CN107153052B - 酶引发的自由基聚合反应及检测应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种新型的信号放大体系和方法，可以用于化学生物医学检测。本发明利用过氧化物酶和G四链体过氧化物酶构建自由基引发体系，用于引发自由基聚合，并利用聚集诱导发光实现荧光信号放大。本体系可以实现对核酸的检测和适配体靶标的检测。本方法可以在荧光定量PCR仪上使用，通过荧光信号获得检测物浓度。相对于PCR、滚环扩增等核酸扩增的方法，本方法不涉及核酸扩增的过程，因而不需要DNA聚合酶等价格昂贵的试剂，也不存在核酸的非特异性扩增的问题。本方法还可以与酶联免疫法、ELISA和核酸扩增等方法联用，实现多轮信号放大，并用于抗体抗原的检测。

Description

酶引发的自由基聚合反应及检测应用
技术领域
本发明利用酶引发自由基聚合反应来实现检测信号的放大，属于生物检测、荧光检测领域。
背景技术
荧光传感因为灵敏度高、样品用量少，在化学、生物检测及临床医学诊断方面应用非常广泛。荧光传感离不开荧光探针的设计与合成，荧光探针可以与样本中的目标分子结合或发生化学反应，从而使探针分子的荧光发生改变，再通过仪器或肉眼观察即可判断样本中目标分子的含量。
为了提高荧光信号的强度，一般将酶反应或者催化剂引入到检测体系中，使荧光信号放大，从而提高检测的灵敏度。酶联免疫法，包括酶联免疫吸附测定法 (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA) 在分析化学领域中应用广泛，已经成为抗体抗原检测的主要方法之一。在这种测定方法中有3种必要的试剂：固相的抗原或抗体、酶标记的抗原或抗体、酶作用的底物。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。其检测原理和过程为：首先使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性；其次使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性；在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应，用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅来进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，故有信号放大的效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。
核酸扩增是核酸聚合酶催化的特殊聚合反应，在检测信号放大中应用广泛。根据核酸扩增反应中温度变化要求，可以将核酸扩增技术分为两大类：一类是聚合酶链式反应（PCR）技术，另一类是核酸恒温扩增技术。无论是PCR技术还是恒温扩增技术，它们信号放大的本质都是扩增特定序列的DNA片段，能将微量的DNA数量级倍扩增，从而大大提高检测灵敏度。一个PCR反应需要以下几种物质的参与：模板序列，引物序列，DNA聚合酶，核苷酸单体。模板序列为需要被放大的DNA序列，含量很少，其他三种物质都是足量的。在一轮扩增反应中，引物与模板结合后在聚合酶催化下，与核苷酸单体发生聚合反应，形成新的DNA链可以做为下一轮扩增反应的模板，因而每一轮扩增之后，模板数量翻倍，十几轮扩增后模板DNA数量增加了几千上万倍，结合双链DNA染料后荧光显著增加。核酸等温扩增技术是在PCR技术基础上发展的核酸扩增技术，如链替代等温扩增、滚环扩增及环介导等温扩增等，这些扩增技术同样用到模版序列和DNA聚合酶，及核苷酸单体等，恒温扩增技术在实际操作和仪器要求方面比PCR技术更为简单方便，近些年在核酸检测领域也有许多发展和应用（参考文献：Chem. Rev. 2015, 115, 12491−12545；J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 7430-743等）。
正因为PCR等核酸扩增技术的序列特异性及扩增的高效性，这些技术可以用于非常微量的核酸序列检测，已经在医学临床诊断和刑事侦查鉴定中有，例如传染病病原体的确认、亲子鉴定等。近些年结合核酸适配体技术，PCR等核酸扩增技术不仅用于序列特异性的检测，还用于各种适配体靶标的检测（如蛋白质、小分子、金属离子等）。一种具体的实施方式为：适配体与靶标分子结合之后，核酸二级结构发生变化，释放了核酸扩增的模板，使PCR等核酸扩增反应得以进行（参考中国专利：申请号：2004800276961、2008100276529、2013106651410、2012105913322等）。
然而，PCR等核酸扩增技术也存在各种问题，核酸扩增技术的序列特异性不是绝对的，样品易污染，不同的核酸序列存在扩增差异，还存在非特异性扩增、脱靶效应等，因而会造成假阳性的结果。在临床检测中，为了避免样本的污染，国内外法律严格规定PCR反应需要由四个无菌实验室进行。其中我国《医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法》、《医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则》明确规定：原则上临床基因扩增检验实验室应当设置以下区域：试剂储存和准备区、标本制备区、扩增区、扩增产物分析区。这使得PCR检测的成本及操作的复杂性大大增加。此外基于核酸扩增技术对引物设计，聚合酶和核苷酸单体（dNTP）等试剂的要求较高，也提高了检测价格。
为了简化操作、降低成本，急发展需其他的信号放大方式来弥补PCR等核酸扩增反应的不足。无论是核酸扩增还是酶联免疫法，都是将酶等催化剂引入检测体系。因而发展新型的催化剂并将其引入检测体系中，就有望获得新的信号放大方式。
Fenton反应由法国科学家Fenton发现，主要反应过程是过氧化氢被亚铁或铁离子催化分解生成羟基自由基（参考文献：环境化学，2006，25，《Fenton及Photo-Fenton反应研究进展》）。后来的研究发现：许多其它金属离子也能够催化该反应，如Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Mo等金属元素的离子，并且，当一些金属离子与有机配体结合形成配合物之后（包括金属卟啉、金属酞菁、金属希夫碱等配合物），催化活性可显著提高。
最近几十年的研究表明，上述一些金属配合物与蛋白质或者核酸等生物分子结合之后，催化活性又有显著提高。一个典型的例子是过氧化物酶，过氧化物酶种类繁多，以辣根过氧化物酶的研究应用最为广泛。辣根过氧化物酶（HRP，EC.1.11.1.7）是一种来源广泛的植物过氧化物酶，该酶由多肽链包裹血红素构成，它可以在非常温和的条件（常温常压和中性pH）下高效催化过氧化氢生成羟基自由基。
另外一个提高金属配合物过氧化物酶活性的方法是将配合物与核酸链结合。
许多文献报道血红素可以与G四链体结构的DNA形成特异结合，并且该复合物具有过氧化物酶活性（参考文献Chem. Biol. 1998, 5, 505-517；Chem. Biol. 1999, 6, 779-787），在一定条件下可以产生自由基（参考文献：J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 1337-1348），进而可以通过自由基反应使一些物质颜色改变或出现化学发光。此外能够形成G四链体的DNA在溶液中会存在两种状态：一种是无规则结构，不能结合血红素等配合物；另一种是G四链体结构。这两种结构可以在一定条件下相互转换。利用这种性质可以设计出各种以G四链体为基础的分子元件，并应用于核酸杂交的检测以及适配体传感器的构建（参考文献：Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2008, 47, 3927-3931；J. Am. Chem. Soc. 2004,126, 7430-7431；Anal. Chem. 2009, 81, 2144-2149；Chembiochem. 2004, 5, 374-379；Acc. Chem. Res., 2013, 46，203–213；Chem. Rev., 2009, 109, 1948–1998；Chem.Rev., 2014, 114, 2881–2941）。
无论是Fenton反应（包括改进的Fenton反应，以及金属配合物催化的Fenton反应），还是过氧化物酶催化反应，又或者是G四链体与血红素的复合物的催化反应，催化速率虽然各不相同，但是这些过程都会产生高活性的羟基自由基，进而可以引发自由基反应，包括自由基聚合反应，因而这些反应或者催化剂广泛应用于有机合成、聚合物合成、废水处理、化学和生物学检测等领域。
其中Fenton反应和辣根过氧化物酶在自由基聚合反应中有很多应用，可以引发烯烃、苯酚等物质的自由基聚合（参考文献：Polymer 2000，41，8183-8192；Polymer 2013，54，1775-1778；Macromolecules 2015, 48, 7792−7802等）。相比之下，G四链体型的过氧化物酶还很少用于自由基聚合，只有少量文献报道了G四链体-血红素复合物可以催化聚苯胺的生成（参考文献Biosensors and Bioelectronics，2015，69，230–234；Chem. Sci., 2015,6, 6659–6664；Sensors and Actuators B，2014，190，384–388；ACS Nano, 2013, 7，1591–1598等）。
自由基聚合是指烯炔类单体，通过自由基链式加成聚合形成聚合物的反应。由于许多单体能进行自由基聚合，能用水为介质进行悬浮和乳液聚合，聚合工艺操作简便，其重现性好，因而自上世纪50年代以来已成为工业生产高分子产品的重要技术。自由基聚合的过程包括引发、链增长、链转移、链终止等过程。由于存在链转移和链终止反应，传统自由基聚合不能较好地控制分子量及大分子结构。为此，人们发展了活性自由基聚合，（参考文献：US．Patent，6538091．2003；Science，1996，1，769-776等），即向体系中加入一个与增长自由基之间存在着偶合-解离可逆反应的试剂，以抑制增长自由基浓度，减少双基终止的发生。这种能够与自由基发生可逆反应的试剂可以是自由基转移剂、稳定自由基等。根据这种可逆反应的不同，人们分别发展了引发转移终止剂（iniferter）法、稳定自由基聚合（stablefree radical po1ymerization，SFRP）、氮氧自由基调控聚合（nitroxide-mediatedpo1ymeIization，NMP），可逆加成断裂链转移聚合（reversible addition-fragmentationchain transfer，RAFT），原子转移自由基聚合（Atom Transfer Radical Polymerization,ATRP）等（参考文献：高分子通报，2008，7，丘坤元《自由基聚合近20年的发展》）。
2001年，唐本忠等人发现了聚集诱导发光（AIE）现象：荧光分子在溶液状态下荧光很弱甚至不发光，而在固态或者聚集态中发光。其原理是聚集态中的分子的旋转受限导致非辐射弛豫受阻而使荧光增强。近十多年，人们发展了许多具有聚集诱导发光性能的荧光分子，并且这类分子已经广泛应用于荧光探针的设计和荧光检测成像（参考文献Chem.Rev. 2015, 115, 11718−11940；中国专利：CN104845607A、CN102219723A、CN104877665A、CN104004510A、CN103842472A、CN104326861A、CN104974745A、CN104447582A、CN103896825B、CN103788940B、CN101928559B、CN102702096B、CN101659865B等）。
具有AIE现象的分子的结构特征是分子通过单键连接多个芳香环，大多包含苯乙烯单元，当分子以游离形式分散在溶液中时，分子内单键的旋转导致激发态以非辐射方式弛豫到基态，而当分子聚集或者其它原因使分子内旋转受阻时，导致非辐射弛豫渠道被抑制，辐射弛豫增强而发光。这类分子虽然大多是多芳环的共轭体系，但是由于空间位阻导致分子内的芳环不共平面，芳环之间存在较大的二面角，这种结构特点使其在聚集态中芳环不容易形成面对面的堆积，不会形成激基缔合物或激基复合物，因而这类分子在聚集态中分子的荧光不容易被猝灭。
用聚集诱导发光分子设计荧光探针的主要思路是：通过与靶标分子的结合使探针分子聚集，或者使探针分子的分子内旋转受抑制，从而使荧光增强。在一些生物大分子（如核酸、蛋白质、肝素）的检测中（参考文献：Chem. Commun. 2006, 3705；Chem. Commun.2014, 50, 6494；ACS Appl. Mater. Inter. 2014, 6, 18344），聚集诱导发光的探针可以通过氢键、静电作用或疏水相互作用聚集到这些生物聚合物周围，从而使荧光增强。然而，这些聚合物的单体并不能使聚集诱导发光的探针荧光增强。
发明内容
本发明提供一种新型的荧光信号放大方法，不用DNA聚合酶，不涉及核酸扩增反应，该方法适用范围广泛，可以用于离子、小分子、生物大分子的检测，包括核酸序列的检测、适配体靶标的检测以及抗体抗原的检测。
为了实现上述目的，本发明利用过氧化物酶构建自由基引发体系，用于引发自由基聚合反应，并利用聚集诱导发光的荧光分子实现荧光信号放大。
该信号放大体系的必要组成包括：过氧化物酶、荧光分子、单体分子。其中荧光分子和单体分子可以是一个整体，也可以是分开的两类分子。该体系特征在于：在没有酶底物的时候，荧光分子分散游离，荧光很弱；当有底物时，过氧化物酶可以催化底物形成自由基，进而引发单体分子的聚合反应，进而使荧光基团聚集或者分子运动受限制，并导致荧光增强。
下面详细介绍上述体系的各种组分。
上述体系中，过氧化物酶选自蛋白质构成的过氧化物酶或核酸构成的过氧化物酶，使用不同的过氧化物酶，可以用来检测不同的物质。其中蛋白质构成的过氧化物酶通过从生物中提取获得，本发明的优选的过氧化物酶来源于植物中的过氧化物酶，其中优选的植物过氧化物酶为辣根过氧化物酶。
