JPH0646876A - モノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 下記性質を有するＪＫ−１３２よりなること
を特徴とする抗ヒトIV型コラーゲンモノクローナル抗
体。 ヒトIV型コラーゲンないし２−メルカプトエタノール
で還元して得られた分子量が７００００以上のヒトIV型
コラーゲンフラグメントを認識し、他の型のコラーゲン
ないしコラーゲン分解物を認識しない。 分子量が140000〜160000（ＳＤＳ−ポリアクリルアミ
ド電気泳動法）である。 免疫グロブリンクラスはIgG2aである。 【効果】 未分解ヒトIV型コラーゲンないしそのＳ−Ｓ
結合が切断されたフラグメントのみを特異的に認識する
ことができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はモノクローナル抗体、特
にヒトIV型コラーゲンを認識し、その分解物を認識しな
い抗ヒトIV型コラーゲンモノクローナル抗体に関する。

【０００２】

【従来の技術】コラーゲンは生体結合組織の構成成分の
一種であり、今までにＩ型からＸＩ型までの異なるタイ
プのコラーゲンが発見されている。これらタイプの異な
るコラーゲンは、それぞれ生体内においても異なる機能
を果たしていると考えられており、特に生化学者の間で
注目され、研究が行われている。そして、この中でも特
にIV型コラーゲンは、生体結合組織や基底膜にそって存
在する他、正常な代謝時や、何等かの原因により組織が
崩壊する時に存在形態が変化したり、血液中に分解物の
形態で放出されることがある。従って、ヒトIV型コラー
ゲンの構造解析やヒト生体結合組織の組織学的研究或い
は生化学的研究を行うためには、ヒトIV型コラーゲンの
特異的な認識が極めて重要な課題となっている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、各タイ
プのコラーゲンは、組織中のものや或いは精製されたも
のであっても他のタイプのコラーゲンと区別することは
極めて困難であり、主として生化学的な方法や熟練者の
観察によってのみ、その存在が確認されていた。一方、
この様なヒトIV型コラーゲンないし分解物を特異的に認
識するモノクローナル抗体の開発も行われている。例え
ばCLINICAL RESEARCH.VOL.34,NO.2,1986,416Aには、８
Ｃ５ ５Ａ５からなる抗ヒトIV型コラーゲンモノクロー
ナル抗体が開示されており、又Proc.Natl,Acad.Sci.,U.
S.A.,Vol.81,pp.7343〜7347には、同じくＣＩＶ１６及
びＣＩＶ２２からなる抗ヒトIV型コラーゲンモノクロー
ナル抗体が開示されている。しかしながら、前記モノク
ローナル抗体８Ｃ５ ５Ａ５はウェスタンブロッティニ
ングによるヒトIV型コラーゲン分解物に対する反応特異
性は５０ｋＤ以上の分解物を、同じくＣＩＶ１６は６０
ｋＤ以上の分解物を認識してしまう。

【０００４】ここで、ヒトIV型コラーゲンは三重鎖構造
を有しており、最小のフラグメントであっても分子量は
７０ｋＤ（７０，０００）程度であり、前記５０ｋＤな
いし６０ｋＤの分解物を認識するモノクローナル抗体を
用いれば、特定組織に存在する未分解のヒトIV型コラー
ゲンのみを認識することは不可能となってしまう。これ
に対し、ＣＩＶ２２はヒトIV型コラーゲンの変性体には
作用しない等の特性を有しているが、IV型コラーゲンの
分離・精製過程で例えばＳ−Ｓ結合の切断などの変性が
生じやすく、前記ＣＩＶ２２のように変性体を認識しな
い抗ヒトIV型コラーゲンモノクローナル抗体では実用上
大きな課題を残している。本発明は前記従来技術の課題
に鑑みなされたものであり、その目的は未分解のヒトIV
型コラーゲンを的確に認識することのできるモノクロー
ナル抗体を提供することにある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】前記目的を達成するため
に本発明者らが鋭意検討を行った結果、サブクラスIgG2
aのモノクローナル抗体に、未分解ヒトIV型コラーゲン
を特異的に認識することができるモノクローナル抗体が
存在することを見出し、本発明を完成するに至った。即
ち、本発明に係るモノクローナル抗体は、下記性質を有
するＪＫ−１３２よりなることを特徴とする。 ヒトIV型コラーゲンおよび２−メルカプトエタノール
で還元されて得た分子量７００００以上のヒトIV型コラ
ーゲンフラグメントを認識し、他の型コラーゲンないし
分解物を認識しない。 分子量が１４００００〜１６００００（ＳＤＳ−ポリ
アクリルアミド電気泳動法）である。 免疫グロブリンクラスはＩｇＧ２ａである。

