JPH0742320B2 - 転移性ヒト腫瘍を確認する方法および組成物 - Google Patents
転移性ヒト腫瘍を確認する方法および組成物Info
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Description
【発明の詳細な説明】 （１）発明の分野 本発明はヒト腫瘍細胞の検出に有用な方法および組成物
を指向する。より詳しくは、本発明は潜在的に有用な腫
瘍免疫診断試薬として、さらに転移病変の予防に有用な
試薬として、580キロドルトンのヒト糖タンパク質抗原
に対して生じた抗体を指向する。
を指向する。より詳しくは、本発明は潜在的に有用な腫
瘍免疫診断試薬として、さらに転移病変の予防に有用な
試薬として、580キロドルトンのヒト糖タンパク質抗原
に対して生じた抗体を指向する。
（２）関連技術の説明 乳癌は北米および北欧において女性に対する主要死因を
構成する。最近の進歩が初期乳癌の検出および根絶の速
度を著しく改良したけれども、乳癌患者のかなりの割合
が転移病変を生じ、ついには死亡する。
構成する。最近の進歩が初期乳癌の検出および根絶の速
度を著しく改良したけれども、乳癌患者のかなりの割合
が転移病変を生じ、ついには死亡する。
腫瘍転移の過程は多くの連続的および高選択的段階によ
り生ずる。これらの段階の多くは腫瘍細胞と受容者環境
との間の多くの複雑な相互作用を必要とし、これらの相
互作用の多くは細胞表面成分により仲介されると思われ
る。転移過程における一定の細胞表面成分の可能な機能
的役割を調べるために、多数の研究者がこれらの成分の
発現または酵素活性を腫瘍細胞サブラインまたはクロー
ンの転移ポテンシャルと相関させた。あるいは、腫瘍細
胞の表面を代謝的または酵素的に修飾し、修飾した細胞
の転移特性を調べた。
り生ずる。これらの段階の多くは腫瘍細胞と受容者環境
との間の多くの複雑な相互作用を必要とし、これらの相
互作用の多くは細胞表面成分により仲介されると思われ
る。転移過程における一定の細胞表面成分の可能な機能
的役割を調べるために、多数の研究者がこれらの成分の
発現または酵素活性を腫瘍細胞サブラインまたはクロー
ンの転移ポテンシャルと相関させた。あるいは、腫瘍細
胞の表面を代謝的または酵素的に修飾し、修飾した細胞
の転移特性を調べた。
例えば、自然転移ラット乳腺癌の細胞表面成分がラット
における乳腺腫瘍転移と関連できる可能な生化学的標識
として前に試験された。ラット乳腺腫瘍転移に有用なモ
デルであると認められた系はネリ（Neri）ほか（198
2）、ジャーナル・オブ・ザ・ナショナル・カンサー・
インステイチュート（J.Natl.Cancer Inst.）、68:507
〜517に記載されたラット13762NF乳腺腫瘍である。1376
2NF系から得られた種々の細胞クローンおよび系は局所
リンパ節および遠位器官へ自然転移する能力が異なるこ
とが認められた。さらに、それらは細胞および組織形態
発現、核型、並びに治療剤に対する応答において差異を
示す。
における乳腺腫瘍転移と関連できる可能な生化学的標識
として前に試験された。ラット乳腺腫瘍転移に有用なモ
デルであると認められた系はネリ（Neri）ほか（198
2）、ジャーナル・オブ・ザ・ナショナル・カンサー・
インステイチュート（J.Natl.Cancer Inst.）、68:507
〜517に記載されたラット13762NF乳腺腫瘍である。1376
2NF系から得られた種々の細胞クローンおよび系は局所
リンパ節および遠位器官へ自然転移する能力が異なるこ
とが認められた。さらに、それらは細胞および組織形態
発現、核型、並びに治療剤に対する応答において差異を
示す。
個々の細胞表面糖タンパク質の発現はこれらの細胞の転
移能力と相関すると認められた。例えば、175,000〜25
0,000の分子量を有するシアロ糖タンパク質（sialo gly
copretein）は転移誘発細胞上に発現されるが、主要シ
アロ糖タンパク質は一次ラット腫瘍から誘発された細胞
中に80,000〜120,000の分子量を有する。約80,000の分
子量を有するシアロ糖タンパク質はより転移性のラット
腫瘍細胞中の発現が低下し、ラット腫瘍細胞により合成
された約580,000の分子量を有する他の糖タンパク質は
より高転移性のラット腫瘍細胞中の発現が増加した。し
かし、転移関連580キロドルトン糖タンパク質はこれま
でヒト腫瘍細胞中に確認されなかったか、またはそれと
関連すとみとめられなかった。
移能力と相関すると認められた。例えば、175,000〜25
0,000の分子量を有するシアロ糖タンパク質（sialo gly
copretein）は転移誘発細胞上に発現されるが、主要シ
アロ糖タンパク質は一次ラット腫瘍から誘発された細胞
中に80,000〜120,000の分子量を有する。約80,000の分
子量を有するシアロ糖タンパク質はより転移性のラット
腫瘍細胞中の発現が低下し、ラット腫瘍細胞により合成
された約580,000の分子量を有する他の糖タンパク質は
より高転移性のラット腫瘍細胞中の発現が増加した。し
かし、転移関連580キロドルトン糖タンパク質はこれま
でヒト腫瘍細胞中に確認されなかったか、またはそれと
関連すとみとめられなかった。
ヒト腫瘍細胞表面上のヒト腫瘍関連抗原タンパク質の確
認はヒト腫瘍細胞を免疫診断できる抗体の製造をもたら
すことができよう。残念ながら、多くのヒト腫瘍細胞表
面成分は抗原性が不十分かまたは抗原性でなく、あるい
はまた種々の正常ヒト組織と関連している。細胞表面抗
原が正常細胞および腫瘍細胞の両方に共通である場合
に、そのような抗原を指向する免疫診断プローブは非常
に多くの疑似陽性反応を示すので不十分である。
認はヒト腫瘍細胞を免疫診断できる抗体の製造をもたら
すことができよう。残念ながら、多くのヒト腫瘍細胞表
面成分は抗原性が不十分かまたは抗原性でなく、あるい
はまた種々の正常ヒト組織と関連している。細胞表面抗
原が正常細胞および腫瘍細胞の両方に共通である場合
に、そのような抗原を指向する免疫診断プローブは非常
に多くの疑似陽性反応を示すので不十分である。
これまで癌免疫診断プローブはそれが多くの疑似陽性反
応および（または）疑似陰性反応を検出するので正確で
なかった。従って、ヒト癌状態と高度の相関を示す腫瘍
診断プローブはヒト腫瘍の早期の診断および治療に有用
であろう。さらに、転移腫瘍と相関する免疫診断プロー
ブは治療する腫瘍学者および外科医に対し同様に有用で
あろう。
応および（または）疑似陰性反応を検出するので正確で
なかった。従って、ヒト癌状態と高度の相関を示す腫瘍
診断プローブはヒト腫瘍の早期の診断および治療に有用
であろう。さらに、転移腫瘍と相関する免疫診断プロー
ブは治療する腫瘍学者および外科医に対し同様に有用で
あろう。
最も一般的かつ全体的範囲において、本発明はgp580と
称される580キロドルトン糖タンパク質腫瘍抗原に対し
て調製された多クローン性および単クローン性の抗体を
含む転移性ヒト腫瘍細胞の確認に有用な組成物を提供す
る。
称される580キロドルトン糖タンパク質腫瘍抗原に対し
て調製された多クローン性および単クローン性の抗体を
含む転移性ヒト腫瘍細胞の確認に有用な組成物を提供す
る。
ラット腫瘍細胞、殊にラット乳癌細胞から分離できると
認められた１形態のgp580抗原はrgp580と称され、rgp58
0と化学的に識別できる関連抗原はヒト腫瘍源から分離
されて確認され、該抗原はhgp580と称される。ここに用
いた「分離できる」という語は特定抗原が特定源から分
離可能であると確認できることを示す。しかし、この称
呼はそのような源がそのように示す抗原の唯一つの分離
源であることを意味するつもりではない。
認められた１形態のgp580抗原はrgp580と称され、rgp58
0と化学的に識別できる関連抗原はヒト腫瘍源から分離
されて確認され、該抗原はhgp580と称される。ここに用
いた「分離できる」という語は特定抗原が特定源から分
離可能であると確認できることを示す。しかし、この称
呼はそのような源がそのように示す抗原の唯一つの分離
源であることを意味するつもりではない。
従って本発明は、詳しくは約550キロドルトンのSDS-PAG
Eで確認できる分子量を有する糖タンパク質を含むこと
を特徴とする実質的に純粋な腫瘍ヒトgp580抗原に対す
る抗体に関する。
Eで確認できる分子量を有する糖タンパク質を含むこと
を特徴とする実質的に純粋な腫瘍ヒトgp580抗原に対す
る抗体に関する。
本発明のgp580抗原はゲル電気泳動法で確認できる約580
キロドルトンの分子量を有する糖タンパク質である。こ
こに用いた「確認できる」という語はgp580抗原がここ
に特定したと類似の条件下にゲル電気泳動法にかけたと
きに580キロドルトンの近似分子量を示すことを表わ
す。しかし当業者に認められるように、そのような大き
さの測定は決して正確ではなく、分子の分離技術におけ
るその別法または変法か個々の抗原により示された大き
さに変動を生ずることができる。
キロドルトンの分子量を有する糖タンパク質である。こ
こに用いた「確認できる」という語はgp580抗原がここ
に特定したと類似の条件下にゲル電気泳動法にかけたと
きに580キロドルトンの近似分子量を示すことを表わ
す。しかし当業者に認められるように、そのような大き
さの測定は決して正確ではなく、分子の分離技術におけ
るその別法または変法か個々の抗原により示された大き
さに変動を生ずることができる。
好ましい態様において、抗体は当業者によく知られた標
準法により製造される単クローン性抗体である。そのよ
うなモノクローナルは好ましくはラット骨髄腫細胞に対
する免疫処置ラット脾細胞の融合により製造される。し
かし本発明の全利点はネズミ由来のものを含め、他の細
胞型の融合により実現することができる。
準法により製造される単クローン性抗体である。そのよ
うなモノクローナルは好ましくはラット骨髄腫細胞に対
する免疫処置ラット脾細胞の融合により製造される。し
かし本発明の全利点はネズミ由来のものを含め、他の細
胞型の融合により実現することができる。
本発明の他の目的は、哺乳動物脾細胞と相同種から得た
骨髄腫細胞とを融合させる段階、ただし脾細胞を与える
生体はgp580抗原を含む抗原混合物で免疫処置されてい
る、細胞を選択培地中で培養する段階、所望抗体の存在
を試験する段階、および所望抗体を生ずる細胞をクロー
ン化する段階を含む方法により得られるhgp580抗原また
はrgp580抗原に対して反応性の抗体を生ずるハイブリッ
ド無限増殖性（continuous）細胞系を提供することであ
る。ヒトhgp580抗原に対して反応性の抗体は、そのよう
な抗体が交差反応性であると認められるのでそれを生ず
るハイブリッド無限増殖性細胞系を、hgp580またはrgp5
80抗原に対する免疫処置した脾細胞を用いて発生させる
ことができる。
骨髄腫細胞とを融合させる段階、ただし脾細胞を与える
生体はgp580抗原を含む抗原混合物で免疫処置されてい
る、細胞を選択培地中で培養する段階、所望抗体の存在
を試験する段階、および所望抗体を生ずる細胞をクロー
ン化する段階を含む方法により得られるhgp580抗原また
はrgp580抗原に対して反応性の抗体を生ずるハイブリッ
ド無限増殖性（continuous）細胞系を提供することであ
る。ヒトhgp580抗原に対して反応性の抗体は、そのよう
な抗体が交差反応性であると認められるのでそれを生ず
るハイブリッド無限増殖性細胞系を、hgp580またはrgp5
80抗原に対する免疫処置した脾細胞を用いて発生させる
ことができる。
ヒト腫瘍指向抗体の生成に有用な実質的に純粋な腫瘍gp
580抗原は、gp580を含む腫瘍からgp580を含む可溶性タ
ンパク質を抽出する段階、抽出物をゲルエクスクルージ
ョンクロマトグラフィー（gel exclusion chromatograp
hy）にかける段階、排除物（excludate）を捕集する段
階、排除物をアニオン交換クロマトグラフィーにかける
段階、アニオン交換樹脂に結合した画分を溶離する段
階、溶出液（eluant）をゲルエクスクルージョンクロマ
トグラフィーにかける段階、排除画分を捕集する段階を
含む方法により調製される。当業者はタンパク質分離技
術に多くの変形が存在できることを認めるであろう。
580抗原は、gp580を含む腫瘍からgp580を含む可溶性タ
ンパク質を抽出する段階、抽出物をゲルエクスクルージ
ョンクロマトグラフィー（gel exclusion chromatograp
hy）にかける段階、排除物（excludate）を捕集する段
階、排除物をアニオン交換クロマトグラフィーにかける
段階、アニオン交換樹脂に結合した画分を溶離する段
階、溶出液（eluant）をゲルエクスクルージョンクロマ
トグラフィーにかける段階、排除画分を捕集する段階を
含む方法により調製される。当業者はタンパク質分離技
術に多くの変形が存在できることを認めるであろう。
またヒト腫瘍指向抗体の生成に有用な実質的に純粋なrg
p580抗原は同様に調製することができる。さらにgp580
は、抗原を含むラットまたはヒト腫瘍からgp580を含む
可溶化タンパク質を抽出する段階、抽出物をゲルエクス
クルージョンクロマトグラフィーにかける段階、排除物
を捕集する段階、排除物を密度勾配遠心法にかける段
階、平衡化密度勾配を分画する段階、gp580含有画分を
ゲルエクスクルージョンクロマトグラフィーかける段
階、排除画分を捕集する段階を含む方法により調製する
ことができる。この方法は実質的に純粋なgp580抗原の
製造に決定的ではないと決定された追加段階の密度勾配
遠心分離を含む。
p580抗原は同様に調製することができる。さらにgp580
は、抗原を含むラットまたはヒト腫瘍からgp580を含む
可溶化タンパク質を抽出する段階、抽出物をゲルエクス
クルージョンクロマトグラフィーにかける段階、排除物
を捕集する段階、排除物を密度勾配遠心法にかける段
階、平衡化密度勾配を分画する段階、gp580含有画分を
ゲルエクスクルージョンクロマトグラフィーかける段
階、排除画分を捕集する段階を含む方法により調製する
ことができる。この方法は実質的に純粋なgp580抗原の
製造に決定的ではないと決定された追加段階の密度勾配
遠心分離を含む。
本発明の他の目的は、試料とhgp580抗原に対して特異性
を有する抗体とを接触させる段階および抗体により結合
された物質を検出する段階を含む、試料中の転移ヒト腫
瘍細胞の存在を検出する方法を提供する。この方法の全
利点は特異的抗原／抗体相互作用を促進する条件下に試
料を抗体と混合し、抗原／抗体相互作用を検出すること
により実現することができる。そのような診断法は一般
に血漿、乳汁、乳房分泌物、尿、唾液、汗、血清および
組織試料を含みそれらに限定されない多くの生物学源か
ら得られる試料に適用することができる。
を有する抗体とを接触させる段階および抗体により結合
された物質を検出する段階を含む、試料中の転移ヒト腫
瘍細胞の存在を検出する方法を提供する。この方法の全
利点は特異的抗原／抗体相互作用を促進する条件下に試
料を抗体と混合し、抗原／抗体相互作用を検出すること
により実現することができる。そのような診断法は一般
に血漿、乳汁、乳房分泌物、尿、唾液、汗、血清および
組織試料を含みそれらに限定されない多くの生物学源か
ら得られる試料に適用することができる。
本発明の他の目的は、試料とhgp580抗体とを層化する段
階、層化試料を特異的抗原／抗体相互作用を促進する条
件下にインキュベートする段階、および抗原／抗体相互
作用を検出する段階を含む非水性試料中の転移ヒト腫瘍
細胞の存在を検出する方法を提供することである。
階、層化試料を特異的抗原／抗体相互作用を促進する条
件下にインキュベートする段階、および抗原／抗体相互
作用を検出する段階を含む非水性試料中の転移ヒト腫瘍
細胞の存在を検出する方法を提供することである。
本発明の他の目的は、患者にgp580抗原に対する抗体を
含む組成物の有効量を投与することを含む、癌患者にお
ける転移病変の頻度を低下させる方法を提供する。
含む組成物の有効量を投与することを含む、癌患者にお
ける転移病変の頻度を低下させる方法を提供する。
第１図はrgp580の分離に用いる操作の略線図である。
第２図は解離性CsCl密度勾配超遠心分離後のMTLn3細胞
により合成された放射性標識巨大分子のゲル濾過であ
り、Ａは〔3H〕グルコサミン標識（−）および〔35S〕
硫酸塩標識（‐‐‐）、Ｂは〔3H〕セリン標識した種々
の密度勾配画分の細胞抽出物をセフアロース（Sepharos
e）CL-2Bカラムクロマトグラフィーに4MグアニジンHCl
（GdnHCl）および0.1M酢酸ナトリウム（すべてpH5.8）
中でかけた。画分の平均密度が示され（ｐ値）、矢はボ
イド容量（V0）およびカラムの全容量（VT）溶出画分を
示す。
により合成された放射性標識巨大分子のゲル濾過であ
り、Ａは〔3H〕グルコサミン標識（−）および〔35S〕
硫酸塩標識（‐‐‐）、Ｂは〔3H〕セリン標識した種々
の密度勾配画分の細胞抽出物をセフアロース（Sepharos
e）CL-2Bカラムクロマトグラフィーに4MグアニジンHCl
（GdnHCl）および0.1M酢酸ナトリウム（すべてpH5.8）
中でかけた。画分の平均密度が示され（ｐ値）、矢はボ
イド容量（V0）およびカラムの全容量（VT）溶出画分を
示す。
第３図はセフアロースCL-2B溶離からの代謝的に放射性
標識し、プールしたボイド容量画分のDEAEセフアセル
（Sephacel）カラム上のイオン交換クロマトグラフィー
であり、培養したMTLn3細胞からのＡは〔3H〕グルコサ
ミン標識、Ｂは〔3H〕フコース標識、およびＣは
〔14C〕セリン標識試料の溶出プロフイルが示される。
実線は塩化ナトリウム溶離の濃度を示す。種々の画分
Ｉ、II、IIIおよびIVは後の分析のためにプールする。
放射性ピークは〔3H〕グルコサミン試料と対照してそれ
らの溶出位置により示した。
標識し、プールしたボイド容量画分のDEAEセフアセル
（Sephacel）カラム上のイオン交換クロマトグラフィー
であり、培養したMTLn3細胞からのＡは〔3H〕グルコサ
ミン標識、Ｂは〔3H〕フコース標識、およびＣは
〔14C〕セリン標識試料の溶出プロフイルが示される。
実線は塩化ナトリウム溶離の濃度を示す。種々の画分
Ｉ、II、IIIおよびIVは後の分析のためにプールする。
放射性ピークは〔3H〕グルコサミン試料と対照してそれ
らの溶出位置により示した。
第４図はラット腫瘍抽出物密度勾配画分のジエチルアミ
ノエチル（DEAE）セフアセル溶出プロフイルであり
（Ａ）、実線は溶離に用いた塩化ナトリウムの濃度を示
す。種々のピーク（I-IV）を個々にプールし、次いでそ
の一部分をSDS-PAGEにかけた。パネルＢは7.5％アクリ
ルアミドゲル上のSDS-PAGE後、精製DEAEプールピークに
125I標識ピーナッツアグルチニン（PNA）を結合させた
オートラジオグラムであり、レーンＡ〜ＤはDEAEカラム
のピークＩ〜IVに相当する。PNAの結合は、ラクトース
がインキュベーションに含まれた対照ゲルにより特異的
であることが示された。タンパク質標準にはそれぞれ20
0、130、92、68および45のMr（×103）を有するミオシ
ン、Ｂ−ガラクトシダーゼ、ホスホリラーゼ、ウシ血清
アルブミンおよびオボアルブミンが含まれる。
ノエチル（DEAE）セフアセル溶出プロフイルであり
（Ａ）、実線は溶離に用いた塩化ナトリウムの濃度を示
す。種々のピーク（I-IV）を個々にプールし、次いでそ
の一部分をSDS-PAGEにかけた。パネルＢは7.5％アクリ
ルアミドゲル上のSDS-PAGE後、精製DEAEプールピークに
125I標識ピーナッツアグルチニン（PNA）を結合させた
オートラジオグラムであり、レーンＡ〜ＤはDEAEカラム
のピークＩ〜IVに相当する。PNAの結合は、ラクトース
がインキュベーションに含まれた対照ゲルにより特異的
であることが示された。タンパク質標準にはそれぞれ20
0、130、92、68および45のMr（×103）を有するミオシ
ン、Ｂ−ガラクトシダーゼ、ホスホリラーゼ、ウシ血清
アルブミンおよびオボアルブミンが含まれる。
第５図はグルタルアルデヒド固定化および非固定化生13
762NF腺癌細胞に対するMAbGP21:56の結合であり、125I
標識MAbGP21:56を１時間インキュベートし、結合した細
胞の反応性を細胞の溶解の直後に測定した。固定化細胞
（ハッチ付）；非固定化細胞（空バー）。
762NF腺癌細胞に対するMAbGP21:56の結合であり、125I
標識MAbGP21:56を１時間インキュベートし、結合した細
胞の反応性を細胞の溶解の直後に測定した。固定化細胞
（ハッチ付）；非固定化細胞（空バー）。
第６図は放射性標識し精製した画分のSDS-PAGEであり、
パネルＡ中〔3H〕グルコサミン標識セフアセルDEAE−セ
ルロース画分Ｉ〜IVはレーンＡ〜Ｄに相当する。パネル
Ｂに〔14C〕セリン標識精製gp580（レーンＡ）およびト
リフルオロメチルスルホン酸処理gp580（レーンＢ）が
示される。電気泳動は２〜17.5％DATDアクリルアミドゲ
ル上で行ないフルオログラフィーにかけた。タンパク質
標準にはそれぞれ200、94、68および45のMr（×103）を
有するミオシン、ホスホリラーゼ、ウシ血清アルブミン
およびオボアルブミンが含まれた。
パネルＡ中〔3H〕グルコサミン標識セフアセルDEAE−セ
ルロース画分Ｉ〜IVはレーンＡ〜Ｄに相当する。パネル
Ｂに〔14C〕セリン標識精製gp580（レーンＡ）およびト
リフルオロメチルスルホン酸処理gp580（レーンＢ）が
示される。電気泳動は２〜17.5％DATDアクリルアミドゲ
ル上で行ないフルオログラフィーにかけた。タンパク質
標準にはそれぞれ200、94、68および45のMr（×103）を
有するミオシン、ホスホリラーゼ、ウシ血清アルブミン
およびオボアルブミンが含まれた。
最も一般的で全体的な範囲において、本発明は癌の確認
および診断に有用なヒト腫瘍免疫診断試薬、殊にヒトに
おける転移癌の検出法を指向する。さらに本発明は転移
疾患の予防および治療に有用な治療組成物を指向する。
rgp580として示されるラット腫瘍細胞表面糖タンパク質
またはhgp580として示されるヒト腫瘍細胞表面糖タンパ
ク質に対して調製された単クローン性抗体が有用なヒト
腫瘍診断試薬であることが測定された。さらに、そのよ
うな抗体を含む治療組成物が転移病変の発生を抑制する
ことが認められた。
および診断に有用なヒト腫瘍免疫診断試薬、殊にヒトに
おける転移癌の検出法を指向する。さらに本発明は転移
疾患の予防および治療に有用な治療組成物を指向する。
rgp580として示されるラット腫瘍細胞表面糖タンパク質
またはhgp580として示されるヒト腫瘍細胞表面糖タンパ
ク質に対して調製された単クローン性抗体が有用なヒト
腫瘍診断試薬であることが測定された。さらに、そのよ
うな抗体を含む治療組成物が転移病変の発生を抑制する
ことが認められた。
ラットrgp580タンパク質は前に種々のラット腫瘍表面上
に発現されることが示されたけれども、それが抗原性で
あることは示されなかった。同様に、580キロドルトン
糖タンパク質はこれまでヒト腫瘍細胞に関連することが
認められなかった。従って本発明はラット腫瘍抗原rgp5
80を指向する抗体がヒト腫瘍を良好に免疫診断できる特
有の発見を開示する。さらに本発明は以前に記載されな
かったヒト癌の免疫診断に同様に有用であるヒト580キ
ロドルトン糖タンパク質抗原を指向する抗体を開示す
る。開示した型の抗体はともに転移ヒト乳腺腫瘍と強く
反応すると思われる。
に発現されることが示されたけれども、それが抗原性で