上述体系中，若采用核酸构成的过氧化物酶，则该过氧化物酶的特征在于：由配合物结合一条或多条核酸链构成。所用的核酸不论是一条还是多条，都可以形成G四链体结构，符合要求的核酸序列通式如下：
序列1：G(G)mG(X1……Y1)G(G)mG(X2……Y2)G(G)mG(X3……Y3)G(G)mG
序列2：G(G)mG(X1……Y1)G(G)mG(X2……Y2) G(G)mG
序列3：G(G)mG(X1……Y1)G(G)mG
序列4：G(G)mG
上述通式中，子序列G(G)mG被子序列(X1……Y1) 、(X2……Y2)、 (X3……Y3)隔开，其中子序列(X1……Y1) 、(X2……Y2)、 (X3……Y3)各自独立选自长度为1-20个碱基的核酸序列，其中的每个碱基各自独立选自核酸碱基A、T、G、C、U及其他可以形成氢键配对的修饰的碱基和非天然碱基，m选自0到10的整数。
以上序列均具有形成G四链体的潜力，其中序列1只需要一条就可以形成G四链体，序列2、3、4相互组合可以形成G四链体。在具体的实施方式中，可以根据检测体系中适配体的序列或者待测核酸序列的特点，设计合适的G四链体序列和使用的核酸链数，以达到最佳的检测效果。
上述核酸构成的过氧化物酶中，所用的配合物可以与G四链体结合，这些配合物为卟啉和类卟啉配合物。
卟啉和类卟啉配合物结构通式如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
或
Figure DEST_PATH_IMAGE002
或
Figure DEST_PATH_IMAGE003
。
上述所有通式中，n选自0-3的整数；
Xa，Xb，Xc，Xd各自独立，选自N、C-R等；Xe，Xf各自独立，选自O、NR、CR1R2；
R1，R2，……R7，R8，各自独立，选自H、F、Cl、Br、I、CN、硝基、亚硝基、R、OR、SR、NRaRb、NRaRbRc、醛基、羧基、酯基、酰胺、酰肼、肟、胍、磺酸基、磷酸基、R取代的烷基、芳香环及芳香环衍生物等；其中R，Ra，Rb，Rc，各自独立，选自H、F、Cl、Br、I、CN、硝基、亚硝基、饱和烷基、不饱和烷基、环烷基、含取代基的烷基、烷氧基、烷基取代的氨基、醛基、羧基、酯基、酰胺、酰肼、肟、胍、磺酸基、磷酸基、芳香环及芳香环衍生物等；
A1，A2，A3，A4各自独立，选自芳香环及芳香环衍生物等；芳香环选自苯环、呋喃、吡咯、咪唑、噻唑、噁唑、三氮唑、萘环、吡啶、嘧啶、喹啉、异喹啉、喹喔啉、薁等，以及上述芳香环的稠环化合物；芳香环衍生物选自含有取代基的上述芳香环化合物，芳香环的取代基参考R1，R2，……R7，R8的描述；
M选自任意的金属离子。Ma选自任意的金属离子，优先选自能够形成平面型配合物的金属离子，如Pt2+、Ni2+。
上述通式中，一些卟啉和类卟啉配合物配体的优选结构如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE004
、
Figure DEST_PATH_IMAGE005
、
Figure DEST_PATH_IMAGE006
、
Figure DEST_PATH_IMAGE007
、
Figure DEST_PATH_IMAGE008
、
Figure DEST_PATH_IMAGE009
、
Figure DEST_PATH_IMAGE010
、
Figure DEST_PATH_IMAGE011
、
Figure DEST_PATH_IMAGE012
、
Figure DEST_PATH_IMAGE013
、
Figure DEST_PATH_IMAGE014
、
Figure DEST_PATH_IMAGE015
、
Figure DEST_PATH_IMAGE016
、
Figure DEST_PATH_IMAGE017
、
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、
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、
Figure DEST_PATH_IMAGE020
Figure DEST_PATH_IMAGE021
、
Figure DEST_PATH_IMAGE022
、
Figure DEST_PATH_IMAGE023
、
Figure DEST_PATH_IMAGE024
、
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Figure DEST_PATH_IMAGE026
、
Figure DEST_PATH_IMAGE027
、
Figure DEST_PATH_IMAGE028
、
Figure DEST_PATH_IMAGE029
、
Figure DEST_PATH_IMAGE030
、
Figure DEST_PATH_IMAGE031
、
Figure DEST_PATH_IMAGE032
、
Figure DEST_PATH_IMAGE033
。
上述配合物中的优选配合物有：
Figure DEST_PATH_IMAGE034
、
Figure DEST_PATH_IMAGE035
、
Figure DEST_PATH_IMAGE036
，
其中M选自：Mn2+、Fe2+、Co2+、Ni2+、Cu2+、Ru2+。
其中血红素结构为：
Figure DEST_PATH_IMAGE037
。
这些配体及配合物，有些通过化学合成获得，有些可以从生物体中提取获得，具体制备方法可以参考本领域已知的文献。
本发明所采用的配合物和配体不限于上述几类化合物，凡是与G四链体具有较高结合常数的配体或配合物都可以应用于本发明中。
这些G四链体与配合物的复合物与一些氧化剂联用（氧化剂选自氧气、过氧化氢、过氧化物、过硫酸盐等）可以作为引发剂引发烯烃、炔烃、环氧丙烷、环氧乙烷、苯酚、苯胺等物质的自由基聚合反应以及巯基-烯炔点击反应。除了应用于荧光信号放大之外，这类复合物还可以应用于有机合成或者高分子合成领域，其反应条件温和，适合于一些水溶性单体的自由基聚合，而且作为引发剂的核酸成分，毒性小，对环境不产生污染，相对于传统的自由基引发剂，具有明显的环保优势。
该信号放大体系使用一种自由基聚合反应就可以达到目的。
为了使聚合反应能够发生，该信号放大体系使用的单体需要含有能够发生自由基反应的官能团。符合该要求的反应官能团有烯、炔、呋喃、苯胺、苯酚、巯基、环烷、含杂原子的环烷等。它们的结构通式如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE038
、
Figure DEST_PATH_IMAGE039
、
Figure DEST_PATH_IMAGE040
、
Figure DEST_PATH_IMAGE041
、
Figure DEST_PATH_IMAGE042
、
Figure DEST_PATH_IMAGE043
、
Figure DEST_PATH_IMAGE044
其中
Figure DEST_PATH_IMAGE045
表示连接有取代基；X选自
Figure DEST_PATH_IMAGE046
、
Figure DEST_PATH_IMAGE047
、
Figure DEST_PATH_IMAGE048
、
Figure DEST_PATH_IMAGE049
；
J选自
Figure 573239DEST_PATH_IMAGE046
、
Figure DEST_PATH_IMAGE050
、
Figure DEST_PATH_IMAGE051
、
Figure DEST_PATH_IMAGE052
、
Figure 428062DEST_PATH_IMAGE047
、
Figure 207799DEST_PATH_IMAGE048
、
Figure 71850DEST_PATH_IMAGE049
。
除巯基之外，其它任意一种官能团均可以发生自由基聚合反应，其中一些反应通式如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE053
，
Figure DEST_PATH_IMAGE054
，
Figure DEST_PATH_IMAGE055
，
Figure DEST_PATH_IMAGE056
，
Figure DEST_PATH_IMAGE057
，
Figure DEST_PATH_IMAGE058
，
上述官能团相互组合还可以发生共聚反应，不一一列举。
巯基在自由基引发条件下，可以与烯、炔发生下面的反应：
Figure DEST_PATH_IMAGE059
，
Figure DEST_PATH_IMAGE060
，
Figure DEST_PATH_IMAGE061
。
在一个单体中，反应官能团的个数可以不止一个，反应官能团的种类可以不止一种。单体中反应官能团的种类和个数不同，聚合反应可以是一种或者多种官能团的聚合反应，聚合产物可以是链状、网状、树枝状。
当含有巯基的单体中还含有烯或者炔官能团时，该单体也可以通过均聚反应生成聚合物，其反应式可表示如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE062
；
当单体含有多个巯基时，该单体可以与烯烃、炔烃单体通过共聚反应生成聚合物，其反应式可表示如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE063
；
如果单体中只含有一个巯基，则多烯烃、多炔烃的化合物可以与很多这样的单体反应，形成低聚物，其反应式可表示如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE064
。
上述类型的反应均可以应用在本荧光信号放大体系中。
聚合反应的产物可以为链式，也可以为树枝状聚合物，也可以为网状聚合物。
聚合反应的产物不一定是高分子，也可以是寡聚物、低分子量聚合物、树枝状分子，只要产物能够达到使荧光分子荧光增强的效果即可。
形成的聚合物可以通过非共价的分子间相互作用进一步形成超分子聚合物，从而诱导更多荧光分子荧光增强。
为了使单体分子能够在水溶液中发生聚合，所采用的单体应该有一定的水溶性。增强水溶性的方式就是在分子上修饰亲水性的官能团，如羟基、氨基、胺、铵、鏻、烷氧链、羧基、磺酸基、磷酸基、磷酸酯、烷基硼基、苯基硼等。
该信号放大体系使用的荧光分子的结构特征是分子通过单键连接多个芳香环，大多包含苯乙烯单元。这种分子的结构特点使得这类分子大多具有聚集诱导发光性质，即当分子以游离形式分散在溶液中时，分子内单键的旋转导致激发态以非辐射方式弛豫到基态，而当分子聚集或者其它原因使分子内旋转受阻时，导致非辐射弛豫渠道被抑制，辐射弛豫增强而发光。这类分子虽然大多是多芳环的共轭体系，但是由于空间位阻导致分子内的芳环不共平面，芳环之间存在较大的二面角，这种结构特点使其在聚集态中芳环不容易形成面对面的堆积，不会形成激基缔合物或激基复合物，因而这类分子在聚集态中分子的荧光不容易被猝灭。
荧光基团优先选自以苯乙烯为子单元的荧光基团，以及它们的衍生物，这类荧光基团种类繁多，可参考聚集诱导发光领域的已知文献选择合适的单元并设计、合成分子。其中一些优选的结构单元如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE065
、
Figure DEST_PATH_IMAGE066
、
Figure DEST_PATH_IMAGE067
、
Figure DEST_PATH_IMAGE068
、
Figure DEST_PATH_IMAGE069
、
Figure DEST_PATH_IMAGE070
、
Figure DEST_PATH_IMAGE071
、
Figure DEST_PATH_IMAGE072
、
Figure DEST_PATH_IMAGE073
、
Figure DEST_PATH_IMAGE074
、
Figure DEST_PATH_IMAGE075
、
Figure DEST_PATH_IMAGE076
、
Figure DEST_PATH_IMAGE077
、
Figure DEST_PATH_IMAGE078
、
Figure DEST_PATH_IMAGE079
、
Figure DEST_PATH_IMAGE080
、
Figure DEST_PATH_IMAGE081
、
Figure DEST_PATH_IMAGE082
、
Figure DEST_PATH_IMAGE083
、
Figure DEST_PATH_IMAGE084
、
Figure DEST_PATH_IMAGE085
、
Figure DEST_PATH_IMAGE086
、
Figure DEST_PATH_IMAGE087
、
Figure DEST_PATH_IMAGE088
。
从这些单元衍生出的荧光分子，有的具有较好的水溶性，可以直接用于该信号放大体系，而有的需要在其结构基础上进行简单修饰或功能化，增强水溶性，以避免荧光分子在水溶液中发生自聚集而荧光增强。
一个荧光分子中所含荧光单元的种类不限于一种，荧光单元的个数也不限于一个，可以根据实际需要合理设计。
这些聚集诱导发光的分子溶解在溶液中，发光较弱甚至不发光。
为了使这种聚集诱导发光的荧光分子能够在聚合反应之后聚集而荧光增强，本发明采用两大类方式来实现：
第一类方式中，荧光分子不参与聚合反应，聚合反应后生成的聚合物的主链或者侧链含有具有结合功能的基团，这些具有结合功能的基团可以通过疏水作用、π-π作用、静电作用、配位作用、氢键作用、可逆共价键结合荧光分子使其聚集在聚合物周围而荧光增强；
第二类方式中，荧光分子参与聚合反应，聚合反应后，荧光分子通过共价键连接而聚集到一起，进而使荧光基团的分子运动受限制而荧光增强。
下面分别论述两类方式的反应单体和荧光分子的设计。
第一类方式中，为了使荧光分子可以结合聚合物，聚合反应后生成的聚合物的主链或者侧链含有具有结合功能的基团，荧光分子也需含有具有结合功能的基团，以便结合到聚合物上。这些具有结合功能的基团不一定在聚合反应之前就存在，它们可以存在于聚合反应前的单体和荧光分子上，或者在聚合反应之后生成。