【０００６】以下、本発明の構成について詳述する。本
発明の抗ヒトIV型コラーゲンモノクローナル抗体はIV型
コラーゲンで哺乳動物を免疫し得られた免疫担当細胞を
継代培養可能な骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマを
形成させ、このハイブリドーマの中から目的のモノクロ
ーナル抗体のみを産生する細胞を選抜し、この細胞を抗
体を産生する条件下で大量に培養することにより製造さ
れる。又、本発明で用いられるヒトIV型コラーゲンは例
えば続生化学実験講座６下、４６５ページの塩分別沈殿
法により調節することができる。ヒトIV型コラーゲンの
抽出材料としてはヒト組織のうち基底膜を含む組織であ
れば皮膚、腎臓、胎盤等どこでもよい。本発明におい
て、ハイブリドーマの調整は、公知の方法例えばNature
256,495-497(1975)に記載の方法に準じて行われる。

【０００７】本発明で免疫される動物は豚、牛、兎、マ
ウス、ラット等、人以外の動物ならなんでもよいが、抗
体生産細胞の相手となるミエローマ細胞がマウス由来の
ものであるため特にマウスがよい。上記方法により調節
したIV型コラーゲンをStahliらの方法(J.Immunol.Metho
dsVol.32,297-304,1980)に従いマウスに皮下注射し免疫
する。注射方法はこれに限らず静脈注射や腹腔内注射で
もよい。マウスは必要に応じて追加免疫される。最終免
疫後３日目にこれらマウスより抗体を生産するリンパ球
を含む脾臓を摘出する。摘出する組織はリンパ節等末梢
リンパ系組織ならどこでもよい。得られた組織から例え
ば免疫実験操作方法Ｂ（1974年日本免疫学会発行1253ヘ゜
ーシ゛）に記載されている方法によりリンパ球が単細胞と
して分離される。

【０００８】次にこのリンパ球が半永久的に継代しうる
ように増殖能を与える。方法としてはE.B.-virusやAbel
son-virus等のウイルスにリンパ球を感染させ形質転換
させる方法、仙台ウイルスや、ポリエチレングリコール
存在下、ある種の癌細胞と細胞融合させる方法等があ
る。安定した抗体を続けて産生させるために、同じマウ
スでも同種のマウス由来の癌細胞、例えばマウスミエロ
ーマ細胞がリンパ球の相手として用いられる。実際の細
胞融合の手法は一般的にJ.Immunol.Method,39,285〜308
(1980)に記載された方法に準ずる。即ち上記二種の細胞
の融合はポリエチレングリコール存在下で行い、ハイブ
リドーマのみ成育可能なＨＡＴ培地（ここではヒポキサ
ンチン，アミノプテリン，チミジン添加培地）で成育さ
せる。ハイブリドーマのコロニーが確認できるようにな
ったらその培養液中の抗体をスクリーニングする。スク
リーニングの方法としては例えばコラーゲン実験法（講
談社４９６ページ）の方法に従えばよい。即ちヒトIV型
コラーゲンのリン酸緩衝溶液(100μg/ml）を塩化ビニル
製マイクロプレートの各ウエルに一滴ずつ加え一晩4゜C
で放置する。ヒトIV型コラーゲン溶液を除去した後に10
%牛胎児血清含有リン酸緩衝液を各ウエルに加えブロッ
キングを行い、ブロッキング溶液を除去した後各ハイブ
リドーマコロニーの上清を１滴ずつ別々の所定のウエル
に加える。反応後上清を除去し洗浄した後、二次抗体を
加え目的の抗体を産生するハイブリドーマを確認する。
用いる二次抗体はハイブリドーマの産生する抗体に結合
する抗イムノグロブリンで、抗体と結合したことがわか
るように蛍光物質、酵素、放射性同位元素等で標識され
るものである。これは市販のものを使用してもよいし、
通常行われる方法によって作成してもよい。