あることは示されなかった。同様に、580キロドルトン
糖タンパク質はこれまでヒト腫瘍細胞に関連することが
認められなかった。従って本発明はラット腫瘍抗原rgp5
80を指向する抗体がヒト腫瘍を良好に免疫診断できる特
有の発見を開示する。さらに本発明は以前に記載されな
かったヒト癌の免疫診断に同様に有用であるヒト580キ
ロドルトン糖タンパク質抗原を指向する抗体を開示す
る。開示した型の抗体はともに転移ヒト乳腺腫瘍と強く
反応すると思われる。
本発明は（ｉ）rgp580抗原の分離および部分精製、（i
i）rgp580抗原に対し特異性を有する単クローン性抗体
の製造、（iii）hgp580抗原の分離および部分精製、並
びに（iv）hgp580抗原に対して特異性を有する単クロー
ン性抗体の製造、に殊に有用であると発明者により決定
された技術に関して開示される。抗原精製段階は抗原の
比較的大きい分子量、他のタンパク質に関するその浮上
密度および他のタンパク質に関する静電荷を利用するよ
うに設計された。単クローン性抗体はラット／ラットお
よびマウス／マウス融合の両方を用いて製造され、ラッ
ト／ラットハイブリッドが好ましい。
i）rgp580抗原に対し特異性を有する単クローン性抗体
の製造、（iii）hgp580抗原の分離および部分精製、並
びに（iv）hgp580抗原に対して特異性を有する単クロー
ン性抗体の製造、に殊に有用であると発明者により決定
された技術に関して開示される。抗原精製段階は抗原の
比較的大きい分子量、他のタンパク質に関するその浮上
密度および他のタンパク質に関する静電荷を利用するよ
うに設計された。単クローン性抗体はラット／ラットお
よびマウス／マウス融合の両方を用いて製造され、ラッ
ト／ラットハイブリッドが好ましい。
本発明により行なわれた試験は癌の検出に免疫スクリー
ニング抗体として、並びに癌の可能な予防および治療に
おいてともに抗gp580抗体の潜在的利用性を示した。こ
こに開示する免疫検出技術は、抗原性であると前に知ら
れておらずまたヒト腫瘍に関連することが前に知られて
いないタンパク質に特有の特異性を有する特有の抗体を
利用するので特有である。しかし、基礎免疫スクリーニ
ング技術は当業者によく知られている。
ニング抗体として、並びに癌の可能な予防および治療に
おいてともに抗gp580抗体の潜在的利用性を示した。こ
こに開示する免疫検出技術は、抗原性であると前に知ら
れておらずまたヒト腫瘍に関連することが前に知られて
いないタンパク質に特有の特異性を有する特有の抗体を
利用するので特有である。しかし、基礎免疫スクリーニ
ング技術は当業者によく知られている。
最も一般的な態様において、免疫スクリーニングにはgp
580抗体を腫瘍細胞または腫瘍細胞生成物（すなわち腫
瘍抗原）を有すると思われる試料に接触させ、それと結
合させることが含まれる。従って、疑いのある試料とgp
580抗体との陽性免疫反応は試料が由来する生体中の癌
細胞の存在の指標であろう。陽性免疫反応を検出する多
くの技術は、放射性標識、抗原または抗体に結合した酵
素（例えばペルオキシダーゼ）により活性化された呈色
物質、放射免疫検定（RIA）、酵素結合免疫吸着検定（E
LISA）、あるいは他の抗原または抗体に結合した他の配
位子例えばフエリチン、アビジン／ピオチンを含めて知
られている。
580抗体を腫瘍細胞または腫瘍細胞生成物（すなわち腫
瘍抗原）を有すると思われる試料に接触させ、それと結
合させることが含まれる。従って、疑いのある試料とgp
580抗体との陽性免疫反応は試料が由来する生体中の癌
細胞の存在の指標であろう。陽性免疫反応を検出する多
くの技術は、放射性標識、抗原または抗体に結合した酵
素（例えばペルオキシダーゼ）により活性化された呈色
物質、放射免疫検定（RIA）、酵素結合免疫吸着検定（E
LISA）、あるいは他の抗原または抗体に結合した他の配
位子例えばフエリチン、アビジン／ピオチンを含めて知
られている。
また本発明のgp580抗原は癌スクリーニング試薬自体と
して有用であることを立証できることが意図される。例
えば、そのような抗原を適当なELISAにとり入れて患者
の血清中の循環抗gp580抗体の存在について検出するこ
とができ、そのような循環抗体の存在は癌の指標であ
る。循環抗体の検出に抗原を利用する技術は一般によく
知られている。
して有用であることを立証できることが意図される。例
えば、そのような抗原を適当なELISAにとり入れて患者
の血清中の循環抗gp580抗体の存在について検出するこ
とができ、そのような循環抗体の存在は癌の指標であ
る。循環抗体の検出に抗原を利用する技術は一般によく
知られている。
発明者により行なわれた試験は本発明の抗体が癌の予
防、殊に転移性疾患の予防に有用であることを示した。
これは抗体試薬に関する新規な発見であると思われ、癌
の予防に対する新規方法を示唆する。そのような抗体製
剤は例えば術後癌患者の治療において、可能な外科関連
合併症であると思われる二次または転移病変の発生の予
防に有用であることができることを予想させる。そのよ
うな製剤は例えばそのような外科後の期間、静脈内注入
により与えることができる。
防、殊に転移性疾患の予防に有用であることを示した。
これは抗体試薬に関する新規な発見であると思われ、癌
の予防に対する新規方法を示唆する。そのような抗体製
剤は例えば術後癌患者の治療において、可能な外科関連
合併症であると思われる二次または転移病変の発生の予
防に有用であることができることを予想させる。そのよ
うな製剤は例えばそのような外科後の期間、静脈内注入
により与えることができる。
あるいは抗gp580の抗体調製物を毒素産生分子例えばコ
レラ、リシン、アブリンまたはモデクシン（modeccin）
毒素に結合させて特定「キラー」抗体を生成させること
ができる。そのような毒素接合抗体はそれにより標的腫
瘍細胞に対する特異性および標的された上記細胞に殺作
用する能力の両方を有する。従ってそのような抗体は腫
瘍細胞集団を求めて破壊する能力および最初の位置にお
けるそのような集団の成長を防げる能力の両方を有する
であろう。
レラ、リシン、アブリンまたはモデクシン（modeccin）
毒素に結合させて特定「キラー」抗体を生成させること
ができる。そのような毒素接合抗体はそれにより標的腫
瘍細胞に対する特異性および標的された上記細胞に殺作
用する能力の両方を有する。従ってそのような抗体は腫
瘍細胞集団を求めて破壊する能力および最初の位置にお
けるそのような集団の成長を防げる能力の両方を有する
であろう。
本発明の抗体は癌スクリーニングキットの形態で提供で
きることが意図される。そのようなキットは適当な抗gp
580抗体並びに免疫反応検出試薬を含む。ここに用いた
ように、免疫反応検出試薬は抗体とgp580抗原との間の
特異的免疫反応を指示または検出できる試薬である。そ
のような試薬の例にはペルオキシダーゼを付けたかまた
は放射性標識した抗原または抗体が含まれる。そのよう
な試薬およびその使用は当業者によく知られている。以
下の実施例Ｉ及びIIは、ラットrgp580抗原及び該抗原に
対する抗体に関し、参考として示すものである。
きることが意図される。そのようなキットは適当な抗gp
580抗体並びに免疫反応検出試薬を含む。ここに用いた
ように、免疫反応検出試薬は抗体とgp580抗原との間の
特異的免疫反応を指示または検出できる試薬である。そ
のような試薬の例にはペルオキシダーゼを付けたかまた
は放射性標識した抗原または抗体が含まれる。そのよう
な試薬およびその使用は当業者によく知られている。以
下の実施例Ｉ及びIIは、ラットrgp580抗原及び該抗原に
対する抗体に関し、参考として示すものである。
実施例Ｉ ラットrgp580の分離および確認 ラット580キロドルトン糖タンパク質、rgp580、は多く
のラット腫瘍またはラット腫瘍細胞系から分離すること
ができる。事実、抗rgp580抗体との交差反応が認められ
るラット腫瘍はいずれもこのラット腫瘍抗原の分離に出
発原料として役立つ。しかし、本発明は、ラット乳腺癌
細胞がその膜に結合した高水準のrgp580を有すると思わ
れるので、好ましいrgp580源がこの細胞であると決定さ
れた。１細胞系、殊にラット13762NF腫瘍細胞クローンM
LTn3、は好ましい原料として利用される。そのような細
胞はネリ（Neri）ほか（1982）、ジャーナル・オブ・ザ
・ナショナル・カンサー・インステイチュート（J.Nat
l.Cancer Inst.）、68:507〜517に記載された自然肺転
移部からクローン化された。しかし、rgp580に対してよ
りよい源であると証明される他の細胞系を将来確認でき
ることもまた当業者は理解するであろう。
のラット腫瘍またはラット腫瘍細胞系から分離すること
ができる。事実、抗rgp580抗体との交差反応が認められ
るラット腫瘍はいずれもこのラット腫瘍抗原の分離に出
発原料として役立つ。しかし、本発明は、ラット乳腺癌
細胞がその膜に結合した高水準のrgp580を有すると思わ
れるので、好ましいrgp580源がこの細胞であると決定さ
れた。１細胞系、殊にラット13762NF腫瘍細胞クローンM
LTn3、は好ましい原料として利用される。そのような細
胞はネリ（Neri）ほか（1982）、ジャーナル・オブ・ザ
・ナショナル・カンサー・インステイチュート（J.Nat
l.Cancer Inst.）、68:507〜517に記載された自然肺転
移部からクローン化された。しかし、rgp580に対してよ
りよい源であると証明される他の細胞系を将来確認でき
ることもまた当業者は理解するであろう。
第１図は次に一層詳しく記載するrgp580の分離に使用さ
れる略線図である。簡単に記載すると、適当な腫瘍細胞
から可溶性タンパク質を抽出した後、抽出物をセフアデ
ックス（Sephadex）G-50カラムに通し、ボイド画分を捕
集する。次いでプールしたボイド画分をCsCl浮上密度勾
配中で遠心分離し、次にセフアロースCL-2Bクロマトグ
ラフィにかける。セフアロースCL-2B画分を次いでDEAE
セフアセルカラムに適用してNaClで溶離し、画分をrgp5
80の存在について分析する。
れる略線図である。簡単に記載すると、適当な腫瘍細胞
から可溶性タンパク質を抽出した後、抽出物をセフアデ
ックス（Sephadex）G-50カラムに通し、ボイド画分を捕
集する。次いでプールしたボイド画分をCsCl浮上密度勾
配中で遠心分離し、次にセフアロースCL-2Bクロマトグ
ラフィにかける。セフアロースCL-2B画分を次いでDEAE
セフアセルカラムに適用してNaClで溶離し、画分をrgp5
80の存在について分析する。
a.薬品 次の薬品はrgp580の分離およびその確認の両方に用いた
例示試薬の部分リストに相当する。しかし当業者は本発
明の範囲から逸脱することなく多くの適当な置換を利用
できることを認めるであろう。Ｄ−〔６−3H〕グルコサ
ミン（20〜30Ci/ミリモル）、Ｄ−〔１−3H〕ガラクト
ース（１〜5Ci/ミリモル）、Ｌ−〔６−3H〕フコース
（20〜35Ci/ミリモル）、Ｌ−〔4,5−3H〕ロイシン（30
〜50Ci/ミリモル）、Ｌ−〔６−3H〕セリン（５〜10Ci/
ミリモル）、Ｌ−〔Ｕ−14C〕セリン（135〜165mCi/ミ
リモル）および〔35S〕Na2SO4はICNフアルマシューテイ
カルズ〔ICN Pharmaceuticals,Irvine,CA）から購入し;
D−〔２−3H〕マンノース（10〜20Ci/ミリモル）はニュ
ー・イングランド・ニュークリア（New England Nuclea
r,Boston,MA）から入手し；ストレプトマイセス（Strep
tomyces）ヒアルロニダーゼおよびコンドロイチナーゼA
BCはマイルズ・ラボラトリーズ（Miles Laboratories,E
lkhart,IN）から入手し；コラゲナーゼVII型はシグマ・
ケミカル社（Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO）から入
手し；トリプシン（３回結晶化）はワーシントン（Wort
hington,Freehold,NJ）から入手し；プロナーゼはカル
ビオケム（Calbiochem,San Diego,CA）から入手し；ア
ルフア変性イーグルの培地（AMEM）はギブコ（GIBCO,Gr
and Island,NY）から入手し；ウシ胎児血清（FBS）はス
テリル・システムズ（Sterile Systems,Logan,UT）から
入手し；塩化セシウムはベセスダ・リサーチ・ラボラト
リーズ（Bethesda Research Laboratories,Rockville,M
D）から入手した。
例示試薬の部分リストに相当する。しかし当業者は本発
明の範囲から逸脱することなく多くの適当な置換を利用
できることを認めるであろう。Ｄ−〔６−3H〕グルコサ
ミン（20〜30Ci/ミリモル）、Ｄ−〔１−3H〕ガラクト
ース（１〜5Ci/ミリモル）、Ｌ−〔６−3H〕フコース
（20〜35Ci/ミリモル）、Ｌ−〔4,5−3H〕ロイシン（30
〜50Ci/ミリモル）、Ｌ−〔６−3H〕セリン（５〜10Ci/
ミリモル）、Ｌ−〔Ｕ−14C〕セリン（135〜165mCi/ミ
リモル）および〔35S〕Na2SO4はICNフアルマシューテイ
カルズ〔ICN Pharmaceuticals,Irvine,CA）から購入し;
D−〔２−3H〕マンノース（10〜20Ci/ミリモル）はニュ
ー・イングランド・ニュークリア（New England Nuclea
r,Boston,MA）から入手し；ストレプトマイセス（Strep
tomyces）ヒアルロニダーゼおよびコンドロイチナーゼA
BCはマイルズ・ラボラトリーズ（Miles Laboratories,E
lkhart,IN）から入手し；コラゲナーゼVII型はシグマ・
ケミカル社（Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO）から入
手し；トリプシン（３回結晶化）はワーシントン（Wort
hington,Freehold,NJ）から入手し；プロナーゼはカル
ビオケム（Calbiochem,San Diego,CA）から入手し；ア
ルフア変性イーグルの培地（AMEM）はギブコ（GIBCO,Gr
and Island,NY）から入手し；ウシ胎児血清（FBS）はス
テリル・システムズ（Sterile Systems,Logan,UT）から
入手し；塩化セシウムはベセスダ・リサーチ・ラボラト
リーズ（Bethesda Research Laboratories,Rockville,M
D）から入手した。
b.細胞 高転移ポテンシャルのラット13762NF腫瘍細胞クローンM
TLn3は高水準のrgp580を示し、従ってその分離の好まし
い原料である。分離に用いた細胞はネリ（Neri）ほか
（1982）、ジャーナル・オブ・ザ・ナショナル・カンサ
ー・インステイチュート（J.Natl.Cancer Inst.）、68:
507〜517に記載されたように自然肺転移部からクローン
化し、凍結クローンとして貯蔵した。MTLn3細胞は100mm
組織培養プレート〔コーニング・グラス（Corning Glas
s,Corning,NY）〕上で、５％CO2−増湿空気混合物中で3
7℃において、10％FBSを含み抗生物質を含まないAMEM培
地中で成長させた。この実施例において使用される細胞
は指数増殖期にあり、試験管内継代T14〜T20であった。
細胞は普通にスクリーンし、シャン（Chen）（1976、イ
ン・ビトロ（In Vitro）、3:229〜232の方法によりマイ
コプラズマおよびウイルスの汚染のないことが認められ
た。
TLn3は高水準のrgp580を示し、従ってその分離の好まし
い原料である。分離に用いた細胞はネリ（Neri）ほか
（1982）、ジャーナル・オブ・ザ・ナショナル・カンサ
ー・インステイチュート（J.Natl.Cancer Inst.）、68:
507〜517に記載されたように自然肺転移部からクローン
化し、凍結クローンとして貯蔵した。MTLn3細胞は100mm
組織培養プレート〔コーニング・グラス（Corning Glas
s,Corning,NY）〕上で、５％CO2−増湿空気混合物中で3
7℃において、10％FBSを含み抗生物質を含まないAMEM培
地中で成長させた。この実施例において使用される細胞
は指数増殖期にあり、試験管内継代T14〜T20であった。
細胞は普通にスクリーンし、シャン（Chen）（1976、イ
ン・ビトロ（In Vitro）、3:229〜232の方法によりマイ
コプラズマおよびウイルスの汚染のないことが認められ
た。
乳腺腫瘍は約１×106生MTLn3細胞を軽麻酔した同系めす
フイッシャー（Fischer）344ラット〔チャールス・リバ
ー・ブリーデイング・ラボラトリーズ（Charles River
Breeding Laboratories,Portage,MI）〕の鼠径部乳房脂
肪パッド中へ皮下注射することにより入手した。この操
作は腫瘍細胞の注射30日後に11.7±4.6mmの直径を有す
る腫瘍を生じ、腫瘍をもつ動物の100％および50％がそ
れぞれリンパ節および肺転移病変を有した。腫瘍の中心
が30日に壊死性であったので、用いた腫瘍の多くは14日
に回収した。腫瘍回収にはラットをメトフアン（Metota
ne）〔ピットマン・ムーア社（Pitman−Moore Inc.,Was
hington,NJ）〕の吸入により殺し、腫瘍を注意深く周囲
組織からとり出し、リン酸塩緩衝食塩水（PBS）中で洗
浄し、細分した。次いで腫瘍片を下記のように抽出し
た。
フイッシャー（Fischer）344ラット〔チャールス・リバ
ー・ブリーデイング・ラボラトリーズ（Charles River
Breeding Laboratories,Portage,MI）〕の鼠径部乳房脂
肪パッド中へ皮下注射することにより入手した。この操
作は腫瘍細胞の注射30日後に11.7±4.6mmの直径を有す
る腫瘍を生じ、腫瘍をもつ動物の100％および50％がそ
れぞれリンパ節および肺転移病変を有した。腫瘍の中心
が30日に壊死性であったので、用いた腫瘍の多くは14日
に回収した。腫瘍回収にはラットをメトフアン（Metota
ne）〔ピットマン・ムーア社（Pitman−Moore Inc.,Was
hington,NJ）〕の吸入により殺し、腫瘍を注意深く周囲
組織からとり出し、リン酸塩緩衝食塩水（PBS）中で洗
浄し、細分した。次いで腫瘍片を下記のように抽出し
た。
c.腫瘍細胞の放射性標識 試験管内成長細胞の代謝放射性標識をrgp580抗原の放射
性標識に使用した。これは一般に〔3H〕グルコサミン、
〔3H〕ガラクトースまたは〔3H〕フコース10μCi/mlを
含む完全培地（AMEMプラス10％FBS;100mm培養プレート
中5ml）中で細胞を24時間成長させ、炭水化物部分に標
識することにより便宜に行なった。細胞を〔3H〕マンノ
ースで標識した試験において、AMEMがデキストロースの
正常濃度の1/2（1g/l）を含有した完全培地に200μCi/m
lを加えたときに十分であると認められた。〔3H〕ロイ
シン、〔14C〕セリン、または〔3H〕セリンで標識した
細胞の製造に対し培地は10μCi/mlの放射性前駆物質お
よび通常の濃度の1/10のアミノ酸（それぞれ5.25mg/lお
よび2.5mg/l）を含有した。MTLn3細胞はMgSO4（80.9モ
ル）をMgCl2で置換したAMEM中の50μCi/mlのNa2〔35S〕
O4で標識した。24時間の標識時間後、培地を捕集し、４
℃で10分間2,000×ｇで遠心分離して細胞破片を除き、
−80℃で凍結することができる。培養プレートをPBSで
２回洗浄し、下記のように細胞からrgp580を抽出した。
性標識に使用した。これは一般に〔3H〕グルコサミン、
〔3H〕ガラクトースまたは〔3H〕フコース10μCi/mlを
含む完全培地（AMEMプラス10％FBS;100mm培養プレート
中5ml）中で細胞を24時間成長させ、炭水化物部分に標
識することにより便宜に行なった。細胞を〔3H〕マンノ
ースで標識した試験において、AMEMがデキストロースの
正常濃度の1/2（1g/l）を含有した完全培地に200μCi/m
lを加えたときに十分であると認められた。〔3H〕ロイ
シン、〔14C〕セリン、または〔3H〕セリンで標識した
細胞の製造に対し培地は10μCi/mlの放射性前駆物質お
よび通常の濃度の1/10のアミノ酸（それぞれ5.25mg/lお
よび2.5mg/l）を含有した。MTLn3細胞はMgSO4（80.9モ
ル）をMgCl2で置換したAMEM中の50μCi/mlのNa2〔35S〕
O4で標識した。24時間の標識時間後、培地を捕集し、４
℃で10分間2,000×ｇで遠心分離して細胞破片を除き、
−80℃で凍結することができる。培養プレートをPBSで
２回洗浄し、下記のように細胞からrgp580を抽出した。
d.代謝的に標識した腫瘍細胞からのrgp580の分離 放射性同位元素で代謝的に標識した細胞をrgp580の分離
に用いて上記の分離および純度をモニターする手段を与
えることができる。標識したタンパク質はセフアロース
CL-4Bカラムのボイド容量付近に移行する。さらに、rgp
580は脱シアリル化後125I標識ピーナッツアグルチニン
を結合し、脱シアリル化rgp580をSDSポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動（SDS-PAGE）後に高分子量PNA結合糖タ
ンパク質として確認することができる。以下により完全
に記載されるこれら２つの技術を用いて培養したMTLn3
細胞およびMTLn3腫瘍の両方からのrgp580の精製をモニ
ターした。
に用いて上記の分離および純度をモニターする手段を与
えることができる。標識したタンパク質はセフアロース
CL-4Bカラムのボイド容量付近に移行する。さらに、rgp
580は脱シアリル化後125I標識ピーナッツアグルチニン
を結合し、脱シアリル化rgp580をSDSポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動（SDS-PAGE）後に高分子量PNA結合糖タ
ンパク質として確認することができる。以下により完全
に記載されるこれら２つの技術を用いて培養したMTLn3
細胞およびMTLn3腫瘍の両方からのrgp580の精製をモニ
ターした。
rgp580の抽出は初めに抽出緩衝液〔４％ツビツタジエン
ト（Zwittergent）3-12、4MグアニジンHCl、0.1M6−ア
ミノヘキサン酸、10mM-Na2 EDTA、5mMフェニルメチルス
ルホニルフルオリド、5mMベンズアミジン−HCl、10ミリ
単位/mlアプロチニンおよび0.1M酢酸ナトリウム、pH6.
0、1ml毎５皿〕中で細胞（0.5×106細胞毎皿）を可溶化
することにより行なわれる。プレートをこすり落し、抽
出物を合せ、可溶化を４℃でかくはん下に18時間続け
た。それを順次８％ツビツタジエントで次に8Mグアニジ
ンHCl（GdnHCl）の添加で（ともにプロテアーゼ阻害剤
とともに）抽出しても細胞からの高分子量〔3H〕グルコ
サミン標識または〔3H〕セリン標識物質の遊離の明らか
な増加がなかった。好ましくはワットマン（Whatman）
１濾紙上で濾過された抽出物をセフアデックスG-50カラ
ムに適用して低分子量溶質を除き、ボイド容量画分をプ
ールする。
ト（Zwittergent）3-12、4MグアニジンHCl、0.1M6−ア
ミノヘキサン酸、10mM-Na2 EDTA、5mMフェニルメチルス
ルホニルフルオリド、5mMベンズアミジン−HCl、10ミリ
単位/mlアプロチニンおよび0.1M酢酸ナトリウム、pH6.
