JP2553343B2 - 癌抗体の測定法 - Google Patents
癌抗体の測定法Info
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- JP2553343B2 JP2553343B2 JP62054921A JP5492187A JP2553343B2 JP 2553343 B2 JP2553343 B2 JP 2553343B2 JP 62054921 A JP62054921 A JP 62054921A JP 5492187 A JP5492187 A JP 5492187A JP 2553343 B2 JP2553343 B2 JP 2553343B2
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- antibody
- npc
- idiotype
- serum
- monoclonal anti
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は癌抗体の測定法、更に詳細には、血清又は体
液中の癌抗体を測定して癌の存在を診断することのでき
る免疫学的測定法に関する。
液中の癌抗体を測定して癌の存在を診断することのでき
る免疫学的測定法に関する。
癌の存在を早期に適確に知ることは、その治療のため
に極めて重要である。そして、近年、癌細胞抗原を測定
して癌を診断する方法が案出されたが、当該抗原を正確
に測定する方法がなく、これが癌の診断を困難にしてい
た。特に上咽頭癌については、適確な診断法がなかっ
た。
に極めて重要である。そして、近年、癌細胞抗原を測定
して癌を診断する方法が案出されたが、当該抗原を正確
に測定する方法がなく、これが癌の診断を困難にしてい
た。特に上咽頭癌については、適確な診断法がなかっ
た。
斯かる実状において、本発明者は上記欠点を克服せん
と鋭意研究を行った結果、本発明者らが始めて調製した
上咽頭癌細胞膜表面抗原に対するモノクローナル抗体の
イディオタイプと結合するモノクローナル抗イディオタ
イプ抗体を適宜選択して使用して血清又は体液中の上咽
頭癌細胞膜表面抗原に対する抗体を測定すれば、上咽頭
癌の存在を、早期にかつ正確に診断できることを見出
し、本発明を完成した。
と鋭意研究を行った結果、本発明者らが始めて調製した
上咽頭癌細胞膜表面抗原に対するモノクローナル抗体の
イディオタイプと結合するモノクローナル抗イディオタ
イプ抗体を適宜選択して使用して血清又は体液中の上咽
頭癌細胞膜表面抗原に対する抗体を測定すれば、上咽頭
癌の存在を、早期にかつ正確に診断できることを見出
し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、血清又は体液を、上咽頭癌細胞
の膜表面抗原に対するモノクローナル抗体のイディオタ
イプに結合するモノクローナル抗イディオタイプ抗体と
接触させ、当該モノクローナル抗イディオタイプ抗体に
結合した抗体量を測定することを特徴とする上咽頭癌細
胞の膜表面抗原に対する抗体の測定法を提供するもので
ある。
の膜表面抗原に対するモノクローナル抗体のイディオタ
イプに結合するモノクローナル抗イディオタイプ抗体と
接触させ、当該モノクローナル抗イディオタイプ抗体に
結合した抗体量を測定することを特徴とする上咽頭癌細
胞の膜表面抗原に対する抗体の測定法を提供するもので
ある。
本発明で使用するモノクローナル抗イディオタイプ抗
体は、上咽頭癌細胞膜表面抗原に特異的に反応するモノ
クローナル抗体で免疫したマウスの脾細胞と骨髄腫細胞
を融合させてハイブリドーマを作製し、該モノクローナ
ル抗体に特異的に反応するモノクローナル抗イディオタ
イプ抗体を産生するハイブリドーマを選択、クローニン
グし、これを無血清培地中で培養するか又は動物に投与
して腹水化し、培地又は腹水を採取することにより製造
される。
体は、上咽頭癌細胞膜表面抗原に特異的に反応するモノ
クローナル抗体で免疫したマウスの脾細胞と骨髄腫細胞
を融合させてハイブリドーマを作製し、該モノクローナ
ル抗体に特異的に反応するモノクローナル抗イディオタ
イプ抗体を産生するハイブリドーマを選択、クローニン
グし、これを無血清培地中で培養するか又は動物に投与
して腹水化し、培地又は腹水を採取することにより製造
される。
特に、上咽頭癌由来の細胞株NPC−204の膜表面抗原に
特異的に反応するモノクローナル抗体のイディオタイプ
と結合するモノクローナル抗イディオタイプ抗体は、矢
野間らによって報告された５−９株をクローニングして
