JPS62500771A - リウマチ熱テストおよびこれに有用なモノクロ−ナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、リウマチ熱にかかシやすい人々を発見するために役立つモノクローナ ル抗体に関するものである。

それは、このような抗体の産生及び使用方法、それを含む組成物、それを産生ず るのに有用なハイプリドーマ細胞系およびそれらを含む診断用キットにもまた関 するものである。

マウス骨髄腫細胞と、免疫マウスから分離した膵臓細胞とを用いてハイブリドー マ細胞系およびモノクローナル抗体をつくる方法は最初にコーラ−（Ｋｈｏｌｅ ｒ　）およびミに、’、ｐイｙ　（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ　）がＮａｔｕｒｅ　２５ ６巻４９５ページ（１９７５）に記載した。その後新しい細胞系およびモノクロ ーナル抗体の作成にかなシの努力が費された。

このような作成に適用できる一般的技術は公知であシよく理解されている。しか しながら操作法を知っていることは成功を保証するものではない。多くの困難お よび予想外の障害がある。実際、所与のハイブリドーマをつくろうとする前には 、もしそれが得られたとしてもそれが抗体を産生ずる保証もないし、産生された 抗体が所望の特異性を示す保証もない。成功の割合は、使用する抗原の型、利用 する融合技術および長期の培養技術によって引き続き維持されるべき所望の特異 性をもったハイプリドーマを確認し、分離するために用いる選択技術に依存リウ マチ熱にかかシやすい人は現在世界人口のかなりの部分を占める。インドではり ウマチ熱の新しい症例は１年に８００万と推定され、メキシコでは３００万症例 、アフリカでは１０００万症例と推定される。これらの人々の最低６０％に、最 後には重大な慢性心疾患が発生する。

特殊のＢ−細胞同種抗原があり、その生成はりウマチ熱をおこす患者と有意に関 係しているということを示唆する強い証拠がある；パタロヨ、マニュエｋ　Ｅ　 等（Ｐａｔａｒｒｏｙｏ。

Ｍａｎｕｅｌ　Ｂ、　ｅｔ　ａｌ　）の”連鎖球菌疾患および免疫反応（５ｔｒ ｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ　Ａｎｄ　Ｔｈｅ　Ｉｍｍｕｎｅ　Ｒ ｅ５ｐｏｎｓｅ）″アカデミツクプレス、１９８０．３６９ページ。感染してい ない、明らかに正常な人にこの同種抗原が発生すること、そして患者の感染して いない家族にそれが受けつがれていることは、同種抗原が遺伝的性質をもつ証拠 である。

つまり、ボゴタ、コロンビヤ、の経産婦から分離された、血清８８３と名づけら れた血清が、世界中の種々の地方の証明された全リウマチ熱患者の７０〜７５％ を正しく特定したという事実が、同種抗原の存在する証拠である。

感染しやすい人へのりウマチ熱の侵襲は、連鎖球菌性咽喉痛の余病である。今日 の状態では、リウマチ熱侵襲を防ぐためには、プラス培養および連鎖球菌抗体の 増加によって明らかになった咽喉痛を、ペニシリンの１ｏ日間の経口投与または 注射によって治療する。この期間内に連鎖球菌感染症を癒すことができないと、 最も危険性の高い年令群（５〜１８才）の３％にリウマチ熱が発生することにな る、というのが本方法を行なう理由である。

現在のところ、現実にリウマチ熱にか−る前に、この病気にか＼る危険性のある 人々を発見する方法はない。

幸いなことに、急性侵襲後、日常的予防およびペニシリン治療によってこの患者 を次の侵襲から守ることができる。生まれた時にその罹患性を確認できれば、そ れは医者が治療する場合の貴重な武器が一つふえたことを意味する。もしも生ま れた時に存在する遺伝マーカーがＢ−細胞から得られるならば、各新生児から得 た、フードをつけたヘパリン加血液の少量について、そのマーカーの存在を調べ ることができる。試験の結果が陽性ならばその子供はりウマチ熱に感染しやすい 人であると決定される（全人口の約１９％）。その母親が自分の子供がリウマチ 熱に感染する危険性があることを知れば、それら子供の咽喉痛はすべて、普通は ペニシリンで、１ｏ日間注意深く治療される。感染しやすくない子供達が連鎖球 菌性咽喉痛に感染したときは、それよシ短かい期間、すなわち４〜５日間治療す る。費用が節約されることは容易にわかる。