0、1ml毎５皿〕中で細胞（0.5×106細胞毎皿）を可溶化
することにより行なわれる。プレートをこすり落し、抽
出物を合せ、可溶化を４℃でかくはん下に18時間続け
た。それを順次８％ツビツタジエントで次に8Mグアニジ
ンHCl（GdnHCl）の添加で（ともにプロテアーゼ阻害剤
とともに）抽出しても細胞からの高分子量〔3H〕グルコ
サミン標識または〔3H〕セリン標識物質の遊離の明らか
な増加がなかった。好ましくはワットマン（Whatman）
１濾紙上で濾過された抽出物をセフアデックスG-50カラ
ムに適用して低分子量溶質を除き、ボイド容量画分をプ
ールする。
セフアデックスG-50カラムからのプールした排除画分を
塩化セシウム（CsCl）0.55g毎グラム溶液中に混合し、
ベックマン（Beckman）SW50.1またはTI50.2ローター中
で、９℃において35,000rpmで48〜72時間遠心分離する
ことにより等密度解離密度勾配遠心法に対し調製した。
勾配は８等画分に分け、各画分の密度および存在すれば
放射能を測定した。次いで画分をプールし、D1〜D4とし
て示される４等容積画分を与え、次いで各画分をゲル濾
過クロマトグラフィーにより分析した。精製されたrgp5
80の一定放射性標識アリコートを、〔14C〕セリン標識r
gp580（１×104Cpm）と10mMトリス中の4MGdnHClおよび
4.3MCsCl（または0.5MGdnHClおよび6.5MCsCl）、すべて
pH7.2、とを混合することにより等密度遠心法にかけ
た。試料は４℃でベックマンSW50.1ローター中で35,000
rpmで60時間遠心分離し、次いで20等画分に分けた。
塩化セシウム（CsCl）0.55g毎グラム溶液中に混合し、
ベックマン（Beckman）SW50.1またはTI50.2ローター中
で、９℃において35,000rpmで48〜72時間遠心分離する
ことにより等密度解離密度勾配遠心法に対し調製した。
勾配は８等画分に分け、各画分の密度および存在すれば
放射能を測定した。次いで画分をプールし、D1〜D4とし
て示される４等容積画分を与え、次いで各画分をゲル濾
過クロマトグラフィーにより分析した。精製されたrgp5
80の一定放射性標識アリコートを、〔14C〕セリン標識r
gp580（１×104Cpm）と10mMトリス中の4MGdnHClおよび
4.3MCsCl（または0.5MGdnHClおよび6.5MCsCl）、すべて
pH7.2、とを混合することにより等密度遠心法にかけ
た。試料は４℃でベックマンSW50.1ローター中で35,000
rpmで60時間遠心分離し、次いで20等画分に分けた。
４等容積塩化セシウム画分D1〜D4は塩化セシウム濃度が
D1に対する1.58g/mlからD4に対する1.37g/mlに低下した
と認められた。種々の密度画分のアリコートを透析し、
凍結乾燥し、各画分中に含まれた主タンパク質を確認す
るためにSDS-PAGEにかけた。ゲル中の糖タンパク質はバ
リッジ（Burridge,K.）、（1976）、プロシーデイング
ス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエ
ンス（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）、77:4457〜4481の方
法による穏酸処理により脱シアリル化することができ、
ゲルを125I標識PNAで染色した。rgp580は主にD2画分
（Ｐ＝1.48±0.03g/ml）中に検出され、D1およびD3画分
中にはやや小量であった。約50％の〔3H〕グルコサミン
標識のしかし８％未満の〔3H〕セリン標識巨大分子がD1
〜D3中に認められた。
D1に対する1.58g/mlからD4に対する1.37g/mlに低下した
と認められた。種々の密度画分のアリコートを透析し、
凍結乾燥し、各画分中に含まれた主タンパク質を確認す
るためにSDS-PAGEにかけた。ゲル中の糖タンパク質はバ
リッジ（Burridge,K.）、（1976）、プロシーデイング
ス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエ
ンス（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）、77:4457〜4481の方
法による穏酸処理により脱シアリル化することができ、
ゲルを125I標識PNAで染色した。rgp580は主にD2画分
（Ｐ＝1.48±0.03g/ml）中に検出され、D1およびD3画分
中にはやや小量であった。約50％の〔3H〕グルコサミン
標識のしかし８％未満の〔3H〕セリン標識巨大分子がD1
〜D3中に認められた。
D1〜D4画分の部分を0.1M酢酸ナトリウム中の4MGdnHCl、
pH5.8、で平衡させた補正済セフアロースCL-2Bカラム
（115×0.8cm）に適用した。各画分の放射能はエタノー
ル200μｌ画分の100μｌ部に加え、次いでリキッド・シ
ント（Liquid Scint）〔ナショナル・ダイアグノス テ
イックス（National Diagnostics,Somerville,NJ）〕に
加えることにより測定した。画分をプールし、水に対し
て広範に透析し、次いで凍結乾燥した。一定のプールし
た画分を50mMトリス−HCl中の8M尿素、0.2％CHAPS、pH
7.2、中に再び溶解し、同一緩衝液中でDEAEセフアセル
カラム（５×1cm）に適用した。カラムを０〜1Mの直線
塩化ナトリウム勾配で洗浄し、溶離した。勾配の完了後
カラムを3M塩化ナトリウムを含む8M尿素で洗浄した。放
射能回収は90％以上であった。画分をその放射能により
プールし、水に対して透析し、凍結乾燥した。画分は次
のように分析した。若干の画分はさらに平衡させたセフ
アロースCL-2Bカラム（115×0.8cm）上で分画し、10mM
トリス−HCl中の１％SDSおよび5mMB−メルカプトエタノ
ールで溶離した。
pH5.8、で平衡させた補正済セフアロースCL-2Bカラム
（115×0.8cm）に適用した。各画分の放射能はエタノー
ル200μｌ画分の100μｌ部に加え、次いでリキッド・シ
ント（Liquid Scint）〔ナショナル・ダイアグノス テ
イックス（National Diagnostics,Somerville,NJ）〕に
加えることにより測定した。画分をプールし、水に対し
て広範に透析し、次いで凍結乾燥した。一定のプールし
た画分を50mMトリス−HCl中の8M尿素、0.2％CHAPS、pH
7.2、中に再び溶解し、同一緩衝液中でDEAEセフアセル
カラム（５×1cm）に適用した。カラムを０〜1Mの直線
塩化ナトリウム勾配で洗浄し、溶離した。勾配の完了後
カラムを3M塩化ナトリウムを含む8M尿素で洗浄した。放
射能回収は90％以上であった。画分をその放射能により
プールし、水に対して透析し、凍結乾燥した。画分は次
のように分析した。若干の画分はさらに平衡させたセフ
アロースCL-2Bカラム（115×0.8cm）上で分画し、10mM
トリス−HCl中の１％SDSおよび5mMB−メルカプトエタノ
ールで溶離した。
セフアロースCL-2Bカラムをデキストラン（それぞれMr
＝２×106、５×105、1.5×105、７×104）の使用によ
り標準化した。炭水化物分析に用いた試料は5mM酢酸ピ
リジニウム、pH5.3で平衡させたバイオゲル（Bio Gel）
PGカラム（115×0.5cm）に適用した。カラムはスパイロ
ほか（Spiro and Bhoyroo）（1974）、ジャーナル・オ
ブ・バイオケミカル・ケミストリー（J.Biol.Chem.）、
249:5709〜5717により記載されたようにフエチユインか
ら調製されたオリゴ糖で標準化した。
＝２×106、５×105、1.5×105、７×104）の使用によ
り標準化した。炭水化物分析に用いた試料は5mM酢酸ピ
リジニウム、pH5.3で平衡させたバイオゲル（Bio Gel）
PGカラム（115×0.5cm）に適用した。カラムはスパイロ
ほか（Spiro and Bhoyroo）（1974）、ジャーナル・オ
ブ・バイオケミカル・ケミストリー（J.Biol.Chem.）、
249:5709〜5717により記載されたようにフエチユインか
ら調製されたオリゴ糖で標準化した。
第２図は解離性CsCl密度勾配超遠心分離後MTLn3細胞に
より合成された放射性標識巨大分子のセフアロースCL-2
B溶出プロフイルの例示である。〔3H〕ガラクトース、
〔3H〕グルコサミン、または〔3H〕セリンで標識した細
胞は２放射性ピーク（Kav＝0.22および0.60）を含む溶
出プロフイルを生じた。第１溶離ピークは巨大分子物質
中へとり込まれた18.6％の〔3H〕グルコサミン、0.45％
の〔3H〕ガラクトースおよび0.1％の〔3H〕セリンを含
有した。〔3H〕ロイシン、〔3H〕マンノース、または〔
3H〕フコースで代謝的に標識したMTLn3細胞は同様の２
ピークのプロフイルを生じたが、しかしボイド容量画分
は0.05〜0.002％のとり込み放射能を含有した。ただ１
つの放射性ピークが細胞をNa2 35SO4とともにインキュベ
ートしたときに観察された（Kav＝0.60）。D2ピークの
分析はポイド容量画分が脱シアリル化およびSDS-PAGE後
の125I標識PNA結合により検出してrgp580の大部分（＞9
0％）を含有することを示した。
より合成された放射性標識巨大分子のセフアロースCL-2
B溶出プロフイルの例示である。〔3H〕ガラクトース、
〔3H〕グルコサミン、または〔3H〕セリンで標識した細
胞は２放射性ピーク（Kav＝0.22および0.60）を含む溶
出プロフイルを生じた。第１溶離ピークは巨大分子物質
中へとり込まれた18.6％の〔3H〕グルコサミン、0.45％
の〔3H〕ガラクトースおよび0.1％の〔3H〕セリンを含
有した。〔3H〕ロイシン、〔3H〕マンノース、または〔
3H〕フコースで代謝的に標識したMTLn3細胞は同様の２
ピークのプロフイルを生じたが、しかしボイド容量画分
は0.05〜0.002％のとり込み放射能を含有した。ただ１
つの放射性ピークが細胞をNa2 35SO4とともにインキュベ
ートしたときに観察された（Kav＝0.60）。D2ピークの
分析はポイド容量画分が脱シアリル化およびSDS-PAGE後
の125I標識PNA結合により検出してrgp580の大部分（＞9
0％）を含有することを示した。
プールし、脱シアリル化し、次いでNaCl溶離勾配の使用
によりセフアセルDEAE−セルロースカラム上でイオン交
換クロマトグラフィーにかけた密度画分D1〜D3のセフア
ロースCL-2Bボイド容量画分が第３図に示される。
〔3H〕グルコサミンまたは〔3H〕ガラクトースで標識し
た細胞は４ピークを含むカラムプロフイルを生じた（第
３図Ａ、ピークＩ〜IV）。ピークＩ〜IVに関連する放射
能はそれぞれ取り込まれた2.0％、7.8％、8.1％および
0.9％の〔3H〕グルコサミンに相当した。対照的に、MTL
n3細胞を〔3H〕マンノースまたは〔3H〕フコース（第３
図Ｂ、ピークＩ、IIIおよびIV）で標識したときに３放
射性標識のみが認められた。後の２ピーク（IIIおよびI
V）のみが〔14C〕セリン標識物質で認められた（第３図
Ｃ）。
によりセフアセルDEAE−セルロースカラム上でイオン交
換クロマトグラフィーにかけた密度画分D1〜D3のセフア
ロースCL-2Bボイド容量画分が第３図に示される。
〔3H〕グルコサミンまたは〔3H〕ガラクトースで標識し
た細胞は４ピークを含むカラムプロフイルを生じた（第
３図Ａ、ピークＩ〜IV）。ピークＩ〜IVに関連する放射
能はそれぞれ取り込まれた2.0％、7.8％、8.1％および
0.9％の〔3H〕グルコサミンに相当した。対照的に、MTL
n3細胞を〔3H〕マンノースまたは〔3H〕フコース（第３
図Ｂ、ピークＩ、IIIおよびIV）で標識したときに３放
射性標識のみが認められた。後の２ピーク（IIIおよびI
V）のみが〔14C〕セリン標識物質で認められた（第３図
Ｃ）。
e.固体腫瘍からのrgp580の分離 rgp580の分離に用いたMTLn3腫瘍を回収し、洗浄し、次
いで湿量組織グラム当り５容積の抽出緩衝液中で均質化
した。抽出物はワットマン１濾紙に通して濾過した後−
80℃で凍結するかまたは直ちに用いた。次いで濾液を、
抽出緩衝液マイナスツビッタジェントで平衡させたセフ
アデックスG-50カラム（10×1cmまたは50×4cm）上のゲ
ル濾過にかけた。ボイド容量画分を後の分析のためにプ
ールした。
いで湿量組織グラム当り５容積の抽出緩衝液中で均質化
した。抽出物はワットマン１濾紙に通して濾過した後−
80℃で凍結するかまたは直ちに用いた。次いで濾液を、
抽出緩衝液マイナスツビッタジェントで平衡させたセフ
アデックスG-50カラム（10×1cmまたは50×4cm）上のゲ
ル濾過にかけた。ボイド容量画分を後の分析のためにプ
ールした。
抽出物を前記のように解離性密度勾配遠心分離にかけ、
ｐ＝1.48±0.07g/mlに相当する密度画分をプールした。
適当な部分を補正済セフアロースCL-2Bカラムに適用
し、ボイド容量画分をプールした。試験管内成長MTLn3
細胞に対して前に測定されたように、透析後125I標識PN
Aを結合させ、7.5％SDS-PAGEゲル中の低移行を有した高
分子量糖タンパク質の大部分は密度勾配画分D2調製物の
セフアロースCL-2Bボイド容量画分中に認められた。プ
ールし、透析し、凍結乾燥したボイド容量画分のアリコ
ートを、タンパク質物質に対してハンターほか（Hunter
and Greenwood）（1962）、ネーチヤ（Nature）、194:
495〜496により記載されたクロラミン−Ｔ法を用いて
125Iで、あるいはマシュボーン（Machborn）ほか（197
4）、ビオシミカ・エ・ビオフイジカ・アクタ（Bioche
m.Biophys.Acta）、362:366〜374により記載されたよう
にシアル酸部分に対して過ヨウ素酸塩−〔3H〕ホウ水素
化物で標識した。非標識および標識抽出物の部分を合わ
せ、次いでDEAEセフアセルカラムに適用した。3H標識物
質は〔3H〕グルコサミン標識した抽出物に類似の４放射
性ピーク中に溶出したが、しかし第２ピークは少い放射
能を含有した。125I標識した抽出物は〔3H〕セリン標識
物質に最も類似するプロフイルで溶出した（第２図およ
び第３図Ａ参照）。
ｐ＝1.48±0.07g/mlに相当する密度画分をプールした。
適当な部分を補正済セフアロースCL-2Bカラムに適用
し、ボイド容量画分をプールした。試験管内成長MTLn3
細胞に対して前に測定されたように、透析後125I標識PN
Aを結合させ、7.5％SDS-PAGEゲル中の低移行を有した高
分子量糖タンパク質の大部分は密度勾配画分D2調製物の
セフアロースCL-2Bボイド容量画分中に認められた。プ
ールし、透析し、凍結乾燥したボイド容量画分のアリコ
ートを、タンパク質物質に対してハンターほか（Hunter
and Greenwood）（1962）、ネーチヤ（Nature）、194:
495〜496により記載されたクロラミン−Ｔ法を用いて
125Iで、あるいはマシュボーン（Machborn）ほか（197
4）、ビオシミカ・エ・ビオフイジカ・アクタ（Bioche
m.Biophys.Acta）、362:366〜374により記載されたよう
にシアル酸部分に対して過ヨウ素酸塩−〔3H〕ホウ水素
化物で標識した。非標識および標識抽出物の部分を合わ
せ、次いでDEAEセフアセルカラムに適用した。3H標識物
質は〔3H〕グルコサミン標識した抽出物に類似の４放射
性ピーク中に溶出したが、しかし第２ピークは少い放射
能を含有した。125I標識した抽出物は〔3H〕セリン標識
物質に最も類似するプロフイルで溶出した（第２図およ
び第３図Ａ参照）。
f.rgp580のSDS-PAGEキヤラクタリゼーション SDS-PAGEはレムリ（Laemmli）（1973）、ネーチヤ（Nat
ure）、227:680〜685の方法に従って7.5％アクリルアミ
ドランニングゲルおよび３％アクリルアミドスタッキン
グゲルの使用により行なった。糖タンパク質検出のため
にゲルをバリッジ（Burridge）（1976）、プロシーデイ
ングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サ
イエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.）、77:4457〜4461によ
り記載された125I標識PNAにかけ、次いでステック（Ste
ck）ほか（1983）、エクスペリメンタル・セル・リサー
チ（Exp.Cell.Res.）、147:255〜267に記載されたよう
に穏酸処理を重ねてシアル酸残留物を除いた。あるいは
同様の系の、しかし架橋剤としてBIS（ビスアクリルア
ミド）の代りにDADT（ジアリルタルタルジアミド）を用
いる2.0〜17.5％直線アクリルアミド勾配ゲルを用いる
ことによりSDS-PAGEを行ない、２％DATDアクリルアミド
のスタツキングゲルを用いた。ゲルは37.8％アクリルア
ミド、1.6％DATDストック溶液から構成し、それはゲル
の多孔性を増し、ランニングゲルマトリックス中へのrg
p580の移行を可能にした。125I標識物質を含むゲルを洗
浄し、乾燥し、コダックＸ−オマツト（Kodakx-Omat）A
Rフィルムを強化スクリーンとともに用いたオートラジ
オグラフィーにかけた。3H標識または14C標識試料を含
むゲルのために、脱色ゲルはフルオログラフグラフィー
のためにエンハンス（Enhance）〔ニュー・イングラン
ド・ニュークリア（New England Nuclear,Boston,M
A）〕で処理し、次に乾燥し、Ｘ線フィルムをゲルにさ
らすことにより処理した。被ばくＸ線フィルムのデンシ
トメトリー走査はゲル走査アクサセサリを有するベック
マンDU-8分光光度計の使用により行なった。スクロース
密度勾配中の等電焦点化はベーンタ（Behnta）ほか（19
75）、アナリテイカル・バイオケミストリ（Anal.Bioch
em.）、69:1〜９に記載されたように、しかしアンホリ
ン（ampholine）〔pH2.5〜5.0および3.0〜10.0、フアル
マシア（Pharmacia,Uppsala,Sweden）の等混合物v/vを
用いて行なった。
ure）、227:680〜685の方法に従って7.5％アクリルアミ
ドランニングゲルおよび３％アクリルアミドスタッキン
グゲルの使用により行なった。糖タンパク質検出のため
にゲルをバリッジ（Burridge）（1976）、プロシーデイ
ングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サ
イエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.）、77:4457〜4461によ
り記載された125I標識PNAにかけ、次いでステック（Ste
ck）ほか（1983）、エクスペリメンタル・セル・リサー
チ（Exp.Cell.Res.）、147:255〜267に記載されたよう
に穏酸処理を重ねてシアル酸残留物を除いた。あるいは
同様の系の、しかし架橋剤としてBIS（ビスアクリルア
ミド）の代りにDADT（ジアリルタルタルジアミド）を用
いる2.0〜17.5％直線アクリルアミド勾配ゲルを用いる
ことによりSDS-PAGEを行ない、２％DATDアクリルアミド
のスタツキングゲルを用いた。ゲルは37.8％アクリルア
ミド、1.6％DATDストック溶液から構成し、それはゲル
の多孔性を増し、ランニングゲルマトリックス中へのrg
p580の移行を可能にした。125I標識物質を含むゲルを洗
浄し、乾燥し、コダックＸ−オマツト（Kodakx-Omat）A
Rフィルムを強化スクリーンとともに用いたオートラジ
オグラフィーにかけた。3H標識または14C標識試料を含
むゲルのために、脱色ゲルはフルオログラフグラフィー
のためにエンハンス（Enhance）〔ニュー・イングラン
ド・ニュークリア（New England Nuclear,Boston,M
A）〕で処理し、次に乾燥し、Ｘ線フィルムをゲルにさ
らすことにより処理した。被ばくＸ線フィルムのデンシ
トメトリー走査はゲル走査アクサセサリを有するベック
マンDU-8分光光度計の使用により行なった。スクロース
密度勾配中の等電焦点化はベーンタ（Behnta）ほか（19
75）、アナリテイカル・バイオケミストリ（Anal.Bioch
em.）、69:1〜９に記載されたように、しかしアンホリ
ン（ampholine）〔pH2.5〜5.0および3.0〜10.0、フアル
マシア（Pharmacia,Uppsala,Sweden）の等混合物v/vを
用いて行なった。
DEAEセフアセルの異なる溶出ピークのアリコートを7.5
％または５％ポリアクリルアミドゲルに適用し、脱シア
リル化し、125I標識PNAで染色した。ピークIIIおよびIV
のみが125I標識PNAに結合した（第4B図、レーンＣおよ
びＤ）。rgp580が５％ポリアクリルアミドゲルにほとん
ど入り込まないので、BISアクリルアミドの代りにDATD
を架橋剤として用いた勾配ゲル上で電気泳動を行なっ
た。2.0〜17.5％DATDアクリルアミド勾配の使用は標識
物質がゲル中へ入り込むのを可能にした。電気泳動およ
びフルオログラフィー後にDEAEセフアセルクロマトグラ
フィーの４〔3H〕グルコサミン標識ピークを調べるとピ
ークＩが単に低分子量物質を含有することを示した。ピ
ークII〜IVが広がったがしかし均一なバンドとして移行
した高分子量物質のみを含有することが観察された〔分
子量約350,000〜800,000（第6A図）〕。他の低分子量バ
ンドは代謝的または化学的に標識した画分中に、Ｘ線フ
ィルムの過被ばくでも検出されず、実質上すべての成分
がこれらの技術で検出されたことを示唆した。
％または５％ポリアクリルアミドゲルに適用し、脱シア
リル化し、125I標識PNAで染色した。ピークIIIおよびIV
のみが125I標識PNAに結合した（第4B図、レーンＣおよ
びＤ）。rgp580が５％ポリアクリルアミドゲルにほとん
ど入り込まないので、BISアクリルアミドの代りにDATD
を架橋剤として用いた勾配ゲル上で電気泳動を行なっ
た。2.0〜17.5％DATDアクリルアミド勾配の使用は標識
物質がゲル中へ入り込むのを可能にした。電気泳動およ
びフルオログラフィー後にDEAEセフアセルクロマトグラ
フィーの４〔3H〕グルコサミン標識ピークを調べるとピ
ークＩが単に低分子量物質を含有することを示した。ピ
ークII〜IVが広がったがしかし均一なバンドとして移行
した高分子量物質のみを含有することが観察された〔分
子量約350,000〜800,000（第6A図）〕。他の低分子量バ
ンドは代謝的または化学的に標識した画分中に、Ｘ線フ
ィルムの過被ばくでも検出されず、実質上すべての成分
がこれらの技術で検出されたことを示唆した。
〔3H〕セリンまたは125I標識ピークを分析するとピーク
II物質が標識されなかったことを除いて類似の結果が得
られた。フルオログラムのデンシトメトリー分析および
標準タンパク質との比較によりrgp580の平均分子量を評
価すると550,000の近似値を生じた（第6B図）。rgp580
の精製はSDS-PAGEによりMTLn3細胞の〔14C〕セリン標識
細胞溶解物を出発物質として用いることにより示すこと
ができた。精製後rgp580はSDS-PAGE分析により均一であ
ることおよび酸沈殿性放射能中にとり込まれた全
〔14C〕セリン約0.08％を含むことが認められた。
II物質が標識されなかったことを除いて類似の結果が得
られた。フルオログラムのデンシトメトリー分析および
標準タンパク質との比較によりrgp580の平均分子量を評
価すると550,000の近似値を生じた（第6B図）。rgp580
の精製はSDS-PAGEによりMTLn3細胞の〔14C〕セリン標識
細胞溶解物を出発物質として用いることにより示すこと
ができた。精製後rgp580はSDS-PAGE分析により均一であ
ることおよび酸沈殿性放射能中にとり込まれた全
〔14C〕セリン約0.08％を含むことが認められた。
種々のDEAEセフアセルピークの組成を決定するためにア
リコートを種々の分解性酵素とともにインキュベート
し、次にそれをSDS-PAGEにより分析した。ピークII中の
〔3H〕グルコサミン標識物質がプロナーゼおよびトリプ
シンに非感受性であると思われたが、しかしそれはスト
レプトマイセスヒアルロニダーゼにより分解でき（表
Ｉ）、この成分がヒアルロン酸であることを示唆するこ
とが認められた。ピークIIIおよびIVの成分は種々の酵
素に対して等しい感受性を有し、プロナーゼによっての
み分解された（表Ｉ）。さらに、ピークIIIおよびIV中
の物質が125I標識PNAを穏酸処理後の高分子量成分に結
合し、これらのピークがrgp580を含むことを示した。化
学的に標識したMTLn3腫瘍組織のDEAEセフアセル画分を
分析し等しい特性が示された。
リコートを種々の分解性酵素とともにインキュベート
し、次にそれをSDS-PAGEにより分析した。ピークII中の
〔3H〕グルコサミン標識物質がプロナーゼおよびトリプ
シンに非感受性であると思われたが、しかしそれはスト
レプトマイセスヒアルロニダーゼにより分解でき（表
Ｉ）、この成分がヒアルロン酸であることを示唆するこ
とが認められた。ピークIIIおよびIVの成分は種々の酵
素に対して等しい感受性を有し、プロナーゼによっての
み分解された（表Ｉ）。さらに、ピークIIIおよびIV中
の物質が125I標識PNAを穏酸処理後の高分子量成分に結
合し、これらのピークがrgp580を含むことを示した。化
学的に標識したMTLn3腫瘍組織のDEAEセフアセル画分を
分析し等しい特性が示された。
g.rgp580の化学的確認 酵素処理 rgp580の種々の分解性酵素に対する感受性は、精製トリ
プシン、プロナーゼ、パパイン、アルフアーキモトリプ
シン、スブチロペプチダーゼＡ（１または10mg/ml）、
コラゲナーゼVI型（1000単位/ml）、コンドロイチナー
ゼABC（１単位/ml）、ストレプトコッカスヒアルロニダ
ーゼ（100混濁低下単位毎ミリリットル）、コレラ菌ノ
イラミニダーゼ（100m単位/ml）、またはβ−ガラクト
シダーゼ（1000単位/ml）を含むダルベッコ（Dulbecc
o）のPBS100ml中で〔3H〕グルコサミン標識、〔3H〕セ
リン標識または化学標識rgp580とともに37℃で１時間イ
ンキュベートすることにより測定した。試料および非処
理対照は2.0〜17.5％DATDアクリルアミド勾配ゲル上のS
DS-PAGE、次に被ばくフルオログラムのデンシトメトリ
ー定量により分析した。
プシン、プロナーゼ、パパイン、アルフアーキモトリプ
シン、スブチロペプチダーゼＡ（１または10mg/ml）、
コラゲナーゼVI型（1000単位/ml）、コンドロイチナー
ゼABC（１単位/ml）、ストレプトコッカスヒアルロニダ
ーゼ（100混濁低下単位毎ミリリットル）、コレラ菌ノ
イラミニダーゼ（100m単位/ml）、またはβ−ガラクト
シダーゼ（1000単位/ml）を含むダルベッコ（Dulbecc
o）のPBS100ml中で〔3H〕グルコサミン標識、〔3H〕セ
リン標識または化学標識rgp580とともに37℃で１時間イ
ンキュベートすることにより測定した。試料および非処
理対照は2.0〜17.5％DATDアクリルアミド勾配ゲル上のS
DS-PAGE、次に被ばくフルオログラムのデンシトメトリ
ー定量により分析した。
コアタンパク質測定 非標識rgp580または〔14C〕セリンで代謝標識したrgp58
0を担体タンパク質として用いたウシ血清アルブミン100
mgに加え、混合物をエッジ（Edge）ほか（1981）、アナ
リテイカル・バイオケミストリー（Anal.Biochem.）、1
18:131〜137により記載されたように窒素パージレアク
チ・バイアル（Reacti-Vial）中、トリフルオロメチル
スルホン酸（アニソール中）（2:1w/w）で４℃で10また
は30分間処理した。試料はジエチルエーテルで抽出し、
透析し、凍結乾燥した。非標識処理物質をクロラミン−
Ｔ法の利用により125Iで化学的に標識した。試料は2.0
〜17.5％DATDアクリルアミドゲルの使用によりSDS-PAGE
で分析した。
0を担体タンパク質として用いたウシ血清アルブミン100
mgに加え、混合物をエッジ（Edge）ほか（1981）、アナ
リテイカル・バイオケミストリー（Anal.Biochem.）、1
18:131〜137により記載されたように窒素パージレアク
チ・バイアル（Reacti-Vial）中、トリフルオロメチル
スルホン酸（アニソール中）（2:1w/w）で４℃で10また
は30分間処理した。試料はジエチルエーテルで抽出し、
透析し、凍結乾燥した。非標識処理物質をクロラミン−
Ｔ法の利用により125Iで化学的に標識した。試料は2.0
〜17.5％DATDアクリルアミドゲルの使用によりSDS-PAGE
で分析した。
アミノ酸分析 rgp580の試料を酸洗浄管中で凍結乾燥し、6Nまたは4N-H
Clで４時間、10時間または24時間110℃で加水分解し
た。分析はノルロイシンを添加内部標準としたLKBモデ
ル401アミノ酸アナライザーを用いて行なった。
Clで４時間、10時間または24時間110℃で加水分解し
た。分析はノルロイシンを添加内部標準としたLKBモデ
ル401アミノ酸アナライザーを用いて行なった。
アルカリホウ水素化物処理 放射性標識炭水化物を有する分離したrgp580の凍結乾燥
試料を50mM-NaOH、1.0M-NaBH4で45℃において24時間処
理した。試料を酢酸で中和し、ダウエックス（Dowex）5
0〔H+〕カラムに通し、蒸留水で溶離し、画分をメタノ
ールの存在下に繰返し乾燥した。オリゴサッカリトール
試料を5mMトリス−HCl（pH7.5）中に再び溶解し、同−
緩衝液中でQAセフアデックス（５×1cm）カラムに適用
した。カラムを5mMトリス−HCl25mlで洗浄し、次いで0.