得たハイブリドーマ76AC6−B9株（第42回日本癌学会総
会）を無血清培地中で培養して得られる抗NPC−204モノ
クローナル抗体〔第42回日本癌学会総会記事演題294（1
983）、臨床免疫18（８）,752−754（1986）〕から次の
如くして製造される。
特異的に反応するモノクローナル抗体のイディオタイプ
と結合するモノクローナル抗イディオタイプ抗体は、矢
野間らによって報告された５−９株をクローニングして
得たハイブリドーマ76AC6−B9株（第42回日本癌学会総
会）を無血清培地中で培養して得られる抗NPC−204モノ
クローナル抗体〔第42回日本癌学会総会記事演題294（1
983）、臨床免疫18（８）,752−754（1986）〕から次の
如くして製造される。
抗NPC−204モノクローナル抗体によりBALB/cマウスを
免疫し、抗体価が充分高まったところで免疫マウスの脾
臓を摘出して得た脾細胞とマウスの骨髄腫細胞NS−１又
はP3u−１と融合させてハイブリドーマを作製する。こ
のハイブリドーマを無血清培地中で培養しNPC−204株の
膜表面抗原に対する抗イディオタイプ抗体、即ちモノク
ローナル抗NPC−204イディオタイプ抗体を産生するハイ
ブリドーマをアルカリフォスファターゼ標識したモノク
ローナル抗NPC−204抗体を用いる酵素免疫測定法（EIA
法）により選択する。効率良く高い力価のモノクローナ
抗イディオタイプ抗体を産生するハイブリドーマを限界
希釈法により無血清培地を用いてクローニングし、モノ
クローナル抗NPC−204イディオタイプ抗体を産生する安
定株IVN−63、IVP−41、IVN−４を得た。
免疫し、抗体価が充分高まったところで免疫マウスの脾
臓を摘出して得た脾細胞とマウスの骨髄腫細胞NS−１又
はP3u−１と融合させてハイブリドーマを作製する。こ
のハイブリドーマを無血清培地中で培養しNPC−204株の
膜表面抗原に対する抗イディオタイプ抗体、即ちモノク
ローナル抗NPC−204イディオタイプ抗体を産生するハイ
ブリドーマをアルカリフォスファターゼ標識したモノク
ローナル抗NPC−204抗体を用いる酵素免疫測定法（EIA
法）により選択する。効率良く高い力価のモノクローナ
抗イディオタイプ抗体を産生するハイブリドーマを限界
希釈法により無血清培地を用いてクローニングし、モノ
クローナル抗NPC−204イディオタイプ抗体を産生する安
定株IVN−63、IVP−41、IVN−４を得た。
これ等の安定株を無血清培地中に培養するか、動物に
投与して腹水化し、培養物又は腹水を採取すればクラス
IgG型か又はIgM型のモノクローナル抗NPC−204イディオ
タイプ抗体が得られる。
投与して腹水化し、培養物又は腹水を採取すればクラス
IgG型か又はIgM型のモノクローナル抗NPC−204イディオ
タイプ抗体が得られる。
斯くして得られるモノクローナル抗NPC−204イディオ
タイプ抗体は次の如き性状及び生物学的性質を有する。
タイプ抗体は次の如き性状及び生物学的性質を有する。
（１）物理化学的性状 （２）安定性 本発明の血清又は体液中の上咽頭癌細胞膜表面抗原に
対する抗体を測定するには、血清又は体液に前記モノク
ローナル抗イディオタイプ抗体を適宜選択して接触させ
て、該抗イディオタイプ抗体と上咽頭癌細胞膜表面抗原
に対する抗体を免疫反応させることにより行われる。こ
の免疫反応は、従来公知のEIA法、RIA法、ラテックス比
濁法又はリポソーム、蛍光標識物質を用いる方法、ある
いはマウス、ラット、モルモット、ウサギ等の動物を介
する免疫応答反応（PCA、DTH反応等）を利用する方法等
によって行うことができる。
対する抗体を測定するには、血清又は体液に前記モノク
ローナル抗イディオタイプ抗体を適宜選択して接触させ
て、該抗イディオタイプ抗体と上咽頭癌細胞膜表面抗原
に対する抗体を免疫反応させることにより行われる。こ
の免疫反応は、従来公知のEIA法、RIA法、ラテックス比
濁法又はリポソーム、蛍光標識物質を用いる方法、ある
いはマウス、ラット、モルモット、ウサギ等の動物を介
する免疫応答反応（PCA、DTH反応等）を利用する方法等
によって行うことができる。
叙上の如き本発明方法によれば、血清又は体液中の上
咽頭癌細胞膜表面抗原に対する抗体を正確に測定するこ
とができ、癌の存在を早期にかつ適確に診断することが
できる。
咽頭癌細胞膜表面抗原に対する抗体を正確に測定するこ
とができ、癌の存在を早期にかつ適確に診断することが
できる。
次に、参考例及び実施例を挙げて説明する。
参考例１ （１）モノクローナル抗NPC−204イディオタイプ抗体産