このような確認テストは、比較的豊かな国々においても重要であるが、第三世界 の国々でははるかに重要である。これらの国では人口が特に多く、いまだに増え っ−あり、すべての連鎖球菌性咽喉痛の治療は不可能であり、経済的にも絶望的 である。出産時および幼児期に罹患性の高い個々人を確認できれば、このような 国の保健機関はこれらの高リスクの人々に努力を集中することができる。これら の人々を確認するための費用の安い方法が、リウマチ熱の最も不幸な結果の一つ である長期にｌる慢性心疾患を予防するための最適の方法であることは明らかで ある。現在、一般保健予算の非常に大きい部分が対症的治療に、そしてリウマチ 熱からおこる長期の慢性心疾患犠牲者を支えるために費されている。予防は明ら かにより安価な方法である。

発　明 リウマチ熱の危険性のある人のテストに用いることのできる新規のモノクローナ ル抗体を産生できる新規のハイブリドーマを発明した。これらのハイブリドーマ の一つは、証明されたりウマチ熱患者の約９５％について遺伝−７−カーを特定 することに成功した。

この説明の目的のために、証明されたりウマチ熱患者とは、修正ジョーンズクリ テリャによって、病気にか＼っている人々のことである。ストラーマンＧ、　Ｈ ，（Ｓｔｏ−１１ｅｒｍａｎ、　Ｇ、　）■、　）　、　１９７５　、　”リウ マチ熱と連鎖状球菌感染症（Ｒｅｕｍａｔｉｃ　Ｆｅｖｅｒ　Ａｎｄ　５ｔｒｅ ｐｔｏｃｏｃｃａｌ　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）”。

ニューヨーク：グリーン、８８１８１ページ。

本発明の根源となった考察は、上に引用せる経産婦の血清８８３が、証明された りウマチ熱患者の７０〜７５％を正しく特定できた、という知見であった。これ らの人々は８８３＋であるとされた。これらの人々から分離したｆ３９ンパ球を 用いて新規のハイブリドーマＤ８／１７を作った。

本発明のハイブリドーマの作成段階は次のようである。

１、　血清８８３＋を用いて、８８３＋である証明されたりウマチ熱患者を特定 する。

２、　８８３＋患者からＢＩＪンパ球を分離する。

３、　動物−好ましくはラットまたはマウスのような１歯類動物−を、分離した リンパ球で免疫する。

４、免疫した動物から、Ｂ−細胞を含む全膵臓細胞を分離する。

５、　分離した膵臓細胞を、動物−好ましくはラットまたはマウスのような１歯 類動物−から分離した骨髄腫細胞と融合する。

６、　融合細胞の中から、リウマチ熱患者−最初の同種抗血清によって調べて彼 等が８８３＋であろうと８８３−であろうと関係なく−からのＢ−リンパ球とプ ラスに反応するハイブリドーマ細胞系を選ぶ。

７、　ハイブリドーマ細胞をクローン化し、モノクローナル抗体をつくる。

クローン化ハイブリドーマは標準法によって希釈してさらにサブクローン化する こともできる。

以後さらに詳しく説明するように、８８３＋の１患者から誘導したハイブリドー マはＤ８／１７ど決められた。Ｄ８／１７を産生ずるハイブリドーマ細胞系がひ とたび確認されると、これら細胞系を利用して、付加的細胞系および抗体のいか なる所望量をも産生ずることができる。この目的のためにそれらを適当に保持し 、培養またはマウスの腹腔内で増殖させる。それらは液体窒素中に保存され、必 要なときに再活性化することができる。

本発明の詳細な説明 本発明をよりよく理解するために、以下にハイブリドーマＤ８／１７をつくる方 法の詳細を述べる。

急性症状を１０−２０年間もっているよく証明されたりウマチ熱患者の多数を、 上記のヒト同種抗血清でテストした。その血清により患者は２群に分けられた： 　８８３”および８８３−０すべての患者は実際にリウマチ熱にか−っていたこ とを強調しておく。

１人の８８３＋患者を選び、定まった時間間隔で１５０ゴづつ、全部で５００− のヘパリン加血液を集めた。血液サンプルからり／パ球をウィンチェスタ−等（ Ｗｉｎ−ｃｈｅｓｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　）の方法、　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ 、　１４１　、９２４（１９７５）で分離した。