【０００９】目的の抗体を産生するハイブリドーマは制
限希釈法を繰り返すことにより最終的に単一のハイブリ
ドーマ（クローンと呼ぶ）からなるコロニーを得ること
ができる。クローンの作るモノクローナル抗体は細胞培
養液から分離精製することができるが、一般的に抗体価
が高いので目的によっては上清そのままでも使用でき
る。又プリスタン前処理のマウス腹腔にクローンを注入
して生じる腹水、及び血清中に存在する非常に抗体価の
高いモノクローナル抗体を用いることも可能である。こ
れら抗体は更に塩析、イオン交換、ゲル濾過、アフィニ
ティークロマトグラフィー、電気泳動等、生化学的一般
手法を適宜組合せて精製することができる。

【００１０】尚本発明で使用されるヒトIV型コラーゲン
モノクローナル抗体とは上記のように精製したものの
他、培養液上清や血清、腹水の状態で得られる標品をも
含める。こうして得られたヒトIV型コラーゲンモノクロ
ーナル抗体はそのまま抗原に反応させ、二次抗体として
フルオレッセインイソチオシアネート等の蛍光物質、ア
ルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ等の酵素、
¹²⁵Ｉ等の放射性同位元素によって標識された抗イムノ
グロブリンを更に結合させることにより抗原の存在を確
認することができる。又、ヒトIV型コラーゲンモノクロ
ーナル抗体自体フルオレッセインイソチオシアネート等
の蛍光物質、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダ
ーゼ等の酵素、¹²⁵Ｉ等の放射性同位元素によって標識
して用いてもよい。

【００１１】

【実施例】以下に実施例をあげて本発明を更に詳細に説
明する。実施例１ ａ）抗原となるヒトIV型コラーゲンの調製 新鮮なヒト胎盤２７５０ｇを細断し洗浄、ポジトロンホ
モジナイザーでホモジネートとしたのち冷凍遠心(10,00
0×g、40分）して、沈殿物を集め0.02M リン酸ナトリウ
ム液に懸濁後、冷凍遠心を３回繰り返した。得られた沈
殿物を0.5Mの酢酸4lに懸濁し塩酸でpH3に調整し、ペプ
シンを加え4゜Cで７日間反応させた。遠心(10,000×g,1
時間)して上澄みを集め、ペプシンを失活させるために
トリスと水酸化ナトリウムを加えてpHを8.5に調整し２
日放置した。中和後塩化ナトリウムを4Mになるように加
え、更に氷酢酸を加えてpH3とし１晩放置した。遠心後
(10,000×g,1時間)上澄みを回収し、沈殿に0.5M酢酸を
加えて５時間攪拌した。遠心後(10,000×g,1時間)上澄
みに塩化ナトリウムを1.2Mになるように加え、一晩放置
した。遠心後(10,000×g,1時間)沈殿を集め、0.5M酢酸
を加えて溶かし、溶けている部分（上澄み）のみを集め
た。上澄みを水に対して透析し遠心によって沈殿を除い
た。得られた上澄みにトリス−塩化ナトリウム溶液を加
えてゆき最終的にトリスが0.1M、塩化ナトリウムが1.0M
になるようにした。溶けていない部分は遠心で除き、上
澄みを0.005Mトリス−1.5M塩化ナトリウムに対して塩析
した。遠心により沈殿物を集め、ホスホセルロースカラ
ムクロマトグラフィーで精製を行い235mgのヒトIV型コ
ラーゲンを得た。 ｂ）免疫した脾細胞の調節 ヒトIV型コラーゲンを100μg含む100μlのリン酸緩衝液
を調節し、BALB/Cマウスに腹腔内注射を行った。１週間
後に同様の処置で２回目の免疫を行った。

【００１２】１回目と２回目の免疫時にBACTO-Adjubant
（DIFCO社製）を0.1mlづつ同時に腹腔内注射した。更に
１週間後ヒトIV型コラーゲン溶液で追加免疫を行った。
最終追加免疫後７２時間目にこのマウスより脾臓を無菌
的に摘出し、ハサミで切片として更にメッシュを通して
リンパ球の懸濁液を得た。赤血球の混在を除くために溶
血用緩衝液に浮遊後1500rpmで５分間遠沈させ、RPMI-16
40培養液で更に２回洗浄した。一方融合細胞としてのマ
ウスミエローマ細胞(SP2/0)は、融合の前々日より10%牛
胎児血清(FCS)を含むRPMI-1640培養液中で10%CO₂、37゜C
の条件で増殖させた。脾細胞100×10⁶個と、ミエローマ
細胞100×10⁶個を含む培養液を混合し、1500rpmで30分
遠心後、上清を捨て、50%ポリエチレングリコール4000
（メルク社製）1mlを１滴づつ滴下しながらゆっくりと
細胞をほぐした。