2Mトリス−HCl（pH7.5）120mlまで直線勾配溶離した。
放射性ピークをプールし、次いでカールソン（Carlso
n）（1968）、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケ
ミストリー（J.Biol.Chem.）、243:616〜622、により記
載されたようにバイオゲルP6カラムに適用した。
試料を50mM-NaOH、1.0M-NaBH4で45℃において24時間処
理した。試料を酢酸で中和し、ダウエックス（Dowex）5
0〔H+〕カラムに通し、蒸留水で溶離し、画分をメタノ
ールの存在下に繰返し乾燥した。オリゴサッカリトール
試料を5mMトリス−HCl（pH7.5）中に再び溶解し、同−
緩衝液中でQAセフアデックス（５×1cm）カラムに適用
した。カラムを5mMトリス−HCl25mlで洗浄し、次いで0.
2Mトリス−HCl（pH7.5）120mlまで直線勾配溶離した。
放射性ピークをプールし、次いでカールソン（Carlso
n）（1968）、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケ
ミストリー（J.Biol.Chem.）、243:616〜622、により記
載されたようにバイオゲルP6カラムに適用した。
rgp580の化学組成 精製rgp580のアミノ酸組成は表IIに示される。当業者が
認めるように、培養MTLn3細胞およびMTLn3腫瘍から分離
したgp580に対して得られた表IIに示される値は実験誤
差内にある。近似的に±10％の実験誤差がそのようなア
ミノ酸分析に予想される。表IIに示される値は個々の４
試験の平均値である。グルタミン酸塩、アスパラギン酸
塩およびセリンは存在する主要アミノ酸であり、トレオ
ニン、グリシンおよびリシンもまたかなりの量に相当し
た。これらのアミノ酸はrgp580の全組成の1/2以上を構
成した。アミノ糖、グルコサミンおよびガラクトサミン
はrgp580の組成の約20％を構成した（表II）。
認めるように、培養MTLn3細胞およびMTLn3腫瘍から分離
したgp580に対して得られた表IIに示される値は実験誤
差内にある。近似的に±10％の実験誤差がそのようなア
ミノ酸分析に予想される。表IIに示される値は個々の４
試験の平均値である。グルタミン酸塩、アスパラギン酸
塩およびセリンは存在する主要アミノ酸であり、トレオ
ニン、グリシンおよびリシンもまたかなりの量に相当し
た。これらのアミノ酸はrgp580の全組成の1/2以上を構
成した。アミノ糖、グルコサミンおよびガラクトサミン
はrgp580の組成の約20％を構成した（表II）。
これらの値は培養したMTLn3細胞および腫瘍組織から精
製したrgp580に対する重複分析値の平均に相当する。炭
水化物値は異なる加水分解時間における値の加水分解０
時への補外により決定した。トリプトフアンは検出され
なかった。
製したrgp580に対する重複分析値の平均に相当する。炭
水化物値は異なる加水分解時間における値の加水分解０
時への補外により決定した。トリプトフアンは検出され
なかった。
rgp580をトリフルオロメチルスルホン酸で脱グリコシル
化してタンパク質コアを生成させた。〔14C〕セリン標
識したrgp580を酸で処理し、次いでSDS-PAGEにより分析
した。タンパク質コアは150,000キロドルトンの概算分
子量を有する単一バンドとして移行した。他の標識バン
ドは検出されなかった。腫瘍組織から分離し、次に125I
で放射性標識したrgp580のタンパク質コアはSDS-PAGEに
より等しい大きさを有した。
化してタンパク質コアを生成させた。〔14C〕セリン標
識したrgp580を酸で処理し、次いでSDS-PAGEにより分析
した。タンパク質コアは150,000キロドルトンの概算分
子量を有する単一バンドとして移行した。他の標識バン
ドは検出されなかった。腫瘍組織から分離し、次に125I
で放射性標識したrgp580のタンパク質コアはSDS-PAGEに
より等しい大きさを有した。
精製した〔14C〕セリン標識rgp580のアリコートを等密
度遠心法にかけてその見掛け密度を測定した。4M-GdnHC
lの存在下に遠心分離すると約1.432g/mlの密度を示した
（1.475〜1.398g/ml、＞90％）。しかし、GdnHClの関連
濃度（0.5M）の存在下に、見掛け密度は1.615g/mlであ
った（1.671〜1.563g/ml、＞90％）。弱い変性条件下の
この見掛け密度の上昇はまたヒアルロン酸および他の高
酸性分子に対して観察された。rgp580の酸の性質はアニ
オン性アミノ酸の高い組成およびシアル酸の高い量によ
って確認された。rgp580上の含量の評価は穏酸（50mM-H
2SO4、１時間、80℃）による〔3H〕グルコサン標識rgp5
80の処理、次いでバイオゲルP4カラム上のクロマトグラ
フィーにより得られた。rgp580中にとり込まれた放射能
の約25.5％がこの処理により遊離され、シアル酸がrgp5
80の主要成分であることを示唆する。さらにrgp580は3.
2±0.5の等電点で等電焦点化するスクロース密度勾配上
の拡散バンドとして移行しその酸性組成が確認された。
度遠心法にかけてその見掛け密度を測定した。4M-GdnHC
lの存在下に遠心分離すると約1.432g/mlの密度を示した
（1.475〜1.398g/ml、＞90％）。しかし、GdnHClの関連
濃度（0.5M）の存在下に、見掛け密度は1.615g/mlであ
った（1.671〜1.563g/ml、＞90％）。弱い変性条件下の
この見掛け密度の上昇はまたヒアルロン酸および他の高
酸性分子に対して観察された。rgp580の酸の性質はアニ
オン性アミノ酸の高い組成およびシアル酸の高い量によ
って確認された。rgp580上の含量の評価は穏酸（50mM-H
2SO4、１時間、80℃）による〔3H〕グルコサン標識rgp5
80の処理、次いでバイオゲルP4カラム上のクロマトグラ
フィーにより得られた。rgp580中にとり込まれた放射能
の約25.5％がこの処理により遊離され、シアル酸がrgp5
80の主要成分であることを示唆する。さらにrgp580は3.
2±0.5の等電点で等電焦点化するスクロース密度勾配上
の拡散バンドとして移行しその酸性組成が確認された。
データはrgp580がシアロムチン様特性を有することを示
唆し、この所見は種々の分解性酵素との〔3H〕セリン標
識rgp580がインキュベーションにより確認された。感受
性は処理したrgp580をSDS-PAGEにかけ、生じたバンドの
デンシトメトリー分析により評価した。精製したrgp580
は種々のプロテアーゼ、コンドロイチナーゼABC、およ
びヒアルロニダーゼに耐性であった（表III）。消化は
プロナーゼ、スブチロペプチダーゼＡおよびノイラミニ
ダーゼとＢ−ガラクトシダーゼとの組合せでのみ観察さ
れた。同様の結果は125I標識MTLn3腫瘍rgp580を分解性
酵素にかけたときに得られた。これらのデータはrgp580
がシアロムチンであること、従ってそれが種々のＯ−結
合オリゴ糖を含むことを示唆する。
唆し、この所見は種々の分解性酵素との〔3H〕セリン標
識rgp580がインキュベーションにより確認された。感受
性は処理したrgp580をSDS-PAGEにかけ、生じたバンドの
デンシトメトリー分析により評価した。精製したrgp580
は種々のプロテアーゼ、コンドロイチナーゼABC、およ
びヒアルロニダーゼに耐性であった（表III）。消化は
プロナーゼ、スブチロペプチダーゼＡおよびノイラミニ
ダーゼとＢ−ガラクトシダーゼとの組合せでのみ観察さ
れた。同様の結果は125I標識MTLn3腫瘍rgp580を分解性
酵素にかけたときに得られた。これらのデータはrgp580
がシアロムチンであること、従ってそれが種々のＯ−結
合オリゴ糖を含むことを示唆する。
rgp580オリゴ糖のホウ水素化物遊離 〔3H〕グルコサミン、〔3H〕ガラクトースおよび〔3H〕
フコースで放射性標識したrgp580のアルカリホウ水素化
物処理により多くのオリゴ糖が遊離された。〔3H〕グル
コサミン標識オリゴ糖をQAEセフアデックスカラムに適
用し、中性（全放射能の22.5％に相当する通過画分）お
よび酸性（保持画分、放射能の76.3％）成分に分離し
た。酸性画分をモノーおよびジーシアリル化オリゴサッ
カリトールが得られる条件（10〜40mMトリス−HCl、pH
7.5）下に溶離した。後の分画はバイオゲルP6カラム上
のゲル濾過クロマトグラフィーにより行なった。若干の
比較的大きい放射性ピークが酸性オリゴサッカリトール
に対して観察された。中性オリゴ糖の大部分は１つの放
射性ピークに関連すると認められた。オリゴ糖は腫瘍組
織から分離されたrgp580から遊離され、化学的に標識さ
れたそのシアル酸部分は類似のプロフイルを示した。
フコースで放射性標識したrgp580のアルカリホウ水素化
物処理により多くのオリゴ糖が遊離された。〔3H〕グル
コサミン標識オリゴ糖をQAEセフアデックスカラムに適
用し、中性（全放射能の22.5％に相当する通過画分）お
よび酸性（保持画分、放射能の76.3％）成分に分離し
た。酸性画分をモノーおよびジーシアリル化オリゴサッ
カリトールが得られる条件（10〜40mMトリス−HCl、pH
7.5）下に溶離した。後の分画はバイオゲルP6カラム上
のゲル濾過クロマトグラフィーにより行なった。若干の
比較的大きい放射性ピークが酸性オリゴサッカリトール
に対して観察された。中性オリゴ糖の大部分は１つの放
射性ピークに関連すると認められた。オリゴ糖は腫瘍組
織から分離されたrgp580から遊離され、化学的に標識さ
れたそのシアル酸部分は類似のプロフイルを示した。
実施例II:rgp580に対して調製した単クローン性抗体の
発生および確認 高転移13762NFラット乳腺癌細胞上に多量に存在するrgp
580抗原に対して特異性を有する単クローン性抗体（GP2
1:56）を生ずるラットハイブリドーマを発生させた。ハ
イブリドーマはラットY3Ag1.2.3骨髄腫細胞と精製rgp58
0によるi.d.免疫処置ラットの脾細胞との融合により作
った。合計27融合がこの糖タンパク質に対し特異性を有
する１ハイブリドーマの生成に必要であったので、rgp5
80は同系F344ラットにおいて低免疫源性であると思われ
た。rgp580に対して特異性を有する抗体を分泌するハイ
ブリドーマの頻度を高める試みにおいて、多くの異なる
免疫処置プロトコル、例えばi.d.およびi.p.経路の抗原
投与、試験管内免疫処置、並びにＢ細胞芽細胞源として
の脾臓およびリンパ節の使用、を用いた。
発生および確認 高転移13762NFラット乳腺癌細胞上に多量に存在するrgp
580抗原に対して特異性を有する単クローン性抗体（GP2
1:56）を生ずるラットハイブリドーマを発生させた。ハ
イブリドーマはラットY3Ag1.2.3骨髄腫細胞と精製rgp58
0によるi.d.免疫処置ラットの脾細胞との融合により作
った。合計27融合がこの糖タンパク質に対し特異性を有
する１ハイブリドーマの生成に必要であったので、rgp5
80は同系F344ラットにおいて低免疫源性であると思われ
た。rgp580に対して特異性を有する抗体を分泌するハイ
ブリドーマの頻度を高める試みにおいて、多くの異なる
免疫処置プロトコル、例えばi.d.およびi.p.経路の抗原
投与、試験管内免疫処置、並びにＢ細胞芽細胞源として
の脾臓およびリンパ節の使用、を用いた。
酵素結合免疫吸収検定（ELISA）および直接結合検定
は、本発明により生成されたハイブリドーマが自然転移
ポテンシャルに関して13762NFラット腺癌のクローン化
標的細胞系に特異的に結合した単クローン性抗体を生じ
たことを示した。低転移MTC細胞に対するよりも高転移M
TLn3細胞に対し３倍数のGP21:56抗体分子が結合した
が、しかしGP21:56は齧歯動物またはヒト由来の他の細
胞系との反応性がわずかかまたはないことを示した。マ
イクロタイタープレートに結合した精製rgp580を使用す
る直接抗体結合検定および種々の13762NF細胞サブクロ
ーンの溶解物を使用する免疫ブロッテイングはGP21:56
がrgp580に特異的に結合したことを確証した。
は、本発明により生成されたハイブリドーマが自然転移
ポテンシャルに関して13762NFラット腺癌のクローン化
標的細胞系に特異的に結合した単クローン性抗体を生じ
たことを示した。低転移MTC細胞に対するよりも高転移M
TLn3細胞に対し３倍数のGP21:56抗体分子が結合した
が、しかしGP21:56は齧歯動物またはヒト由来の他の細
胞系との反応性がわずかかまたはないことを示した。マ
イクロタイタープレートに結合した精製rgp580を使用す
る直接抗体結合検定および種々の13762NF細胞サブクロ
ーンの溶解物を使用する免疫ブロッテイングはGP21:56
がrgp580に特異的に結合したことを確証した。
速度論的研究は、GP21:56がrgp580に対して高い親和性
を有さないが、しかしそれがこの糖タンパク質に対する
高い結合活性を示すことを示した。試験管内でMTLn3細
胞に結合すると、GP21:56分子は24時間の半減期で除去
された。13762NF腫瘍の凍結組織切片を用いた局在化研
究はGP21:56が試験管内培養細胞と同様に生体内成長腫
瘍細胞と反応することを示した。高転移MTLn3腫瘍細胞
の50％以上が免疫ペルオキシダーゼ法の使用に陽性であ
り、中間転移MTF7およびMTLn2細胞の約20％並びに低転
移MTCおよびMTPa細胞の約10％未満がrgp580に対し陽性
であった。rgp580の発現は細胞間で不均一であり、主に
腫瘍細胞表面に関連した。
を有さないが、しかしそれがこの糖タンパク質に対する
高い結合活性を示すことを示した。試験管内でMTLn3細
胞に結合すると、GP21:56分子は24時間の半減期で除去
された。13762NF腫瘍の凍結組織切片を用いた局在化研
究はGP21:56が試験管内培養細胞と同様に生体内成長腫
瘍細胞と反応することを示した。高転移MTLn3腫瘍細胞
の50％以上が免疫ペルオキシダーゼ法の使用に陽性であ
り、中間転移MTF7およびMTLn2細胞の約20％並びに低転
移MTCおよびMTPa細胞の約10％未満がrgp580に対し陽性
であった。rgp580の発現は細胞間で不均一であり、主に
腫瘍細胞表面に関連した。
a.物質および方法 下記物質および方法は本発明者がrgp580を指向するモノ
クローナルの製造に適すると認めた技術に相当する。次
の態様はハイブリドーマの生成にラット脾臓／ラット骨
髄腫ハイブリッドを用いるけれども、他のハイブリドー
マ技術例えばマウス／マウスハイブリッドを用いる技術
が同様によく適用されることが測定された。
クローナルの製造に適すると認めた技術に相当する。次
の態様はハイブリドーマの生成にラット脾臓／ラット骨
髄腫ハイブリッドを用いるけれども、他のハイブリドー
マ技術例えばマウス／マウスハイブリッドを用いる技術
が同様によく適用されることが測定された。
動物 近交８週令フィッシャー（Fischer）（F344/CDL）ラッ
ト（RT1′）はチャールス・リバー・ブリーディング・
ラボラトリーズ（Charles River Breeding Laboratorie
s）により供給された。動物は使用前に７日間検疫し、
標準齧歯動物固形試料および非塩素処理湧水を任意に与
えた。動物はジ・ユニバシテイ・オブ・テキサス・シス
テム・カンサー・センター（The University of Texas
System Cancer Center）およびインステイチュート・オ
ブ・ラボラトリー・アニマル・リゾーシス、ナショナル
・リサーチ・カウンシル（Institnte of Laboratory An
imal Resources,National Research Council）により示
された指針下に保持した。
ト（RT1′）はチャールス・リバー・ブリーディング・
ラボラトリーズ（Charles River Breeding Laboratorie
s）により供給された。動物は使用前に７日間検疫し、
標準齧歯動物固形試料および非塩素処理湧水を任意に与
えた。動物はジ・ユニバシテイ・オブ・テキサス・シス
テム・カンサー・センター（The University of Texas
System Cancer Center）およびインステイチュート・オ
ブ・ラボラトリー・アニマル・リゾーシス、ナショナル
・リサーチ・カウンシル（Institnte of Laboratory An
imal Resources,National Research Council）により示
された指針下に保持した。
細胞および細胞系 ラット骨髄腫Y3Ag1.2.3（RT1v）細胞系はミルステイン
（C.Milstein,MRC Laboratories,Cambridge,England）
から入手し、高グルコースプラス10％FBS〔ハイクロン
（Hyclone）、Logan,UT）〕中の抗生物質を含まないDME
Mおよび20mVヘプス（Hepes）中でかくはん培養に維持し
た。
（C.Milstein,MRC Laboratories,Cambridge,England）
から入手し、高グルコースプラス10％FBS〔ハイクロン
（Hyclone）、Logan,UT）〕中の抗生物質を含まないDME
Mおよび20mVヘプス（Hepes）中でかくはん培養に維持し
た。
13762NFラット乳腺癌のクローン化サブライン（MTLn3、
MTLn2、MTF7、MTC）並びに非クローン化親系MTLY（リン
パ節転移部から）およびMTPa（原腫瘍から）をネリ（Ne
ri）ほか（1982）、ジャーナル・オブ・ザ・ナショナル
・カンサー・インステイチュート（J.Natl.Cancer Ins
t.）、68:507に記載されたように得て成長させた。細胞
系およびクローンはすべて普通にスクリーンし、マイコ
プラズマ（Mycoplasma）および齧歯動物ウイルス汚染が
ないと認められた。細胞系MTLn3、MTF7、MTC、MTLYおよ
びMTPaは試験管内継代10〜18で、MTLn2細胞は継代38〜4
0で使用した。
MTLn2、MTF7、MTC）並びに非クローン化親系MTLY（リン
パ節転移部から）およびMTPa（原腫瘍から）をネリ（Ne
ri）ほか（1982）、ジャーナル・オブ・ザ・ナショナル
・カンサー・インステイチュート（J.Natl.Cancer Ins
t.）、68:507に記載されたように得て成長させた。細胞
系およびクローンはすべて普通にスクリーンし、マイコ
プラズマ（Mycoplasma）および齧歯動物ウイルス汚染が
ないと認められた。細胞系MTLn3、MTF7、MTC、MTLYおよ
びMTPaは試験管内継代10〜18で、MTLn2細胞は継代38〜4
0で使用した。
他の細胞系はラット乳腺癌R32-30Ac（RT1′）CSEおよび
MNU-344〔メイソン・リサーチ・インステイチュート（M
ason Research Institute,Worcester,MA）〕の腫瘍外植
片から作った。腫瘍片は同系受容者に皮下移植し、腫瘍
のとり出し前に２回生体内継代した。腫瘍外植片は0.25
％トリプシン〔ギブコ（GIBCO,Grand Island,NY）およ
び１％コラゲナーゼ〔シグマ・ケミカル社（Sigma Chem
i-cal Co.,St,Louis,MO）〕で室温で１時間酵素的に処
理して細胞系を作った。正常成ラット線維芽細胞の短期
培養は同様の酵素操作を用いて８週令F344ラットのジフ
イステルネ（Xiphister-nae）から作った。胎児肺線維
芽細胞は14〜16日令F344ラット胎児から酵素処理なく分
離した。肺を細分し、培養に置き線維芽細胞を成長させ
た。これらの細胞系は低継代（継代７未満）でAMEMプラ
ス10％PBS中に維持し、他に記載しなければそれらは普
通に100mm組織培養プレート〔コーニング・グラス（Cor
ning Glass,Corning,NY）上で培養した。
MNU-344〔メイソン・リサーチ・インステイチュート（M
ason Research Institute,Worcester,MA）〕の腫瘍外植
片から作った。腫瘍片は同系受容者に皮下移植し、腫瘍
のとり出し前に２回生体内継代した。腫瘍外植片は0.25
％トリプシン〔ギブコ（GIBCO,Grand Island,NY）およ
び１％コラゲナーゼ〔シグマ・ケミカル社（Sigma Chem
i-cal Co.,St,Louis,MO）〕で室温で１時間酵素的に処
理して細胞系を作った。正常成ラット線維芽細胞の短期
培養は同様の酵素操作を用いて８週令F344ラットのジフ
イステルネ（Xiphister-nae）から作った。胎児肺線維
芽細胞は14〜16日令F344ラット胎児から酵素処理なく分
離した。肺を細分し、培養に置き線維芽細胞を成長させ
た。これらの細胞系は低継代（継代７未満）でAMEMプラ
ス10％PBS中に維持し、他に記載しなければそれらは普
通に100mm組織培養プレート〔コーニング・グラス（Cor
ning Glass,Corning,NY）上で培養した。
黒色腫細胞系SK-MEL-19、SK-MEL-75、DXIおよびHS929は
フオグ（J.Fogh,Memorial Sloane-Kettering Cancer Ce
nter,New York,NY）から入手した。細胞系MDA286および
MDA436はカイロー（R.Cailleau,U.T.M.D.Anderson Hosp
ital and Tumor Institute at Houston,Houston,TX.）
から入手した。マウス乳腺腫瘍細胞66、67、168.1およ
び4526はヘプナー（G.Heppner,Michigan Cancer Founda
tion,Detroit,MI.）から入手した。
フオグ（J.Fogh,Memorial Sloane-Kettering Cancer Ce
nter,New York,NY）から入手した。細胞系MDA286および
MDA436はカイロー（R.Cailleau,U.T.M.D.Anderson Hosp
ital and Tumor Institute at Houston,Houston,TX.）
から入手した。マウス乳腺腫瘍細胞66、67、168.1およ
び4526はヘプナー（G.Heppner,Michigan Cancer Founda
tion,Detroit,MI.）から入手した。
免疫処置プロトコル （ｉ）生体内 ８週令F344ラットを前記D2画分およびフロインド（Freu
nd）の完全アジュバントを含む1:1（V/V）乳濁液でi.d.