这些具有结合功能的基团有羧基、磺酸基、磷酸基、磷酸酯基、连有芳香环的羟基、羟基、硼酸基、芳香环取代的硼酸基、氨基、胺基、含取代基的胺基、亚胺基、肟基、胍基、含取代基的胍基、膦基、含氮杂环的季铵盐、含金属的配合物基、含芳香环的基团、容易形成氢键的基团、巯基等。
这些基团大致可以分为以下几类：阴离子类、阳离子类、配合物类、其它结合基团。
现列举一些上述具有结合功能的基团如下：
阴离子类：
Figure DEST_PATH_IMAGE089
、
Figure DEST_PATH_IMAGE090
、
Figure DEST_PATH_IMAGE091
、
Figure DEST_PATH_IMAGE092
、
Figure DEST_PATH_IMAGE093
、
Figure DEST_PATH_IMAGE094
、
Figure DEST_PATH_IMAGE095
；
其中，
Figure DEST_PATH_IMAGE096
表示此处可以连接其他取代基团，如H、烷基、苯、烷氧基、含取代基的烷基、含取代基的苯等，可以根据具体情况选择合适的取代基；
其中一些优选结构如下：
Figure 613120DEST_PATH_IMAGE089
、
Figure 904425DEST_PATH_IMAGE091
、
Figure DEST_PATH_IMAGE097
、
Figure DEST_PATH_IMAGE098
、
Figure DEST_PATH_IMAGE099
、
Figure DEST_PATH_IMAGE100
、
Figure DEST_PATH_IMAGE101
。
阳离子类：
Figure DEST_PATH_IMAGE102
、
Figure DEST_PATH_IMAGE103
、
Figure DEST_PATH_IMAGE104
；
其中，
Figure 46824DEST_PATH_IMAGE096
表示此处可以连接其他取代基团，如H、烷基、苯、烷氧基、含取代基的烷基、含取代基的苯等，可以根据具体情况选择合适的取代基；
其中一些优选结构如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE105
、
Figure DEST_PATH_IMAGE106
、
Figure DEST_PATH_IMAGE107
、
Figure DEST_PATH_IMAGE108
、
Figure DEST_PATH_IMAGE109
、
Figure DEST_PATH_IMAGE110
、
Figure DEST_PATH_IMAGE111
、
Figure DEST_PATH_IMAGE112
。
配合物类：
Figure DEST_PATH_IMAGE113
、
Figure DEST_PATH_IMAGE114
；
其中，
Figure 527615DEST_PATH_IMAGE096
表示此处可以连接其他取代基团，如H、烷基、苯、烷氧基、含取代基的烷基、含取代基的苯等，可以根据具体情况选择合适的取代基；
其中一些优选结构如：
Figure DEST_PATH_IMAGE115
、
Figure DEST_PATH_IMAGE116
、
Figure DEST_PATH_IMAGE117
、
Figure DEST_PATH_IMAGE118
。
上述基团中，阴离子类和阳离子类基团可以通过静电作用、氢键作用结合到一起，几种优选的结合方式如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE119
、
Figure DEST_PATH_IMAGE120
、
Figure DEST_PATH_IMAGE121
。
阴离子类基团还可以通过配位作用结合配合物类基团，例如：
Figure DEST_PATH_IMAGE122
、
Figure DEST_PATH_IMAGE123
、
Figure DEST_PATH_IMAGE124
。
除上述几类基团外，还有许多基团可以通过π-π作用、氢键等弱相互作用结合另外一些基团，也可以应用于本发明中，其中一些基团的结构如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE125
、
Figure DEST_PATH_IMAGE126
、
Figure DEST_PATH_IMAGE127
、、
Figure DEST_PATH_IMAGE128
、
Figure DEST_PATH_IMAGE129
、
Figure DEST_PATH_IMAGE130
、
Figure DEST_PATH_IMAGE131
、
Figure DEST_PATH_IMAGE132
、
Figure DEST_PATH_IMAGE133
、
Figure DEST_PATH_IMAGE134
、
Figure DEST_PATH_IMAGE135
、
Figure DEST_PATH_IMAGE136
。
它们通过π-π作用、氢键结合其它基团的方式如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE137
、
Figure DEST_PATH_IMAGE138
、
Figure DEST_PATH_IMAGE139
、
Figure DEST_PATH_IMAGE140
、
Figure DEST_PATH_IMAGE141
、
Figure DEST_PATH_IMAGE142
、
Figure DEST_PATH_IMAGE143
、
Figure DEST_PATH_IMAGE144
。
π-π作用、氢键是分子间的弱相互作用，能够形成π-π作用或氢键的分子远不止上述几种，均可应用与本发明中。
除了上述几种结合方式，可逆共价键也可以用来构建聚合物与荧光分子的结合，这些具有结合功能的基团有：
Figure DEST_PATH_IMAGE145
、
Figure DEST_PATH_IMAGE146
、
Figure DEST_PATH_IMAGE147
、
Figure DEST_PATH_IMAGE148
、
Figure DEST_PATH_IMAGE149
、
Figure DEST_PATH_IMAGE150
等。
现列举一些优选结构表示可逆共价键的结合：
Figure DEST_PATH_IMAGE151
，
Figure DEST_PATH_IMAGE152
，
Figure DEST_PATH_IMAGE153
，
Figure DEST_PATH_IMAGE154
。
根据上述几种结合方式，选择并设计相应的单体和荧光分子。聚合反应的单体或者荧光分子不一定含有具有结合功能的基团，只需要在聚合反应之后生成的聚合物和荧光分子含有上述一种具有结合功能的基团即可。
如果单体和荧光分子含有具有结合功能的官能团，则单体分子和相应的荧光分子的的设计思路如下：
由于核酸是带负电荷的，为了避免聚合反应的产物干扰核酸G四链体的形成，因而聚合物的单体分子除含反应官能团之外，其所含的具有结合功能的基团优先选择电中性、两亲性或者阴离子型基团，相对的，荧光分子所含的具有结合功能的基团优先选择电中性、两亲性或者阳离子型基团。无论单体分子还是荧光分子，都不限于只含有一种符合要求的具有结合功能的基团，也可以是多种基团的组合，并且可以含有重复的基团。
除了含有具有结合功能的基团外，单体还含有符合聚合反应条件的官能团，具体要求参考前面对聚合反应条件的叙述。具有结合功能的基团和反应官能团相互组合，通过共价键连接或者有机单元桥连可以构建无数符合要求的单体分子，均可以应用于本发明中。
这类单体结构通式为：
Figure DEST_PATH_IMAGE155
其中，RG为反应官能团，BG为具有结合功能的基团，L为连接基团，x、z为非0的整数，y为0-20的整数。该通式表示一个分子中连接有x个反应官能团和z个具有结合功能的基团。即使x和z为1，y为0，反应官能团和具有结合功能的基团的排列组合仍然太多，不一一列举，只列出少数优选的单体分子结构如下，这些结构并不限制本发明的保护范围，单体分子的优选结构有：
Figure DEST_PATH_IMAGE156
、
Figure DEST_PATH_IMAGE157
、
Figure DEST_PATH_IMAGE158
、
Figure DEST_PATH_IMAGE159
、
Figure DEST_PATH_IMAGE160
、
Figure DEST_PATH_IMAGE161
、
Figure DEST_PATH_IMAGE162
、
Figure DEST_PATH_IMAGE163
、
、
Figure DEST_PATH_IMAGE164
、
Figure DEST_PATH_IMAGE165
、
Figure DEST_PATH_IMAGE166
、
Figure DEST_PATH_IMAGE167
、
Figure DEST_PATH_IMAGE168
、
Figure DEST_PATH_IMAGE169
、
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、
Figure DEST_PATH_IMAGE171
、
Figure DEST_PATH_IMAGE172
、
Figure DEST_PATH_IMAGE173
、
Figure DEST_PATH_IMAGE174
、
Figure DEST_PATH_IMAGE175
、
Figure DEST_PATH_IMAGE176
、
Figure DEST_PATH_IMAGE177
、
Figure DEST_PATH_IMAGE178
、
Figure DEST_PATH_IMAGE179
、
Figure DEST_PATH_IMAGE180
、
Figure DEST_PATH_IMAGE181
、
Figure DEST_PATH_IMAGE182
、
Figure DEST_PATH_IMAGE183
、
Figure DEST_PATH_IMAGE184
、
Figure DEST_PATH_IMAGE185
、
Figure DEST_PATH_IMAGE186
、
Figure DEST_PATH_IMAGE187
、
Figure DEST_PATH_IMAGE188
、
Figure DEST_PATH_IMAGE189
、
Figure DEST_PATH_IMAGE190
、
Figure DEST_PATH_IMAGE191
、
Figure DEST_PATH_IMAGE192
、
Figure DEST_PATH_IMAGE193
、
Figure DEST_PATH_IMAGE194
、
Figure DEST_PATH_IMAGE195
、
Figure DEST_PATH_IMAGE196
、
Figure DEST_PATH_IMAGE197
、
Figure DEST_PATH_IMAGE198
、
Figure DEST_PATH_IMAGE199
、
Figure DEST_PATH_IMAGE200
、
Figure DEST_PATH_IMAGE201
、
Figure DEST_PATH_IMAGE202
、
Figure DEST_PATH_IMAGE203
、
Figure DEST_PATH_IMAGE204
、
Figure DEST_PATH_IMAGE205
、
Figure DEST_PATH_IMAGE206
、
Figure DEST_PATH_IMAGE207
、
Figure DEST_PATH_IMAGE208
、
Figure DEST_PATH_IMAGE209
、
Figure DEST_PATH_IMAGE210
、
Figure DEST_PATH_IMAGE211
、
Figure DEST_PATH_IMAGE212
。
除了含有具有结合功能的基团外，荧光分子还含有具有聚集诱导发光的荧光单元，具体要求参考前面的叙述。具有结合功能的基团和荧光基团相互组合，通过共价键连接或者有机单元桥连可以构建无数符合要求的荧光分子，均可以应用于本发明中。
这类荧光分子结构通式为：
Figure DEST_PATH_IMAGE213
其中，F为荧光单元，BG为具有结合功能的基团，L为连接基团，x、z为非0的整数，y为0-20的整数。该通式表示一个分子中连接有x个荧光单元和z个具有结合功能的基团。即使x和z为1，y为0，荧光单元和具有结合功能的基团的排列组合仍然太多，不一一列举，只列出少数优选的荧光分子结构如下，这些结构并不限制本发明的保护范围，荧光分子的优选结构有：
Figure DEST_PATH_IMAGE214
、
Figure DEST_PATH_IMAGE215
、
Figure DEST_PATH_IMAGE216
、
Figure DEST_PATH_IMAGE217
、
Figure DEST_PATH_IMAGE218
、
Figure DEST_PATH_IMAGE219
、
Figure DEST_PATH_IMAGE220
、
Figure DEST_PATH_IMAGE221
、
Figure DEST_PATH_IMAGE222
、
Figure DEST_PATH_IMAGE223
、
Figure DEST_PATH_IMAGE224
、
Figure DEST_PATH_IMAGE225
、
Figure DEST_PATH_IMAGE226
、
Figure DEST_PATH_IMAGE227
、
Figure DEST_PATH_IMAGE228
、
Figure DEST_PATH_IMAGE229
、
Figure DEST_PATH_IMAGE230
、
Figure DEST_PATH_IMAGE231
、
Figure DEST_PATH_IMAGE232
、
Figure DEST_PATH_IMAGE233
。
参考前面对结合方式的叙述，可以选出一些优选的单体和荧光分子的组合来构建聚合诱导的荧光增强体系。例如：丙烯酸是常用的化工原料，以丙烯酸为单体，聚合反应生成聚丙烯酸，是阴离子型聚合物，可以诱导阳离子型的荧光分子的聚集，使其荧光增强。