生細胞株の作製： NPC−204株の膜表面抗原に対するモノクローナル抗NP
C−204抗体を産生するハイブリドーマ76AC6−B9株を無
血清倍地SFM−101（日水製薬株式会社製）中で培養し、
培養上清中より得た抗NPC−204抗体を56℃、30分温浴中
で反応させたのちコンプリート・フロイント・アジバン
ト中に混和してBALB/c ♀マウス６〜８週令に100μｇ
皮下注射した。初回注射の２週間後に抗NPC−204抗体を
インコンプリート・フロイント・アジバント中に混和し
て100μｇ皮下注射した。更に２週間経過後、抗NPC−20
4抗体をPBS中に溶解して100μｇマウスの腹腔内に注射
し、３日後に脾臓を摘出して単核脾細胞とした後、８−
アザグアニン耐性BALB/cマウス骨髄細胞株NS−１又はP3
u−１と50％PEG（シグマ社製、分子量4,000）により融
合させた。
生細胞株の作製： NPC−204株の膜表面抗原に対するモノクローナル抗NP
C−204抗体を産生するハイブリドーマ76AC6−B9株を無
血清倍地SFM−101（日水製薬株式会社製）中で培養し、
培養上清中より得た抗NPC−204抗体を56℃、30分温浴中
で反応させたのちコンプリート・フロイント・アジバン
ト中に混和してBALB/c ♀マウス６〜８週令に100μｇ
皮下注射した。初回注射の２週間後に抗NPC−204抗体を
インコンプリート・フロイント・アジバント中に混和し
て100μｇ皮下注射した。更に２週間経過後、抗NPC−20
4抗体をPBS中に溶解して100μｇマウスの腹腔内に注射
し、３日後に脾臓を摘出して単核脾細胞とした後、８−
アザグアニン耐性BALB/cマウス骨髄細胞株NS−１又はP3
u−１と50％PEG（シグマ社製、分子量4,000）により融
合させた。
融合細胞の選択は無血清倍地SFM−101により行なっ
た。融合細胞の培養上清についてEIA法により抗NPC−20
4抗体との結合性を調べ、反応性の高いものについて限
界希釈法によりクローニングを実施し、モノクローナル
抗NPC−204イディオタイプ抗体産生株IVN−63、IVP−4
1、IVN−４を得た。
た。融合細胞の培養上清についてEIA法により抗NPC−20
4抗体との結合性を調べ、反応性の高いものについて限
界希釈法によりクローニングを実施し、モノクローナル
抗NPC−204イディオタイプ抗体産生株IVN−63、IVP−4
1、IVN−４を得た。
（２）抗NPC−204イディオタイプ抗体の製造： （１）で得られたモノクローナル抗NPC−204イディオ
タイプ抗体産生株を無血清倍地中で培養し、培養液を1,
500rpmで15分間遠心分離したのち、上清を更に10,000rp
mで20分間遠心分離し上清を得た。この上清を限外ろ過
膜Amicon Diaflo YMIOを用いて1/10〜1/20容量まで濃縮
したのち、等容量の飽和硫安を加えて蛋白分画を沈殿さ
せた。冷所に１夜置いたのち10,000rpm、15分間遠心分
離し、得られた沈殿物をPBSに溶解した後、0.9％NaCl液
で48時間透析して、それぞれ３種のモノクローナル抗NP
C−204イディオタイプ抗体を得た。
タイプ抗体産生株を無血清倍地中で培養し、培養液を1,
500rpmで15分間遠心分離したのち、上清を更に10,000rp
mで20分間遠心分離し上清を得た。この上清を限外ろ過
膜Amicon Diaflo YMIOを用いて1/10〜1/20容量まで濃縮
したのち、等容量の飽和硫安を加えて蛋白分画を沈殿さ
せた。冷所に１夜置いたのち10,000rpm、15分間遠心分
離し、得られた沈殿物をPBSに溶解した後、0.9％NaCl液
で48時間透析して、それぞれ３種のモノクローナル抗NP
C−204イディオタイプ抗体を得た。
実施例１（EIA・二抗体法） リン酸緩衝液（PBS）に溶解したモノクローナル抗NPC
−204イディオタイプ抗体（IVN−63抗イディオタイプ抗
体）（×1,000）100μをEIA用96穴マイクロプレート
に取り、４℃、24時間反応させ、精製水で洗浄後、0.2
％BSA/PBS（−）によりブロッキングを行い、モノクロ
ーナル抗NPC−204イディオタイプ抗体感作プレート（以
下感作プレートと略称）を作製した。続いて、この感作
プレートに血清サンプルを加え、２時間反応後、洗浄
し、血清サンプル中のNPC−204膜抗体存在の有無をアル
カリフォスファターゼ標識した抗ヒトイムグロブリンに
より調べた。その結果、第１図に示した様に正常人およ
び他癌患者血清に比し、上咽頭癌患者血清では明らかな
高値を示した。