Ｆｉｃｏｌ　Ｉ−Ｈｙｐａｑｕｅ糖−脂質混合物を、水と比較して１．０７７の ｂｏｕｙａｎｔ密度をもつように調製した。ヘパリン加血液をその密度混合物上 に注意深く層状に流し込み、チューブを２５０Ｏｒｐｍで４０分間回転させた。

この密度では赤血球と白血球は底に沈澱し、Ｔ−およびＢ−細胞はＦｉ　ｃｏ　 ｌ　Ｉ−Ｈｙｐａｑｕｅ物質中に掴えられる。Ｔ−およびＢ−細胞を集め、燐酸 緩衝食塩液で３回洗い、１−につき１００万細胞の割合の濃度で再懸濁させた。

Ｔ−細胞を除去するために細胞懸濁液を、ノイラミニダーゼ処理−羊赤血球細胞 の５％懸濁液と混ぜ、１１０００ｒｐで１０分間遠沈し、４℃で１時間放置する 。ロゼツト細胞、すなわち羊赤血球に結合した細胞、および非ロセット細胞を、 同じｂｏｕｙａｎｔ密度ノＦｉ　ｃｏ　Ｉ　Ｉ−Ｈｙｐａｑｕｅ物質２−３艷に 再懸濁させた。前のように遠沈を繰シ返した。ロゼツＩ−Ｔ−細胞はＢ−細胞群 を残してチューブの底に沈澱した、層中の細胞の約２０％がＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙ −ｐａｑｕｅ混液中でロゼツトを形成しなかった。これらのＢ細胞−Ｔ細胞の２ ％以下のマクロファージも含む−を混液から回収し、燐酸緩衝食塩液で洗って、 注射用に準備した。全血の１５０−サンプルは約４０００万ケのＢ−細胞を供給 する。

これらヒ）Ｂ−細胞に対する抗体をふやすために、その細胞をマウスに注射して 免疫した。細胞を２０００万づつの２部分に分けた。各マウス（２匹）に１回腹 腔内注射し、その後マウスの免疫反応を刺激するためにアジュバントとして０． ２　ｍｌ明ばん（４ｍ９７ｍ！　’）を注射した。４週間後、２回目の２０００ 万Ｂ−細胞をアジュバントなしで同じマウスに注射した。４日後マウスを殺した 。

免疫マウスから膵臓を無菌的に摘出し、２０ゲージ皮下注射針で細切した。生成 した細胞−および組織断片−懸濁液を減菌したステ／レスｍ１１スクリーンを通 して押出した。その細胞懸濁液をその後血清−ｆｒｅｅのＤＭＥＭで洗い、臨床 用遠心分離器で１００Ｏｒｐｍで５分間遠沈した。ベレットヲ０．１７Ｍ塩化ア ンモニウム５−に懸濁させ、懸濁液を、時々撹はんしながら１０分間氷上に保っ た。

１０分間の終りに血清−ｆｒｅｅ　ＤＭＥＭを加えて全量を５０−にし、再び細 胞を１０分間１０００　ｒｐｍで遠沈した。

対数的に増殖するＰ、Ｕ骨髄腫細胞を、５〇−遠沈管中で１１０００ｒｐで５分 間遠沈しベレットにすることにより収穫した。生成したペレッＩ・を１〇−血清 −ｆｒｅｅ　ＤＭＥＭに再懸濁し、再懸ＦＪが完了した後、チューブに血清ｆｒ ｅｅＤＭＥＭを加えて５０−にする。骨髄腫細胞を前記のように臨床用遠心分離 器でベレットにし、生成したベレットを１〇−血清ｆｒｅｅ　ＤＭＥＭに再懸濁 し、数を数えた。膵臓細胞と骨髄腫細胞を１：１の比で混合した。

