针序列的子序列5’-AGTTAGCACCCA-3’完全互补配对。
对照序列:5’-TGGGTCCTAACT-3’(SEQ ID NO.5),为靶标序列的单个碱基突变序列。
设两组溶液,第一组,加入靶标序列0.0005mM,混匀,20分钟后,荧光增强十几倍。第二组,加入对照序列0.0005mM,混匀,20分钟后,荧光几乎没有增强。
该实验说明该方法可以用于特定序列的核酸检测,并且可以区分单碱基突变,具有较高的选择性。
检测原理如附图3所示:DNA探针序列201的子序列5’-GGGTAGGGCGGGTTG GG-3’为G四链体序列,然而在没有靶标序列的时候,DNA探针序列201通过碱基配对形成二级结构,不形成G四链体,因而不能结合配合物,当有靶标序列202时,DNA与靶标序列通过碱基配对形成另外一种二级结构,并使G四链体序列暴露出来,形成稳定的G四链体结构,并结合配合物203,进而可以催化巯基单体和烯烃单体的共聚反应。
聚合反应产物之一为:
除上述产物外,荧光单体双键可能发生烯烃聚合反应,因而生成的聚合物中,荧光基团的分子运动受限制,使荧光显著增强。
上述体系中,各种物质的浓度、反应温度和时间可以进一步优化,以提高检测灵敏度。
上述体系中,配合物可以用其他金属配合物代替。
上述体系中,按类似的原理,可以使用其它探针序列用于其他序列核酸的检测,不仅可以检测DNA还可以检测RNA。
上述体系中,巯基化合物可以用其它化合物代替,如:
等。
上述体系中,聚合产物不一定需要形成高分子,也可以是寡聚物。
例如:可以用以下两个单体代替上述两个单体,
反应的主要产物为:
该产物中有6个荧光基团,通过分子内的疏水聚集,也可以使荧光明显增强。
实施实例5,巯基烯炔点击反应应用于DNA检测。
配置25mM的HEPES缓冲液,pH=7,含有:100mM的KCl;血红素,浓度0.001m;过氧化氢,浓度0.0005mM;荧光单体,0.05mM;
DNA探针序列1:5’-ATGACTATCTTTAAT GGGTAGGG-3’(SEQ ID NO.6),浓度0.001mM;DNA探针序列2:5’-GGGTTGGG CGTATGGAAAATGAG-3’(SEQ ID NO.7),浓度0.001mM。
其中荧光单体分子为:
上述溶液可以用于靶标DNA检测,可检测的靶标序列为:5’-CTCATTTTCCATACATTAAAGATAGTCAT-3’(SEQ ID NO.8),其5’端子序列CTCATTTTCCATACA可以与探针序列2的3’端子序列CGTATGGAAAATGAG形成互补配对;其3’端子序列TTAAAGATAGTCAT可以与探针序列1的5’端子序列ATGACTATCTTTAAT形成互补配对。
向溶液中加入靶标序列0.001mM,混匀,20分钟后,荧光增强十几倍。
检测原理如附图4所示,说明如下:在没有靶标序列303的时候,两条探针序列301和302游离在溶液中,不形成G四链体,因而不能结合血红素,当有靶标序列时,靶标序列同时与两条探针序列部分互补配对,并使两条探针序列的富G序列端游离出来,在钾离子作用下,形成稳定的G四链体,并结合血红素304,进而可以催化荧光单体的聚合反应。
上述荧光单体即可能发生烯的聚合反应,又可能发生巯基与烯的加成反应,巯基与巯基之间还可能形成二硫键,因而产物为交联聚合物。生成的聚合物中,荧光基团旋转受限,因而荧光增强。聚合反应的可能产物有:
上述体系中,各种物质的浓度、反应温度和时间可以进一步优化,以提高检测灵敏度。
上述体系中,血红素可以用其他金属配合物代替。
上述体系中,按类似的原理,可以使用其他探针序列用于其他序列核酸的检测,不仅可以检测DNA还可以检测RNA。
上述体系中,过氧化氢可以不加,也可以用其他过氧化物代替。
上述体系中,荧光分子可以用其它分子代替,部分优选结构如下:
这些分子可以发生交联聚合反应,使荧光增强更加明显。
实施实例7,苯酚类单体用于三磷酸腺苷的检测。
配置20mM的Tris-HCl缓冲液,pH=7,含有血红素,浓度0.002mM;乙酰丙酮,浓度0.001-0.002mM;过氧化氢,0.5mM;荧光单体分子,0.5mM;ATP(三磷酸腺苷)适配体序列:5’-ACCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGGT-3’(SEQ ID NO.10),浓度0.001mM,该适配体序列可以形成G四链体结构。