这类方式中，既可以采用均聚反应，也可以采用共聚反应，即使用的单体不限于一种，而且不需要每一种单体都符合上述要求。聚合反应的聚合物能够使荧光分子聚集的必要条件是：不需要每个单体都含有具有结合功能的基团，只要其中一种单体含有具有结合功能的基团，可以结合荧光分子，该基团不参与聚合反应，即在聚合反应前后不改变。这样，聚合反应前，单体与荧光分子结合分散游离在溶液中，不发光或者发光弱，聚合后，聚合物可以结合多个荧光分子而使荧光分子聚合，并使发光增强。
在一些结合方式中，需要多个官能团的协同参与，如果将这些官能团分布于两个单体上，那么单个单体分子由于缺乏协同作用，难以形成有效结合，而形成聚合物之后，多个侧链的官能团协同作用就可以形成稳定的结合。例如下列聚合反应：
Figure DEST_PATH_IMAGE234
上述单体分子也可以结合含多硼酸基的荧光分子，但是稳定性不够，容易解离，而形成聚合物后，相邻单体的残基可以协同结合一个荧光分子，结合稳定性显著提高。
再例如下列聚合反应：
Figure DEST_PATH_IMAGE235
上述反应中有两种单体分子，虽然每种单体都可以以各自的方式结合荧光分子，但是稳定性不够，容易解离，而形成聚合物后，相邻单体的残基可以协同结合一个荧光分子，结合稳定性显著提高。
以上聚合反应或分子结构并不作为本发明的限定，凡是具有类似特点的单体或者聚合反应都可以应用与本发明中。这类方式中，既可以采用均聚反应，也可以采用共聚反应，即使用的单体不限于一种，聚合反应的聚合物能够使荧光分子聚集的必要条件是：其中一种单体或者荧光分子在聚合反应之后能够生成具有结合功能的基团，可以结合荧光分子。这样，聚合反应前，荧光分子分散游离在溶液中，不发光或者发光弱，聚合后，聚合物和荧光分子上生成了具有结合功能的基团，因而聚合物可以结合多个荧光分子而使荧光分子聚集，并使发光增强。
相比含有具有结合功能的基团的单体或者荧光分子，这种单体在聚合反应之前不会结合荧光分子，因而具有更低的背景荧光。
无论是单体或者荧光分子，其所必要的官能团大多是已知的有机官能团，单体或者荧光分子的制备方法可以参考本领域的已知文献进行合成或者制备。有许多符合要求的单体可以直接购买获得，例如：丙烯酸、丙烯酰胺、丙烯酸酯等。
下面论述第二类反应单体和荧光分子的设计。
第二类方式中，荧光分子参与聚合反应，聚合反应后，荧光分子通过共价键连接而聚集到一起。因而这类荧光单体的设计思路是：将聚合反应官能团和荧光基团相互组合，通过共价键连接或者有机单元桥连可以构建无数符合要求的荧光单体分子，均可以应用于本发明中。反应官能团和荧光基团的设计参考前面的论述。
该方式中既可以采用均聚反应，也可以采用共聚反应，即使用的单体不限于一种，而且不需要每一种单体都符合上述要求，即不需要每个单体都是荧光单体。聚合反应后荧光增强的必要条件是，至少有一种单体分子的结构中含有至少一个荧光基团。荧光基团可以选自方式一中采用的荧光基团，具体结构参考前面的论述。
这种单体的结构通式为：
Figure DEST_PATH_IMAGE236
其中，RG为反应官能团，F为荧光基团，L为连接基团，x、z为非0的整数，y为0-20的整数。该通式表示一个分子中连接有x个反应官能团和z个荧光基团。即使x和z为1，y为0，荧光单元和反应官能团的排列组合仍然太多，不一一列举，只列出少数优选的荧光分子结构如下，这些结构并不限制本发明的保护范围，一些优选的荧光单体分子结构：
Figure DEST_PATH_IMAGE237
、
Figure DEST_PATH_IMAGE238
、
Figure DEST_PATH_IMAGE239
、
Figure DEST_PATH_IMAGE240
、
Figure DEST_PATH_IMAGE241
、
Figure DEST_PATH_IMAGE242
、
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、
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、
Figure DEST_PATH_IMAGE245
、
Figure DEST_PATH_IMAGE246
、
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、
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、
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、
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、
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、
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、
Figure DEST_PATH_IMAGE253
、
Figure DEST_PATH_IMAGE254
、
Figure DEST_PATH_IMAGE255
、
Figure DEST_PATH_IMAGE256
、
Figure DEST_PATH_IMAGE257
、
Figure DEST_PATH_IMAGE258
、
Figure DEST_PATH_IMAGE259
、
Figure DEST_PATH_IMAGE260
、
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、
Figure DEST_PATH_IMAGE262
、
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、
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、
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、
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、
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、
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、
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、
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、
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、
Figure DEST_PATH_IMAGE272
、
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、
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、
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、
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、
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、
Figure DEST_PATH_IMAGE278
、
Figure DEST_PATH_IMAGE279
、
Figure DEST_PATH_IMAGE280
、
Figure DEST_PATH_IMAGE281
、
Figure DEST_PATH_IMAGE282
。
上述荧光单体分子，有的可以发生均聚反应生成高分子，而有的不容易发生均聚反应，可以与其他单体共聚生成高分子，例如含呋喃的荧光单体分子可以与丙烯酸等缺电子烯烃发生共聚反应。
这类方式中，为了降低荧光单体分子的自身荧光，可以连接一些缺电子的反应官能团，这类官能团有可能通过电子转移作用猝灭分子的荧光，而加成聚合反应之后，这些官能团共轭结构被打断，因而不再猝灭荧光，结合聚集诱导发光的作用，荧光显著增强。
以上内容已经说明了该荧光信号放大体系的必要组成，按照上述要求选择或设计试剂可以构建自由基聚合反应的荧光信号放大体系。为了增强荧光放大的效果，还可以添加一些物质，这些物质根据具体情况添加，也可以不加。根据功能不同，这些物质有自由基引发剂、链转移剂、稳定自由基、稳定自由基前体、荧光猝灭剂等。
下面分别介绍这几种物质：
自由基引发剂：用于加速自由基引发过程。一些单体的聚合活性可能不高，单纯靠G四链体与配合物的复合物难以引发，适当添加这类物质，这些物质通过与G四链体复合物发生氧化还原或者自由基转移反应形成初期的自由基，用于引发自由基聚合。
这类物质有偶氮化物、叔胺、过氧化物、过氧酸、过氧酸酯、过硫酸盐等。这类物质种类繁多，可参考自由基聚合领域的相关文献选择或设计合适的物质用于本发明中。简单列举几种分子，不作为本发明保护范围的限制，结构如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE283
、
Figure DEST_PATH_IMAGE284
、
Figure DEST_PATH_IMAGE285
。
链转移剂：用于转移活性自由基，抑制活性自由基的链终止反应，增加单体反应的转化率。这类物质有巯基化合物、β-二酮等。这类物质种类繁多，可参考自由基聚合领域的相关文献选择或设计合适的物质用于本发明中。简单列举几种分子，不作为本发明保护范围的限制，结构如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE286
、
Figure DEST_PATH_IMAGE287
、
Figure DEST_PATH_IMAGE288
。
稳定自由基或稳定自由基前体：用于增加聚合度。这些物质或者这些物质形成的自由基可以与链增长的自由基发生可逆的链终止或加成消除反应，用于抑制链转移和链终止反应，实现活性自由基聚合，提高聚合反应的聚合度。这类物质有胺氧自由基、烷氧胺、黄原酸酯、碘化物、碘等。其具体的反应原理，参考自由基聚合领域的文献可知。这类物质种类繁多，可参考自由基聚合领域的相关文献选择或设计合适的物质用于本发明中。简单列举几种分子，不作为本发明保护范围的限制，结构如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE289
、
Figure DEST_PATH_IMAGE290
、
Figure DEST_PATH_IMAGE291
、
Figure DEST_PATH_IMAGE292
、
Figure DEST_PATH_IMAGE293
、
Figure DEST_PATH_IMAGE294
、
Figure DEST_PATH_IMAGE295
、
Figure DEST_PATH_IMAGE296
、
Figure DEST_PATH_IMAGE297
。
荧光猝灭剂可以在聚合反应前与荧光分子形成非共价的超分子复合物，通过能量共振转移或者电子转移机理猝灭荧光分子的荧光，从而降低本底荧光；而聚合反应之后，荧光分子与聚合物结合力高于与单体的结合，或者荧光基团被包裹在聚合物中，使得猝灭剂与荧光分子解离，不再猝灭荧光。这类试剂的运用可以提高荧光增强倍数和检测信噪比。这类物质种类繁多，可参考分子染料和荧光领域的相关文献选择或设计合适的物质用于本发明中。简单列举几种分子，不作为本发明保护范围的限制，结构如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE298
、
Figure DEST_PATH_IMAGE299
、
Figure DEST_PATH_IMAGE300
Figure DEST_PATH_IMAGE301
、
Figure DEST_PATH_IMAGE302
、
Figure DEST_PATH_IMAGE303
。
其中有一些是常用的酸碱指示剂，如甲基橙、酚酞、酚红、邻苯二酚紫等，可以直接从市面上购得。
以上内容已经说明了该荧光信号放大体系的各种主要成分，下面详细介绍上述信号放大方法的原理。
若使用蛋白质构成的过氧化物酶，则该体系用于荧光检测，主要包含两个过程：一、过氧化物酶催化底物形成自由基，并引发自由基反应；二、自由基聚合的产物使聚集诱导发光的分子聚集而荧光增强。
若使用核酸构成的过氧化物酶，则该体系用于荧光检测，主要包含三个过程：一、靶标分子与核酸结合形成G四链体结构，并结合配合物，形成过氧化物酶；二、核酸构成的过氧化物酶引发自由基反应；三、自由基聚合的产物使聚集诱导发光的分子聚集而荧光增强。
不管使用哪一种过氧化物酶，最后两过程都类似。下面以核酸构成的过氧化物酶的体系为例，分别叙述每个过程的原理。
第一过程的原理：
选择并设计合适的核酸链，当没有检测物存在时，核酸游离在溶液中自然卷曲，或者通过互补配对，形成一定的二级结构，但是不形成G四链体，因而就不能结合配合物，不会产生自由基；当有检测物时，核酸与检测物结合折叠形成四链体结构，或者原先的二级结构解离，结合检测物并形成G四链体结构，然后即可结合配合物。
如果检测物是一段核酸序列，则利用该核酸的互补序列设计检测体系。作为检测物的核酸可以与检测体系中的核酸通过碱基配对形成更加稳定的二级结构，这个新形成的二级结构与溶液中钾离子进一步作用，并折叠形成G四链体。
如果检测物不是核酸，是其它小分子、大分子、病毒或细胞，则利用该小分子、大分子、病毒或细胞的适配体序列设计检测体系。体系中所使用的核酸含有适配体序列，该序列在没有靶标存在的情况下自然卷曲，或者通过互补配对，形成一定的二级结构，但是不形成G四链体，当靶标即检测物存在时，靶标结合适配体序列，形成新的二级结构，并折叠形成G四链体。
上述过程在核酸检测和适配体传感器的文献中已经有详细论述，根据这些文献，可以选择合适的策略设计相应的核酸序列。
第二过程是本发明的关键过程。
一些金属配合物在一定条件下可以催化一些物质，如氧气、双氧水等过氧化物产生自由基，一些金属配合物与G四链体结合后，可使上述催化速率提高很多倍，这些自由基可以引发其它的自由基反应，如巯基与烯炔的加成反应、烯烃或苯酚等化合物的自由基加成反应。