免疫処置した。各ラットは合計0.4mlを4i.d.部位に（0.
1ml/部位）を与えた。免疫処置は隔週にフロインドの不
完全アジュバント中の抗原0.1mlを、生じた肉芽腫中へ
注入することにより繰返した。最終i.d.攻撃は融合のた
めの脾臓または頚部リンパ節の除去４〜５日前に与え
た。あるいは類似の操作に従いラットを抗原のi.p.注射
により免疫処置した。
nd）の完全アジュバントを含む1:1（V/V）乳濁液でi.d.
免疫処置した。各ラットは合計0.4mlを4i.d.部位に（0.
1ml/部位）を与えた。免疫処置は隔週にフロインドの不
完全アジュバント中の抗原0.1mlを、生じた肉芽腫中へ
注入することにより繰返した。最終i.d.攻撃は融合のた
めの脾臓または頚部リンパ節の除去４〜５日前に与え
た。あるいは類似の操作に従いラットを抗原のi.p.注射
により免疫処置した。
（ii）試験管内 用いた方法はルーベンほか（Luben and Muhler（198
0）、Mol.Immunol.,17:935に初めに記載された方法の変
形であった。胸腺リンパ球調整培地は10日令ラット胸腺
リンパ球をDMEMプラス２％ウサギ血清〔クアドロマ社
（Quadroma,Inc.,Escondido,CA）〕中に２×106細胞/ml
の濃度で48時間培養することにより得られた。遠心分離
後、調整培地を−70℃で貯蔵した。免疫処置のため単個
細胞懸濁液を無経験F344ラットの脾臓から調製した。脾
細胞を５日間、胸腺リンパ球調整培地10mlおよび２％ウ
サギ血清を有するDMEM中の抗原とともにインキュベート
した。５日後、生じた芽細胞を、標準操作を用いてY3Ag
1.2.3骨髄腫細胞と融合させた。
0）、Mol.Immunol.,17:935に初めに記載された方法の変
形であった。胸腺リンパ球調整培地は10日令ラット胸腺
リンパ球をDMEMプラス２％ウサギ血清〔クアドロマ社
（Quadroma,Inc.,Escondido,CA）〕中に２×106細胞/ml
の濃度で48時間培養することにより得られた。遠心分離
後、調整培地を−70℃で貯蔵した。免疫処置のため単個
細胞懸濁液を無経験F344ラットの脾臓から調製した。脾
細胞を５日間、胸腺リンパ球調整培地10mlおよび２％ウ
サギ血清を有するDMEM中の抗原とともにインキュベート
した。５日後、生じた芽細胞を、標準操作を用いてY3Ag
1.2.3骨髄腫細胞と融合させた。
ハイブリドーマ生成 脾臓またはリンパ節の細胞は細ゲージ目網を通して培地
5ml中へ入れることにより調製した。血清を含まない培
地中で細胞を２回洗浄し、細胞生存率をトリパンブルー
排除法により測定した。脾細胞（２×108）をY3Ag1.2.3
細胞と混合し、細胞混合物を500×ｇで５分間遠心分離
することによりペレットにした。ペレットをpH7.2に調
整したDMEM中の50％ポリエチレングリコール1450〔ジェ
ー・ティー・ベーカー・ケミカル社（J.T.Baker Chemic
al Co.,Phllip−sburg,NJ）〕2mlの１分間にわたる添加
により穏やかに再懸濁した。融合混合物を１分間振り動
かし、DMEM8mlで希釈し、500×ｇで５分間遠心分離し
た。細胞を、20％FBS、10-4Ｍヒポキサンケン〔シグマ
（Sigma,St.Louis MO）〕、４×10-7Ｍアミノプテリン
〔シグマ（Sigma）〕および1.6×10-5Ｍチミジンを含む
DMEM（HAT培地）〔シグマ（Sigma）〕200ml中に再懸濁
した。アリコート（1ml）を、24時間前に２×104照射
（30Gy、ガンマ線照射）ラット線維芽細胞／ウエルで接
種したコスター（Costar）24ウエルプレート〔コスター
（Costar,Cambridge,MA）〕中へ分配した。標準培養条
件下に37℃で24時間インキュベートした後、HAT培地（1
ml）を加えた。細胞融合はハイブリッドの存在について
スクリーニングする前に７〜14日間インキュベートし
た。
5ml中へ入れることにより調製した。血清を含まない培
地中で細胞を２回洗浄し、細胞生存率をトリパンブルー
排除法により測定した。脾細胞（２×108）をY3Ag1.2.3
細胞と混合し、細胞混合物を500×ｇで５分間遠心分離
することによりペレットにした。ペレットをpH7.2に調
整したDMEM中の50％ポリエチレングリコール1450〔ジェ
ー・ティー・ベーカー・ケミカル社（J.T.Baker Chemic
al Co.,Phllip−sburg,NJ）〕2mlの１分間にわたる添加
により穏やかに再懸濁した。融合混合物を１分間振り動
かし、DMEM8mlで希釈し、500×ｇで５分間遠心分離し
た。細胞を、20％FBS、10-4Ｍヒポキサンケン〔シグマ
（Sigma,St.Louis MO）〕、４×10-7Ｍアミノプテリン
〔シグマ（Sigma）〕および1.6×10-5Ｍチミジンを含む
DMEM（HAT培地）〔シグマ（Sigma）〕200ml中に再懸濁
した。アリコート（1ml）を、24時間前に２×104照射
（30Gy、ガンマ線照射）ラット線維芽細胞／ウエルで接
種したコスター（Costar）24ウエルプレート〔コスター
（Costar,Cambridge,MA）〕中へ分配した。標準培養条
件下に37℃で24時間インキュベートした後、HAT培地（1
ml）を加えた。細胞融合はハイブリッドの存在について
スクリーニングする前に７〜14日間インキュベートし
た。
特異性抗対に対するスクリーニング ハイブリドーマ細胞をELISAを用いて特異性抗体の生成
について試験した。標的細胞の単層を96ウエルマイクロ
テストプレート中で集密に成長させ、0.5％グルタルア
ルデヒドで固定化し、1.0％ウシ血清アルブミン（BSA）
を含むPBS中に−20℃で貯蔵した。ハイブリドーマ培養
上澄みの試料（50μl/ウエル）を標的細胞とともに１時
間室温でインキュベートした。標的細胞をPBSプラス0.0
5％BSAで３回洗浄した。１％BSAを含むPBS中に1/1000に
希釈したビオチニル化ヤギ／ラットIgG〔ベクター・ラ
ボラトリーズ（Vector Labs.,Burlingame,CA）〕を加え
（50μl/ウエル）、細胞とともに室温で１時間インキュ
ベートした。細胞を３回洗浄し、次にPBSプラス１％BSA
中に1/1000に希釈したストレプタビジン（Streptavidi
n）架橋剤〔ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ社（B
ethesda Research Laboratories,Inc.,Gait-hersburg,M
D）〕（50μl/ウエル）を添加し、室温でさらに45分間
インキュベートした。
について試験した。標的細胞の単層を96ウエルマイクロ
テストプレート中で集密に成長させ、0.5％グルタルア
ルデヒドで固定化し、1.0％ウシ血清アルブミン（BSA）
を含むPBS中に−20℃で貯蔵した。ハイブリドーマ培養
上澄みの試料（50μl/ウエル）を標的細胞とともに１時
間室温でインキュベートした。標的細胞をPBSプラス0.0
5％BSAで３回洗浄した。１％BSAを含むPBS中に1/1000に
希釈したビオチニル化ヤギ／ラットIgG〔ベクター・ラ
ボラトリーズ（Vector Labs.,Burlingame,CA）〕を加え
（50μl/ウエル）、細胞とともに室温で１時間インキュ
ベートした。細胞を３回洗浄し、次にPBSプラス１％BSA
中に1/1000に希釈したストレプタビジン（Streptavidi
n）架橋剤〔ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ社（B
ethesda Research Laboratories,Inc.,Gait-hersburg,M
D）〕（50μl/ウエル）を添加し、室温でさらに45分間
インキュベートした。
プレートをPBSプラス0.05％BSAで６回洗浄した。結合し
た抗体を0.1Mクエン酸塩緩衝液pH4.5および0.012％過酸
化水素に溶解したｏ−フエニレンジアミン（1mg/ml）試
薬（100μｌウエル）を用いて定量した。暗所で15分間
インキュベートした後、450nmにおける吸光度をタイタ
ーテク・マルチスキヤナー（Titertek Multiscanner）
〔フロー・ラボラトリース（Flow Laboratories,Mc Lea
n,VA）〕を用いて測定した。全検定にY3Ag1.2.3培養上
澄みを陰性対照として用いた。上澄みがバックグラウン
ド上の２標準偏差に等しいかそれより大きい吸光度を有
すれば、それをgp580特異性単クローン性抗体（MAb）に
対して陽性であるとみなした。陽性ウエルのハイブリド
ーマは、照射ラット線維芽細胞を供給細胞として用いる
限界希釈により２回クローン化した。
た抗体を0.1Mクエン酸塩緩衝液pH4.5および0.012％過酸
化水素に溶解したｏ−フエニレンジアミン（1mg/ml）試
薬（100μｌウエル）を用いて定量した。暗所で15分間
インキュベートした後、450nmにおける吸光度をタイタ
ーテク・マルチスキヤナー（Titertek Multiscanner）
〔フロー・ラボラトリース（Flow Laboratories,Mc Lea
n,VA）〕を用いて測定した。全検定にY3Ag1.2.3培養上
澄みを陰性対照として用いた。上澄みがバックグラウン
ド上の２標準偏差に等しいかそれより大きい吸光度を有
すれば、それをgp580特異性単クローン性抗体（MAb）に
対して陽性であるとみなした。陽性ウエルのハイブリド
ーマは、照射ラット線維芽細胞を供給細胞として用いる
限界希釈により２回クローン化した。
他のMAb結合検定はラットＦ（ab′）2に対する125I標識
アフイニテイー精製抗体を用いた〔デイーン（Dr.C.J.D
ean,Chester Beatty Research Institute,Sutton,Surr
y,England）〕。細胞上澄みまたは精製MAbの試料を生細
胞の集密単層とともに４℃で、または96ウエルマイクロ
テストプレート中で成長させた固定化細胞とともに室温
で、１時間インキュベートした。結合したMAbは５×105
cpm/ウエルの125I標識ヒツジ／ラット（ab′）2ととも
に４℃で（生細胞）、または室温で（固定化細胞）１時
間インキュベートすることにより測定した。細胞はPBS
で洗浄し、2N-NaOH200μｌで溶解した。放射能をベック
マンモデル8000ガンマカウンター中の計数により測定し
た。
アフイニテイー精製抗体を用いた〔デイーン（Dr.C.J.D
ean,Chester Beatty Research Institute,Sutton,Surr
y,England）〕。細胞上澄みまたは精製MAbの試料を生細
胞の集密単層とともに４℃で、または96ウエルマイクロ
テストプレート中で成長させた固定化細胞とともに室温
で、１時間インキュベートした。結合したMAbは５×105
cpm/ウエルの125I標識ヒツジ／ラット（ab′）2ととも
に４℃で（生細胞）、または室温で（固定化細胞）１時
間インキュベートすることにより測定した。細胞はPBS
で洗浄し、2N-NaOH200μｌで溶解した。放射能をベック
マンモデル8000ガンマカウンター中の計数により測定し
た。
試験管内MTLn3細胞によるMAbクリアランスの速度 96ウエルプレート中のMTLn3細胞の指数増殖クローンを
１回５％FBSを含むAMEM中で洗浄し、培養上澄み（10μl
/ml抗体）50μl/ウエルとともに氷上で１時間インキュ
ベートした。プレートを３回AMEMで洗浄し、各プレート
を４区画に分けた。初めに結合したMAbの量を測定する
ため１区画を125I標識ヒツジ／ラットＦ（ab′）230μ
ｌとともに４℃で１時間インキュベートした。残余区画
は95％空気、５％CO2の雰囲気中で37℃において０〜32
時間インキュベートした。定期的に１区画を上記のよう
に処理した。十分に洗浄した後、細胞を溶解し、放射能
を上記のように測定した。
１回５％FBSを含むAMEM中で洗浄し、培養上澄み（10μl
/ml抗体）50μl/ウエルとともに氷上で１時間インキュ
ベートした。プレートを３回AMEMで洗浄し、各プレート
を４区画に分けた。初めに結合したMAbの量を測定する
ため１区画を125I標識ヒツジ／ラットＦ（ab′）230μ
ｌとともに４℃で１時間インキュベートした。残余区画
は95％空気、５％CO2の雰囲気中で37℃において０〜32
時間インキュベートした。定期的に１区画を上記のよう
に処理した。十分に洗浄した後、細胞を溶解し、放射能
を上記のように測定した。
rgp580に対しMAb GP21:56を結合させるプレート 精製rgp580を次の方法によりイムノテク（Immunotech）
Ｉプレート〔A/Sヌンク（A/S Nunc,Kamstrap,Denmar
K）〕上で一夜固定化した。rgp580の溶液（１μg/ml）
を初めに音波処理し、アリコートをピペットでマイクロ
テストプレートに入れた（50μl/ウエル）。プレートを
３回PBSで洗浄し、次いでPBSプラス１％BSAとともに室
温で１時間インキュベートした。プレートをPBSプラス
１％BSA中に−20℃で貯蔵した。
Ｉプレート〔A/Sヌンク（A/S Nunc,Kamstrap,Denmar
K）〕上で一夜固定化した。rgp580の溶液（１μg/ml）
を初めに音波処理し、アリコートをピペットでマイクロ
テストプレートに入れた（50μl/ウエル）。プレートを
３回PBSで洗浄し、次いでPBSプラス１％BSAとともに室
温で１時間インキュベートした。プレートをPBSプラス
１％BSA中に−20℃で貯蔵した。
速度論的研究 クローン化MTLn3細胞を１回PBSプラス１％BSAで洗浄
し、125I標識GP21:56（1Ci/mg）とともに４℃でインキ
ュベートした。飽和結合の測定のためMTLn3細胞（８×1
04）を125I標識GP21:56（4.2×104CPM）とともにインキ
ュベートし、アリコートを1 1/2時間まで定期的にと
る。アリコートは３回PBS/BSA緩衝液で洗浄し、放射能
を前記のように測定した。非特異的結合は試料を1000倍
過剰の非標識抗体の存在下にインキュベートしたときに
結合した放射能の測定により評価した。解離の速度はMT
Ln3細胞を上記のように125I標識GP21:56とともに１時間
インキュベートし、次いで1000倍過剰の冷抗体を加え、
1 1/2時間にわたりアリコートをとることにより測定し
た。細胞は３回PBS/BSA緩衝液で洗浄し、細胞結合放射
能を標準操作により測定した。
し、125I標識GP21:56（1Ci/mg）とともに４℃でインキ
ュベートした。飽和結合の測定のためMTLn3細胞（８×1
04）を125I標識GP21:56（4.2×104CPM）とともにインキ
ュベートし、アリコートを1 1/2時間まで定期的にと
る。アリコートは３回PBS/BSA緩衝液で洗浄し、放射能
を前記のように測定した。非特異的結合は試料を1000倍
過剰の非標識抗体の存在下にインキュベートしたときに
結合した放射能の測定により評価した。解離の速度はMT
Ln3細胞を上記のように125I標識GP21:56とともに１時間
インキュベートし、次いで1000倍過剰の冷抗体を加え、
1 1/2時間にわたりアリコートをとることにより測定し
た。細胞は３回PBS/BSA緩衝液で洗浄し、細胞結合放射
能を標準操作により測定した。
MAbの精製 MAbは培養上澄みから、硫酸アンモニウム（40％飽和）
沈殿による濃縮後アフイニテイークロマトグラフィーに
より分離した。抗ラットＫ鎖MAb〔マーク1;ベイジン
（H.Bazin,Bruss-els,Beligum）〕をアフイーゲル（Aff
i-Gel）10（タンパク質10mg/mlビーズ）に結合させるこ
とにより免疫収着カラムを作った。免疫収着カラムから
のMAb GP21:56の溶離を3Mチオシアン酸カリウムで行な
い、画分（1ml）を捕集し、直ちに0.1ヘペス緩衝液pH8.
0で中和した。タンパク質濃度はブラドフオード（Bradf
ord）（1976）、アナリテイカル・バイオケミストリー
（Anal.Biochem.）、72:248に記載のようにブラドフオ
ード検定を用いて測定し、MAbの純度はドデシル硫酸ナ
トリウム中のポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PA
GE）により検定した。抗体アイソタイプはラットIgG1、
IgG2a、IgG2b、IgG2cおよびIgMに対する抗血清〔マイル
ズ・ラボラトリーズ社（Miles Laboratories,Inc.,Nape
rville,IL）〕を用いて軟寒天中の二重拡散分析により
確認した。精製した抗体はクロラミン−Ｔ法により125I
〔ICNフアルマシューテイクス（ICN Pharmaceutics,Irv
ine,CA）〕で2Ci/mgの特定活性に標識した。
沈殿による濃縮後アフイニテイークロマトグラフィーに
より分離した。抗ラットＫ鎖MAb〔マーク1;ベイジン
（H.Bazin,Bruss-els,Beligum）〕をアフイーゲル（Aff
i-Gel）10（タンパク質10mg/mlビーズ）に結合させるこ
とにより免疫収着カラムを作った。免疫収着カラムから
のMAb GP21:56の溶離を3Mチオシアン酸カリウムで行な
い、画分（1ml）を捕集し、直ちに0.1ヘペス緩衝液pH8.
0で中和した。タンパク質濃度はブラドフオード（Bradf
ord）（1976）、アナリテイカル・バイオケミストリー
（Anal.Biochem.）、72:248に記載のようにブラドフオ
ード検定を用いて測定し、MAbの純度はドデシル硫酸ナ
トリウム中のポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PA
GE）により検定した。抗体アイソタイプはラットIgG1、
IgG2a、IgG2b、IgG2cおよびIgMに対する抗血清〔マイル
ズ・ラボラトリーズ社（Miles Laboratories,Inc.,Nape
rville,IL）〕を用いて軟寒天中の二重拡散分析により
確認した。精製した抗体はクロラミン−Ｔ法により125I
〔ICNフアルマシューテイクス（ICN Pharmaceutics,Irv
ine,CA）〕で2Ci/mgの特定活性に標識した。
免疫ペルオキシダーゼ操作 13762NF腺癌サブクローンの組織試料は106腫瘍細胞／ラ
ットの注射23日後にF344ラットの乳房脂肪パッド中の皮
下（s.c.）成長腫瘍から得た。組織を液体窒素中で素早
く凍結し、必要になるまで−20℃で貯蔵した。クリオス
タット切片（厚さ４μｍ）を免疫ペルオキシダーゼ染色
に用いた。操作は基質としてジアミノベンジン（DAB）
（1mg/ml、トリス−HCl中、pH7.2）を有するベクタスタ
イン（Vectastain）ABC抗ラットIgGキット〔ベクター・
ラボラトリーズ（Vector Laboratories,San Francisco,
CA）〕を用いた。切片はメイヤー（Meyer）のヘマトキ
シリンで対比染色し、レイツ（Leitz）顕微鏡写真装置
中で調べた。
ットの注射23日後にF344ラットの乳房脂肪パッド中の皮
下（s.c.）成長腫瘍から得た。組織を液体窒素中で素早
く凍結し、必要になるまで−20℃で貯蔵した。クリオス
タット切片（厚さ４μｍ）を免疫ペルオキシダーゼ染色
に用いた。操作は基質としてジアミノベンジン（DAB）
（1mg/ml、トリス−HCl中、pH7.2）を有するベクタスタ
イン（Vectastain）ABC抗ラットIgGキット〔ベクター・
ラボラトリーズ（Vector Laboratories,San Francisco,
CA）〕を用いた。切片はメイヤー（Meyer）のヘマトキ
シリンで対比染色し、レイツ（Leitz）顕微鏡写真装置
中で調べた。
イムノブロッテイング ウエスタン・ブロットを実質的にトウビン（Towbin）ほ
か（1979）、P.N.A.S.,76:4350により記載されたように
行なった。タンパク質は２〜17.5％DATD架橋、変性ポリ
アクリルアミド勾配ゲルからニトロセルロース紙に50ボ
ルト、0.29アンペアで一夜電気泳動的に移した。抗原は
ブロットを125I標識抗体とともに３時間インキュベート
し、次いでコダックＸ−OMAT ARフイルムを用いてオー
トラジオグラフィーを行なうことにより検出した。
か（1979）、P.N.A.S.,76:4350により記載されたように
行なった。タンパク質は２〜17.5％DATD架橋、変性ポリ
アクリルアミド勾配ゲルからニトロセルロース紙に50ボ
ルト、0.29アンペアで一夜電気泳動的に移した。抗原は
ブロットを125I標識抗体とともに３時間インキュベート
し、次いでコダックＸ−OMAT ARフイルムを用いてオー
トラジオグラフィーを行なうことにより検出した。
b.MAb GP21:56の発生および特異性 rgp580に対してMAbを生成させるために、多くの種々の
生体内および試験管内免疫処置操作を用いた（表IV参
照）。無経験ラットを皮内（i.d.）または腹腔内（i.
p.）にrgp580で攻撃させ、脾臓および頚部リンパ節の両
方をY3Ag1.2.3骨髄腫細胞との融合に対するＢ芽細胞源
として用いた。さらに、試験管内免疫処置操作を用いて
所望特異性を有するハイブリドーマを生成する確率を高
めた。この免疫処置技術を用いた合計27融合から、一次
スクリーニング検定でMTLn3細胞と特異的ELISA反応性を
示した単に１つのMAb（GP21:56として示す）を生じた。
融合当りに形成されたハイブリッドの頻度は低かった。
平均して単に20〜25％のウエルが成長に対して陽性であ
ったが、しかしこれは免疫処置プロトコルおよびＢ芽細
胞に若干依存した。若干の融合においてハイブリッドが
少し検出されたかまたは検出できなかった。
生体内および試験管内免疫処置操作を用いた（表IV参
照）。無経験ラットを皮内（i.d.）または腹腔内（i.