其中荧光分子为:
上述溶液可以用于三磷酸腺苷(ATP)的检测,加入0.001mM的ATP,混匀,20分钟后,荧光显著增强。对照组,加入三磷酸鸟苷(GTP)等,没有变化。
检测原理如下:在没有ATP的时候,DNA序列难以形成稳定的G四链体,因而不能结合血红素,当有ATP时,DNA与ATP结合,形成稳定的G四链体结构,并结合血红素,进而可以催化过氧化氢生成羟基自由基,并引发荧光单体的自由基聚合反应,
聚合反应为:
生成的聚合物为共轭聚合物,相对于单体,聚合物中的芳香环更加拥挤,分子旋转受抑制,因而荧光显著增强。
上述体系中,各种物质的浓度、反应温度和时间可以进一步优化,以提高检测灵敏度。
上述体系中,血红素可以用其他金属配合物代替。
上述体系中,乙酰丙酮可以不加,也可以用其它β-二酮代替,也可以用其它自由基转移试剂代替,如巯基化合物等。
上述体系中,荧光分子可以用其他荧光分子代替,这类荧光分子的设计思路参考发明内容的叙述。用在本例子中的一些优选分子有:
实施实例8,基于适配体的免疫球蛋白E的检测。
配制20mM磷酸缓冲液,pH=7,含有:KCl,100mM;血红素,浓度0.001mM;乙酰丙酮,0.001mM;过氧化氢,0.001mM;荧光单体,0.1mM;适配体序列:5’-GGGGCACGTTTATCCGTCCCTCCTAGTGGCGTGCCCC-3’(SEQ ID NO.11),浓度0.0005mM,该适配体序列可以选择性结合免疫球蛋白E;G四链体序列的DNA,序列:5’-GGTAGGAGGGACGGATAAAC-3’(SEQ ID NO.12),浓度0.0005mM,该序列同时可以与适配体序列的部分互补配对。
其中荧光单体为:
上述溶液可以用于免疫球蛋白E的检测。
检测原理如附图6所示,检测过程及原理如下:
将待测样本加入上述溶液中,如果样本中不含免疫球蛋白E(503),则适配体序列501和G四链体序列502保持互补配对,因而不会形成G四链体结构,溶液不会发生变化。如果样本中含有免疫球蛋白E,则适配体序列优先结合免疫球蛋白E,使G四链体序列502解离出来,并形成G四链体,结合血红素504,引发荧光单体的聚合反应,使荧光增强。聚合反应的过程和原理与实施实例3相同。
上述体系中,各种物质的浓度、反应温度和时间可以进一步优化,以提高检测灵敏度。
上述体系中,血红素可以用其他金属配合物代替。
上述体系中,乙酰丙酮可以不加,也可以用其它β-二酮代替,也可以用其它自由基转移试剂代替,如巯基化合物等。
上述体系中,还可以加入黄原酸酯、碘化物等,用于抑制链转移和链终止反应,实现活性自由基聚合。
上述体系中,还可以加入丙烯酰胺单体,使聚合产物形成共聚物。
上述体系中,荧光分子可以用其他荧光分子代替,这类荧光分子的设计思路参考发明内容的叙述。
上述体系中,按照类似原理,使用其它蛋白质的适配体序列,可以用来检测相关的蛋白质。
实施实例9,与滚环扩增联用用于检测DNA序列。
配制50mM Tris-HCl缓冲液,pH=7.5,含有:KCl,100mM;MgCl2,10mM;血红素,浓度0.02mM;乙酰丙酮,0.001mM;过氧化氢,0.02mM;两种单体,浓度均为0.1mM;核苷酸单体dNTP,其中dCTP为0.01mM,dGTP为0.1mM,dATP为0.02mM,dTTP为0.05mM;Phi29 DNA聚合酶;环模版序列,浓度0.00001mM。
其中,两种单体为:
环模版序列为:p CCCAACCCGCCCTACCCAAAACCCAACCCGCCCTACCCAAAACCCAACCCGCCCTACCCAACCACACGATCCTAA(SEQ ID NO.13),其中子序列AACCACACGA TCCTAA与靶标序列5’-TTAGGATCGTGTGGTT-3’(SEQ ID NO.14)完全互补配对,子序列CCCAACCCGCCCTACCC的互补序列可以形成G四链体。