为了增强自由基的引发速率，可以适当添加自由基引发剂、链转移试剂、自由基稳定剂等。其作用是使G四链体复合物周围的自由基更快传递到单体分子上。一旦反应被引发，就不再需要G四链体复合物的参与，在自由基聚合反应中，一个自由基可以与无数个单体加成反应形成聚合物，因而该过程是信号放大的关键过程。
传统基于G四链体-血红素复合物的检测中，每消耗一分子双氧水，只产生一分子羟基自由基，只能使一分子的染料分子的颜色或发光等性质发生变化。而本发明中，G四链体复合物每消耗一分子双氧水，虽然也只产生一分子羟基自由基，但是可以引发无数的单体聚合形成一条聚合物链，并诱导无数荧光分子的聚集，相比传统基于G四链体复合物的检测具有信号放大的效果，聚合度越大，则可以诱导聚集的荧光分子越多，信号放大效果越明显，荧光信号也越强。
由于增长的自由基链之间可以通过链终止反应而终止加成反应，所以聚合度不可能无限大。但是通过向体系中加入一些稳定自由基或稳定自由基前体，就可以利用引发转移终止剂（iniferter）法、稳定自由基聚合（stable free radical po1ymerization，SFRP）、氮氧自由基调控聚合（nitroxide-mediated po1ymeIization，NMP），可逆加成断裂链转移聚合（reversible addition-fragmentation chain transfer，RAFT），原子转移自由基聚合（Atom Transfer Radical Polymerization, ATRP）等方法降低自由基链的浓度，以抑制不可逆的链终止反应，达到增加聚合度的目的。这些方法都是自由基聚合领域常用的方法，具体原理和具体的试剂参考该领域的文献即可选择和设计。
第三过程分两类方式论述：
第一类方式中，荧光分子不参与聚合反应，聚合反应形成的聚合物中含有单体的残基，这些残基通过分子相互作用结合荧光分子，一条聚合物含有多个残基，因而可以结合多个荧光分子，由于聚集诱导发光的基团主要由芳环等疏水性官能团构成，因而这些荧光分子可以通过疏水作用发生进一步的聚集，从而限制分子单键的旋转，使荧光增强。
第二类方式中，荧光分子参与聚合反应，聚合产物中含有多个或许多荧光分子，这些聚合物中，荧光分子通过共价键连接在一起，相对于单体，其分子单键的旋转受一定阻碍，而且这些聚合物还可以通过分子内的疏水作用发生折叠，进一步限制单键旋转，使荧光增强。
除此之外，一些连接有强吸电子基的双键可以猝灭荧光基团的荧光，而发生聚合反应之后，这些双键转变成单键，使荧光恢复。
为了降低聚合反应前的背景荧光，可以添加荧光猝灭剂，其作用是与游离的荧光分子用过弱的分子相互作用结合，通过能量转移猝灭荧光分子的自荧光。而聚合反应之后，荧光分子优先与聚合物结合，或者荧光分子被聚合物包裹，从而使猝灭基团远离荧光分子，因而使荧光分子荧光恢复。
经过上述三个过程，本发明的荧光信号放大体系可以实现对核酸序列的检测和适配体靶标的检测。由于适配体靶标范围广泛，可以是离子、小分子、蛋白质、病毒、细菌、细胞等，因而该方法可以检测上述各种靶标，具有广泛的适用性。在具体的检测应用中，可以进行对照实验以排除假阳性，对照实验与检测实验的区别在于：对照实验不含G四链体序列，其余成分和条件与检测实验相同。相对传统基于G四链体检测的方法，该方法具有信号放大的作用，因而更高的灵敏度。
本方法也可以在实验室常用的荧光定量PCR仪上使用，即将各种需要的试剂配置成溶液放置于PCR管中，按照常规PCR过程操作PCR仪即可。在每一轮变性退火过程中，温度的升高有利于自由基扩散，同时G四链体与配合物形成的复合物解离后又在降温时重新复合，引发新一轮自由基聚合反应和荧光信号的增强，经过多轮循环，荧光信号随之得到极大的放大，因而从PCR仪读取荧光信号强度就可以获得检测物浓度。相对于PCR、滚环扩增等核酸扩增以放大信号的方法，本发明的方法不需要DNA聚合酶、核苷酸单体等价格昂贵的试剂，所用的主要试剂都是有机小分子，可以大规模合成，有的是低廉的化工原料，如丙烯酸、丙烯酰胺等，不仅成本低，而且易于保存。由于本方法不涉及核酸扩增的过程，因而不存在核酸的非特异性扩增的问题，不会有新的核酸序列产生，因而在PCR仪器上使用时，每一轮变性退火都依靠原本的核酸序列引发自由基聚合，即具有更高的准确度。
本发明的信号放大体系中，除了荧光变化之外，还会发生其他一些物理性质的变化，这些物理变化，也可以作为检测依据。
一些荧光分子在聚集前后也会发生紫外吸收的变化，例如有些分子如苯酚、苯胺类分子在聚合反应之后，共轭体系变大，在可见光区出现吸收，使颜色加深，因而通过肉眼观察颜色的变化也可以判断检测物是否存在。依据该判断方法，除了一些荧光分子外，一些非荧光的具有共轭结构的分子也可以用于本体系，例如螺吡喃类染料、偶氮类染料、三苯甲烷类染料等。参考染料领域的相关文献可选择并设计合适的分子。
一些单体（如丙烯酰胺）在聚合之后形成大分子凝胶，使溶液成凝胶状，流动性变差，通过肉眼即可判断检测物是否存在。该判断方法不需要荧光分子的参与，只需要单体分子。为了使聚合产物容易形成凝胶，聚合产物所带静电荷应为零或接近于零。构建这类聚合物，可以由电中性，或两亲性的单体分子，进行均聚反应生成，也可以由阴离子型单体和阳离子型单体通过共聚反应生成。由于不需要荧光基团，因而这类单体分子的设计更简单，选择范围更广泛，在前面对单体的叙述中已经概括了这些单体的设计原理，参考前面的叙述即可。
本发明的信号放大体系可以用于过氧化物酶底物的检测，还可以与其他酶反应联用，用于检测酶或酶的底物。例如氧化酶在氧气存在下可以催化底物生成过氧化氢。而过氧化氢可以在过氧化物酶或G四链体复合物存在下催化生成羟基自由基，并引发自由基聚合反应和荧光信号的放大。这些氧化酶有葡萄糖氧化酶、尿酸氧化酶、氨基酸氧化酶等，它们底物分别是葡萄糖、尿酸、氨基酸等。因而向本发明的体系加入这些酶，可以检测它们各自的底物；或者向本发明的体系加入底物，可以检测相应的酶及酶的活性。
在上述基础上，本发明的信号放大体系还可以结合酶联免疫法，用于抗体或抗原的检测信号放大。酶联免疫法的关键是利用酶标记的抗原或者抗体催化底物来实现信号放大，其中常用的标记酶为氧化酶和辣根过氧化物酶。
针对不同酶标记的酶联免疫法，本发明可以有不同的联用方法。
联用方法一：若酶联免疫法使用氧化酶标记的抗体或抗原，则在检测过程中或者检测的最后一步加入本发明前面所述的体系中除过氧化氢之外的物质即可，包括过氧化物酶、单体分子、荧光分子等。
该联用方法所需的材料为：酶联免疫法的所有试剂，以及本发明前面所述的体系中除过氧化氢之外的组分。
联用检测过程为：在酶联免疫法中的氧化酶催化底物产生过氧化氢之后，本发明体系的过氧化物酶接着催化过氧化氢产生自由基，之后是自由基引发单体分子的聚合反应，进而通过溶液粘度、颜色变化或荧光增强判断抗体、抗原等物质的存在。
联用方法二：若酶联免疫法使用过氧化物酶标记的抗体或抗原，则在检测过程中或者检测的最后一步加入本发明前面所述的体系中除过氧化物酶之外的物质即可，包括过氧化氢、单体分子、荧光分子等。
该联用方法所需的材料为：酶联免疫法的所有试剂，及本发明前面所述的体系中除过氧化物酶之外的组分。
联用检测过程为：在酶联免疫法中的过氧化物酶催化过氧化氢产生羟基自由基之后，羟基自由基接着引发本发明体系的单体分子的聚合反应，进而通过溶液粘度、颜色变化或荧光增强判断抗体、抗原等物质的存在。
上述联用方法中使用的过氧化物酶可以来源于酶联免疫法常用的过氧化物酶，也可以使用核酸构成的过氧化物酶。其中核酸构成的过氧化物酶与抗体或抗原的连接方式可以是共价键，也可以是非共价键的特异结合方式。非共价键的特异结合方式主要有适配体靶标的结合，在这种结合方式中，构成过氧化物酶的核酸的序列特征是：一条核酸链，包含G四链体序列和适配体序列，适配体为需要标记的抗体或抗原的适配体；适配体与抗体或抗原特异结合的同时，也使G四链体序列附着在抗体或抗原的表面，结合配合物后就具有了过氧化物酶活性。
酶联免疫法中应用较多的是酶联免疫吸附测定法 (Enzyme-LinkedImmunoSorbent Assay，ELISA)。ELISA测定方法中有3种必要的试剂：固相的抗原或抗体、酶标记的抗原或抗体、酶作用的底物。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。具体原理和设计方法可以参考ELISA检测相关的文献。与酶联反应法一样，本发明的信号放大体系也可以与ELISA检测联用，联用方法与前面一致，都是利用酶联免疫检测中产生的过氧化氢或自由基引发单体分子的聚合反应和荧光增强。
本发明与ELISA法联用的一种方法是，使用亲和素标记抗原或抗体，并使用生物素标记的G四链体核酸，还需要加入本发明所采用的配合物、单体分子、荧光分子、引发剂等，以引发聚合反应和荧光增强。使用该方法设计一种抗体的检测，其过程和原理为：将这种抗体的抗原固定在固相薄膜上，再浸入待测溶液，该薄膜可以特异吸附待测溶液中的抗体，然后清洗薄膜，去除非特异吸附，再加入亲和素标记的第二抗体，使之与吸附在薄膜上的第一抗体结合，然后清洗薄膜，去多余的亲和素标记的抗体，再加入生物素标记的G四链体核酸，生物素与亲和素结合，使G四链体固定在薄膜上，然后清洗薄膜，去除多余的G四链体，最后将薄膜浸入含有配合物、单体分子、荧光分子、引发剂等物质的溶液中。如果待测溶液含有抗体，则会引发单体分子的聚合和荧光的增强。如果将抗体固定于固相薄膜上，按上述类似的原理设计检测试剂，就可以用于检测抗原。
本发明与ELISA法联用的另外一种方法是，使用氧化酶类标记抗原或抗体，除了酶相应的底物之外，还需要加入本发明所采用的单体分子和荧光分子等，以引发聚合反应和荧光增强。例如：使用该方法设计一种抗体的检测，其过程和原理为：将这种抗体的抗原固定在固相薄膜上，再浸入待测溶液，该薄膜可以特异吸附待测溶液中的抗体，然后清洗薄膜，去除非特异吸附，再加入氧化酶标记的第二抗体，使之与吸附在薄膜上的第一抗体结合，然后清洗薄膜，去多余的氧化酶标记的抗体，最后将薄膜浸入含有氧化酶底物的本发明体系的溶液中。如果待测溶液含有抗体，则会引发单体分子的聚合和荧光的增强。如果将抗体固定于固相薄膜上，按上述类似的原理设计检测试剂，就可以用于检测抗原。其中使用的氧化酶可以是葡萄糖氧化酶、尿酸氧化酶、氨基酸氧化酶等。
本发明的荧光信号放大体系与酶联免疫法的联用方法不限于以上两种方法，酶联免疫检测领域的文献中所使用方法（包括双抗体夹心法、双位点一步法、间接法测抗体、竞争法等）都可以与本发明的体系联用，并且用于相关物质的检测。
传统ELISA方法和其它酶联免疫法的信号放大是基于酶催化底物反应的高效性，而上述改进的ELISA方法是利用酶反应的自由基产物引发聚合反应，即酶反应和自由基聚合反应联用，实现两轮的信号放大，因而该方法具有更高的灵敏度。同时将检测的底物范围扩大到抗体抗原，具有更广泛的适用性。
本发明的信号放大体系还可以与核酸扩增反应联用，实现信号的两轮放大。以滚环扩增为例，与本发明联用的过程和原理为：设计环状核酸模板序列，其子序列含有G四链体的互补序列，将该环状核酸、核苷酸单体和DNA聚合酶代替G四链体核酸加入到本发明的体系中，除不含G四链体序列之外，体系中含有能够与G四链体结合的配合物，还含有单体分子、荧光分子、引发剂等，具体试剂参考之前的叙述。
该体系中，为了引发核酸扩增，还需要引物序列。
如果将该体系用于核酸的检测，则可以将靶标核酸序列作为引物序列，设计相应的环状模版序列，当体系中存在靶标序列时，靶标序列与模版配对，然后DNA聚合酶催化核酸扩增反应，扩增产物中含有许多G四链体序列的重复片段，因而该扩增产物与配合物结合形成多个G四链体复合物，进而引发单体分子的聚合和荧光分子的聚集荧光增强。
如果将该体系用于核酸适配体靶标的检测，则可以设计合适的引物序列和模版序列，其中引物序列包含适配体序列，序列特征是3’端一段子序列可以与环模版配对。在没有靶标分子时，引物序列通过自身碱基配对形成一种二级结构，该结构中3’段子序列不被暴露，因而不能作为模版的引物，当靶标分子存在时，靶标分子与引物序列结合，形成另外一种二级结构，该结构中3’端子序列游离出来，因而可以与模版配对，并相继引发核酸扩增、聚合反应、荧光增强。
本发明的荧光信号放大体系与核酸扩增的联用方法不限于以上两种方法，核酸扩增领域的文献中所使用核酸扩增方法都可以与本发明的体系联用，并且用于相关的物质的检测。
本发明的信号放大体系还可以与酶联免疫法和核酸扩增同时联用，应用于相关物质的检测。该联用方法需要：酶联免疫法中除了酶标记的抗体抗原之外的试剂和材料，还需要本发明体系中除过氧化物酶之外的组分，同时还包含适配体序列、模版序列，以及核酸聚合酶和核苷酸单体。
联用检测过程中，靶标物质通过特异的结合方式（如抗体抗原结合或适配体-靶标结合等）富集到固相载体上，富集到固相上的靶标物质特异结合其适配体，之后含有适配体序列的核酸的3’末端可以与模版序列配对，在核酸聚合酶作用下发生核酸扩增，扩增的产物富含G四链体结构，结合配合物后可催化底物产生自由基，并引发单体分子的聚合反应，进而通过溶液粘度、颜色变化或荧光增强判断物质的存在。
本发明的荧光放大体系以及上述的各种改进方法都可以做成试纸或试剂盒应用于环境监测、医学诊断等领域。
附图说明
图1为G四链体酶引发丙烯酸聚合的示意图。
图2为凝血酶检测的示意图，101为DNA序列，102为血红素，103为凝血酶。
图3为DNA检测的示意图，201为DNA探针序列，202为靶标序列，203为配合物。
图4为DNA配对的示意图，301为DNA探针序列1，302为DNA探针序列2，303为靶标序列，304为血红素。
图5为汞离子检测示意图，401为DNA序列，402为汞离子，403为血红素。
图6为蛋白质检测示意图，501为适配体序列，502为G四链体序列，503为靶标蛋白质，504为血红素。
图7为ELISA联用法检测蛋白质示意图，601为固相薄膜，602为抗体，603为靶标蛋白，604为适配体序列，605为环模版，606为DNA聚合酶，607为血红素。
具体实施方式
为了说明本发明的原理以及其优势，下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明，其目的在于帮助更好的理解本发明的内容，但这些具体实施方案不以任何方式限制本发明的保护范围。在实际应用中，可以根据具体情况实施最合适的方案。
实施实例1，G四链体过氧化物酶的构建及催化丙烯酰胺聚合反应。
配置10 mM的Tris-HCl缓冲液，pH = 7，含有的物质及浓度如下：