【００１３】１分後、FCS含有RPM-1640培養液を1mlゆっ
くりと滴下しながら細胞を混合させ、同様の操作を１分
間繰り返した。更にFCSを含むRPMI-1640培養液7mlを３
分間かけてゆっくりと遠心管を回転させながら加えた。
この時点で培養液を更に加え200×10⁶個の細胞が50mlの
培養液に含まれるように調節しこの細胞懸濁液を0.1ml
づつ96穴マイクロプレートに分注し、10% CO₂下で37゜C
（100%相対湿度）で培養した。尚マイクロプレートには
予めマウスの貧食細胞を10⁴個／ウエルの割合で加えて
おき、又FCSを含むRPMI-1640培養液には分注時に既にHA
T(H:ヒポキサンチン A:チミノプテリン T:チミジン）
を含むものを用いた。この改良法によると少なくとも５
日目まで培養液を換える必要がなく、バクテリアの混在
のチャンスも少なくすることができ、５日前後までには
ハイブリドーマのコロニーが認められた。10〜25日後に
この培養液上清を0.2ml取り目的抗体のスクリーニング
に用いた。スクリーニングはコラーゲン実験法(講談社4
96ヘ゜ーシ゛)の方法に従った。即ちヒトIV型コラーゲンの10
0μg/mlリン酸緩衝溶液を塩化ビニル製マイクロプレー
トの各ウエルに１滴ずつ加え一晩4゜Cで放置した。ヒトI
V型コラーゲン溶液を除去した後に10％FCS-PBS溶液をピ
ペットで３滴各ウエルに加え１時間ブロッキングを行っ
た。ブロッキング溶液を除去した後各ハイブリドーマコ
ロニーの上清を１滴ずつ別々の所定のウエルに加えた。
１時間反応させた後上清を除去しPBSで３回洗浄した。

【００１４】二次抗体としてFITC（フルオレッセイン
イソチオシアネート）でラベルした抗マウスIgG（F（A
B)₂フラグメント)溶液を加え３０分放置し、二次抗体溶
液を除去して充分洗浄した。上記検体上清の中から蛍光
を発するものを選び、これに対応するハイブリドーマを
４種得、これらハイブリドーマを制限希釈法によりクロ
ーニングした。まずハイブリドーマが１ウエルあたり0.
3個、1.0個、3個 となる様に培養液で希釈した。このと
き１ウエルあたり１００万個の胸腺細胞を加えて正確に
希釈できるようにした。マイクロプレートは37゜Cで10%C
O₂ 100%相対湿度の条件で培養した。５日目に検鏡し１
ウエル中に１個のクローンを含むものをチェックしてお
き、２週間生育したところで同様の制限希釈を繰り返し
た。この操作を３回繰り返して最終的に２種類のクロー
ンを選択し、クローンを通常の培養器にうつしかえ、夫
々5mlの培養液で5×10⁶個／mlになるまで培養した。

【００１５】そのうちの１種類のコロニーの培養液を遠
心管に移し1500rpmで５分間遠沈させ、上清と細胞を分
離し、細胞にはRPMI-1640培養液をあらたに0.5ml加えゆ
っくり懸濁させた。この細胞懸濁液に4.5mlのFCSを含む
RPMI-1640培養液でを加え継代培養した。即ち細胞1×10
⁶個を5mlのFCSを含むRPMI培養液に懸濁させ5% CO₂ 37゜C
100%相対湿度の条件で培養した。６０時間後5×10⁶個
に増殖しこの操作で１代の培養となった。

【００１６】この細胞を遠心分離で培養液と分離し新し
い培養液を加えて希釈した。1×10⁶個/mlに希釈された
細胞懸濁液1mlに4mlの培養液を加えるという操作で継代
培養し、１０代継代培養された50mlの培養液から遠心分
離により5×10⁷個の細胞を得、5lの培養液に懸濁させ
た。これを回転培養ビン１０本に分注し5% CO₂ 37゜C 10
0%相対湿度1rpmの条件で５日間培養した。5×10⁶個/Ml
に達した培養液から遠心分離で細胞を除き吸引濾過し、
濾液に硫酸アンモニウムを加え45%として沈殿物を加え
た。