检测过程及原理:将待测样本加入上述溶液中,37摄氏度恒温12小时,如果其中没有靶标序列,或者所含有的DNA与环模板不配对,则溶液不会发生反应。如待测样本中含有靶标序列5’-TTAGGATCGTGTGGTT-3’,则可以与环模板互补配对,进而在Phi29聚合酶催化下发生核酸扩增,扩增产物为模板的互补序列,因而在钾离子存在下形成大量G四链体结构,并结合血红素引发荧光单体的自由基聚合反应,并使荧光增强。
聚合反应的过程和原理与实施实例1类似。
聚合反应为:
该反应中,四苯乙烯单体含有马来酰亚胺结构,可猝灭周围基团的荧光,导致分子本身光很弱,而聚合之后,该结构被破坏,结合聚集诱导发光机理,使荧光增强倍数显著提高。
上述体系中,各种物质的浓度、反应温度和时间可以进一步优化,以提高检测灵敏度。
上述体系中,血红素可以用其他金属配合物代替。
上述体系中,乙酰丙酮可以用其它自由基转移试剂代替,如其它β-二酮化合物等。
上述体系中,还可以加入黄原酸酯、碘化物等,用于抑制链转移和链终止反应,实现活性自由基聚合。
上述体系中,荧光分子可以用其他荧光分子代替,这类荧光分子的设计思路参考发明内容的叙述。
实施实例10,ELISA联用法检测蛋白质。
本例子中,以血小板生长因子B链(PDGF-BB,platelet-derived growth factorB-chain)的检测为例说明本发明与ELISA法联用的方法。
所需材料如下:
固相,固定了PDGF-BB抗体的薄膜,参考免疫检测相关的文献制备。
缓冲液1,清洗缓冲液:20mM磷酸缓冲液,pH=7,含有:140mM NaCl,5mM KCl,1mMCaCl2,1mM MgCl2。
缓冲液2,适配体缓冲液:20mM Tris-HCl缓冲液,pH=7,含有:140mM NaCl,5mMKCl,1mM CaCl2,1mM MgCl2;还有DNA序列:5’-TACTCAGGGCACTGCAAG CAATTGTGGTCCCAATGGGCTGAGTATTTTTGGGTAGGGCGGGTTGGG-3’(SEQ ID NO.15),浓度0.001mM,其中其子序列TACTCAGGGCACTGCAAGCAATTGTGGTCCC AATGGGCTGAGTA为PDGF-BB适配体序列,子序列GGGTAGGGCGGGTTGGG,可以形成G四链体。
缓冲液3,扩增缓冲液:50mM Tris-HCl缓冲液,pH=7.5,含有10mM MgCl2;含有Phi29 DNA聚合酶;核苷酸单体dNTP,其中dCTP为0.01mM,dGTP为0.12mM,dATP为0.01mM,dTTP为0.07mM;环模板,浓度0.001mM。其中,环模板序列为:p CCCAACCCGCCCTACCCAAAACCCAACCCGCCCTACCCAAAACCCAACCCGCCCTACCCAAAACCCAACCCG CCCTACCCAAAA-3’(SEQ IDNO.16)。
缓冲液4,聚合缓冲液:100mM乙酸钾缓冲液,pH=5,含有血红素,浓度0.02mM;乙酰丙酮,浓度0.001-0.002mM;过氧化氢,0.5mM;荧光单体分子,0.5mM,其中荧光单体为:
其中,缓冲液2中的序列的子序列GGGTAGGGCGGGTTGGG,不仅可以形成G四链体,还可以与缓冲液3中环模板序列互补配对,作为引物进行核酸扩展反应。
上述的薄膜和4种缓冲液可以用于PDGF-BB的检测。
检测流程与原理如附图7所示,说明如下:
(1)将薄膜601浸入待测液,如果待测液中有PDGF-BB,则发生抗体抗原结合,使PDGF-BB(603)与薄膜上的抗体602结合固定在薄膜上,
(2)用缓冲液1洗薄膜数次,以去除非特异性吸附的物质,然后浸入缓冲液2,如果膜上有PDGF-BB,则适配体序列与之结合,使DNA序列604固定在薄膜上,
(3)用缓冲液1洗薄膜数次,以去除未被结合的DNA,然后浸入缓冲液3,37摄氏度恒温数小时,如果膜上有DNA序列604,则3’端序列可以与溶液中模板序列605互补配对,并作为引物在DNA聚合酶606作用下发生滚环扩增反应,扩增产物含有大量重复的G四链体序列,并且通过适配体与蛋白质的特异作用固定在薄膜上,