KCl，100 mM；血红素，浓度0.02 mM；乙酰丙酮，浓度0.01 mM；丙烯酰胺 2 mM；
G四链体序列的DNA，序列：5’-GGGTAGGGCGGGTTGGG-3’（SEQ ID NO.1），浓度0.01mM。
将上述溶液室温搅拌1小时，仍是溶液状。向上述混合液中加入过氧化氢0.02 mM，即可引发聚合反应，反应时间1小时，溶液成凝胶状。结果表明G四链体与血红素可以催化烯的聚合反应。
上述反应过程如下：G四链体序列与血红素结合，形成的复合物具有过氧化物酶活性，可以催化过氧化氢生成羟基自由基；羟基自由基与乙酰丙酮反应生成乙酰丙酮自由基，反应如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE304
乙酰丙酮自由基引发丙烯酰胺聚合，反应如下：
链引发：
Figure DEST_PATH_IMAGE305
，
链增长：
Figure DEST_PATH_IMAGE306
，
链终止：两个自由基成键形成产物。
根据上述反应原理，该体系可以检测过氧化氢，判断依据是溶液粘度是否增大，如果成凝胶状，则通过肉眼即可判断。
上述体系中，各种物质的浓度、反应温度和时间可以进一步优化，以提高检测灵敏度。
上述体系中，血红素可以用其他金属配合物代替。
上述体系中，DNA序列可以用其它可形成G四链体的序列代替。
上述体系中，乙酰丙酮可以用其它β-二酮代替，也可以用其它自由基转移试剂代替，如巯基化合物等。
上述体系中，丙烯酰胺可以用其它单体代替，如各种丙烯酸或丙烯酰胺衍生物等。
上述体系中，还可以加入黄原酸酯、碘化物等，用于抑制链转移和链终止反应，实现活性自由基聚合。例如链增长自由基可以与黄原酸酯发生如下可逆的加成消去反应：
Figure DEST_PATH_IMAGE307
该反应可以降低链增长自由基浓度，因而抑制了链终止反应，并使链增长反应继续进行，增加聚合度。
该体系与葡萄糖氧化酶联用，具体方法是，溶液中不加过氧化氢，加入葡萄糖氧化酶，其余成分与之前的溶液相同，通过溶液粘度的变化可以检测D-葡萄糖，而对其他糖类没有响应。反之，溶液中不加过氧化氢，加入D-葡萄糖，可以检测葡萄糖氧化酶活性。
按上述类似的原理，该体系与尿酸氧化酶联用，通过溶液粘度的变化可以检测尿酸；与尿酸联用，可以检测尿酸氧化酶。
按上述类似的原理，该体系可以检测氨基酸氧化酶或其底物氨基酸，也可以用于其他能够生成过氧化氢的酶的检测以及其底物的检测。
实施实例2，基于聚丙烯酸的荧光信号放大体系。
丙烯酸是常用的化工原料，廉价易得，并且相关的引发剂的研究也非常多，因而非常适合用于本发明的体系中。聚丙烯酸带负电荷，可以诱导阳离子聚集在其周围，因而可以设计阳离子型聚集诱导发光的分子用于实现荧光信号放大。
配置20 mM的磷酸钾缓冲液，pH = 8，含有：2-巯基乙醇，浓度0.005 mM；丙烯酸0.5 mM；G四链体序列的DNA，序列：5’-GGGTAGGGCGGGTTGGG-3’（SEQ ID NO.1），浓度0.001mM；
配合物，浓度0.002mM，配合物结构为：
Figure DEST_PATH_IMAGE308
；
荧光分子，0.01 mM，所用荧光分子为：
Figure DEST_PATH_IMAGE309
；
黄原酸酯：0.002 mM，
Figure DEST_PATH_IMAGE310
；
过氧化氢，0.005 mM，加入过氧化氢后，混匀，反应1小时后，荧光增强。
上述过程原理如下：
G四链体序列与配合物结合，形成的复合物具有过氧化物酶活性，可以催化过氧化氢生成羟基自由基；羟基自由基与2-巯基乙醇反应生成巯基自由基，反应如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE311
巯基自由基引发丙烯酸聚合反应，
链引发：
Figure DEST_PATH_IMAGE312
链增长：
Figure DEST_PATH_IMAGE313
链终止：两个自由基成键形成产物。
产物聚丙烯酸通过静电作用结合许多荧光分子，使溶液荧光增强。
上述全过程如附图1所示。
黄原酸酯的加入是为了增加反应的聚合度，其作用机理与实施实例1类似。
为了降低体系的背景荧光，可以向体系中加入少量酚红，浓度0至0.01 mM。原理如下：酚红在溶液中带负电荷，与荧光分子可以通过静电作用结合，通过能量转移的机理猝灭荧光分子的荧光，当聚丙烯酸形成之后，由于聚丙烯酸所带负电荷数量多，因而可以荧光分子优先与聚合物结合，并发生聚集，而受聚合物电荷排斥作用，酚红不能结合聚合物，不再猝灭荧光。
根据上述反应原理，该体系可以检测过氧化氢，判断依据是溶液荧光是否增强。
上述体系中，各种物质的浓度、反应温度和时间可以进一步优化，以提高检测灵敏度。
上述体系中，配合物可以用其他金属配合物代替。
上述体系中，DNA序列可以用其它可形成G四链体的序列代替。
上述体系中，巯基乙醇可以用β-二酮代替，也可以用其它自由基转移试剂代替。
上述体系中，丙烯酸可以用其它阴离子型单体代替，也可以达到类似的效果。
上述体系中，荧光分子可以用其他荧光分子代替，这类荧光分子的设计思路参考发明内容的叙述。
上述体系中，黄原酸酯可以用碘化物等其他类似的试剂代替，用于抑制链转移和链终止反应，实现活性自由基聚合。
该体系与葡萄糖氧化酶联用，具体方法是，溶液中不加过氧化氢，加入葡萄糖氧化酶，其余成分与之前的溶液相同，通过溶液粘度的变化可以检测D-葡萄糖，而对其他糖类没有响应。反之，溶液中不加过氧化氢，加入D-葡萄糖，可以检测葡萄糖氧化酶活性。
按上述类似的原理，该体系与尿酸氧化酶联用，通过溶液粘度的变化可以检测尿酸；与尿酸联用，可以检测尿酸氧化酶。
按上述类似的原理，该体系可以检测氨基酸氧化酶或其底物氨基酸，也可以用于其他能够生成过氧化氢的酶的检测以及其底物的检测。
实施实例3，烯烃类荧光单体应用于凝血酶的检测。
配置25 mM的HEPES缓冲液，pH = 8，含有：KCl，1 mM；血红素，浓度0.001mM；乙酰丙酮，0.001 mM；过氧化氢，0.001 mM；G四链体序列的DNA，序列：5’- GGTTGGTGTGGTTGG-3’（SEQ ID NO.2），浓度0.0005 mM，该序列同时是凝血酶适配体序列；荧光单体，0.1 mM，荧光单体为：
Figure DEST_PATH_IMAGE314
。
上述溶液可以用于凝血酶的检测。加入凝血酶0.0005 mM，混匀，20分钟后，荧光增强十几倍。
检测原理如附图2所示：在没有凝血酶103的时候，DNA序列101难以形成稳定的G四链体，因而不能结合血红素，当有凝血酶时，DNA序列101与凝血酶103结合，形成稳定的G四链体结构，并结合血红素102，进而可以催化过氧化氢生成羟基自由基，并引发荧光单体的自由基聚合反应，生成的聚合物中，侧链的四苯乙烯分子通过疏水聚集使荧光增强。
聚合反应方程式为：
Figure DEST_PATH_IMAGE315
聚合反应机理与实施实例1类似。
上述体系中，各种物质的浓度、反应温度和时间可以进一步优化，以提高检测灵敏度。
上述体系中，血红素可以用其他金属配合物代替。
上述体系中，乙酰丙酮可以用其它β-二酮代替，也可以用其它自由基转移试剂代替，如巯基化合物等。
上述体系中，还可以加入黄原酸酯、碘化物等，用于抑制链转移和链终止反应，实现活性自由基聚合。
上述体系中，还可以加入丙烯酰胺单体，使聚合产物形成共聚物。
上述体系中，荧光分子可以用其他荧光分子代替，这类荧光分子的设计思路参考发明内容的叙述。
上述体系中，荧光分子还可以不止含有一个反应官能团，例如以下分子：
Figure 490103DEST_PATH_IMAGE247
上述分子可以发生交联聚合反应，形成网状聚合物，因而相对于线性聚合物，分子内旋转更加受限制，更利于荧光增强。
上述各种分子都可以参考本领域已知的文献使用已知的合成方法进行合成制备。
实施实例4，巯基烯炔点击反应应用于DNA检测。
巯基烯炔点击反应与烯烃聚合反应稍有不同，巯基在反应过程中起自由基转移作用，因而极少量的自由基可以引发大量官能团的反应，直到巯基消耗完为止。
配置25 mM的HEPES缓冲液，pH = 7，含有：100 mM 的KCl；配合物，浓度0.001mM；巯基化合物单体，0.05 mM；烯烃荧光单体，0.05 mM；DNA探针序列：5’- GGGTAGGGCGGGTTGGGAGTTAGCACCCAACCC -3’（SEQ ID NO.3），浓度0.0005 mM。
其中，配合物为酞菁锰，结构为
Figure DEST_PATH_IMAGE316
；
巯基化合物单体结构为：
Figure DEST_PATH_IMAGE317
。
荧光单体为：
Figure 952309DEST_PATH_IMAGE247
。
上述溶液可以用于靶标DNA检测，靶标序列：5’-TGGGTGCTAACT-3’ （SEQ IDNO.4），与探针序列的子序列5’-AGTTAGCACCCA-3’完全互补配对。
对照序列：5’-TGGGTCCTAACT-3’（SEQ ID NO.5），为靶标序列的单个碱基突变序列。
设两组溶液，第一组，加入靶标序列0.0005 mM，混匀，20分钟后，荧光增强十几倍。第二组，加入对照序列0.0005 mM，混匀，20分钟后，荧光几乎没有增强。
该实验说明该方法可以用于特定序列的核酸检测，并且可以区分单碱基突变，具有较高的选择性。
检测原理如附图3所示：DNA探针序列201的子序列5’-GGGTAGGGCGGGTTG GG-3’为G四链体序列，然而在没有靶标序列的时候，DNA探针序列201通过碱基配对形成二级结构，不形成G四链体，因而不能结合配合物，当有靶标序列202时，DNA与靶标序列通过碱基配对形成另外一种二级结构，并使G四链体序列暴露出来，形成稳定的G四链体结构，并结合配合物203，进而可以催化巯基单体和烯烃单体的共聚反应。
聚合反应产物之一为：
Figure DEST_PATH_IMAGE318
除上述产物外，荧光单体双键可能发生烯烃聚合反应，因而生成的聚合物中，荧光基团的分子运动受限制，使荧光显著增强。
上述体系中，各种物质的浓度、反应温度和时间可以进一步优化，以提高检测灵敏度。
上述体系中，配合物可以用其他金属配合物代替。
上述体系中，按类似的原理，可以使用其它探针序列用于其他序列核酸的检测，不仅可以检测DNA 还可以检测RNA。
上述体系中，巯基化合物可以用其它化合物代替，如：
Figure DEST_PATH_IMAGE319
、
Figure DEST_PATH_IMAGE320
等。
上述体系中，聚合产物不一定需要形成高分子，也可以是寡聚物。
例如：可以用以下两个单体代替上述两个单体，
Figure DEST_PATH_IMAGE321
和
Figure 113163DEST_PATH_IMAGE249
，
反应的主要产物为：
Figure DEST_PATH_IMAGE322
Figure DEST_PATH_IMAGE323
该产物中有6个荧光基团，通过分子内的疏水聚集，也可以使荧光明显增强。
实施实例5，巯基烯炔点击反应应用于DNA检测。
配置25 mM的HEPES缓冲液，pH = 7，含有：100 mM 的KCl；血红素，浓度0.001m；过氧化氢，浓度 0.0005 mM；荧光单体，0.05 mM；
DNA探针序列1：5’- ATGACTATCTTTAAT GGGTAGGG -3’（SEQ ID NO.6），浓度0.001mM；DNA探针序列2：5’- GGGTTGGG CGTATGGAAAATGAG -3’（SEQ ID NO.7），浓度0.001 mM。
其中荧光单体分子为：
Figure 787858DEST_PATH_IMAGE250
。
上述溶液可以用于靶标DNA检测，可检测的靶标序列为：5’-CTCATTTTCCATACATTAAAGATAGTCAT-3’（SEQ ID NO.8），其5’端子序列CTCATTTTCCATACA可以与探针序列2的3’端子序列CGTATGGAAAATGAG形成互补配对；其3’端子序列TTAAAGATAGTCAT可以与探针序列1的5’端子序列ATGACTATCTTTAAT形成互补配对。
向溶液中加入靶标序列0.001 mM，混匀，20分钟后，荧光增强十几倍。
检测原理如附图4所示，说明如下：在没有靶标序列303的时候，两条探针序列301和302游离在溶液中，不形成G四链体，因而不能结合血红素，当有靶标序列时，靶标序列同时与两条探针序列部分互补配对，并使两条探针序列的富G序列端游离出来，在钾离子作用下，形成稳定的G四链体，并结合血红素304，进而可以催化荧光单体的聚合反应。
上述荧光单体即可能发生烯的聚合反应，又可能发生巯基与烯的加成反应，巯基与巯基之间还可能形成二硫键，因而产物为交联聚合物。生成的聚合物中，荧光基团旋转受限，因而荧光增强。聚合反应的可能产物有：
Figure DEST_PATH_IMAGE324
Figure DEST_PATH_IMAGE325
上述体系中，各种物质的浓度、反应温度和时间可以进一步优化，以提高检测灵敏度。
上述体系中，血红素可以用其他金属配合物代替。
上述体系中，按类似的原理，可以使用其他探针序列用于其他序列核酸的检测，不仅可以检测DNA 还可以检测RNA。
上述体系中，过氧化氢可以不加，也可以用其他过氧化物代替。
上述体系中，荧光分子可以用其它分子代替，部分优选结构如下：
Figure 780085DEST_PATH_IMAGE251
Figure 678770DEST_PATH_IMAGE252
Figure 920396DEST_PATH_IMAGE253
这些分子可以发生交联聚合反应，使荧光增强更加明显。
实施实例6，汞离子检测。
配置25 mM的HEPES缓冲液，pH = 7，含有：1 mM 的KCl；血红素，浓度0.001mM；乙酰丙酮，0.001 mM；过氧化氢，0.001 mM；单体分子，0.1 mM；荧光分子，0.01 mM；G四链体序列的DNA，序列：5’- GTTGGAAGGCGGAAGGTTC-3’（SEQ ID NO.9），浓度0.0005 mM。
其中，单体分子为：
Figure 664361DEST_PATH_IMAGE177
；荧光分子为：
Figure 307832DEST_PATH_IMAGE230
。
上述溶液可以用于汞离子的检测，加入高氯酸汞0.001 mM，混匀，20分钟后，荧光增强十几倍。