【００１７】沈殿物は更にプロテインＡにより精製し
た。計15lの培養液から92mgのモノクローナル抗体を粉
末として得た。このモノクローナル抗体はSDS−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動法で単一のバンドでありＪＫ
−１３２と名付けた。ＪＫ−１３２の性質 ａ）ＪＫ−１３２の反応特異性 各種抗原を1μg/mlになるようにリン酸緩衝液に溶解
し、これらの溶液を0.1ml正確に塩化ビニル製マイクロ
プレートの各ウエルに滴下し4゜Cで一夜放置した。抗原
溶液を除去した後10%ウシ胎児血清を0.5ml各ウエルに加
え、１時間ブロッキングした。ブロッキング溶液を除去
した後、10μg/mlに調整したＪＫ−１３２を0.1ml各ウ
エルに滴下し１時間反応させた。リン酸緩衝液でよく洗
浄した後二次抗体としてペルオキシダーゼ標識抗マウス
IgG抗体(CappeL社製)を0.2mlずつ各ウエルに加え１時間
反応させた。二次抗体溶液を除いた後、リン酸緩衝液で
４回洗浄し、0.001%過酸化水素を含む基質溶液を0.1ml
各ウエルに加えた。基質溶液はｏ−フェレンジアミンを
使用直前に0.1Mクエン酸−0.2Mリン酸緩衝液(pH4.8)に
溶解し0.4mg/mlとしたものを用いた。１０分後、各ウエ
ルに20μlの8M硫酸溶液を加え反応を停止させ、マイク
ロプレート光度計で492nmの吸光度を測定した。その結
果を表１に示す。

【００１８】

【表１】抗ヒトIV型コラーゲンモノクローナル抗体ＪＫ
−１３２の各種抗原に対する認識特異性 ＊ 数値は使用したリン酸緩衝液の４９２ｎｍの吸光度
を０．００とした場合の各サンプルの吸光度 ＊ ＳＰ２／０は対照としてミエローマ細胞（ＳＰ／
０）の培養液をサンプルとしたもの

【００１９】表１から分かるようにＪＫ−１３２はヒト
由来の他の型のコラーゲン、即ちヒトＩ型コラーゲン、
ヒトIII型コラーゲン、ヒトＶ型コラーゲンや、牛IV型
コラーゲンは認識せず、ヒトフィブロネクチン、ヒトラ
ミンニン、マウスラミニンも認識しなかった。 ｂ）組織切片に対する反応特異性 ５１才女性のヒト子宮頸部組織から採取されたヒト子宮
頸部正常組織の凍結切片(厚さ7μm)をスライドグラスに
のせ、0.2mlのＪＫ−１３２溶液を滴下し室温で３０分
放置したのち0.1M pH7.0の4゜Cリン酸緩衝液で３回、計
１５分洗浄した。これに、フルオレッセイン標識抗マウ
スIgG抗体（タゴ社製）を0.2ml滴下し室温で３０分放置
したのちリン酸緩衝液で３回、計１５分洗浄した。よく
水を切ったのち50%グリセリンを滴下したカバーグラス
をかぶせた。これを蛍光顕微鏡（オリンパス光学社製）
で観察した。

【００２０】この結果、ＪＫ−１３２はヒト子宮頸部正
常組織では基底膜に沿ってIV型コラーゲンに反応し帯状
に蛍光を発していた。 ｃ）ヒトIV型コラーゲン分解物に対する反応特異性 次に、ヒトIV型コラーゲン分解物に対する反応特異性を
調べた。ヒトIV型コラーゲンの500μg/ml、0.1Mトリス塩
酸緩衝溶液（5mM塩化カルシウム、0.2M塩化ナトリウ
ム、10mM N-メチルマラレイン酸を含む）にCollagenase
FormIII(Advance Biofactures Corporation社製)100ユ
ニットを３７℃２時間作用させた後、４℃とし10mM ED
TAを１滴加えて反応を停止させた。更に２−メルカプト
エタノールのリン酸緩衝液を過剰に加え３分沸騰させコ
ラゲナーゼで分解したヒトIV型コラーゲン分解物を還元
したものも調整した。