肺臓細胞／骨髄腫ｍ胞混合物を５分間１１０００ｒｐでベレットにし、注意して ほとんど全ての上澄液を除去した。

ベレットをその後、４０％ポリエチレングリコール（３２００〜３７００分子量 ）と５．６％ジメチルスルフオキシドを含むＤＭＥＭ　ｌ、　Ｑ　、ｚに３７℃ で懸濁した。そのチューブをバイアル回転機上に置き、２Ｑ　ｒｐｍで正確に１ 分間回転させた。この１分間の終シに、３７℃の血清−ｆｒｅｅ　Ｉ別を１．０ −追加し、チューブを回転機に戻し、２分間回転させた。その２分間の終りにｚ Ｏ−の血清−ｆｒｅｅ　ＤＭＪｈを加えて、再度細胞懸濁液の容量を２倍にした 。該チューブを回転機に戻し、２分間回転させた。２分の終シに、１０％馬血清 を含むＤＭＥＭ　４．　Ｏｍをその混合物に加え、再び回転機に戻し、今度は３ 分間回転させた。３分間の終りにＤＭＥＭ　／　１０％馬血清８．０−をその混 合物に加え、回転機に戻して３分間回転させた。その後ＤＭＥＭ　／１０％馬血 清をチューブに加えて全量を５０ｍとした。その細胞混合物を５分間１０００　 ｒｐｍで遠沈した。ベレットを、１０％馬血清それに補充的にヒボキサンチンお よびチミン／を含むＤＭＥＭ　１０−に再懸濁した。全量を５０Ｔｎｔとし、そ の混合物の一部を組織培養皿にとり、−晩３７℃で、７％ＤＯ２空気中で培養し た。

翌日、１０％馬血清、補充的ヒボキサンチンおよびチミジンを含むＤＭＥＭと、 ＺＸ濃度のアミノプテリンの等量を各組織培養皿に加え、細胞をイノキュベータ ーに戻した。２，３日以内にハイプリドーマクローンカ環れ、１週間以内に抗体 産生細胞のスクリーニングが始めることもできる。

培養物を約２゛週間増殖させ、それから上澄液に、リウマチ熱患者のＢ−細胞上 の抗原に特異的なモノクローナル抗体があるかどうかを試験した。

間接的免疫螢光法として知られる試験を行うために、上述のように作ったＢ−細 胞の一部分をとＥｌ、１００μｌにつき約ｉｏｏ、ｏｏｏ　ｍ胞を含むサンプル がミクロタイター凹みに置かれるようにｎｇＮする。５００Ｘ５で８分間遠沈し 、上澄液を吸引除去し、１００μｌのｐＨ７，２冷（４℃）燐酸緩衝食塩液（Ｐ ＢＳ）、１％ＢＳＡおよび０．０２％す）　ｌ）ウムアチドに再懸濁する。細胞 を再び同じ速度で遠沈し、上澄液を除去する。試験する上澄液２０μｌをその懸 濁液に加え、プレートをしづかにた＼いて細胞を試験する上澄液中に拡散させ、 そのプレートを４℃で１時間インキュベートする。それから上記溶液１５０μｌ をプレートに満たし、５００×７で１０分間遠沈し、上澄液をとり除く。最後の 洗浄および遠沈後、プレート中の細胞を上記ＰＢＳ溶液で洗い、洗浄緩衝液を除 き、フルオレツセイノと結合した山羊抗マウス免疫グロブリフ２０μｌを細胞に 加え、再び４℃で１時間培養する。培養後、細胞を再び冷ＰＢＳ溶液１５０μＥ に懸濁し、遠沈し、上澄液を除去する。細胞をおだやかにＰＢＳ溶液２０μｌに 再懸濁させ、ガラススライド上に置き、カバースリップをかける。標準螢光顕微 鏡を用いて螢光細胞を読む。Ｂ−細胞集団の６０％が螢光を発している場合は結 果はプラスであるとされる。

上記の結果を確認するために標準細胞障害性アツセーも行われた。上記の同じＢ 細胞−各々が１０００細胞を含む−をテラサキ・プレートの凹みに置いた。各サ ンプルを試験する上澄液２〜５μｌと混ぜた。既知量の補体を加え（普通は新鮮 なモルモット補体）、それから少量のトリバンブルー色素を加えた。

この標準テストにおいて、プラスの抗体はりウマチ熱患者のＢ−細胞上の抗原と 反応する。何らかの起源−例えばモルモット血清由来−の補体の存在下において は、その抗体は細胞にとって細胞障害性であり、色素の細胞中への浸透を可能に する。こうしてプラス細胞は青色になシ、顕微鏡下で容易に見つけると七ができ る。テスト細胞の８０％以上が青色に変った場合、そのテストはプラスと読みと られ、Ｂ−細胞の細胞表面に特異的抗原が存在することを示す。