(4)用缓冲液1洗薄膜数次,以去除环模板605、DNA聚合酶606等物质,然后浸入缓冲液4,如果膜上有G四链体序列,则可以结合血红素607,并引发聚合反应,聚合反应的机理参考前面的实施实例或相关文献,聚合产物为聚苯胺衍生物,共轭增加,因而可观察到颜色加深、荧光增强等现象。
上述体系中,有三轮信号放大的过程,分别是:靶标蛋白富集于薄膜上,是第一轮;滚环扩增使G四链体数量倍增,是第二轮;G四链体复合物引发聚合反应,是第三轮。因而该体系具有非常高的灵敏度。
其中,由于上述体系中滚环扩增的引物序列就是G四链体序列,因而也可以不经过第二轮信号放大过程,即省去缓冲液2的浸入和洗涤,直接浸入缓冲液3,以引发聚合反应。
上述体系中,聚合反应不限于苯胺类单体的聚合,也可以使用烯烃聚合、巯基烯炔点击反应等设计检测溶液。
上述体系中,可以加入其它单体,利用共聚反应改进检测条件或灵敏度。
上述体系中,血红素可以用其他金属配合物代替。
类似于前面的实施实例,上述体系中使用的一些试剂可以用其它具有类似功能的试剂代替,各种物质的浓度、反应温度和时间可以进一步优化,以提高检测灵敏度。
上述体系中,荧光分子可以用其他荧光分子代替,这类荧光分子的设计思路参考发明内容的叙述。其中一些优选的单体结构如下:
上述体系中,按照类似原理,可以设计并使用其它蛋白质的适配体序列和抗体,用来检测相关的蛋白质。
上述体系中,适配体序列可以用抗体代替,将抗体和G四链体序列偶联起来,利用双抗体夹心法检测靶标蛋白,并且不限于PDGF-BB的检测。
一些ELISA试剂盒中的部分试剂可以直接应用于这类方法,用于相关物质的检测。例如,上述体系的适配体序列可以用辣根过氧化物酶标记的抗体代替,同时省去核酸序列及滚环扩增过程,用于相关物质的检测。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 湖北中医药大学
<120> 一种荧光检测信号放大体系
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
gggtagggcg ggttggg 17
<210> 2
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
ggttggtgtg gttgg 15
<210> 3
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
gggtagggcg ggttgggagt tagcacccaa ccc 33
<210> 4
<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
tgggtgctaa ct 12
<210> 5
<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
tgggtcctaa ct 12
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
atgactatct ttaatgggta ggg 23
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
gggttgggcg tatggaaaat gag 23
<210> 8
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
ctcattttcc atacattaaa gatagtcat 29
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
gttggaaggc ggaaggttc 19
<210> 10
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
acctggggga gtattgcgga ggaaggt 27
<210> 11
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 11
ggggcacgtt tatccgtccc tcctagtggc gtgcccc 37
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 12