【００２１】実験方法はコラーゲン実験法（講談社500ヘ
゜ーシ゛）に記載のイムノブロッティング法に従った。上記
方法で作成したコラゲナーゼによるヒトIV型コラーゲン
分解物を定法によりSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳
動を行った。このゲルの上にニトロセルロース膜フィル
ターを二枚重ね、移転用緩衝液（10%メチルアルコール-
25mMトリス−グリシン緩衝液(pH8.3)）で40mA、２時間
泳動を行った。ゲルに接している側のフィルターは免疫
反応に、もう一枚は蛋白質バンドの染色用に用いた。免
疫反応用のフィルターは10mlの10%FCS-リン酸緩衝液で
ブロッキングを行いパラフィルム上に乗せた。ＪＫ−１
３２溶液を0.5mlフィルター上に加え更にパラフィルム
をのせて１時間反応させた。反応後、リン酸緩衝液で３
回洗浄して、二次抗体としてペルオキシダーゼ標識抗マ
ウスIgG抗体（Cappel社製）を0.5ml加え１時間反応させ
た。反応後リン酸緩衝液で１回、Tween80-リン酸緩衝液
で２回、更にリン酸緩衝液で１回洗浄した。これに基質
溶解として3mg/ml ４クロロ−１−ナフトールのメチル
アルコール溶液5ml，リン酸緩衝液25ml、30%過酸化水素
水10μlを直前に混合したものを加えて５分反応させフ
ィルターを蒸留水中に移して反応を停止させた。これと
蛋白質バンドの染色の結果を比較するとＪＫ−１３２は
ヒトIV型コラーゲン分解物のうち分子量70000未満の断
片は認識しなかった。イムノブロティングの結果を第１
図に示す。 ｄ）ＪＫ−１３２分子量 ＪＫ−１３２の分子量はSDS−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動法から140000〜160000であった。 ｅ）ＪＫ−１３２の免疫グロブリン・クラス ＪＫ−１３２の免疫グロブリン・クラスの固定はオクタ
ロニー二重免疫拡散法により行い、IgG2aであると判明
した。

【００２２】試験例１ ＪＫ−１３２でヒト子宮頸部組織のヒトIV型コラーゲン
を観察した。５０才、女性の子宮頸部組織から採取され
たヒト子宮頸部正常組織の冷凍切片（厚さ7μm）をスラ
イドグラスにのせ、標本に0.2mlのＪＫ−１３２溶液を
滴下し室温で３０分放置したのち0.1M pH7.0の4゜Cリン
酸緩衝液で３回、計１５分洗浄した。これにフルオレッ
セイン標識抗マウスIgG抗体（タゴ社製）を0.2ml滴下し
室温で３０分放置したのちリン酸緩衝液で３回、計１５
分洗浄した。よく水を切ったのち50%グリセリンを滴下
しカバーグラスをかぶせた。これを蛍光顕微鏡（オリン
パス光学社製）で観察した。その結果ＪＫ−１３２はヒ
ト子宮頸部正常組織では血管の基底膜に沿ってヒトIV型
コラーゲンに反応し帯状に蛍光を発しており、間接蛍光
抗体法によりＪＫ−１３２がヒト子宮頸部組織のIV型コ
ラーゲンを認識することが明らかにされた。

【００２３】試験例２ ＪＫ−１３２でヒト皮膚組織のヒトIV型コラーゲンを観
察した。４５才、男性の皮膚組織から採取されたヒト皮
膚正常組織の冷凍切片（厚さ7μm）をスライドグラスに
のせ、標本に0.2mlのＪＫ−１３２溶液を滴下し、室温
で３０分放置したのち0.1M pH7.0の4゜Cリン酸緩衝液で
３回、計１５分洗浄した。これにフルオレッセイン標識
抗マウスIgG抗体（タゴ社製）を0.2ml滴下し、室温で３
０分放置したのちリン酸緩衝液で３回、計１５分洗浄し
た。よく水を切ったのち50%グリセリンを滴下しカバー
グラスをかぶせた。これを蛍光顕微鏡（オリンパス光学
社製）で観察した。その結果ＪＫ−１３２はヒト皮膚正
常組織では血管の基底膜に沿ってヒトIV型コラーゲンに
反応し帯状に蛍光を発しており、間接蛍光抗体法により
ＪＫ−１３２がヒト皮膚組織のIV型コラーゲンを認識す
ることが明らかにされた。

【００２４】試験例３ ＪＫ−１３２でヒト胎盤組織のヒトIV型コラーゲンを観
察した。ヒト胎盤組織から採取されたヒト胎盤正常組織
の冷凍切片（厚さ7μm）をスライドグラスにのせ、標本
に0.2mlのＪＫ−１３２溶液を滴下し室温で３０分放置
したのち0.1M pH7.0の4゜Cリン酸緩衝液で３回、計１５
分洗浄した。これにフルオレッセイン標識抗マウスIgG
抗体（タゴ社製）を0.2ml滴下し室温で３０分放置した
のちリン酸緩衝液で３回、計１５分洗浄した。よく水を
切ったのち50%グリセリンを滴下しカバーグラスをかぶ
せた。これを蛍光顕微鏡（オリンパス光学社製）で観察
した。その結果ＪＫ−１３２はヒト胎盤正常組織では血
管の基底膜に沿ってヒトIV型コラーゲンに反応し帯状に
蛍光を発しており、間接蛍光抗体法によりＪＫ−１３２
がヒト胎盤組織のIV型コラーゲンを認識することが明ら
かにされた。