こうして１００以上の上澄液を試験した。この方法で、ハイプリドーマＤ８／１ ７は、ヒト同種抗血清８８３によって最初に８８３＋か８８３−かに決められた すべてのりウマチ熱患者に特異的であることがわかった。

こうして、本発明の単一のハイプリドーマクローンを試験に用いた場合、全リウ マチ熱患者の９５％が彼等のＢ−細胞上に抗原を示す。

Ｄ８／１７から得られた本発明のモノクローナル抗体は、リンパ球の選択パネル のどの抗原とも反応しない。Ａ。

Ｂ、Ｃ，およびＤＲＩ〜ＤＲ８並びにＨＬ　Ａ特異性を包含するリンパ球を選び 出した、なぜならばすべての人は、彼等がリウマチ熱に感染しやすいか否かに関 係なく、彼等のリンパ球表面にこれらの遺伝的に決定された同種抗原をいくつか もっているからである。抗体がこれらリンパ球上のいかなる抗原とも反応しない という事実は、その抗体がリウマチ熱にか＼りやすい人々に特異的な抗原に対し て特異性をもっているというもう一つの証拠となる。

上述の方法は、本発明の新規なモノクローナル抗体を産生ずる新規なハイブリド ーマを作る。この抗体は標準的方法で分離することができるが、必ずしもそうす る必要はない。一般的に有用な方法ては、例えば沈澱１透析。

クロマトグラフィー、膜ろ過および電気泳動が含まれる。

抗体を分離するのに用いられるそのような方法の一つは、増殖する培養細胞の上 澄液から硫酸アンモニウムによって抗体を沈澱することであった。この方法では 、活溌に増殖するバイブリド−・７抗体分泌クローンから得た上澄液１００ｒｎ ｔを２７℃で２４，２り硫酸アンモニウムどゆっくり混ぜ、上澄液物質の４０％ 硫酸アンモニウム溶液をつくる。混合物を磁気撹拌棒でゆっくり撹拌しながら３ ０分間放置する。上澄液を傾瀉し、ベレットを４０％硫酸アンモニウム溶液で３ 回洗った、その都度１０．００Ｏｒｐｍで遠沈した。最後にペレットを０．０２ ％ナトリウムアチドを含む受酸緩衝食塩液２〜５−に再懸濁し、同じ緩衝液で平 衡にした３　０　ｍｔ　ＤＥｉ七ルローズ力ラムを通す。落下する先端は純粋な 抗体を含んでいた、それを２〜３づにｅ縮し、！Ａ一部分を使用時まで貯蔵する 。

別法は、マウス免疫グロブリンに対して生じた抗血清に、モノクローナル抗体を 吸収させることである。例えば、その抗血清を臭化シアンで活性化したセファロ ーズ・ビーズに結合させる。モノクローナル抗体を含む上澄液をカラムを通過さ せ、それによってそれをカラム上に掴える。カラムを燐酸緩衝溶液、ｐＨ７，６ ，で徹底的に洗った後、第二の段階はｐＨの低い緩衝液（クエン酸す）　ＩＪ　 ラム、　ｐＨ２，５〜３．９）を通過させることである。

これはモノクローナル抗体を解離させる。解離した抗体をカラム溶出液から集め 、０．ＩＮ水酸化すトリウムでｐＨ７，６に中和し、その後の使用のために濃縮 する。

本発明のプロセスにより、モノクローナル抗体を培養培地に分泌するハイブリド ーマを作ることができる。培養培地の上澄液はモノクローナル抗体を十分大きい 濃度で含み、そのためその上澄液があたかもモノクローナル抗体であるかのよう にその上澄液をほとんどあらゆる目的に使うことができる。ハイプリドーマ培養 細胞は、多数の既知の、そして容易に得られる培養培地を用いる標準的方法によ って、その他のバイブリド°−マおよび抗体をつくるために用いることができる 。

Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ／ｃマウスは現在免疫のために好ましい対象であるが、その他の マウス種も用いられ、他のｒｑｉｉｍ類−特にラット−も用いられることが判明 した。