p.）にrgp580で攻撃させ、脾臓および頚部リンパ節の両
方をY3Ag1.2.3骨髄腫細胞との融合に対するＢ芽細胞源
として用いた。さらに、試験管内免疫処置操作を用いて
所望特異性を有するハイブリドーマを生成する確率を高
めた。この免疫処置技術を用いた合計27融合から、一次
スクリーニング検定でMTLn3細胞と特異的ELISA反応性を
示した単に１つのMAb（GP21:56として示す）を生じた。
融合当りに形成されたハイブリッドの頻度は低かった。
平均して単に20〜25％のウエルが成長に対して陽性であ
ったが、しかしこれは免疫処置プロトコルおよびＢ芽細
胞に若干依存した。若干の融合においてハイブリッドが
少し検出されたかまたは検出できなかった。
rgp580に対する特異性を有して形成されるハイブリッド
の頻度は他の抗原に対するものに比べて著しく低かっ
た。対照として無経験ラットからの脾臓を用い、ハイブ
リドーマ成長を有するウエルの数が通常16〜20％程度で
あったがしかしrgp580以外の抗原が100％までのハイブ
リッド成長に対して陽性のウエルを生じたことが認めら
れた。rgp580に対して形成されたハイブリッドの低い頻
度はこの抗原が同系受容体中で低免疫原性であることを
示唆する。rgp580の限定量のために、ハイブリッドは初
めにMTLn3細胞との反応性を基にして選択した。これら
の条件下でのみMAb GP21:56は反応性であった。
の頻度は他の抗原に対するものに比べて著しく低かっ
た。対照として無経験ラットからの脾臓を用い、ハイブ
リドーマ成長を有するウエルの数が通常16〜20％程度で
あったがしかしrgp580以外の抗原が100％までのハイブ
リッド成長に対して陽性のウエルを生じたことが認めら
れた。rgp580に対して形成されたハイブリッドの低い頻
度はこの抗原が同系受容体中で低免疫原性であることを
示唆する。rgp580の限定量のために、ハイブリッドは初
めにMTLn3細胞との反応性を基にして選択した。これら
の条件下でのみMAb GP21:56は反応性であった。
精製rgp580に対するMAb GP21:56の結合 前節に記載したELISAはMAb GP21:56がrgp580上に存在す
るエピトープを認識することを示唆した。これを確認す
るためにMAb GP21:56の精製rgp580を認識する能力を、
固定化rgp580を抗原として用いて固相抗体結合検定で測
定した。アフイニテイー精製MAb GP21:56（100μg/ml）
の結合は三重複試料で測定した。MAb GP21:56はrgp580
に特異的に結合したが、13762NF腺癌上に発現された他
の細胞表面抗原に対して特異性を有するMAbはrgp580に
結合しなかった。
るエピトープを認識することを示唆した。これを確認す
るためにMAb GP21:56の精製rgp580を認識する能力を、
固定化rgp580を抗原として用いて固相抗体結合検定で測
定した。アフイニテイー精製MAb GP21:56（100μg/ml）
の結合は三重複試料で測定した。MAb GP21:56はrgp580
に特異的に結合したが、13762NF腺癌上に発現された他
の細胞表面抗原に対して特異性を有するMAbはrgp580に
結合しなかった。
非クローン化およびクローン化13762NF細胞系に対するM
Ab GP21:56の結合前の検定はMAb GP21:56が精製rgp580
と反応したことを示した。13762NF乳腺癌の種々のサブ
ラインを用いてこれらのクローン化細胞系とのMAb GP2
1:56の反応性に対する定量的データを得た。グルタルア
ルデヒド固定化MTLn3細胞、MTF7、MTCおよびMTPa細胞に
対する直接結合検定を用い、結合したMAbを125I標識ヒ
ツジ／ラットＦ（ab′）2を用いて検定した。第５図か
ら、高MAb濃度で13762NF細胞に対するMAb GP21:56の結
合プロフイルがこれらの細胞クローンの転移ポテンシャ
ルおよびrgp580の細胞量に関連することを知ることがで
きる。結果はMTF7またはMTC細胞よりもMTLn3に結合した
MAb GP21:56の量が３倍であったこと、および親MTPa細
胞に対する結合がわずかであったことを示す。この結果
に対する他の説明は、固定化プロセスの結果GP21:56に
結合するrgp580エピトープの利用性が低かったこと、ま
たは細胞表面上の他の「マスキング」プロテオグリカン
の発現がMAbの結合を妨げたことである。しかし、非固
定化13762NFのNP40抽出物はインタクト細胞と同様にGP2
1:56と反応し、種々の13762NF細胞クローンから抽出し
たrgp580の化学量はMAb結合データを支持した。
Ab GP21:56の結合前の検定はMAb GP21:56が精製rgp580
と反応したことを示した。13762NF乳腺癌の種々のサブ
ラインを用いてこれらのクローン化細胞系とのMAb GP2
1:56の反応性に対する定量的データを得た。グルタルア
ルデヒド固定化MTLn3細胞、MTF7、MTCおよびMTPa細胞に
対する直接結合検定を用い、結合したMAbを125I標識ヒ
ツジ／ラットＦ（ab′）2を用いて検定した。第５図か
ら、高MAb濃度で13762NF細胞に対するMAb GP21:56の結
合プロフイルがこれらの細胞クローンの転移ポテンシャ
ルおよびrgp580の細胞量に関連することを知ることがで
きる。結果はMTF7またはMTC細胞よりもMTLn3に結合した
MAb GP21:56の量が３倍であったこと、および親MTPa細
胞に対する結合がわずかであったことを示す。この結果
に対する他の説明は、固定化プロセスの結果GP21:56に
結合するrgp580エピトープの利用性が低かったこと、ま
たは細胞表面上の他の「マスキング」プロテオグリカン
の発現がMAbの結合を妨げたことである。しかし、非固
定化13762NFのNP40抽出物はインタクト細胞と同様にGP2
1:56と反応し、種々の13762NF細胞クローンから抽出し
たrgp580の化学量はMAb結合データを支持した。
さらに、MAb GP21:56の結合は生育可能な、非固定化細
胞および固定化細胞に対して同様であった。上記細胞系
に加えて親系MTLy（リンパ節転移部から得た非クローン
化細胞系）の使用もまた試験した。MTLyは高転移性であ
る。MAb GP21:56は種々の固定化した生13762NF細胞クロ
ーンに対し実質的に同じパターンの反応性を有したが、
しかし生細胞に対するMAb GP21:56の実際の結合は固定
化MTLn3またはMTLy細胞に対するより約40％低かった。
胞および固定化細胞に対して同様であった。上記細胞系
に加えて親系MTLy（リンパ節転移部から得た非クローン
化細胞系）の使用もまた試験した。MTLyは高転移性であ
る。MAb GP21:56は種々の固定化した生13762NF細胞クロ
ーンに対し実質的に同じパターンの反応性を有したが、
しかし生細胞に対するMAb GP21:56の実際の結合は固定
化MTLn3またはMTLy細胞に対するより約40％低かった。
MAb GP21:56抗原の確認 rgp580に対するGP21:56の特異性を確認する証拠は13762
NFクローンおよび精製rgp580の細胞溶解物を含むSDSポ
リアクリルアミドゲルに対する125I標識アフイニテイー
精製GP21:56のイムノブロツテイングにより示された。
これらの試験においてGP21:56はrgp580として確認され
た高分子量成分に結合した。
NFクローンおよび精製rgp580の細胞溶解物を含むSDSポ
リアクリルアミドゲルに対する125I標識アフイニテイー
精製GP21:56のイムノブロツテイングにより示された。
これらの試験においてGP21:56はrgp580として確認され
た高分子量成分に結合した。
試験管内成長細胞系に結合するMAb GP21:56の特異性 MAb GP21:56の特異性を確認するためにこのMAbの結合を
ELISAを用いて多くの確認された細胞系に対して試験し
た。ラット、マウス、およびヒト由来の細胞系を使用
し、結果はGP21:56が13762NFラット乳腺癌のクローン化
細胞系に特異性を有した。非常にわずかの反応性が他の
培養ラット腫瘍細胞または正常線維芽細胞上に認めら
れ、また確認されたマウスまたはヒト乳腺腫瘍細胞また
はヒト黒色腫細胞系に対しGP21:56の極くわずかな結合
があった。しかし、非常に良好な反応性はGP21:56とヒ
ト腫瘍生検切片との間に、殊に乳房由来のヒト腫瘍との
間に認められた。さらに交差反応性は胎児ラット肺また
は肝線維芽細胞で観察されなかった。
ELISAを用いて多くの確認された細胞系に対して試験し
た。ラット、マウス、およびヒト由来の細胞系を使用
し、結果はGP21:56が13762NFラット乳腺癌のクローン化
細胞系に特異性を有した。非常にわずかの反応性が他の
培養ラット腫瘍細胞または正常線維芽細胞上に認めら
れ、また確認されたマウスまたはヒト乳腺腫瘍細胞また
はヒト黒色腫細胞系に対しGP21:56の極くわずかな結合
があった。しかし、非常に良好な反応性はGP21:56とヒ
ト腫瘍生検切片との間に、殊に乳房由来のヒト腫瘍との
間に認められた。さらに交差反応性は胎児ラット肺また
は肝線維芽細胞で観察されなかった。
MTLn3細胞に対するMAb GP21:56の飽和結合 MTLn3細胞上に発現されたrgp580抗原に対するGP21:56の
親和力は125I標識GP21:56の結合の会合および解離速度
論の測定により決定された。MAb 21:56はMTLn3細胞との
比較的低い会合速度を有し、約１時間が飽和結合に要し
た。MTLn3細胞に結合したGP21:56に対する初期解離速度
は遅く、1 1/2時間の検定中、非常にわずかに遊離し
た。これらのデータはGP21:56が細胞抗原に対して高親
和力を有さないが、しかし結合すると高い結合活性を有
することを示す。
親和力は125I標識GP21:56の結合の会合および解離速度
論の測定により決定された。MAb 21:56はMTLn3細胞との
比較的低い会合速度を有し、約１時間が飽和結合に要し
た。MTLn3細胞に結合したGP21:56に対する初期解離速度
は遅く、1 1/2時間の検定中、非常にわずかに遊離し
た。これらのデータはGP21:56が細胞抗原に対して高親
和力を有さないが、しかし結合すると高い結合活性を有
することを示す。
細胞に結合したMAb 21:56の変調 培養MTLn3細胞の表面からMAb GP21:56のクリアランス速
度は表面結合MAbの宿命の追跡により測定した。培養上
澄み（10μg/mlMAb）をMTLn3細胞とともに１時間インキ
ュベートし、細胞表面上に保持されるMAbを次いで125I
標識ヒツジ／ラットＦ（ab′）2で32時間まで種々の時
間定量した。試験管内でMTLn3細胞上の表面結合GP21:56
の半減期は24時間程度であると評価された。
度は表面結合MAbの宿命の追跡により測定した。培養上
澄み（10μg/mlMAb）をMTLn3細胞とともに１時間インキ
ュベートし、細胞表面上に保持されるMAbを次いで125I
標識ヒツジ／ラットＦ（ab′）2で32時間まで種々の時
間定量した。試験管内でMTLn3細胞上の表面結合GP21:56
の半減期は24時間程度であると評価された。
MAb GP21:56と組織切片中の13762NF腫瘍との反応性 現場成長腫瘍上のrgp580の分布の測定および同系F344ラ
ットのMAb GP21:56腫瘍組織の反応性を確認するため
に、結合したMAbの分布を調べた。106MTLn3、MTF7、MTL
n2またはMTPa細胞のs.c.注射から形成された腫瘍を23日
目にとり出し、凍結した。MAb反応性は免疫ペルオキシ
ダーゼ染色操作を用いて測定した。MAb GP21:56はMTLn3
細胞に広くしかし均一な結合を示した。MTLn3細胞がす
べて反応したのではないが、しかし一般に細胞の50％以
上がMAbと反応した。反応性の多くは細胞表面と、およ
び細胞外マトリックスと結合すると認められた。MTF7、
MTLn2およびMTPa腫瘍は非常に低割合のGP21:56反応性細
胞を有した。MTF7およびMTLn2腫瘍中の細胞の約20％がG
P21:56と反応性であっが、MTPa腫瘍は非常にわずかのGP
21:56反応性細胞を有した。試験した13762NFサブライン
のすべてにおいてGP21:56の局在化は不均一で主に細胞
表面と結合した。
ットのMAb GP21:56腫瘍組織の反応性を確認するため
に、結合したMAbの分布を調べた。106MTLn3、MTF7、MTL
n2またはMTPa細胞のs.c.注射から形成された腫瘍を23日
目にとり出し、凍結した。MAb反応性は免疫ペルオキシ
ダーゼ染色操作を用いて測定した。MAb GP21:56はMTLn3
細胞に広くしかし均一な結合を示した。MTLn3細胞がす
べて反応したのではないが、しかし一般に細胞の50％以
上がMAbと反応した。反応性の多くは細胞表面と、およ
び細胞外マトリックスと結合すると認められた。MTF7、
MTLn2およびMTPa腫瘍は非常に低割合のGP21:56反応性細
胞を有した。MTF7およびMTLn2腫瘍中の細胞の約20％がG
P21:56と反応性であっが、MTPa腫瘍は非常にわずかのGP
21:56反応性細胞を有した。試験した13762NFサブライン
のすべてにおいてGP21:56の局在化は不均一で主に細胞
表面と結合した。
実施例III:hgp580の分離および確認 rgp580の分離に用いたと同様の技術を用い、hgp580とし
て示されるrgp580と類似の特性を示すタンパク質をヒト
細胞源から確認し、分離した。この糖タンパク質はrgp5
80と生化学的に識別できるが、しかしhgp580は腫瘍関連
「標識」であり、ヒト腫瘍免疫診断試薬の開発に類似の
機能を有することが測定された。hgp580に対して作られ
た抗原調製物は一般にrgp580に対して調製されたものよ
りもヒト腫瘍免疫診断に好ましい。当業者はhgp580に用
いた技術とrgp580に記載した技術との間のわずかな変動
が、特に示さない限り重大な変動を意味しないことを認
めるであろう。
て示されるrgp580と類似の特性を示すタンパク質をヒト
細胞源から確認し、分離した。この糖タンパク質はrgp5
80と生化学的に識別できるが、しかしhgp580は腫瘍関連
「標識」であり、ヒト腫瘍免疫診断試薬の開発に類似の
機能を有することが測定された。hgp580に対して作られ
た抗原調製物は一般にrgp580に対して調製されたものよ
りもヒト腫瘍免疫診断に好ましい。当業者はhgp580に用
いた技術とrgp580に記載した技術との間のわずかな変動
が、特に示さない限り重大な変動を意味しないことを認
めるであろう。
a.hgp580の分離 組織および細胞 ラット13762NF細胞系およびクローンを10％ウシ胎児血
清を有し、抗体を有さないAMEM中で、実施例Ｉに記載し
たように増湿雰囲気中で37℃で成長させた。ヒト乳癌腫
瘍はデパートメント・オブ・パソロジー・エム・ディー
・アンダーソン・ホスピタル・アンド・ツモア・インス
テイチュート（Department of Pathology,M.D.Anderson
Hospital and Tumor Institute）から外科除去または
剖検後入手した。
清を有し、抗体を有さないAMEM中で、実施例Ｉに記載し
たように増湿雰囲気中で37℃で成長させた。ヒト乳癌腫
瘍はデパートメント・オブ・パソロジー・エム・ディー
・アンダーソン・ホスピタル・アンド・ツモア・インス
テイチュート（Department of Pathology,M.D.Anderson
Hospital and Tumor Institute）から外科除去または
剖検後入手した。
hgp580の分離 hgp580の精製に用いた１つの方法は基本的にrgp580の分
離に対して記載した方法に従う。簡単に記載すると、腫
瘍を細分し、プロテアーゼ阻害剤（5mM-EDTA、2mM−Ｌ
−トシルアミド２−フエニルエチルクロロメチルアルカ
リ、50mM6−アミノヘキサン酸、5mMフエニルメチルスル
ホニルフルオリド、5mMベンズアミジン−HClおよび10単
位/mlアプロチニン）を含む0.1M酢酸ナトリウム、pH6.
0、中の4Mグアニジン塩酸塩および４％ツビッタジエン
ト3-12（５容積毎組織湿量ｇ）で４℃において12時間抽
出した。抽出物をワットマン１濾紙により濾過し、次に
ツビッタジエントを除いた抽出緩衝液で平衡させたセフ
アデックスG-50カラム（50×4cm）上のゲル濾過にかけ
た。ボイド容量画分をプールし、塩化セシウムを加えた
（CsCl0.55g/g−溶液）。試料をベックマンTI50.2ロー
ター中で９℃で35,000rpmで48〜60時間遠心分離した。
次いで勾配を８等画分に分画し、その密度を測定した。
1.55〜1.45g/mlの密度を有する画分をプールし、0.1M酢
酸ナトリウム中の4Mグアニジン塩酸塩、pH5.8、と平衡
させた補正済セフアロースCL-2Bカラム（100×2cm）に
適用した。次いでボイド容量画分をプールし、透析し、
凍結乾燥した。次いで画分のアリコートを125Iおよびク
ロラミンＴでタンパク質に対して、または過ヨウ素酸塩
−〔3H〕ホウ水素化物でシアヌル酸に対して化学的に標
識した。
離に対して記載した方法に従う。簡単に記載すると、腫
瘍を細分し、プロテアーゼ阻害剤（5mM-EDTA、2mM−Ｌ
−トシルアミド２−フエニルエチルクロロメチルアルカ
リ、50mM6−アミノヘキサン酸、5mMフエニルメチルスル
ホニルフルオリド、5mMベンズアミジン−HClおよび10単
位/mlアプロチニン）を含む0.1M酢酸ナトリウム、pH6.
0、中の4Mグアニジン塩酸塩および４％ツビッタジエン
ト3-12（５容積毎組織湿量ｇ）で４℃において12時間抽
出した。抽出物をワットマン１濾紙により濾過し、次に
ツビッタジエントを除いた抽出緩衝液で平衡させたセフ
アデックスG-50カラム（50×4cm）上のゲル濾過にかけ
た。ボイド容量画分をプールし、塩化セシウムを加えた
（CsCl0.55g/g−溶液）。試料をベックマンTI50.2ロー
ター中で９℃で35,000rpmで48〜60時間遠心分離した。
次いで勾配を８等画分に分画し、その密度を測定した。
1.55〜1.45g/mlの密度を有する画分をプールし、0.1M酢
酸ナトリウム中の4Mグアニジン塩酸塩、pH5.8、と平衡
させた補正済セフアロースCL-2Bカラム（100×2cm）に
適用した。次いでボイド容量画分をプールし、透析し、
凍結乾燥した。次いで画分のアリコートを125Iおよびク
ロラミンＴでタンパク質に対して、または過ヨウ素酸塩
−〔3H〕ホウ水素化物でシアヌル酸に対して化学的に標
識した。
後の精製は8M尿素、0.2％トリトンX-100および50mMトリ
スHCl、pH6.8、で平衡させたセフアセルDEAEカラム（５
×1cm）上のイオン交換クロマトグラフィーにより行な
った。溶離は塩化ナトリウム勾配（０〜1M）で行ない、
次に高塩洗浄した（3M）。放射性プロフイルにより決定
した適当な画分を次にプールし、透析し、凍結乾燥し
た。
スHCl、pH6.8、で平衡させたセフアセルDEAEカラム（５
×1cm）上のイオン交換クロマトグラフィーにより行な
った。溶離は塩化ナトリウム勾配（０〜1M）で行ない、
次に高塩洗浄した（3M）。放射性プロフイルにより決定
した適当な画分を次にプールし、透析し、凍結乾燥し
た。
hgp580の分離に対する改良法 hgp580を分離する改良法において、腫瘍組織をPBS中で
洗浄し、次いで細分し、4MグアニジンHCl、１％ツビッ
タジエント3-12、0.1M酢酸ナトリウムの溶液、pH6.2、
中でプロテアーゼ阻害剤の存在下に抽出した。約18時間
の一夜抽出後、溶液を細メッシュナイロンフイルターに
通して濾過し、次いで8M尿素、5mM塩化ナトリウムおよ
び酢酸ナトリウム、pH7.0、で平衡させた調製用セフア
デックスG-50カラム（４×50cm）に適用した。ボイド容
量画分を捕集し、次いで0.2％CHAPSを含むことを除いて
同様の緩衝液中でDEAE−セフアセルカラムに適用した。
カラムを平衡緩衝液で洗浄し、次いで増加直線塩化ナト
リウム勾配で溶離した。種々のピーク画分をプールし、
8M尿素で３倍（V/V）に希釈し、DEAE−セフアセルカラ
ム（1ml）に適用した。次いで物質を少量の4Mグアニジ
ンCHlで溶離した。次いで溶出物を4MグアニジンHCl、0.
2％CHAPSおよび0.1M酢酸ナトリウム、pH5.8、中で補正
済セフアロースCL-2Bカラム（２×100cm）上でゲル濾過
クロマトグラフィーにかけた。ボイド容量画分をプール
し、精製hgp580に相当し、SDS−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動、次に銀染色により純度について検定する。
洗浄し、次いで細分し、4MグアニジンHCl、１％ツビッ
タジエント3-12、0.1M酢酸ナトリウムの溶液、pH6.2、
中でプロテアーゼ阻害剤の存在下に抽出した。約18時間
の一夜抽出後、溶液を細メッシュナイロンフイルターに
通して濾過し、次いで8M尿素、5mM塩化ナトリウムおよ
び酢酸ナトリウム、pH7.0、で平衡させた調製用セフア
デックスG-50カラム（４×50cm）に適用した。ボイド容
量画分を捕集し、次いで0.2％CHAPSを含むことを除いて
同様の緩衝液中でDEAE−セフアセルカラムに適用した。
カラムを平衡緩衝液で洗浄し、次いで増加直線塩化ナト
リウム勾配で溶離した。種々のピーク画分をプールし、
8M尿素で３倍（V/V）に希釈し、DEAE−セフアセルカラ
ム（1ml）に適用した。次いで物質を少量の4Mグアニジ
ンCHlで溶離した。次いで溶出物を4MグアニジンHCl、0.