检测原理如附图5所示：在没有汞离子402的时候，DNA序列401难以形成稳定的G四链体，因而不能结合血红素403，溶液中单体的醇羟基虽然可以通过与荧光分子形成可逆的B-O键来结合荧光分子，但是该结合不够稳定，所以荧光很弱。当有汞离子时，DNA上的4个T碱基可以结合2个汞离子，形成T-Hg-T结构，因而DNA可以形成稳定的G四链体结构，并结合血红素403，进而可以催化过氧化氢生成羟基自由基，并引发单体的自由基聚合反应，生成的聚合物中，侧链含有许多醇羟基，空间相邻的4个羟基可协同结合一个荧光分子，因而荧光分子与聚合物的结合力，显著大于与单体分子的结合力。结合到聚合物上的荧光分子通过疏水聚集而使荧光显著增强。
聚合产物与荧光分子的结合方式如：
Figure DEST_PATH_IMAGE326
。
上述体系中，各种物质的浓度、反应温度和时间可以进一步优化，以提高检测灵敏度。
上述体系中，血红素可以用其他金属配合物代替。
上述体系中，乙酰丙酮可以用其它β-二酮代替，也可以用其它自由基转移试剂代替，如巯基化合物等。
上述体系中，还可以加入黄原酸酯、碘化物等，用于抑制链转移和链终止反应，实现活性自由基聚合。
上述体系中，还可以加入丙烯酰胺单体，使聚合产物形成共聚物。
上述体系中，按类似的原理，DNA序列可以用其它类似结构的序列代替。
上述体系中，荧光分子可以用其他荧光分子代替，这类荧光分子的设计思路参考发明内容的叙述。用在本例子中的一些优选分子有：
Figure 111840DEST_PATH_IMAGE231
、
Figure 309603DEST_PATH_IMAGE232
。
实施实例7，苯酚类单体用于三磷酸腺苷的检测。
配置20 mM的Tris-HCl缓冲液，pH = 7，含有血红素，浓度0.002 mM；乙酰丙酮，浓度0.001-0.002 mM；过氧化氢，0.5 mM；荧光单体分子，0.5 mM；ATP（三磷酸腺苷）适配体序列：5’- ACCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGGT -3’（SEQ ID NO.10），浓度0.001 mM，该适配体序列可以形成G四链体结构。
其中荧光分子为：
Figure 388417DEST_PATH_IMAGE263
。
上述溶液可以用于三磷酸腺苷（ATP）的检测，加入0.001 mM的ATP，混匀，20分钟后，荧光显著增强。对照组，加入三磷酸鸟苷（GTP）等，没有变化。
检测原理如下：在没有ATP的时候，DNA序列难以形成稳定的G四链体，因而不能结合血红素，当有ATP时，DNA与ATP结合，形成稳定的G四链体结构，并结合血红素，进而可以催化过氧化氢生成羟基自由基，并引发荧光单体的自由基聚合反应，
聚合反应为：
Figure DEST_PATH_IMAGE327
生成的聚合物为共轭聚合物，相对于单体，聚合物中的芳香环更加拥挤，分子旋转受抑制，因而荧光显著增强。
上述体系中，各种物质的浓度、反应温度和时间可以进一步优化，以提高检测灵敏度。
上述体系中，血红素可以用其他金属配合物代替。
上述体系中，乙酰丙酮可以不加，也可以用其它β-二酮代替，也可以用其它自由基转移试剂代替，如巯基化合物等。
上述体系中，荧光分子可以用其他荧光分子代替，这类荧光分子的设计思路参考发明内容的叙述。用在本例子中的一些优选分子有：
Figure 352307DEST_PATH_IMAGE264
Figure 592795DEST_PATH_IMAGE265
Figure 543434DEST_PATH_IMAGE266
Figure 894781DEST_PATH_IMAGE267
。
实施实例8，基于适配体的免疫球蛋白E的检测。
配制20 mM磷酸缓冲液，pH = 7，含有：KCl，100 mM；血红素，浓度0.001mM；乙酰丙酮，0.001 mM；过氧化氢，0.001 mM；荧光单体，0.1 mM；适配体序列：5’-GGGGCACGTTTATCCGTCCCTCCTAGTGGCGTGCCCC-3’（SEQ ID NO.11），浓度0.0005 mM，该适配体序列可以选择性结合免疫球蛋白E；G四链体序列的DNA，序列：5’- GGTAGGAGGGACGGATAAAC-3’（SEQ IDNO.12），浓度0.0005 mM，该序列同时可以与适配体序列的部分互补配对。
其中荧光单体为：
Figure 247265DEST_PATH_IMAGE314
或
Figure 658654DEST_PATH_IMAGE243
。
上述溶液可以用于免疫球蛋白E的检测。
检测原理如附图6所示，检测过程及原理如下：
将待测样本加入上述溶液中，如果样本中不含免疫球蛋白E（503），则适配体序列501和G四链体序列502保持互补配对，因而不会形成G四链体结构，溶液不会发生变化。如果样本中含有免疫球蛋白E，则适配体序列优先结合免疫球蛋白E，使G四链体序列502解离出来，并形成G四链体，结合血红素504，引发荧光单体的聚合反应，使荧光增强。聚合反应的过程和原理与实施实例3相同。
上述体系中，各种物质的浓度、反应温度和时间可以进一步优化，以提高检测灵敏度。
上述体系中，血红素可以用其他金属配合物代替。
上述体系中，乙酰丙酮可以不加，也可以用其它β-二酮代替，也可以用其它自由基转移试剂代替，如巯基化合物等。
上述体系中，还可以加入黄原酸酯、碘化物等，用于抑制链转移和链终止反应，实现活性自由基聚合。
上述体系中，还可以加入丙烯酰胺单体，使聚合产物形成共聚物。
上述体系中，荧光分子可以用其他荧光分子代替，这类荧光分子的设计思路参考发明内容的叙述。
上述体系中，按照类似原理，使用其它蛋白质的适配体序列，可以用来检测相关的蛋白质。
实施实例9，与滚环扩增联用用于检测DNA序列。
配制50 mM Tris-HCl缓冲液, pH = 7.5，含有：KCl，100 mM；MgCl2，10 mM；血红素，浓度0.02mM；乙酰丙酮，0.001 mM；过氧化氢，0.02 mM；两种单体，浓度均为0.1 mM；核苷酸单体dNTP，其中dCTP为0.01 mM，dGTP为0.1 mM，dATP为0.02 mM，dTTP为0.05 mM；Phi29DNA聚合酶；环模版序列，浓度0.00001 mM。
其中，两种单体为：
Figure 96589DEST_PATH_IMAGE242
和
Figure DEST_PATH_IMAGE328
；
环模版序列为：p CCCAACCCGCCCTACCCAAAACCCAACCCGCCCTACCCAAAACCCAACCCGCCCTACCCAACCACACGATCCTAA（SEQ ID NO.13），其中子序列AACCACACGA TCCTAA与靶标序列5’-TTAGGATCGTGTGGTT-3’（SEQ ID NO.14）完全互补配对，子序列CCCAACCCGCCCTACCC的互补序列可以形成G四链体。
检测过程及原理：将待测样本加入上述溶液中，37摄氏度恒温12小时，如果其中没有靶标序列，或者所含有的DNA与环模板不配对，则溶液不会发生反应。如待测样本中含有靶标序列5’-TTAGGATCGTGTGGTT-3’，则可以与环模板互补配对，进而在Phi29聚合酶催化下发生核酸扩增，扩增产物为模板的互补序列，因而在钾离子存在下形成大量G四链体结构，并结合血红素引发荧光单体的自由基聚合反应，并使荧光增强。
聚合反应的过程和原理与实施实例1类似。
聚合反应为：
Figure DEST_PATH_IMAGE329
该反应中，四苯乙烯单体含有马来酰亚胺结构，可猝灭周围基团的荧光，导致分子本身光很弱，而聚合之后，该结构被破坏，结合聚集诱导发光机理，使荧光增强倍数显著提高。
上述体系中，各种物质的浓度、反应温度和时间可以进一步优化，以提高检测灵敏度。
上述体系中，血红素可以用其他金属配合物代替。
上述体系中，乙酰丙酮可以用其它自由基转移试剂代替，如其它β-二酮化合物等。
上述体系中，还可以加入黄原酸酯、碘化物等，用于抑制链转移和链终止反应，实现活性自由基聚合。
上述体系中，还可以加入丙烯酰胺单体，使聚合产物形成共聚物。
上述体系中，荧光分子可以用其他荧光分子代替，这类荧光分子的设计思路参考发明内容的叙述。
实施实例10，ELISA联用法检测蛋白质。
本例子中，以血小板生长因子B链（PDGF-BB，platelet-derived growth factorB-chain）的检测为例说明本发明与ELISA法联用的方法。
所需材料如下：
固相，固定了PDGF-BB抗体的薄膜，参考免疫检测相关的文献制备。
缓冲液1，清洗缓冲液：20 mM磷酸缓冲液，pH = 7，含有：140 mM NaCl，5 mM KCl，1mM CaCl2，1 mM MgCl2。
缓冲液2，适配体缓冲液：20 mM Tris-HCl缓冲液, pH = 7，含有：140 mM NaCl，5mM KCl，1 mM CaCl2，1 mM MgCl2；还有DNA序列：5’-TACTCAGGGCACTGCAAG CAATTGTGGTCCCAATGGGCTGAGTATTTTTGGGTAGGGCGGGTTGGG-3’（SEQ ID NO.15），浓度 0.001 mM，其中其子序列TACTCAGGGCACTGCAAGCAATTGTGGTCCC AATGGGCTGAGTA为PDGF-BB适配体序列，子序列GGGTAGGGCGGGTTGGG，可以形成G四链体。
缓冲液3，扩增缓冲液：50 mM Tris-HCl缓冲液, pH = 7.5，含有10 mM MgCl2；含有Phi29 DNA聚合酶；核苷酸单体dNTP，其中dCTP为0.01 mM，dGTP为0.12 mM，dATP为0.01mM，dTTP为0.07 mM；环模板，浓度0.001 mM。其中，环模板序列为：p CCCAACCCGCCCTACCCAAAACCCAACCCGCCCTACCCAAAACCCAACCCGCCCTACCCAAAACCCAACCCGCCCTACCCAAAA-3’（SEQ IDNO.16）。
缓冲液4，聚合缓冲液：100 mM乙酸钾缓冲液，pH = 5，含有血红素，浓度0.02 mM；乙酰丙酮，浓度0.001-0.002 mM；过氧化氢，0.5 mM；荧光单体分子，0.5 mM，其中荧光单体为：
Figure 454889DEST_PATH_IMAGE270
。
其中，缓冲液2中的序列的子序列GGGTAGGGCGGGTTGGG，不仅可以形成G四链体，还可以与缓冲液3中环模板序列互补配对，作为引物进行核酸扩展反应。
上述的薄膜和4种缓冲液可以用于PDGF-BB的检测。
检测流程与原理如附图7所示，说明如下：
（1）将薄膜601浸入待测液，如果待测液中有PDGF-BB，则发生抗体抗原结合，使PDGF-BB（603）与薄膜上的抗体602结合固定在薄膜上，
（2）用缓冲液1洗薄膜数次，以去除非特异性吸附的物质，然后浸入缓冲液2，如果膜上有PDGF-BB，则适配体序列与之结合，使DNA序列604固定在薄膜上，
（3）用缓冲液1洗薄膜数次，以去除未被结合的DNA，然后浸入缓冲液3，37摄氏度恒温数小时，如果膜上有DNA序列604，则3’端序列可以与溶液中模板序列605互补配对，并作为引物在DNA聚合酶606作用下发生滚环扩增反应，扩增产物含有大量重复的G四链体序列，并且通过适配体与蛋白质的特异作用固定在薄膜上，
（4）用缓冲液1洗薄膜数次，以去除环模板605、DNA聚合酶606等物质，然后浸入缓冲液4，如果膜上有G四链体序列，则可以结合血红素607，并引发聚合反应，聚合反应的机理参考前面的实施实例或相关文献，聚合产物为聚苯胺衍生物，共轭增加，因而可观察到颜色加深、荧光增强等现象。
上述体系中，有三轮信号放大的过程，分别是：靶标蛋白富集于薄膜上，是第一轮；滚环扩增使G四链体数量倍增，是第二轮；G四链体复合物引发聚合反应，是第三轮。因而该体系具有非常高的灵敏度。
其中，由于上述体系中滚环扩增的引物序列就是G四链体序列，因而也可以不经过第二轮信号放大过程，即省去缓冲液2的浸入和洗涤，直接浸入缓冲液3，以引发聚合反应。
上述体系中，聚合反应不限于苯胺类单体的聚合，也可以使用烯烃聚合、巯基烯炔点击反应等设计检测溶液。
上述体系中，可以加入其它单体，利用共聚反应改进检测条件或灵敏度。
上述体系中，血红素可以用其他金属配合物代替。
类似于前面的实施实例，上述体系中使用的一些试剂可以用其它具有类似功能的试剂代替，各种物质的浓度、反应温度和时间可以进一步优化，以提高检测灵敏度。
上述体系中，荧光分子可以用其他荧光分子代替，这类荧光分子的设计思路参考发明内容的叙述。其中一些优选的单体结构如下：
Figure 396300DEST_PATH_IMAGE271
、
Figure 509750DEST_PATH_IMAGE272
、
Figure 903822DEST_PATH_IMAGE273
、
Figure 128130DEST_PATH_IMAGE274
、
Figure 658468DEST_PATH_IMAGE275
。
上述体系中，按照类似原理，可以设计并使用其它蛋白质的适配体序列和抗体，用来检测相关的蛋白质。
上述体系中，适配体序列可以用抗体代替，将抗体和G四链体序列偶联起来，利用双抗体夹心法检测靶标蛋白，并且不限于PDGF-BB的检测。
一些ELISA试剂盒中的部分试剂可以直接应用于这类方法，用于相关物质的检测。例如，上述体系的适配体序列可以用辣根过氧化物酶标记的抗体代替，同时省去核酸序列及滚环扩增过程，用于相关物质的检测。
序列表 SEQUENCE LISTING
<110> 朱泽策
<120> 酶引发的自由基聚合反应及检测应用
<130>
<160> 16
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gggtagggcg ggttggg 17
<210> 2
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ggttggtgtg gttgg 15
<210> 3
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gggtagggcg ggttgggagt tagcacccaa ccc 33
<210> 4