現在用いられるマウス骨留腫Ｐ３Ｕ細胞は、ＢＡ　Ｌ　Ｂ／ｃ牌臓膵臓と、ＢＡ ＬＢ／Ｃ骨髄腫細胞との融合から生じ、免疫グロブリン合成および分泌のない細 胞系をつくる。しかし多くの他のマウス骨髄腫細胞系が知られており、例えば貯 臓銀行から手に入る。これらは本発明の実施のために利用することができる。細 胞系は上に説明したように薬物に抵抗性のある種類であることが望ましい、その ため融合しない骨髄腫細胞は生き残らない。最も一般的な種類ば８−アザグアニ ン抵抗細胞系である、これには酵素１（ＯＰＩばか欠けており、従ってＩ−Ｉ　 Ａ　Ｔ培地では増殖しない。骨髄腫細胞系も免疫グロブリン非分泌性種類が好ま しい（例えばＰ３ｕ系列）、これは細胞によって産生された抗体がモノクローナ ル抗体に混入するのを辺止するためである。融合プロセスのために適した膵臓細 胞：骨髄腫細胞の比は約５＝１からｔ：ｏｓｔである。好ましい比は工：１であ る。

現在のところ好ましい融合促進物質は平均分子量約１０００〜４０００のＰＥＧ （ポリエチレングリコール）である。その他の融合促進物質も知られており、使 用することができる。

本発明のモノクローナル抗体は、アメリカ＠養フレクンヨノに保存され、受付番 号　と指定されるハイブリドーマ細胞系からつくることができる。その細胞系を 用いてこのどちらかの方法で別の抗体をつくることができる。

最も純粋なモノクローナル抗体は、選択したハイブリドーマを適した培地で、適 した期間イノビトロ培養することによって産生される。その抗体は、所望ならば 上澄液から回収されるが、そうする必要はない。適当な培地および適当な培養時 間が知られており、または容易に決めることができる。幾つかの使われる培地の 中で代表的なのはダルベツコの変形イーグル培地およびＲＰＭＩ　１６４０であ る、これらはＭＡバイオプロダクｙ　（ＭＡ　Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ）　。

ウォルカースヴイル、マリーラ／ド、から入手できる。

このイノビトロ法は、その他の抗体がほとんど含まれない、はとんど単一特異的 なモノクローナル抗体を作シ出す。しかしこのインビ）ｏ法は、成る目的のため には十分な量または濃度の抗体を産生ずることができないかも知れない、なぜな らば産生されるモノクローナル抗体の濃度は約１−２０μｇ／−に過ぎないから である。

いくらか純粋でないモノクローナル抗体を遥かに大きい濃度で産生させるために 選択したハイブリドーマをマウス、好ましくは遺伝子°組成が同じ（ｓｙｎｇｅ ｎｅｉｃ　）であるか又はこれに準する（　ｓｅｍｉｓｙｎｇｅｎｅｉｃ　）マ ウスの腹腔内に注射する。ハイブリドーマは適当なインキュベーション時間の後 、そのマウスに抗体産生性腫瘍を誘起する。

その結果宿主マウスの血流中および腹腔的滲出液（腹水）中には高濃度の所望抗 体（約５−２０　ｍｙ／ｍｌ　）が産生ずる。

宿主マウスは血液および腹水中に正常の抗体をも有するとはいえ、これら正常抗 体の濃度はモノクローナル抗体濃度の約５％にしか過ぎない。その上これらの正 常抗体は、特異性においては抗−ヒ）Ｂ−細胞ではないから、採取した復水また は血清から得られるモノクローナル抗体は混入抗体をほとんど含まない。

本発明のモノクローナル抗体組成物は、普通に得られる例えばヒト抗血清のよう な抗体組成物とは区別される。

この後者の組成物は、たとえ高度に精製した形であっても著量の混入抗体を含む 。それに対して本発明の組成物には混入抗体がほとんどない。したがってこれら は熟練せる当業者には容易にわかるように、容易に多数の医薬的用途に用いられ る。その組成物は、薬物的に不活性な媒ｉ−ｔなわち毒性がなく、選ばれた用途 において抗体の生理的活性に悪い影響を与えない媒質−中に抗体を含む。多く使 用される媒質は、ハイブリドーマがその中で増殖し、抗体を産生じて放出する培 養培地である。それは水性媒質であってもよいしく例えば、等侵食塩溶液）また はブドウ糖溶液、またはピーナツ油またはゴマ油のような油であってもよい。

本発明の生産物の最も重要な医学的用途は、リウマチ熱の危険性のある人を見出 すことである。この診断的目的のために、選択された抗体を被験者からのＢ−リ ンパ球と反応させる、プラスの場合には、その人はＤ８／１７由来の抗体と反応 する抗原をもっていると特徴づけられる。