ggtaggaggg acggataaac 20
<210> 13
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 13
cccaacccgc cctacccaaa acccaacccg ccctacccaa aacccaaccc gccctaccca 60
<210> 14
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 14
ttaggatcgt gtggtt 16
<210> 15
<211> 66
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 15
tactcagggc actgcaagca attgtggtcc caatgggctg agtatttttg ggtagggcgg 60
gttggg 66
<210> 16
<211> 84
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 16
cccaacccgc cctacccaaa acccaacccg ccctacccaa aacccaaccc gccctaccca 60
aaacccaacc cgccctaccc aaaa 84
Claims (9)
1.一种荧光检测信号放大体系,组成包括:单体分子、过氧化物酶;
所述单体分子的特征在于:分子中含有反应官能团,反应官能团选自:烯、炔、呋喃、苯胺、苯酚、巯基、环烷、含杂原子的环烷;所述单体分子中至少有一种为荧光单体分子,荧光单体分子的特征在于:分子中含有以苯乙烯为子单元的荧光基团,还含有反应官能团,二者通过共价键连接或者有机单元桥连;其中,反应官能团选自:烯、炔、呋喃、苯胺、苯酚、巯基、环烷、含杂原子的环烷;
过氧化物酶选自蛋白质类过氧化物酶或核酸类过氧化物酶;
所述体系特征在于:在没有酶底物的时候,荧光单体分子分散游离,荧光很弱;当有底物时,过氧化物酶可以催化底物形成自由基,进而引发荧光单体分子的聚合反应,进而使荧光基团的分子运动受限制,并导致荧光增强;
所述荧光单体分子中的荧光基团的结构如下:
2.如权利要求1所述的荧光检测信号放大体系,其组成还包括以下一种或几种物质:链转移剂、稳定自由基、稳定自由基前体、荧光猝灭剂;链转移剂选自巯基化合物或β-二酮;稳定自由基或稳定自由基前体,选自胺氧自由基、烷氧胺、黄原酸酯、碘化物、碘;荧光猝灭剂能够在聚合反应前与荧光分子形成非共价的超分子复合物,通过能量共振转移或者电子转移机理猝灭荧光分子的荧光,从而降低本底荧光。
3.如权利要求1~2任意一项所述的检测信号放大体系,其特征在于,与氧化酶联用,应用于氧化酶底物的检测;与氧化酶联用的体系特征为,不含过氧化物,含有氧化酶;
检测过程是:氧化酶能够催化底物,生成过氧化物,进而被体系中过氧化物酶催化形成自由基,进而引发单体分子的聚合反应,通过溶液粘度或荧光增强判断底物的存在。
4.如权利要求1~3任意一项所述的检测信号放大体系,其特征在于,其中所用过氧化物酶选自核酸构成的过氧化物酶;所述过氧化物酶的特征在于:由可形成G四链体结构的核酸与配合物结合构成;
所述可形成G四链体结构的核酸可以是一条或者多条,它们的序列通式如下:
序列1:
G(G)mG(X1……Y1)G(G)mG(X2……Y2)G(G)mG(X3……Y3)G(G)mG;
序列2:G(G)mG(X1……Y1)G(G)mG(X2……Y2)G(G)mG;
序列3:G(G)mG(X1……Y1)G(G)mG;
序列4:G(G)mG
上述通式中,子序列G(G)mG被子序列(X1……Y1)、(X2……Y2)、(X3……Y3)隔开,其中子序列(X1……Y1)、(X2……Y2)、(X3……Y3)各自独立选自长度为1~20个碱基的核酸序列,其中的每个碱基各自独立选自核酸碱基A、T、G、C、U及其他可以形成氢键配对的修饰的碱基和非天然碱基,m选自0到10的整数;其中序列1只需要一条就可以形成G四链体,序列2、3、4相互组合可以形成G四链体;
所用的配合物特征在于:能够与G四链体核酸发生特异结合;配合物选自卟啉和类卟啉配合物;