【００２５】試験例４ ＪＫ−１３２でヒト腎臓組織のヒトIV型コラーゲンを観
察した。ヒト腎臓組織から採取されたヒト腎臓正常組織
の冷凍切片（厚さ7μm）をスライドグラスにのせ、標本
に0.2mlのＪＫ−１３２溶液を滴下し、室温で３０分放
置したのち0.1MpH7.0の4゜Cリン酸緩衝液で３回、計１５
分洗浄した。これにフルオレッセイン標識抗マウスIgG
抗体（タゴ社製）を0.2ml滴下し室温で３０分放置した
のちリン酸緩衝液で３回、計１５分洗浄した。よく水を
切ったのち50%グリセリンを滴下しカバーグラスをかぶ
せた。これを蛍光顕微鏡（オリンパス光学社製）で観察
した。その結果ＪＫ−１３２はヒト腎臓正常組織では基
底膜に沿ってヒトIV型コラーゲンに反応し帯状に蛍光を
発しており、間接蛍光抗体法によりＪＫ−１３２がヒト
腎臓組織のIV型コラーゲンを認識することが明らかにさ
れた。

【００２６】実施例２ 直接蛍光抗体法に用いるためＪＫ−１３２ を蛍光標識
し、組織切片のIV型コラーゲンを認識するかどうか調べ
た。実施例１で得たＪＫ−１３２、20mgを用い実施例１
の方法に従い蛍光標識されたＪＫ−１３２を0.05MのNac
lを含む0.01Mリン酸緩衝液の溶液18mlのとして得た。こ
の溶液は280mlの紫外吸収からＪＫ−１３２を11mgを含
むことがわかった。４５才のヒト子宮頸部組織から採取
されたヒト子宮頸部正常組織の凍結切片（厚さ7μm）を
スライドグラスにのせ、0.2mlの蛍光標識したＪＫ−１
３２溶液を滴下し室温で３０分放置したのち0.1M pH7.
0の4゜Cのリン酸緩衝液で３回、計１５分洗浄した。よく
水を切ったのち50%グリセリンを滴下しカバ−グラスを
かぶせた。これを蛍光顕微鏡（オリンパス光学社製）で
観察した。ヒト子宮頸部正常組織で血管の基底膜に沿っ
てIV型コラーゲンに反応して帯状の蛍光が観側された。
これで、蛍光標識されたＪＫ−１３２はヒト子宮頸部組
織のIV型コラーゲンの確認に有効であることがわかっ
た。

【００２７】実施例３ ＪＫ−１３２をペルオキシダーゼで修飾しヒトIV型コラ
ーゲンに対する認識の特異性を調べた。ペルオキシダー
ゼ（hotrseradish peroxdase TypeIIシグマ社製）5mgを
0.3Mの重炭酸ナトリウム水溶液pH8.1、1.0mlに溶解し、
これに100%エタノールに溶解した1%のフルオロニトロベ
ンゼン液0.1mlを加え室温でゆっくり混和させた。更に
0.05MのNaIO₄溶液1.0mlを加え室温で３０分反応させ、
クエンチングのため0.2Mのエチレングリコール溶液を1.
0ml加え、室温で１時間放置した。反応液は充分量の0.0
1M pH9.5の炭酸ナトリウム緩衝液で4゜Cのものとで透析
しペルオキシダーゼ−アルデヒド溶液とした。