2％CHAPSおよび0.1M酢酸ナトリウム、pH5.8、中で補正
済セフアロースCL-2Bカラム（２×100cm）上でゲル濾過
クロマトグラフィーにかけた。ボイド容量画分をプール
し、精製hgp580に相当し、SDS−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動、次に銀染色により純度について検定する。
b.hgp580の化学的確認 ドデシル硫酸ナトリウム中のポリアクリルアミドゲル電
気泳動（SDS-PAGE）によるhgp580の分析を２方法により
行なった。糖タンパク質検定のため、７％アクリルアミ
ドランニングゲルおよび３％アクリルアミドスタッキン
グゲルを用いてSDS-PAGEを行なった。ゲルを固定化し、
80℃で１時間50mM-H2SO4で処理して糖タンパク質を脱シ
アリル化し、次いで125I標識ピーナッツアグルチニンを
上に置き、洗浄し、乾燥した。糖タンパク質のポリアク
リルアミドゲル中への移行を達成するために直線勾配ゲ
ルを、架橋剤としてN,N−メチレンビスアクリルアミド
よりもむしろN,N−ジアリルタルタルジアミド（DATD）
とともに用いた。スタッキングゲルは２％DATDアクリル
アミドで構成した。125I標識物質を含むゲルを、強化ス
クリーンを有するコダックX-Omat ARフイルムを用いて
オートラジオグラフィーにかけた。3H標識試料を含むゲ
ルに対しては脱染色ゲルを乾燥前にエンハンス〔ニュー
・イングランド・ニユクリア（New Eng-land Nuclear,B
oston,MA）〕で処理し、次いでＸ線フイルムに暴露し
た。
気泳動（SDS-PAGE）によるhgp580の分析を２方法により
行なった。糖タンパク質検定のため、７％アクリルアミ
ドランニングゲルおよび３％アクリルアミドスタッキン
グゲルを用いてSDS-PAGEを行なった。ゲルを固定化し、
80℃で１時間50mM-H2SO4で処理して糖タンパク質を脱シ
アリル化し、次いで125I標識ピーナッツアグルチニンを
上に置き、洗浄し、乾燥した。糖タンパク質のポリアク
リルアミドゲル中への移行を達成するために直線勾配ゲ
ルを、架橋剤としてN,N−メチレンビスアクリルアミド
よりもむしろN,N−ジアリルタルタルジアミド（DATD）
とともに用いた。スタッキングゲルは２％DATDアクリル
アミドで構成した。125I標識物質を含むゲルを、強化ス
クリーンを有するコダックX-Omat ARフイルムを用いて
オートラジオグラフィーにかけた。3H標識試料を含むゲ
ルに対しては脱染色ゲルを乾燥前にエンハンス〔ニュー
・イングランド・ニユクリア（New Eng-land Nuclear,B
oston,MA）〕で処理し、次いでＸ線フイルムに暴露し
た。
rgp580およびhgp580に対する種々の分解性酵素の効果は
125I標識糖タンパク質をDPBS100ml中で37℃において１
時間インキュベートすることにより測定した。酵素検定
はトリプシン、ヘプシン、プロナーゼ、パパイン（1mM
−Ｂ−メルカプトエタノールで活性化）、キモトリプシ
ン、スブチロペプチダーゼＡ（１および10mg/ml）、コ
ンドロイチナーゼABC（１単位/ml）、ストレプトマイセ
スヒアルロニダーゼ（100TRU/ml）、コレラ菌（Vibrio
chlo-rea）ノイラミニダーゼ（10単位/ml）であった。
次いで試料および非処理対照を２〜17.5％DATDアクリル
アミドゲル上のSDS-PAGE分析にかけ、乾燥し、Ｘ線フイ
ルムに暴露した。生じたフイルムはゲル走査アクセサリ
を用いてベックマンDU-8上でデンシトメトリー的に走査
した。
125I標識糖タンパク質をDPBS100ml中で37℃において１
時間インキュベートすることにより測定した。酵素検定
はトリプシン、ヘプシン、プロナーゼ、パパイン（1mM
−Ｂ−メルカプトエタノールで活性化）、キモトリプシ
ン、スブチロペプチダーゼＡ（１および10mg/ml）、コ
ンドロイチナーゼABC（１単位/ml）、ストレプトマイセ
スヒアルロニダーゼ（100TRU/ml）、コレラ菌（Vibrio
chlo-rea）ノイラミニダーゼ（10単位/ml）であった。
次いで試料および非処理対照を２〜17.5％DATDアクリル
アミドゲル上のSDS-PAGE分析にかけ、乾燥し、Ｘ線フイ
ルムに暴露した。生じたフイルムはゲル走査アクセサリ
を用いてベックマンDU-8上でデンシトメトリー的に走査
した。
シアル酸部分は過ヨウ素酸塩−〔3H〕ホウ水素化物で化
学的に標識し、次いでＯ結合（セリンまたはトレオニン
に対する炭水化物の結合）オリゴ糖を1M-NaBH4中の50mM
-NaOHで、N2雰囲気下に24時間45℃で処理することによ
り遊離させた。反応は酢酸の添加により停止させ、試料
をダウエックス50（H+）カラムに通した。オリゴ糖を含
むシアル酸を、50mM酢酸ピリジニウム、pH5.3、で平衡
させたバイオゲルP6カラム中で分析した。
学的に標識し、次いでＯ結合（セリンまたはトレオニン
に対する炭水化物の結合）オリゴ糖を1M-NaBH4中の50mM
-NaOHで、N2雰囲気下に24時間45℃で処理することによ
り遊離させた。反応は酢酸の添加により停止させ、試料
をダウエックス50（H+）カラムに通した。オリゴ糖を含
むシアル酸を、50mM酢酸ピリジニウム、pH5.3、で平衡
させたバイオゲルP6カラム中で分析した。
rgp580およびhgp580のアミノ酸分析はノルロイシンを内
部標準といてLKBモデル401アミノ酸アナライザーで行な
った。試料は酸洗浄管中で凍結乾燥し、次いでGdnHClで
100℃で24時間加水分解した。
部標準といてLKBモデル401アミノ酸アナライザーで行な
った。試料は酸洗浄管中で凍結乾燥し、次いでGdnHClで
100℃で24時間加水分解した。
hgp580の比較確認の結果は表Ｖに示される。示されるよ
うにhgp580はrgp580と多くの生化学的特性を共有する。
しかし、両者はアミノ酸分析に基いて識別することがで
きる。表Ｖに示されるアミノ酸分析の結果は４試験の平
均を表わし、±10％以内で正確であると思われる。
うにhgp580はrgp580と多くの生化学的特性を共有する。
しかし、両者はアミノ酸分析に基いて識別することがで
きる。表Ｖに示されるアミノ酸分析の結果は４試験の平
均を表わし、±10％以内で正確であると思われる。
実施例IV:hgp580に対する単クローン生抗体の発生 ヒト腫瘍細胞に対して特異性を示す単クローン性抗体は
rgp580抗原調製物をrgp580抗原に対して前に記載したと
非常に類似する方法を用いて発生させた。好ましい態様
において、下記のようにhgp580を含む調製物で免疫処置
したラットの脾細胞を用いて脾細胞をラット骨髄腫細胞
系に融合させて発生させた。しかし、他の細胞系例えば
マウス／マウスハイブリッドはハイブリドーマの生成に
良好に用いることができる。hgp580に対してモノクロー
ナルを発生させる次の操作とrgp580に対して記載した操
作との間の変動は重大ではなく、ましろ改善方策を意味
する。
rgp580抗原調製物をrgp580抗原に対して前に記載したと
非常に類似する方法を用いて発生させた。好ましい態様
において、下記のようにhgp580を含む調製物で免疫処置
したラットの脾細胞を用いて脾細胞をラット骨髄腫細胞
系に融合させて発生させた。しかし、他の細胞系例えば
マウス／マウスハイブリッドはハイブリドーマの生成に
良好に用いることができる。hgp580に対してモノクロー
ナルを発生させる次の操作とrgp580に対して記載した操
作との間の変動は重大ではなく、ましろ改善方策を意味
する。
a.物質および方法 動物 近交８週令フイッシャー（F344/CDL）ラット（RT1′）
はハーランド・スプラグ・ドーレイ（Harland Sprague
Dawley,Houston,Texas）から供給された。ラットは標準
齧歯動物飼料および非塩素処理湧水を任意に与え、ジ・
ユニバシテイ・オブ・テキサス・システム・カンサー・
センター（the University of Texas System Cancer Ce
nter）およびインステイチュート・オブ・ラボラトリー
・アニマル・リゾーシス；ナショナル・リサーチ・カウ
ンシル（Institute of Laboratory Annimal Res-ource
s,National Research Council）により示された指針下
に保持した。
はハーランド・スプラグ・ドーレイ（Harland Sprague
Dawley,Houston,Texas）から供給された。ラットは標準
齧歯動物飼料および非塩素処理湧水を任意に与え、ジ・
ユニバシテイ・オブ・テキサス・システム・カンサー・
センター（the University of Texas System Cancer Ce
nter）およびインステイチュート・オブ・ラボラトリー
・アニマル・リゾーシス；ナショナル・リサーチ・カウ
ンシル（Institute of Laboratory Annimal Res-ource
s,National Research Council）により示された指針下
に保持した。
細胞および細胞系 ラット骨髄腫Y3Ag1.2.3（RT1v）をミルステイン（C.Mil
stein,MRC Laboratories,Cambridge,England）から入手
し、抗体を含まないダルベッコの変性イーグル培地（DM
EM）および20mMヘペス高グルコースプラス10％ウシ胎児
血清（FBS）〔ハイクローン（Hyclon,Logan,UT）〕中で
かくはん培養に維持した。
stein,MRC Laboratories,Cambridge,England）から入手
し、抗体を含まないダルベッコの変性イーグル培地（DM
EM）および20mMヘペス高グルコースプラス10％ウシ胎児
血清（FBS）〔ハイクローン（Hyclon,Logan,UT）〕中で
かくはん培養に維持した。
13762NFラット乳腺癌のクローン化サブライン（MTLn3、
MTLn2、MTF7、MTC）および非クローン化MTPaを得、前記
のように成長させた。全細胞系は普通にスクリーンし、
マイコプラズマおよびウイルス汚染のないことを認め
た。
MTLn2、MTF7、MTC）および非クローン化MTPaを得、前記
のように成長させた。全細胞系は普通にスクリーンし、
マイコプラズマおよびウイルス汚染のないことを認め
た。
他の細胞系はラット乳腺癌R32-30Ac（RT1′）、DMBA-1
（RT1′）、ラット乳腺癌MNU-F344-（RT1′）およびラ
ット線維芽肉腫CSE（RT1′）から作った。成および胎児
ラット線維芽細胞の短期培養を前記のように得た。ヒト
黒色腫系はフオグ（J.Fogh,Sloane Kettering Cancer C
enter,NY,NY）により供給され、MDA-436はカイロー（R.
Cailleau）から入手し、ヒト乳房脳転移部はデパートメ
ント・オブ・ノイロ・オンコロジー、エム・デイー・ア
ンダーソン・ホスピタル（Department of Neuro-oncolo
gy,M.D.Anderson Hospital,Houston,Texas）から入手し
た。
（RT1′）、ラット乳腺癌MNU-F344-（RT1′）およびラ
ット線維芽肉腫CSE（RT1′）から作った。成および胎児
ラット線維芽細胞の短期培養を前記のように得た。ヒト
黒色腫系はフオグ（J.Fogh,Sloane Kettering Cancer C
enter,NY,NY）により供給され、MDA-436はカイロー（R.
Cailleau）から入手し、ヒト乳房脳転移部はデパートメ
ント・オブ・ノイロ・オンコロジー、エム・デイー・ア
ンダーソン・ホスピタル（Department of Neuro-oncolo
gy,M.D.Anderson Hospital,Houston,Texas）から入手し
た。
ハイブリドーマ生成 ハイブリドーマは前にrgp580に対して記載したプロトコ
ルに従ってhgp580でi.d.免疫処置したラットの脾細胞を
用いて発生させた。脾細胞は細ゲージ網を通して培地5m
l中へ入れることにより調製した。細胞は２回血清を含
まない培地で洗浄し、生存率をトリパンブルー排除法に
より測定した。脾細胞（２×108）を108Y3Ag1.2.3ラッ
ト骨髄腫細胞と混合し、細胞混合物を500×ｇで５分間
遠心分離することによりペレットにした。ペレットをpH
7.2に調整したDMEM中の50％ポリエチレングリコール145
0〔ジェー・ティー・ベーカー・ケミカル社（J.T.Baker
Chemical Co.,Phill-ipsburg,NJ）2mlの１分間にわた
る添加により穏やかに再懸濁した。融合混合物をさらに
１分間振り動かし、DMEM8mlで希釈し、500×ｇで５分間
遠心分離した。細胞を20％FBS、10-4Ｍヒポキサンチン
〔シグマ（Sigma）〕、４×10-7Ｍアミノプテリン〔シ
グマ（Sigma）〕および1.6×10-5Ｍチミジンを含むDMEM
〔HA培地：シグマ（Sigma）〕200ml中に再び懸濁させ
た。アリコート（1ml）を、24時間前に２×104照射（30
Gy、ガンマ線照射）ラット線維芽細胞／ウエルで接種し
たコスター24ウエルプレート〔コスター（Costar,Cambr
idge,MA）〕中へ分散させた。標準培養条件で37℃で24
時間インキュベートした後、HAT培地1mlを加えた。融合
はハイブリッドの存在についてスクリーニングする前に
上記条件下に７〜14日間インキュベートした。
ルに従ってhgp580でi.d.免疫処置したラットの脾細胞を
用いて発生させた。脾細胞は細ゲージ網を通して培地5m
l中へ入れることにより調製した。細胞は２回血清を含
まない培地で洗浄し、生存率をトリパンブルー排除法に
より測定した。脾細胞（２×108）を108Y3Ag1.2.3ラッ
ト骨髄腫細胞と混合し、細胞混合物を500×ｇで５分間
遠心分離することによりペレットにした。ペレットをpH
7.2に調整したDMEM中の50％ポリエチレングリコール145
0〔ジェー・ティー・ベーカー・ケミカル社（J.T.Baker
Chemical Co.,Phill-ipsburg,NJ）2mlの１分間にわた
る添加により穏やかに再懸濁した。融合混合物をさらに
１分間振り動かし、DMEM8mlで希釈し、500×ｇで５分間
遠心分離した。細胞を20％FBS、10-4Ｍヒポキサンチン
〔シグマ（Sigma）〕、４×10-7Ｍアミノプテリン〔シ
グマ（Sigma）〕および1.6×10-5Ｍチミジンを含むDMEM
〔HA培地：シグマ（Sigma）〕200ml中に再び懸濁させ
た。アリコート（1ml）を、24時間前に２×104照射（30
Gy、ガンマ線照射）ラット線維芽細胞／ウエルで接種し
たコスター24ウエルプレート〔コスター（Costar,Cambr
idge,MA）〕中へ分散させた。標準培養条件で37℃で24
時間インキュベートした後、HAT培地1mlを加えた。融合
はハイブリッドの存在についてスクリーニングする前に
上記条件下に７〜14日間インキュベートした。
特異性抗体に対するスクリーニング ハイブリドーマは次のようにELISA検定を用いて特異性
抗体の生成について試験した。hgp580に対する抗体につ
いて試験するため、精製抗体を音波処理し、次いでイム
ノテク−１プレート〔50μl/ウエル;A/Sヌンク（A/S Nu
nc,Kamstrap,Denmark）〕上で一夜固定化した。プレー
トをダルベツコのリン酸塩緩衝食塩水（DPBS）で３回お
よびPBSプラス１％ウシ血清アルブミン（BSA）で１回１
時間洗浄した。プレートは必要になるまでBSA含有緩衝
液中に−20℃で貯蔵した。ハイブリドーマ培養上澄みの
試料（50μl/ウエル）をhgp580とともに室温で１時間イ
ンキュベートした。
抗体の生成について試験した。hgp580に対する抗体につ
いて試験するため、精製抗体を音波処理し、次いでイム
ノテク−１プレート〔50μl/ウエル;A/Sヌンク（A/S Nu
nc,Kamstrap,Denmark）〕上で一夜固定化した。プレー
トをダルベツコのリン酸塩緩衝食塩水（DPBS）で３回お
よびPBSプラス１％ウシ血清アルブミン（BSA）で１回１
時間洗浄した。プレートは必要になるまでBSA含有緩衝
液中に−20℃で貯蔵した。ハイブリドーマ培養上澄みの
試料（50μl/ウエル）をhgp580とともに室温で１時間イ
ンキュベートした。
プレートをPBSプラス0.05％BSAで３回洗浄した。PBSプ
ラス１％BSA中に1/1000に希釈したビオチニル化ヤギ／
ラットIgG〔ベクター・ラボラトリーズ（Vector Labs.,
Burlingame,CA）〕を加え（50μl/ウエル）、細胞とと
もに25℃で１時間インキュベートした。プレートを３回
洗浄し、次にPBSプラス１％BSA中に1/1000に希釈したス
トレプタビジン架橋剤〔ベセスダ・リサーチ・ラボラト
リーズ社（Bethe-sda Research Laboratories,Inc.,Gai
thersburg MD）〕（50μl/ウエル）を各ウエルに加え、
25℃で45分間インキュベートした。プレートをPBSプラ
ス0.05％BSAで６回洗浄し、結合した抗体を、0.012％過
酸化水素を加えた0.1Mクエン酸塩緩衝液に溶解したｏ−
フエニレンジアミン（1mg/ml）pH4.5（100μl/ウエル）
を用いて定量した。暗所で15分間インキュベートした後
450nmにおける吸光度をタイタテク・マルチスキヤナー
〔フロー・ラボラトリーズ（Flow Labora-tories）〕を
用いて測定した。全検定において、Y3Ag1.2.3培地上澄
みを陰性対照として用いた。上澄みがバックグラウンド
上の２標準偏差に等しいかまたはそれより大きい吸光度
を有すればそれが陽性であるとみなした。陽性ウエルか
らのハイブリドーマを、照射ラット線維芽細胞を供給細
胞として用いる限界希釈により２回クローン化した。
ラス１％BSA中に1/1000に希釈したビオチニル化ヤギ／
ラットIgG〔ベクター・ラボラトリーズ（Vector Labs.,
Burlingame,CA）〕を加え（50μl/ウエル）、細胞とと
もに25℃で１時間インキュベートした。プレートを３回
洗浄し、次にPBSプラス１％BSA中に1/1000に希釈したス
トレプタビジン架橋剤〔ベセスダ・リサーチ・ラボラト
リーズ社（Bethe-sda Research Laboratories,Inc.,Gai
thersburg MD）〕（50μl/ウエル）を各ウエルに加え、
25℃で45分間インキュベートした。プレートをPBSプラ
ス0.05％BSAで６回洗浄し、結合した抗体を、0.012％過
酸化水素を加えた0.1Mクエン酸塩緩衝液に溶解したｏ−
フエニレンジアミン（1mg/ml）pH4.5（100μl/ウエル）
を用いて定量した。暗所で15分間インキュベートした後
450nmにおける吸光度をタイタテク・マルチスキヤナー
〔フロー・ラボラトリーズ（Flow Labora-tories）〕を
用いて測定した。全検定において、Y3Ag1.2.3培地上澄
みを陰性対照として用いた。上澄みがバックグラウンド
上の２標準偏差に等しいかまたはそれより大きい吸光度
を有すればそれが陽性であるとみなした。陽性ウエルか
らのハイブリドーマを、照射ラット線維芽細胞を供給細
胞として用いる限界希釈により２回クローン化した。
他の免疫検定はラットＦ（ab′）２に対する125I標識ア
フイニテイー精製抗体〔ディーン（Dr.C.J.Dean,Cheste
r Beatty Research Institute,sutt-on,Surry,Englan
d）を用いた。単クローン性抗体の50μｌ希釈液を生細
胞の単層とともに４℃で１時間、または96ウエルマイク
ロテストプレート上で集密に成長した固定化細胞ととも
に25℃でインキュベートした。結合した単クローン性抗
体を十分洗浄した後125I標識ヒツジ／ラットＦ（ab′）
２５×105cpm/ウエルとともに１時間４℃（生細胞）ま
たは25℃（固定化細胞）でインキュベートすることによ
り定量した。細胞を培地で洗浄し、2N-NaOH200mlで洗浄
した。放射能をベックマンモデル8,000ガンマカウンタ
ー中の計数により測定した。
フイニテイー精製抗体〔ディーン（Dr.C.J.Dean,Cheste
r Beatty Research Institute,sutt-on,Surry,Englan
d）を用いた。単クローン性抗体の50μｌ希釈液を生細
胞の単層とともに４℃で１時間、または96ウエルマイク
ロテストプレート上で集密に成長した固定化細胞ととも
に25℃でインキュベートした。結合した単クローン性抗
体を十分洗浄した後125I標識ヒツジ／ラットＦ（ab′）
２５×105cpm/ウエルとともに１時間４℃（生細胞）ま
たは25℃（固定化細胞）でインキュベートすることによ
り定量した。細胞を培地で洗浄し、2N-NaOH200mlで洗浄
した。放射能をベックマンモデル8,000ガンマカウンタ
ー中の計数により測定した。
単クローン性抗体の精製および放射性標識 単クローン性抗体は、硫酸アンモニウム（40％飽和）沈
殿により濃縮した後培養上澄みからアフイニテイークロ
マトグラフイーにより分離した。抗ラットＫ鎖MAb、マ
ーク１〔ベイジン（H.Bazin,Brussels,Belgium）〕をア
フイゲル−10（タンパク質10mg/mlビーズ）に製造業者
の使用説明書を用いて結合させ、陽性単クローン性抗体
の精製に用いた。吸着カラムからの単クローン性抗体の
溶離は3Mチオシアン酸カリウムで行ない、画分（1ml）
を捕集し、直ちに0.1Mヘペス緩衝液、pH8.0、で中和し
た。単クローン性抗体はドデシル硫酸ナトリウム中のポ
リアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）により純度
について検定し、必要なときに125ヨウ素〔ICNフアルマ
シューテイカル社（ICN Pharmaceutical Inc.,Irvine,C
A）〕でクロラミンＴ法で約２μCi/μｇの比活性に放射
性標識した。
殿により濃縮した後培養上澄みからアフイニテイークロ
マトグラフイーにより分離した。抗ラットＫ鎖MAb、マ
ーク１〔ベイジン（H.Bazin,Brussels,Belgium）〕をア
フイゲル−10（タンパク質10mg/mlビーズ）に製造業者
の使用説明書を用いて結合させ、陽性単クローン性抗体
の精製に用いた。吸着カラムからの単クローン性抗体の
溶離は3Mチオシアン酸カリウムで行ない、画分（1ml）
を捕集し、直ちに0.1Mヘペス緩衝液、pH8.0、で中和し
た。単クローン性抗体はドデシル硫酸ナトリウム中のポ
リアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）により純度
について検定し、必要なときに125ヨウ素〔ICNフアルマ
シューテイカル社（ICN Pharmaceutical Inc.,Irvine,C
A）〕でクロラミンＴ法で約２μCi/μｇの比活性に放射
性標識した。
イムノブロテイング イムノブロットは実質的にトウビン（Towbin）ほか（19
79）、P.N.A.S.,76:4350の方法により、既に記載した変
形を用いて行なった。タンパク質は２〜17.5％DATD架
橋、変性ポリアクリルアミド勾配ゲルから一夜ニトロセ
ルロース紙に50ボルト、0.29アンペアで電気泳動的に移
した。抗原は製造業者の使用説明書〔ベクター・ラボラ
トリーズ（Vector Labs.,San Francisco,CA）〕により
ベクタスタインアルカリ性ホスフアターゼ操作を用いて
検出した。
79）、P.N.A.S.,76:4350の方法により、既に記載した変
形を用いて行なった。タンパク質は２〜17.5％DATD架
橋、変性ポリアクリルアミド勾配ゲルから一夜ニトロセ
ルロース紙に50ボルト、0.29アンペアで電気泳動的に移
した。抗原は製造業者の使用説明書〔ベクター・ラボラ
トリーズ（Vector Labs.,San Francisco,CA）〕により
ベクタスタインアルカリ性ホスフアターゼ操作を用いて
検出した。
免疫ペルオキシダーゼ操作 組織試料（ヒトおよびラット）は液体N2中で素早く凍結
し、必要になるまで−20℃で貯蔵した。４μｍクリオス
タット切片を免疫ペルオキシダーゼ染色操作に用いた。
従ったプロトコルは基質として0.02％過酸化水素で1:1
に希釈したジアミノベンジン（1mg/ml）トリス−HCl
中、pH7.2）を有するベクタスタインABC抗ラットIgG操
作〔ベクタ・ラボラトリーズ（Vector Laboratories,Sa
n Francisco CA）〕であった。
し、必要になるまで−20℃で貯蔵した。４μｍクリオス
タット切片を免疫ペルオキシダーゼ染色操作に用いた。
従ったプロトコルは基質として0.02％過酸化水素で1:1
に希釈したジアミノベンジン（1mg/ml）トリス−HCl
中、pH7.2）を有するベクタスタインABC抗ラットIgG操
作〔ベクタ・ラボラトリーズ（Vector Laboratories,Sa
n Francisco CA）〕であった。
b.例示抗ヒトgp580単クローン性抗体 表VIはrgp580またはhgp580に対して発生させ、hgp580抗
原に対して免疫活性を示す陽性ハイブリドーマクローン
の試料を示す。抗体生成の高い力価に基き、クローンHG
R1:69を抗体確認研究に選択した。
原に対して免疫活性を示す陽性ハイブリドーマクローン
の試料を示す。抗体生成の高い力価に基き、クローンHG
R1:69を抗体確認研究に選択した。
ハイブリドーマクローンHGR1:69（ATCC寄託第HB9041
号）およびGP21:56（ATCC寄託第HB9042号）はアメリカ
ン・タイプ・カルチャ・コレクション（Ammerican Type
Culture Collection）に1985年３月20日にブタベスト
条約に基いて寄託した。
号）およびGP21:56（ATCC寄託第HB9042号）はアメリカ
ン・タイプ・カルチャ・コレクション（Ammerican Type
Culture Collection）に1985年３月20日にブタベスト
条約に基いて寄託した。
実施例V:ヒト腫瘍の検出 前記操作により生じた単クローン性抗体を予想ヒト腫瘍
の確認および検出に対する検定プロトコルに良好に利用
することができる。一般に免疫診断プロトコルは当業者
によく知られている。本発明のこれらの単クローン性抗
体免疫検出系は便宜に種々の試料型中の腫瘍細胞の検出
に適用できる。例えば、腫瘍抗原hgp580の存在は水性試
料例えば血液、尿、汗、血清、血漿、複数の浸出液また
は腹水液中で検出でき、一般に知られた多くの免疫検定
技術例えば放射免疫検定（「RIA」）および酵素結合免
疫収着検定（「ELISA」）、の１つにより行なうことが
できる。あるいは、固体組織例えば組織生検中に存在す
る腫瘍細胞を、よく知られた免疫組織検定を用いて検出
することができる。
の確認および検出に対する検定プロトコルに良好に利用
することができる。一般に免疫診断プロトコルは当業者
によく知られている。本発明のこれらの単クローン性抗
体免疫検出系は便宜に種々の試料型中の腫瘍細胞の検出
に適用できる。例えば、腫瘍抗原hgp580の存在は水性試
料例えば血液、尿、汗、血清、血漿、複数の浸出液また
は腹水液中で検出でき、一般に知られた多くの免疫検定
技術例えば放射免疫検定（「RIA」）および酵素結合免
疫収着検定（「ELISA」）、の１つにより行なうことが
できる。あるいは、固体組織例えば組織生検中に存在す
る腫瘍細胞を、よく知られた免疫組織検定を用いて検出
することができる。
a.水性試料中のgp580の定量および検出に対する提案固
相放射免疫検定 循環hgp580の存在が患者の体中のどこかの腫瘍の存在あ
るいは化学療法の進行または再発の発症を追跡する診断
手段として有用な診断指標であることを証明できる。次
のプロトコルは水性試料中の循環hgp580抗原の検出およ
び定量に本発明の単クローン性抗体を利用する示唆方法
である。
相放射免疫検定 循環hgp580の存在が患者の体中のどこかの腫瘍の存在あ
るいは化学療法の進行または再発の発症を追跡する診断
手段として有用な診断指標であることを証明できる。次
のプロトコルは水性試料中の循環hgp580抗原の検出およ
び定量に本発明の単クローン性抗体を利用する示唆方法
である。
水性試料検定の好ましい態様はhgp580抗原の定量化に対
する標準放射免疫検定法を利用する。簡単に記載する
と、製造業者の使用説明書に従いアフイニテイー精製単
クローン性抗体をアフイ・ゲル10（20mgのタンパク質を
有するアフイ−ゲル10、1ml）に結合させることにより