−204イディオタイプ抗体（IVN−63抗イディオタイプ抗
体）（×1,000）100μをEIA用96穴マイクロプレート
に取り、４℃、24時間反応させ、精製水で洗浄後、0.2
％BSA/PBS（−）によりブロッキングを行い、モノクロ
ーナル抗NPC−204イディオタイプ抗体感作プレート（以
下感作プレートと略称）を作製した。続いて、この感作
プレートに血清サンプルを加え、２時間反応後、洗浄
し、血清サンプル中のNPC−204膜抗体存在の有無をアル
カリフォスファターゼ標識した抗ヒトイムグロブリンに
より調べた。その結果、第１図に示した様に正常人およ
び他癌患者血清に比し、上咽頭癌患者血清では明らかな
高値を示した。
実施例２ （PCA反応法） 上咽頭癌患者及び正常人の血清0.1mlをモルモット背
部皮内に注射し、１時間後に、モノクローナル抗NPC−2
04イディオタイプ抗体（IVN−63抗イディオタイプ抗
体）10μｇ及び１％エバンスブルー1mlを静脈内注射し
た。その10分後に、患者血清注射部位の色素浸潤の大き
さを測定した。その結果は表３のとおりであり、患者血
清の色素浸潤の大きさは正常人血清のそれに比較して明
らかに大きかった。
部皮内に注射し、１時間後に、モノクローナル抗NPC−2
04イディオタイプ抗体（IVN−63抗イディオタイプ抗
体）10μｇ及び１％エバンスブルー1mlを静脈内注射し
た。その10分後に、患者血清注射部位の色素浸潤の大き
さを測定した。その結果は表３のとおりであり、患者血
清の色素浸潤の大きさは正常人血清のそれに比較して明
らかに大きかった。
第１図は、モノクローナル抗NPC−204イディオタイプ抗
体を用いて血清中の上咽頭癌細胞膜表面抗原に対する抗
体を測定したときの結果を示す図である。
体を用いて血清中の上咽頭癌細胞膜表面抗原に対する抗
体を測定したときの結果を示す図である。
Claims (3)
- 【請求項１】血清又は体液を、上咽頭癌細胞の膜表面抗
原に対するモノクローナル抗体のイディオタイプに結合
するモノクローナル抗イディオタイプ抗体と接触させ、
当該モノクローナル抗イディオタイプ抗体に結合した抗
体量を測定することを特徴とする上咽頭癌細胞の膜表面
抗原に対する抗体の測定法。 - 【請求項２】上咽頭癌細胞が、上咽頭癌由来の細胞株NP
C−204である特許請求の範囲第１項記載の測定法。 - 【請求項３】動物を介する免疫応答反応により行う特許
請求の範囲第１項記載の測定法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62054921A JP2553343B2 (ja) | 1987-03-10 | 1987-03-10 | 癌抗体の測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62054921A JP2553343B2 (ja) | 1987-03-10 | 1987-03-10 | 癌抗体の測定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63221248A JPS63221248A (ja) | 1988-09-14 |
| JP2553343B2 true JP2553343B2 (ja) | 1996-11-13 |
Family
ID=12984080
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62054921A Expired - Lifetime JP2553343B2 (ja) | 1987-03-10 | 1987-03-10 | 癌抗体の測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2553343B2 (ja) |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS59122951A (ja) * | 1982-12-03 | 1984-07-16 | イエシバ・ユニヴア−シテイ− | ヒトの抗生得ｄｎａ抗体上の共通イデイオタイプと反応可能なモノクロ−ナル抗体 |
-
1987
- 1987-03-10 JP JP62054921A patent/JP2553343B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS63221248A (ja) | 1988-09-14 |
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