いか々る試験に用いられる、抗体含有組成物も、抗原と反応して検出可能の生成 物を生産できるほど十分な抗体を含んでいなければならない。このような診断的 に有効な量の抗体は、熟練せる当業者には公知の多数の要因によってかなり変化 する。これら要因としては、例えば、害施する試験の感度、使用する器材および 被験す：／プルの量がある。

多数の臨床テストはどれでも本発明のハイブリドーマおよび抗体を用いて実施す ることができる。典型的テストとしてはラジオイムノアッセー、酵素結合免疫試 験。

沈澱、凝固、直接的および間接的免疫螢光法、補体結合テストがある。これらの テストでは競合的およびサンドウィッチ型アッセーを使用することもできる。こ れらのテストでは検出可能の標識を用いることもできる。抗原。

モノクローナル抗体、または家兎抗マウス血清のような抗−抗体を標識化できる 。有用な標識としては、フルオレツセイン、Ｉコーダミンまたはオーラミンのよ うな螢光標識がある。＋ＡＣ、＋３１１　、１２５１　、２５８のような放射性 同位元素を用いることもできる。使用される酵素標識としては例えばβ−グルカ ミダーゼ、β−Ｄ−グルコシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、イレアーゼ、 グルコースオキシダーゼ＋ペルオキシダーゼ、酸性またはアルカリ性ホスファタ ーゼがある。細胞、抗体、抗原および抗血清のような生物学的産物を標識化する 方法はよく知られており、記載する必要はない。

これらの標識を検出するための現在使用できる方法はいくつかある、例えば比色 法、スペクトロフォトメトリー、フルオロスペクトロフォトメトリー、光学的お よびガス測定方法、並びに同位元素ケ検出する種々の器機的方法。

本発明によって有効に用いられるあらゆるテストは、本発明のモノクローナル抗 体と、リウマチ熱の危険性のある人のＢ−リンパ球にあられれる抗原とから成る 検出可能の反応生産物の生成から成る。もちろん検出可能の反応生産物にはその 他の、抗抗体のような成分も存在することか可能である。

現在好ましい診断テストは、本発明のハイブリドーマを確認するために用いられ た上記のテストである。論断的目的のためには、リウマチ熱の危険のある人のｆ ３　ｙンパ球上“の抗原を認識するハイブリドーマを用いてテストを行う。その テストではハイブリドーマ１μｌを被験者の１３−リンパ球集団１μｌ　（２０ ００細胞）、家兎補体５μｌ　、　）　Ｕバンブルーまたはエオシン（１５％水 溶液）のような色素およびホルマリン５μｌ、ｐＨ７，０と混ぜる。

プラスのテスト結果は青か赤の色の出現で示される、これは肉眼で見える。この 色の出現は、抗体とＢ　ＩＪンバ球抗原との反応産物が、補体の存在下ではり／ パ球てとって細胞障害性であるためである。細胞障害作用は細胞膜の破壊をおこ し、色素が破れた細胞の成分と反応して色を生ずる。

この方法は、精巧な器機が使えないような場合に特に役に立つ。低パワーの簡単 な顕微鏡がこのテストのための器機として必要なすべてである。技術者は高度に 訓練される必要がない。テストを行うために用いる一般的キットは、診断量の本 発明の抗体を、補体および色素と共に含む。現在好ましい補体はモルモット補体 であるが、その他のものも用いられる。

適当な測定器機がある場合の適用できるもう一つのテストでは、被験者からの血 液をｐｌ−１７，２〜７．６の燐酸緩衝食塩液のような緩衝液中で、標識化され た形の本発明のモノクローナル抗体を含む混合物と共に約２０’〜４５℃でイン キュベートする。プラスの反応がある場合、抗原−標識化抗体の反応生産物をそ の選択した標識に合う器機な用いて検出することができる。

このテストのためのキットは、緩衝液と、発明の標識化モノクローナル抗体の診 断量とを含む。

このテストの感度は、抗抗体をいわゆるマーカー抗体として用いることにより改 善される。この方法において、被験者からの血液を緩衝液中で選択した温度で、 本発明のモノクローナル抗体およびフルオレッセイ／と結合した山羊または家兎 抗マウス抗体のような標識化抗血清を含む混合物と共にインキュベ−１・する。