所述检测信号放大体系特征是:上述核酸在一定条件下可形成四链体结构,在另外一些条件下形成非四链体的结构;从非四链体向四链体结构的转变,可导致过氧化物酶活性的显著提高,进而引发单体分子的聚合反应和体系荧光的增强;利用核酸序列结构的转变,所述体系可以检测靶标核酸序列、适配体靶标、汞离子;
所述卟啉和类卟啉配合物的结构通式如下:
上述通式中,n选自0-3的整数;Xa,Xb,Xc,Xd各自独立,选自N、C-R、Si-R;Xe,Xf各自独立,选自O、NR、CR1R2;
R1,R2,……R7,R8,各自独立,选自H、F、Cl、Br、I、CN、硝基、亚硝基、OR、SR、NRaRb、NRaRbRc、醛基、羧基、酯基、酰胺、酰肼、肟、胍、磺酸基、磷酸基、R取代的烷基、芳香环及芳香环衍生物;其中R,Ra,Rb,Rc,各自独立,选自H、F、Cl、Br、I、CN、硝基、亚硝基、饱和烷基、不饱和烷基、环烷基、含取代基的烷基、烷氧基、烷基取代的氨基、醛基、羧基、酯基、酰胺、酰肼、肟、胍、磺酸基、磷酸基、芳香环及芳香环衍生物;
A1,A2,A3,A4各自独立,选自芳香环及芳香环衍生物;芳香环选自苯环、呋喃、吡咯、咪唑、噻唑、噁唑、三氮唑、萘环、吡啶、嘧啶、喹啉、异喹啉、喹喔啉、薁,以及上述芳香环的稠环化合物;芳香环衍生物选自含有取代基的上述芳香环化合物,芳香环的取代基参考R1,R2,……R7,R8的描述;
M选自Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Ru、Rh、Sn、Ce金属离子。
5.一种核酸检测信号放大体系,所述体系除了含有如权利要求4所述检测信号放大体系的全部组分之外,还含有核酸探针序列,所述体系可用于检测探针序列的互补序列;所述体系特征在于,G四链体形成的必要条件是探针序列与靶标序列互补配对;形成四链体后,进而可结合配合物并引发自由基反应,通过溶液粘度、荧光强度的变化判断靶标序列的存在。
6.一种含有适配体的检测信号放大体系,所述体系除了含有如权利要求5所述核酸检测信号放大体系的全部组分之外,还含有适配体序列,所述体系可以应用于适配体靶标的检测;所述体系特征在于,G四链体形成的必要条件是适配体序列与靶标形成复合物;形成四链体后,进而可结合配合物并引发自由基反应,通过溶液粘度、荧光强度的变化判断靶标的存在。
7.一种联用检测体系,其特征在于,将权利要求1~6中任意一项检测信号放大体系,与酶联免疫试剂联用,用于抗体或抗原的检测信号放大;所述联用检测体系所需的材料为:酶联免疫所有试剂,以及权利要求1~2中任意一项检测信号放大体系中的全部组分或权利要求3~6中任意一项检测信号放大体系中除氧化酶之外的组分;其中酶联免疫试剂中,标记抗体或抗原的酶为氧化酶;
联用进行检测过程为:在酶联免疫试剂中的氧化酶催化底物产生过氧化氢之后,权利要求1~6中任意一项检测信号放大体系的过氧化物酶接着催化过氧化氢产生自由基,之后是自由基引发单体分子的聚合反应,进而通过溶液粘度、颜色变化或荧光增强判断抗体、抗原物质的存在。
8.一种联用检测体系,其特征在于,将权利要求1~6中任意一项检测信号放大体系,与酶联免疫试剂联用,用于抗体或抗原的检测信号放大;所述联用检测体系所需的材料为:酶联免疫所有试剂,以及权利要求1~6中任意一项检测信号放大体系中除过氧化物酶之外的组分;其中酶联免疫试剂中,标记抗体或抗原的酶为过氧化物酶;
联用进行检测过程为:在酶联免疫试剂中的过氧化物酶催化过氧化氢产生羟基自由基之后,羟基自由基接着引发权利要求1~6中任意一项检测信号放大体系的单体分子的聚合反应,进而通过溶液粘度、颜色变化或荧光增强判断抗体、抗原物质的存在。
9.如权利要求8所述的联用检测体系,其特征在于:使用核酸构成的过氧化物酶代替过氧化物酶标记的抗体或抗原;构成过氧化物酶的核酸的序列特征是:一条含G四链体序列和适配体序列的核酸链,适配体为需要标记的抗体或抗原的适配体;适配体与抗体或抗原特异结合的同时,也使G四链体序列附着在抗体或抗原的表面,结合配合物后就具有了过氧化物酶活性。
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