【００２８】次に実施例１で得られたモノクローナル抗
体ＪＫ−１３２、5mgを1mlの炭酸ナトリウム緩衝液に溶
解させ3mlのペルオキシダーゼ−アルデヒド溶液3mlに加
え室温で３時間混和した。更にこの溶液に5mgのNaBH₄を
加え4゜Cで一晩放置した。反応生成物はリン酸水で透析
しセファデックスG-200のカラムで精製した。目的とす
る画分は蛋白質を280nm、ペルオキシダーゼを403nmの紫
外吸収で追跡し両者が一致する画分を分取することによ
り得られた。この画分はＪＫ−１３２を4.0mgを含むリ
ン酸緩衝液7mlであった。４５才、男性の胃から採取さ
れたヒト胃正常組織の凍結切片（厚さ7μm）をスライド
グラスにのせ、ペルオキシダーゼで標識したＪＫ−１３
２を0.2ml滴下し室温で３０分間放置し、0.1M pH6.8の4
゜Cリン酸緩衝液で３回、計１５分洗浄した。これを基質
溶液中に３０分浸清した。基質溶液はジアミノベンチジ
ン25mgを0.005%の過酸化水素を含む0.05M pH7.6のトリ
ス緩衝液100mlに溶解させ調節した。染色が完了した後
リン酸緩衝液で３回、計１０分間洗浄を行い50%グリセ
リンを滴下してカバーグラスでおおった。顕微鏡下、茶
褐色に染色された標本を観察した。その結果ヒト胃正常
組織では血管の基底膜に沿って帯状にIV型コラーゲンに
対する呈色が観察された。これで、ペルオキシダーゼで
標識したＪＫ−１３２はヒト胃組織中のIV型コラーゲン
の確認に有用であることがわかった。

【００２９】実施例４ アフィニティーゲルの作製 ａ）ＪＫ−１３２Fabフラグメントの作製 25mgのＪＫ−１３２を20mMのNaH₂PO₄、20mMのcystin-HC
l、10mM EDTA-Na₄（pH6.2）5mlに溶解させ0.5mlの固定化
パパインを加え、37゜Cで５時間反応させた。15mlの10mM
Tris-HCl緩衝液（pH7.5）を加え混合したのち遠心し
た。この上澄25mlをプロテインＡで精製し、6.8mgのFab
フラグメントを得た。 ｂ）アフィニティーゲルの調整 0.5gのCNBr-actibated Sepharose 4B（ファルマシオ社
製）を１mM HClで膨潤させガラスフィルター上で膨潤を
繰り返し、1.1mlのゲルとした。ａ）で調節したＪＫ−
１３２のFabフラグメントをカップリングバッファー（N
aCl(0.5M）を含む0.1M pH8.NaHCO3バッファー）に溶解
し、このゲルと混合、室温で２時間攪拌した。ゲルをブ
ロッキング試薬（0.2Mグリシン(pH8.7)）に移し室温で
２時間攪拌したのち、過剰のＪＫ−１３２のFabフラグ
メントブロッキング試薬を洗い流すためカップレングバ
ッファー及び酢酸バッファー（NaCl(0.5M)を含む0.1M
pH4の酢酸バッファー）でゲルを洗浄した。この操作で
1.5mlのＪＫ−１３２を利用したアフィニティーゲルが
得られた。これを使ってヒト胎盤をペプシン処理した粗
精製コラーゲンを精製したところヒトIV型コラーゲンの
みが効率よく分取できた。

【００３０】本発明の抗ヒトIV型コラーゲンモノクロー
ナル抗体ＪＫ−１３２はヒトIV型コラーゲンの構造解析
及びヒトIV型コラーゲンの分布、存在形態を観察するこ
とによるヒト生体結合組織の組織学的研究或いは生化学
的研究のための試薬として有用である。又、これらのモ
ノクローナル抗体を用いて作製したアフィニティーゲル
はヒトIV型コラーゲンの精製、分取に有用である。

【００３１】

【発明の効果】以上説明したように本発明にかかるモノ
クローナル抗体によれば、ＪＫ−１３２を用いることに
より未分解ヒトIV型コラーゲンないしそのＳ−Ｓ結合が
切断されたフラグメントのみを特異的に認識することが
できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１はＪＫ−１３２のヒトIV型コラーゲン分解
物に対するイムノブロッティングの結果を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 8310−2Ｊ 33/577 Ｂ 9015−2Ｊ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記性質を有するＪＫ−１３２よりなる
   ことを特徴とする抗ヒトIV型コラーゲンモノクローナル
   抗体。 ヒトIV型コラーゲンないし２−メルカプトエタノール
   で還元して得られた分子量が７００００以上のヒトIV型
   コラーゲンフラグメントを認識し、他の型のコラーゲン
   ないしコラーゲン分解物を認識しない。 分子量が140000〜160000（ＳＤＳ−ポリアクリルアミ
   ド電気泳動法）である。 免疫グロブリンクラスはIgG2aである。