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tgggtgctaa ct 12
<210> 5
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tgggtcctaa ct 12
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
atgactatct ttaatgggta ggg 23
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gggttgggcg tatggaaaat gag 23
<210> 8
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
ctcattttcc atacattaaa gatagtcat 29
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
gttggaaggc ggaaggttc 19
<210> 10
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
acctggggga gtattgcgga ggaaggt 27
<210> 11
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
ggggcacgtt tatccgtccc tcctagtggc gtgcccc 37
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
ggtaggaggg acggataaac 20
<210> 13
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
cccaacccgc cctacccaaa acccaacccg ccctacccaa aacccaaccc gccctaccca 60
accacacgat cctaa 75
<210> 14
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
ttaggatcgt gtggtt 16
<210> 15
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
tactcagggc actgcaagca attgtggtcc caatgggctg agtatttttg ggtagggcgg 60
gttggg 66
<210> 16
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
cccaacccgc cctacccaaa acccaacccg ccctacccaa aacccaaccc gccctaccca 60
aaacccaacc cgccctaccc aaaa 84

Claims (28)

1.一种信号放大的检测体系，组成包括：荧光分子、单体分子、过氧化物酶；
所使用的荧光分子种类不限于一种，荧光分子的特征在于：分子中含有苯乙烯单元，还含有具有结合功能的基团，二者通过共价键连接或者有机单元桥连；
所使用的单体分子种类不限于一种，单体分子的特征在于：分子中含有反应官能团，反应官能团选自：烯、炔、呋喃、苯胺、苯酚、巯基、环烷、含杂原子的环烷；所使用的单体中，其中至少有一种符合以下特征：除含有上述反应官能团外，还含有具有结合功能的基团，二者通过共价键连接或者有机单元桥连；
荧光分子和单体分子上的具有结合功能的基团各自独立，选自：羧基、磺酸基、磷酸基、磷酸酯基、连有芳香环的羟基、羟基、硼酸基、芳香环取代的硼酸基、氨基、胺基、含取代基的胺基、亚胺基、肟基、胍基、含取代基的胍基、膦基、含氮杂环的季铵盐、含金属的配合物基、含芳香环的基团、容易形成氢键的基团、巯基；荧光分子和单体分子的结合基团可以通过疏水作用、π-π作用、静电作用、配位作用、氢键作用、可逆共价键结合起来；
过氧化物酶选自蛋白质构成的过氧化物酶或核酸构成的过氧化物酶；
该体系特征在于：在没有酶底物的时候，荧光分子分散游离，荧光很弱；当有底物时，过氧化物酶可以催化底物形成自由基，进而引发单体分子的自由基聚合反应，进而使荧光分子聚集在聚合产物上，并导致荧光分子的荧光增强。
2.如权利要求1所述的检测体系，单体分子的优选结构有：
Figure FDA0002466459340000011
Figure FDA0002466459340000021
Figure FDA0002466459340000031
3.如权利要求1所述的检测体系，所使用的荧光分子的特征在于：分子中含有以苯乙烯为子单元的荧光基团，还含有具有结合功能的基团，二者通过共价键连接或者有机单元桥连；
其中，荧光基团优选结构如下：
Figure FDA0002466459340000032
4.如权利要求3所述的检测体系，所使用的荧光分子的特征在于：分子中含有以苯乙烯为子单元的荧光基团，还含有具有结合功能的基团，二者通过共价键连接或者有机单元桥连；
荧光分子的优选结构有：
Figure FDA0002466459340000041
5.一种信号放大的检测体系，其组成除了包括如权利要求1所述的荧光分子、单体分子、过氧化物酶之外，还包括以下一种或几种物质：链转移剂、稳定自由基、稳定自由基前体、荧光猝灭剂；
链转移剂的特征在于能够与自由基发生自由基转移反应，抑制活性自由基的链终止反应，增加单体反应的转化率；这类物质选自巯基化合物、β-二酮；
稳定自由基或稳定自由基前体，特征在于：这些物质或者这些物质形成的自由基可以与链增长的自由基发生可逆的链终止或加成消除反应，用于抑制链转移和链终止反应，实现活性自由基聚合，提高聚合反应的聚合度；这类物质选自胺氧自由基、烷氧胺、黄原酸酯、碘化物、碘；
荧光猝灭剂可以在聚合反应前与荧光分子形成非共价的超分子复合物，通过能量共振转移或者电子转移机理猝灭荧光分子的荧光，从而降低本底荧光。
6.如权利要求1至5所述的任意一种检测体系，过氧化物酶选自蛋白质构成的过氧化物酶，这些酶来源于生物中。
7.如权利要求6所述的任意一种检测体系，过氧化物酶选自植物过氧化物酶。
8.如权利要求7所述的任意一种检测体系，过氧化物酶为辣根过氧化物酶。
9.如权利要求1至5所述的任意一种检测体系，该体系应用于过氧化物酶底物的检测。
10.如权利要求1至5所述的任意一种检测体系，与氧化酶联用，应用于氧化酶底物的检测；与氧化酶联用的体系特征为，不含过氧化物，含有氧化酶；
检测过程是：氧化酶可以催化底物，生成过氧化物，进而被体系中过氧化物酶催化形成自由基，进而引发单体分子的聚合反应，通过溶液粘度或荧光增强判断底物的存在。
11.如权利要求1至5所述的任意一种检测体系，与氧化酶底物联用，应用于氧化酶活性的检测；
与氧化酶底物联用的体系特征为，不含过氧化物，含有氧化酶底物；
检测过程是：氧化酶可以催化底物，生成过氧化物，进而被体系中过氧化物酶催化形成自由基，进而引发单体分子的聚合反应，通过溶液粘度或荧光增强判断氧化酶的活性大小。
12.一种信号放大的检测体系，组成选自如权利要求1至5中任意一种检测体系，其中所用过氧化物酶选自核酸构成的过氧化物酶；该过氧化物酶的特征在于：由可形成G四链体结构的核酸与配合物结合构成；
可形成G四链体结构的核酸可以是一条或者多条，它们的序列通式如下：
序列1：G(G)mG(X1……Y1)G(G)mG(X2……Y2)G(G)mG(X3……Y3)G(G)mG；
序列2：G(G)mG(X1……Y1)G(G)mG(X2……Y2)G(G)mG；
序列3：G(G)mG(X1……Y1)G(G)mG；
序列4：G(G)mG
上述通式中，子序列G(G)mG被子序列(X1……Y1)、(X2……Y2)、(X3……Y3)隔开，其中子序列(X1……Y1)、(X2……Y2)、(X3……Y3)各自独立选自长度为1-20个碱基的核酸序列，其中的每个碱基各自独立选自核酸碱基A、T、G、C、U及其他可以形成氢键配对的修饰的碱基和非天然碱基，m选自0到10的整数；其中序列1只需要一条就可以形成G四链体，序列2、3、4相互组合可以形成G四链体；
所用的配合物特征在于：能够与G四链体核酸发生特异结合；配合物选自卟啉和类卟啉配合物；
该检测体系特征是：上述核酸在一定条件下可形成四链体结构，在另外一些条件下形成非四链体的结构；从非四链体向四链体结构的转变，可导致过氧化物酶活性的显著提高，进而引发单体分子的聚合反应和体系荧光的增强；利用核酸序列结构的转变，该体系可以检测靶标核酸序列、适配体靶标、汞离子。
13.如果权利要求12所述的检测体系，所用配合物通式如下：
Figure FDA0002466459340000061
上述通式中，n选自0-3的整数；Xa，Xb，Xc，Xd各自独立，选自N、C-R；
R1，R2，……R7，R8，各自独立，选自H、F、Cl、Br、I、CN、硝基、亚硝基、羧基、酯基、酰胺、酰肼、肟、胍、磺酸基、磷酸基、烷基；
A1，A2，A3，A4各自独立，选自芳香环及芳香环衍生物；
M选自任意的金属离子。
14.如权利要求13所述的检测体系，所用配合物配体的优选结构选自以下结构：
Figure FDA0002466459340000062
Figure FDA0002466459340000071
15.如权利要求12所述的检测体系，配合物选自Cr、Mn、Fe、Co、Ni金属元素的配合物。
16.如权利要求13所述的检测体系，配合物选自以下优选结构：
Figure FDA0002466459340000081
其中M选自：Mn2+、Fe2+、Co2+、Ni2+。
17.一种核酸检测体系，该体系除了含有如权利要求12所述的组分之外，还含有核酸探针序列，该体系可用于检测探针序列的互补序列；该体系特征在于，G四链体形成的必要条件是探针序列与靶标序列互补配对；形成四链体后，进而可结合配合物并引发自由基反应，通过溶液荧光强度的变化判断靶标序列的存在。
18.一种含有适配体的检测体系，该体系除了含有如权利要求12所述的组分之外，还含有适配体序列，该体系可以应用于适配体靶标的检测；该体系特征在于，G四链体形成的必要条件是适配体序列与靶标形成复合物；形成四链体后，进而可结合配合物并引发自由基反应，通过溶液荧光强度的变化判断靶标的存在。
19.一种基于核酸扩增的核酸检测体系，该体系含有如权利要求12中，除G四链体序列之外其余的组分，同时，该体系还含有模版序列，以及核酸聚合酶和核苷酸单体；模版序列的特征是：模版子序列含有探针序列和G四链体序列的互补序列，G四链体序列的互补序列可以在模版中重复出现；
该体系可以用于检测探针序列的互补序列；其原理是靶标序列与探针序列互补配对，在核酸聚合酶作用下以模版序列为模版发生核酸扩增，扩增的产物富含G四链体结构，进而引发自由基聚合反应；通过溶液粘度、荧光强度的变化判断靶标序列的存在。
20.一种基于核酸扩增的适配体靶标检测体系，该体系含有如权利要求12中，除G四链体序列之外其余的组分，同时，该体系还含有适配体序列、模版序列，以及核酸聚合酶和核苷酸单体；
适配体序列结构特征是：序列3’末端的子序列能够与体系中非模版序列的核酸发生互补配对，形成一种二级结构，不能作为模版引物，而当适配体序列与靶标分子结合之后，使序列3’末端的子序列暴露出来，并与模版序列配对；模版序列的特征是：模版子序列含有G四链体序列的互补序列，G四链体序列的互补序列可以在模版中重复出现；
该体系可以用于检测适配体靶标；其原理是靶标与适配体结合后，3’末端的子序列可以与模版序列配对，在核酸聚合酶作用下以模版序列为模版发生核酸扩增，扩增的产物富含G四链体结构，进而引发自由基聚合反应；通过溶液粘度、荧光强度的变化判断靶标序列的存在。
21.一种检测体系，包含如权利要求19和20中任意一个检测体系的所有组分，所用模版序列为环状序列。
22.如权利要求1所述的检测体系，与酶联免疫法联用，用于抗体或抗原的检测信号放大；该联用方法所需的材料为：酶联免疫法的所有试剂，以及权利要求1所述的检测体系中除过氧化氢之外的组分；其中酶联免疫法试剂中，标记抗体或抗原的酶为氧化酶；
联用检测过程为：在酶联免疫法中的氧化酶催化底物产生过氧化氢之后，本发明体系的过氧化物酶接着催化过氧化氢产生自由基，之后是自由基引发单体分子的聚合反应，进而通过溶液粘度、颜色变化或荧光增强判断抗体、抗原物质的存在。
23.如权利要求1所述的检测体系，与酶联免疫法联用，用于抗体或抗原的检测信号放大；该联用方法所需的材料为：酶联免疫法的所有试剂，以及权利要求1所述的检测体系中除过氧化物酶之外的组分；其中酶联免疫法试剂中，标记抗体或抗原的酶为过氧化物酶；
联用检测过程为：在酶联免疫法中的过氧化物酶催化过氧化氢产生羟基自由基之后，羟基自由基接着引发本发明体系的单体分子的聚合反应，进而通过溶液粘度、颜色变化或荧光增强判断抗体、抗原物质的存在。
24.如权利要求23所述的检测体系，其特征在于：使用核酸构成的过氧化物酶代替过氧化物酶标记的抗体或抗原；构成过氧化物酶的核酸的序列特征是：一条含G四链体序列和适配体序列的核酸链，适配体为需要标记的抗体或抗原的适配体；适配体与抗体或抗原特异结合的同时，也使G四链体序列附着在抗体或抗原的表面，结合配合物后就具有了过氧化物酶活性。
25.一种基于核酸扩增的酶联免疫检测方法，其特征在于：该检测体系包含如权利要求23中除过氧化物酶标记的抗体或抗原之外其余组分，同时还包含如权利要求20所述的适配体序列、模版序列，以及核酸聚合酶和核苷酸单体；
靶标物质通过特异的结合方式富集到固相载体上，富集到固相上的靶标物质特异结合其适配体，之后含有适配体序列的核酸的3’末端可以与模版序列配对，在核酸聚合酶作用下发生核酸扩增，扩增的产物富含G四链体结构，结合配合物后可催化底物产生自由基，并引发单体分子的聚合反应，进而通过溶液粘度、颜色变化或荧光增强判断物质的存在。
26.如权利要求25所述的检测方法，所用模版序列为环状序列。
27.一种试剂盒，其特征在于包含如权利要求1至24中任意一种检测体系的试剂和材料；该试剂盒可以应用于相关物质的检测。
28.一种试纸，其特征在于包含如权利要求1至24中任意一种检测体系的试剂和材料；该试纸可以应用于相关物质的检测。
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