プラステストで生成した検出可能の生産物は、Ｂ−リンパ球抗原、モノクローナ ル抗原、および標識化抗血清の反応生産物である。その生産物は、もしフルオレ ッセインで標識化されているならば、フルオロメーターで検出できる。当業者に 公知の、しかも抗体反応性を破壊しないその他の標識も、抗原の検出性を高める ために用いることができる。

このような標識は例えば放射性同位元素−例、　＋２５Ｉ、　＋３１）。

３Ｈ１または”Ｃ（ＲＩＡ）　−−！たけ酵素−例：ホースラディツシュベルオ キシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、等である （　ＥＬＩＳＡ　）。

手続補正書（自発） 昭和６２年１月２ｚ日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ハイブリドーマ細胞系Ｄ８／１７またはそのサブクローンから誘導されるモ ノクローナル抗体であって、ヒトＢ−リンパ球のリウマチ熱関連の補足抗原とは 特異的に反応し、Ｂ−リンパ球のＡ，Ｂ，Ｃ，ＤＲ′−１〜ＤＲＷ８座の既知の ＨＬＡ抗原とは反応しないモノクローナル抗体。 ２．ハイプリドーマ細胞系Ｄ８／１７，またはそのサプクローンおよびそのため の培養培地を含む組成物。 ３．ヒトＢ−リンパ球のリウマチ熱関連の補足抗原と特異的に反応し、Ｂ−リン パ球のＡ，Ｂ，Ｃ，ＤＲ１〜ＤＲＷ８座の既知のＨＬＡ抗原とは反応しないモノ クローナル抗体の製法であって、ハイプリドーマ細胞系Ｄ８／１７またはそのサ プクローンをそのための培養培地で培養し、その培養培地の上澄液から抗体を回 収することから成るモノクローナル抗体の製法。 ４．リウマチ熱にかゝる危険性のある人を検出する方法であって、上記の人から 得たＢ−リンパ球をハイプリドーマ細胞系Ｄ８／１７またはそのサプクローンか ら誘導したモノクローナル抗体の診断的有効量を含む組成物と反応させることと 、テストがプラスの場合には上記モノクローナル抗体とＢ−リンパ球からの補足 抗原とを含む反応生産物の存在を検出することとから成り、上記抗体は、ヒトＢ −リンパ球上のリウマチ熱関連補足抗原と特異的に反応するがヒトＢ−リンパ球 上のＡ，Ｂ，Ｃ，ＤＲ１〜ＤＲＷ８座の既知のＨＬＡ抗原とは反応しないという 特徴を有する検出方法。 ５．ハイプリドーマ細胞系Ｄ８／１７またはそのサプクローンに由来するモノク ローナル抗体の診断的有効量を含み、混入抗体はほとんど含まないモノクローナ ル抗体組成物であって、上記抗体はヒト−Ｂ−リンパ球上の補足リウマチ熱一関 連一抗原と特異的に反応するがヒトＢ−リンパ球のＡ，Ｂ，Ｃ，ＤＲ−１〜ＤＲ Ｗ８座の既知のＨＬＡ抗原と反応しないモノクローナル抗体組成物。 ６．リウマチ熱の危険性のある人を検出するためのテストキットであって、 １．ハイプリドーマ細胞系Ｄ８／１７またはそのサプクローンに由来し、ヒトＢ −リンパ球上の補足リウマチ熱関連抗原と特異的に反応し、ヒトＢ−リンパ球の Ａ，Ｂ，Ｃ，ＤＲ−１〜ＤＲＷ８座の既知のＨＬＡ抗原とは反応しないという特 徴を有するモノクローナル抗体と、２．上記モノクローナル抗体と反応して検出 可能の生産物を生成する第二の抗体 とから成るテストキット。 ７．リウマチ熱の危険性のある人を確認するためのテストキットであって、 １．ハイプリドーマ細胞系Ｄ８／１７またはそのサプクローンに由来し、ヒトＢ −リンパ球上の補足リウマチ熱関連抗原と反応し、ヒトＢ−リンパ球上のＡ，Ｂ ，Ｃ，Ｄｒ−１〜ＤＲＷ８座の既知のＨＬＡ抗原とは反応しないモノクローナル 抗体と、 ２．補体と、 ３．溶解した細胞を目に見えるようにする色素とから成るテストキット。