イムノビーズ（immunobeads）を調製する。このように
調製したイムノビーズを用いて初めに所与試料アリコー
ト中に存在するhgp580のすべてを結合させる。
する標準放射免疫検定法を利用する。簡単に記載する
と、製造業者の使用説明書に従いアフイニテイー精製単
クローン性抗体をアフイ・ゲル10（20mgのタンパク質を
有するアフイ−ゲル10、1ml）に結合させることにより
イムノビーズ（immunobeads）を調製する。このように
調製したイムノビーズを用いて初めに所与試料アリコー
ト中に存在するhgp580のすべてを結合させる。
試料アリコートのhgp580のこの初期結合を行なうために
キムノビーズ（10μｌ充填カラム）をRIA緩衝液（0.5％
ウシ血清アルブミン、0.19％トリトンX-100、0.02％ア
ジ化物、DPBS中、pH7.4）100ml、標準抗原希釈液（また
は水性試料例えば患者の血清試料）、正常ヒト血清100
μｌおよびプロテアーゼ阻害剤と1.5mlポリスチレン管
中で混合する。結合は４℃で一夜管を回転し、次いで抗
原装填免疫ビーズをRIA緩衝液で６回洗浄することによ
り終らせる。
キムノビーズ（10μｌ充填カラム）をRIA緩衝液（0.5％
ウシ血清アルブミン、0.19％トリトンX-100、0.02％ア
ジ化物、DPBS中、pH7.4）100ml、標準抗原希釈液（また
は水性試料例えば患者の血清試料）、正常ヒト血清100
μｌおよびプロテアーゼ阻害剤と1.5mlポリスチレン管
中で混合する。結合は４℃で一夜管を回転し、次いで抗
原装填免疫ビーズをRIA緩衝液で６回洗浄することによ
り終らせる。
イムノビーズにより結合されたhgp580の量を、次いでビ
オチニル化単クローン性抗体製造および放射性標識スト
レプタビジンを利用しアビジン／ビオチン反応を利用し
て定量することができる。簡単に記載すれば、単クロー
ン性抗体（0.1Mヘペス、pH8.0中1mg/ml）と無水DMSO中
の1mg/mlD−ビオチンＮ−ヒドロキシルスクシンイミド
エステル（「NHS−ビオチン」）とを1:8（v/v）のNHS−
ビオチン：単クローン性抗体比で０℃で４時間反応させ
ることによりビオチニル化単クローン性抗体を調製す
る。ビオチニル化が終った後、ビオチニル抗体をセント
リフリー・マイクロパーテイション装置（Centrifree M
icropartition Unit）およびYM-30膜による限外濾過に
よりNHSおよび非結合ビオチンを含まなくすることがで
きる。有用な洗浄緩衝液は100mMヘペスおよび0.05％ア
ジ化物、pH8.0、である。
オチニル化単クローン性抗体製造および放射性標識スト
レプタビジンを利用しアビジン／ビオチン反応を利用し
て定量することができる。簡単に記載すれば、単クロー
ン性抗体（0.1Mヘペス、pH8.0中1mg/ml）と無水DMSO中
の1mg/mlD−ビオチンＮ−ヒドロキシルスクシンイミド
エステル（「NHS−ビオチン」）とを1:8（v/v）のNHS−
ビオチン：単クローン性抗体比で０℃で４時間反応させ
ることによりビオチニル化単クローン性抗体を調製す
る。ビオチニル化が終った後、ビオチニル抗体をセント
リフリー・マイクロパーテイション装置（Centrifree M
icropartition Unit）およびYM-30膜による限外濾過に
よりNHSおよび非結合ビオチンを含まなくすることがで
きる。有用な洗浄緩衝液は100mMヘペスおよび0.05％ア
ジ化物、pH8.0、である。
ビオチニル化抗体10μｇを抗原装填し洗浄したイムノビ
ーズに加え、室温で４時間インキュベートする。次いで
イムノビーズをRIA緩衝液で６回洗浄し、さらに125Iス
トレプタビジン５μｇとともに４時間インキュベート
し、RIA緩衝液で６回洗浄し、結合した放射能をオート
ガンマカウンター中で測定する。ストレプタビジンのヨ
ウ素化はクロラミン−Ｔ法により便宜に行なうことがで
きる。既知抗原濃度で生じた標準曲線と患者試料で生じ
たものとを比較することにより患者試料中に存在するhg
p580の濃度を決定することができる。
ーズに加え、室温で４時間インキュベートする。次いで
イムノビーズをRIA緩衝液で６回洗浄し、さらに125Iス
トレプタビジン５μｇとともに４時間インキュベート
し、RIA緩衝液で６回洗浄し、結合した放射能をオート
ガンマカウンター中で測定する。ストレプタビジンのヨ
ウ素化はクロラミン−Ｔ法により便宜に行なうことがで
きる。既知抗原濃度で生じた標準曲線と患者試料で生じ
たものとを比較することにより患者試料中に存在するhg
p580の濃度を決定することができる。
b.ヒト組織生検上のhgp580抗原の検出 本発明の単クローン性抗体はまたヒト組織生検中の腫瘍
細胞の存在の検定に良好に利用できる。好ましい態様に
おいて、腫瘍組織試料を液体窒素中で凍結し、必要にな
るまで−20℃で気密容器中に貯蔵する。好ましくは厚さ
約４μｍのクリオスタット切片を全免疫組織学検定に使
用する。好ましい検定プロトコルは酵素標識として西洋
ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリ性ホスフアター
ゼを用いてベクタスタインABC抗ラットIgGまたは抗マウ
スIgG操作に用い、その両者は当業者によく知られてい
る。
細胞の存在の検定に良好に利用できる。好ましい態様に
おいて、腫瘍組織試料を液体窒素中で凍結し、必要にな
るまで−20℃で気密容器中に貯蔵する。好ましくは厚さ
約４μｍのクリオスタット切片を全免疫組織学検定に使
用する。好ましい検定プロトコルは酵素標識として西洋
ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリ性ホスフアター
ゼを用いてベクタスタインABC抗ラットIgGまたは抗マウ
スIgG操作に用い、その両者は当業者によく知られてい
る。
簡単に記載すれば、組織切片をアセトン中で固定化し、
内因性酵素活性をメタノール中の0.3％H2O2（ペルオキ
シダーゼ染色に対し）、または20％酢酸（ホスフアター
ゼ染色に対し）を用いて阻害する。抗体（上澄み、腹水
またはアフイニティー精製物）をスライド上に層化し、
１時間インキュベートし、洗浄し、組織を製造者の使用
指示書に従ってビオチニル化抗ラット（またはマウス）
IgGとともに30分間インキュベートする。次にアビジン
−酵素複合体を緩衝液で十分洗浄した後スライド上に層
化し、組織とともに１時間インキュベートする。このと
き適当な酵素基質が調製される。組織を洗浄し、酵素と
ともに５〜30分間インキュベートし、洗浄し、メイヤー
（Mayer）のヘマトキシリンで対比染色する。生検組織
中の腫瘍細胞の存在はスライド上で顕微鏡で観察できる
陽性酵素反応の出現により示される。
内因性酵素活性をメタノール中の0.3％H2O2（ペルオキ
シダーゼ染色に対し）、または20％酢酸（ホスフアター
ゼ染色に対し）を用いて阻害する。抗体（上澄み、腹水
またはアフイニティー精製物）をスライド上に層化し、
１時間インキュベートし、洗浄し、組織を製造者の使用
指示書に従ってビオチニル化抗ラット（またはマウス）
IgGとともに30分間インキュベートする。次にアビジン
−酵素複合体を緩衝液で十分洗浄した後スライド上に層
化し、組織とともに１時間インキュベートする。このと
き適当な酵素基質が調製される。組織を洗浄し、酵素と
ともに５〜30分間インキュベートし、洗浄し、メイヤー
（Mayer）のヘマトキシリンで対比染色する。生検組織
中の腫瘍細胞の存在はスライド上で顕微鏡で観察できる
陽性酵素反応の出現により示される。
表VIIはrgp580に対して生じた代表的な単クローン性抗
体（GP21:56）またはhgp580に対して生じたもの（HGR1:
69）を用いて上記方法で種々の組織試料をスクリーニン
グすることから得られた結果を示す。ラットまたはヒト
抗原に対して調製された抗体がヒト腫瘍の確認に等しく
よく機能すると思われる。さらにこれらの単クローン性
抗体が乳房起始の腫瘍、殊に乳房組織起始を有する転移
腫瘍に対する優先を示すことが当業者に認められよう。
体（GP21:56）またはhgp580に対して生じたもの（HGR1:
69）を用いて上記方法で種々の組織試料をスクリーニン
グすることから得られた結果を示す。ラットまたはヒト
抗原に対して調製された抗体がヒト腫瘍の確認に等しく
よく機能すると思われる。さらにこれらの単クローン性
抗体が乳房起始の腫瘍、殊に乳房組織起始を有する転移
腫瘍に対する優先を示すことが当業者に認められよう。
実施例VI:腫瘍転移増殖および転移の阻害剤としてのgp5
80に対する抗体 ラット腫瘍検定を、腫瘍細胞の肺転移増殖および自然転
移の予防または抑制における本発明の単クローン性抗体
の効果を示すために工夫した。１検定において、106MTL
n3細胞を各ラットの乳房脂肪パッド中へ皮下注射する24
時間前に、アフイニテイー精製GP21:56をメトファン麻
酔ラットの前頚静脈中へ静脈内注射した（100μg/ラッ
ト）。腫瘍細胞の注射と同時に各ラットに前頚静脈中へ
追加100μｇを静脈内に与えた。
80に対する抗体 ラット腫瘍検定を、腫瘍細胞の肺転移増殖および自然転
移の予防または抑制における本発明の単クローン性抗体
の効果を示すために工夫した。１検定において、106MTL
n3細胞を各ラットの乳房脂肪パッド中へ皮下注射する24
時間前に、アフイニテイー精製GP21:56をメトファン麻
酔ラットの前頚静脈中へ静脈内注射した（100μg/ラッ
ト）。腫瘍細胞の注射と同時に各ラットに前頚静脈中へ
追加100μｇを静脈内に与えた。
腫瘍は試験管内で30日間成長させ、その間に抗体を50μ
g/ラットの濃度で週３回静脈内投与した。30日後動物を
メトファンの吸入により殺し、肺、鼠径および腰リンパ
節、腎臓、胸腺中の明らかな転移の存在に対して顕微鏡
で調べた。gp580と交差反応しない抗体を対照群に用い
た。
g/ラットの濃度で週３回静脈内投与した。30日後動物を
メトファンの吸入により殺し、肺、鼠径および腰リンパ
節、腎臓、胸腺中の明らかな転移の存在に対して顕微鏡
で調べた。gp580と交差反応しない抗体を対照群に用い
た。
表VIII中の結果により示されるように、腫瘍関連タンパ
ク質gp580を指向する抗体が自然転移の発生を著しく低
下した。類似の研究において、注入腫瘍細胞による肺転
移増殖を防ぐ抗体の能力を試験した。F344ラットをメト
ファン吸入により麻酔し、アフイニテイー精製MAb 50μ
ｇを各ラットの前頚静脈に静脈内注射した。MAbの注射
直後、５×104MTLn3細胞を前頚静脈中へi.v.注射した。
23〜30日後動物を殺し、各動物を明らかな転移について
調べた。各動物の肺中に存在する腫瘍の量を各肺中の生
腫瘍コロニーの数の計数により測定した。適当な非反応
性MAbを対照として用いた。単クローン性抗体MT10:21は
gp580と反応しない単クローン性抗体である。しかし、
この抗体は他の転移関連抗原と反応できると思われる。
ク質gp580を指向する抗体が自然転移の発生を著しく低
下した。類似の研究において、注入腫瘍細胞による肺転
移増殖を防ぐ抗体の能力を試験した。F344ラットをメト
ファン吸入により麻酔し、アフイニテイー精製MAb 50μ
ｇを各ラットの前頚静脈に静脈内注射した。MAbの注射
直後、５×104MTLn3細胞を前頚静脈中へi.v.注射した。
23〜30日後動物を殺し、各動物を明らかな転移について
調べた。各動物の肺中に存在する腫瘍の量を各肺中の生
腫瘍コロニーの数の計数により測定した。適当な非反応
性MAbを対照として用いた。単クローン性抗体MT10:21は
gp580と反応しない単クローン性抗体である。しかし、
この抗体は他の転移関連抗原と反応できると思われる。
表IXに示されるデータはまた自然転移、殊に肺に対する
もの、の低下に潜在的に有用性を示す。そのような所見
はさらに、そのような抗体は、例えば若干の腫瘍学者が
転移腫瘍の転位を促進すると感知している癌外科に対す
るアジュバントとして利用する可能性を高める。さら
に、そのような抗体およびgp580抗原は転移の予防に対
する免疫処置プロトコルの開発を生ずる。
もの、の低下に潜在的に有用性を示す。そのような所見
はさらに、そのような抗体は、例えば若干の腫瘍学者が
転移腫瘍の転位を促進すると感知している癌外科に対す
るアジュバントとして利用する可能性を高める。さら
に、そのような抗体およびgp580抗原は転移の予防に対
する免疫処置プロトコルの開発を生ずる。
本発明は特定態様に関して記載されているけれども、当
業者は利用技術が一般に多くの変形および態様を有する
よく知られた方法であることを理解しよう。適当な変更
は当業者に明らかであろう。例えば、本単クーロン性抗
体が主にラット／ラットハイブリッドに関して記載され
ているけれども、マウス／マウスハイブリッドが表VIに
示されるように同様に適当である。同様に、熟練分子生
物学者およびタンパク質生化学者は開示されたタンパク
質分離技術において多くの変形をgp580の良好な分離に
利用できることを認めるであろう。そのような変形はす
べて本発明および特許請求の範囲内にあると考えられ
る。
業者は利用技術が一般に多くの変形および態様を有する
よく知られた方法であることを理解しよう。適当な変更
は当業者に明らかであろう。例えば、本単クーロン性抗
体が主にラット／ラットハイブリッドに関して記載され
ているけれども、マウス／マウスハイブリッドが表VIに
示されるように同様に適当である。同様に、熟練分子生
物学者およびタンパク質生化学者は開示されたタンパク
質分離技術において多くの変形をgp580の良好な分離に
利用できることを認めるであろう。そのような変形はす
べて本発明および特許請求の範囲内にあると考えられ
る。
【図面の簡単な説明】 第１図はrgp580の分離に用いる操作の略線図であり、 第２図は解離性CsCl密度勾配超遠心分離後のMTLn3細胞
により合成された放射性標識巨大分子のゲル濾過を示す
グラフであり、第2A図はグルコサミン標識（−）および
〔35S〕硫酸塩標識〔‐‐‐〕、第2B図は〔3H〕セリ
ン、標識抽出物である。 第３図はセフアロースCL-2B溶離からの代謝的に放射性
標識し、プールしたボイド容量画分のDEAEセフアセルカ
ラム上のイオン交換クロマトグラフィーの溶出プロフイ
ルであり、 第4A図はラット腫瘍抽出物密度勾配画分のDEAEセフアセ
ル溶出プロフイルであり、第4B図は第4A図のピークＩ〜
IVのオートラジオグラムである。 第５図は固定化（ハッチ付）および非固定化（空バー）
生13762NF腺癌細胞に対するMAb GP21:56の結合を示すグ
ラフであり、 第６図は放射性標識し精製した画分のSDS-PAGEであっ
て、第6A図は〔3H〕グルコサミン標識、第6B図は
〔14C〕セリン標識である。
により合成された放射性標識巨大分子のゲル濾過を示す
グラフであり、第2A図はグルコサミン標識（−）および
〔35S〕硫酸塩標識〔‐‐‐〕、第2B図は〔3H〕セリ
ン、標識抽出物である。 第３図はセフアロースCL-2B溶離からの代謝的に放射性
標識し、プールしたボイド容量画分のDEAEセフアセルカ
ラム上のイオン交換クロマトグラフィーの溶出プロフイ
ルであり、 第4A図はラット腫瘍抽出物密度勾配画分のDEAEセフアセ
ル溶出プロフイルであり、第4B図は第4A図のピークＩ〜
IVのオートラジオグラムである。 第５図は固定化（ハッチ付）および非固定化（空バー）
生13762NF腺癌細胞に対するMAb GP21:56の結合を示すグ
ラフであり、 第６図は放射性標識し精製した画分のSDS-PAGEであっ
て、第6A図は〔3H〕グルコサミン標識、第6B図は
〔14C〕セリン標識である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ１２Ｎ 15/02 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ピーター エイ ステック アメリカ合衆国 テキサス州 77030 ヒ ューストン ホールカム 1800 アパート メント 208 (56)参考文献 特開 昭60−253976（ＪＰ，Ａ) Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｅｄ ｉｎｇｓ，45［３］（1986）Ｐ．470 Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ Ｐｒ ｏｃｅｅｄｉｎｓ，16［２］（1984）Ｐ. 355−360
Claims (10)
- 【請求項１】約550キロドルトンのSDS-PAGEで確認でき
る分子量を有する糖タンパク質を含むことを特徴とする
実質的に純粋な腫瘍ヒトgp580抗原に対する抗体であっ
て、該抗原が、さらに、ヒト乳癌細胞の細胞膜部分から
分離することができ、トリプシンまたはヒアルロニダー
ゼによる処理に実質的に耐性であり、プロナーゼによる
処理に対し実質的に感受性であるか、あるいはノイラミ
ニダーゼによる処理後ピーナッツアグルチニンに対する
実質的な結合を示すものである上記抗体。 - 【請求項２】抗原が糖タンパク質の各1000アミノ酸残基
に対しほぼ下記数の各表示されたアミノ酸残基を有する
hgp580抗原として確認されるものである、特許請求の範
囲第（１）項記載の抗体。 アスパラギン酸 120 トレオニン 87 セリン 166 グルタミン酸 154 プロリン 37 グリシン 78 アラニン 26 システイン 検出されず バリン 65 メチオニン 検出されず ロイシン 56 イソロイシン 38 チロシン 23 フェニルアラニン 29 ヒスチジン 11 リシン 94 アルギニン 16 グルコサミン 147 ガラクトサミン 113 - 【請求項３】抗原がヒト腫瘍指向抗体の生成に有用な実
質的に純粋な腫瘍ヒトgp580抗原であって、 A. （ａ）gp580抗原を含む腫瘍からgp580を含む可溶性タン
パク質を抽出し、 （ｂ）抽出物をゲルエクスクルージョンクロマトグラフ
ィーにかけ、 （ｃ）排除物を捕集し、 （ｄ）排除物をアニオン交換クロマトグラフィーにか
け、 （ｅ）アニオン交換樹脂に結合した画分を溶離し、 （ｆ）溶出液をゲルエクスクルージョンクロマトグラフ
ィーにかけ、 （ｇ）排除画分を捕集するか、または B. （ａ）gp580抗原を含む腫瘍からgp580を含む可溶性タン
パク質を抽出し、 （ｂ）抽出物をゲルエクスクルージョンクロマトグラフ
ィーにかけ、 （ｃ）排除物を捕集し、 （ｄ）排除物を密度勾配遠心法にかけ、 （ｅ）平衡化密度勾配を画分し、 （ｆ）gp580含有画分をゲルエクスクルージョンクロマ
トグラフィーにかけ、 （ｇ）排除画分を捕集する、 ことを含むことを特徴とする方法により製造できるもの
である、特許請求の範囲第（１）項記載の抗体。 - 【請求項４】抗体がさらに単クローン性抗体と規定され
る特許請求の範囲第（１）項〜第（３）項のいずれか１
項に記載の抗体。 - 【請求項５】単クローン性抗体がさらにHGR 1:69（ATCC
寄託HB 9041から入手可能）と規定される特許請求の範
囲第（４）項記載の抗体。 - 【請求項６】試料中の転移ヒト腫瘍細胞の存在を検出す
る試験管内検出方法であって、試料と、約550キロドル
トンのSDS-PAGEで確認できる分子量を有する糖タンパク
質を含むことを特徴とする実質的に純粋な腫瘍ヒトgp58
0抗原に対する抗体とを接触させ、抗体により結合され
た物質を検出することを含む方法であって、該抗原が、
さらに、ヒト乳癌細胞の細胞膜部分から分離することが
でき、トリプシンまたはヒアルロニダーゼによる処理に
実質的に耐性であり、プロナーゼによる処理に対し実質
的に感受性であるか、あるいはノイラミニダーゼによる
処理後ピーナッツアグルチニンに対する実質的な結合を
示すものである上記方法。 - 【請求項７】該抗原が糖タンパク質の各1000アミノ酸残
基に対しほぼ下記数の各表示されたアミノ酸残基を有す
るhgp580抗原として確認されるものである、特許請求の
範囲第（６）項記載の方法。 アスパラギン酸 120 トレオニン 87 セリン 166 グルタミン酸 154 プロリン 37 グリシン 78 アラニン 26 システイン 検出されず バリン 65 メチオニン 検出されず ロイシン 56 イソロイシン 38 チロシン 23 フェニルアラニン 29 ヒスチジン 11 リシン 94 アルギニン 16 グルコサミン 147 ガラクトサミン 113 - 【請求項８】該抗原がヒト腫瘍指向抗体の生成に有用な
実質的に純粋な腫瘍ヒトgp580抗原であって、 A. （ａ）gp580抗原を含む腫瘍からgp580を含む可溶性タン
パク質を抽出し、 （ｂ）抽出物をゲルエクスクルージョンクロマトグラフ
ィーにかけ、 （ｃ）排除物を捕集し、 （ｄ）排除物をアニオン交換クロマトグラフィーにか
け、 （ｅ）アニオン交換樹脂に結合した画分を溶離し、 （ｆ）溶出液をゲルエクスクルージョンクロマトグラフ
ィーにかけ、 （ｇ）排除画分を捕集するか、または B. （ａ）gp580抗原を含む腫瘍からgp580を含む可溶性タン
パク質を抽出し、 （ｂ）抽出物をゲルエクスクルージョンクロマトグラフ
ィーにかけ、 （ｃ）排除物を捕集し、 （ｄ）排除物を密度勾配遠心法にかけ、 （ｅ）平衡化密度勾配を画分し、 （ｆ）gp580含有画分をゲルエクスクルージョンクロマ
トグラフィーにかけ、 （ｇ）排除画分を捕集する、 ことを含むことを特徴とする方法により製造できるもの
である、特許請求の範囲第（６）項記載の方法。 - 【請求項９】該抗原がさらに単クローン性抗体と規定さ
れる、特許請求の範囲第（６）項〜第（８）項のいずれ
か１項記載の方法。 - 【請求項１０】単クローン性抗体がさらにHGR 1:69（AT
CC寄託HB 9041から入手可能）と規定される、特許請求
の範囲第（９）項記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/846,938 US5030559A (en) | 1986-04-01 | 1986-04-01 | Methods and compositions for the identification of metastatic human tumors |
| US846938 | 1986-04-01 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62253395A JPS62253395A (ja) | 1987-11-05 |
| JPH0742320B2 true JPH0742320B2 (ja) | 1995-05-10 |
Family
ID=25299361
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62080856A Expired - Lifetime JPH0742320B2 (ja) | 1986-04-01 | 1987-04-01 | 転移性ヒト腫瘍を確認する方法および組成物 |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5030559A (ja) |
| EP (1) | EP0240341B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0742320B2 (ja) |
| AT (1) | ATE105569T1 (ja) |
| AU (1) | AU599364B2 (ja) |
| CA (1) | CA1307478C (ja) |
| DE (1) | DE3789781T2 (ja) |
| DK (1) | DK162387A (ja) |
| ES (1) | ES2051737T3 (ja) |
| FI (1) | FI89806C (ja) |
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| US5648223A (en) * | 1994-08-31 | 1997-07-15 | Activated Cell Therapy, Inc. | Methods for enriching breast tumor cells |
| US5840502A (en) * | 1994-08-31 | 1998-11-24 | Activated Cell Therapy, Inc. | Methods for enriching specific cell-types by density gradient centrifugation |
| US5663051A (en) * | 1994-08-31 | 1997-09-02 | Activated Cell Therapy, Inc. | Separation apparatus and method |
| DE19530272C1 (de) * | 1995-08-17 | 1996-11-21 | Univ Eberhard Karls | Antikörper 103 B2 |
| DE19530273C1 (de) * | 1995-08-17 | 1996-12-12 | Univ Eberhard Karls | Antikörper 105A5 |
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| WO2002044418A2 (en) * | 2000-11-28 | 2002-06-06 | Wyeth | Expression analysis of fkbp nucleic acids and polypeptides useful in the diagnosis and treatment of prostate cancer |
| AU2002227004A1 (en) * | 2000-11-28 | 2002-06-11 | Wyeth | Expression analysis of SMARC nucleic acids and polypeptides useful in the diagnosis and treatment of prostate cancer |
| US7169722B2 (en) * | 2002-01-28 | 2007-01-30 | Guardian Industries Corp. | Clear glass composition with high visible transmittance |
| US7482116B2 (en) | 2002-06-07 | 2009-01-27 | Dna Genotek Inc. | Compositions and methods for obtaining nucleic acids from sputum |
| EP2059258B1 (en) * | 2006-09-08 | 2019-11-13 | Wyeth LLC | Arginine wash in protein purification using affinity chromatography |
| US20090324596A1 (en) * | 2008-06-30 | 2009-12-31 | The Trustees Of Princeton University | Methods of identifying and treating poor-prognosis cancers |
| US10745701B2 (en) | 2007-06-28 | 2020-08-18 | The Trustees Of Princeton University | Methods of identifying and treating poor-prognosis cancers |
| EP3928715A1 (en) * | 2011-06-19 | 2021-12-29 | DNA Genotek, Inc. | Devices, solutions and methods for sample collection |
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| US4140753A (en) * | 1976-04-30 | 1979-02-20 | Scripps Clinic & Research Foundation | Diagnostic method and reagent |
| US4145336A (en) * | 1976-04-30 | 1979-03-20 | Scripps Clinic And Research Foundation | Carcinoembryonic antigen isomer |
| IN150740B (ja) * | 1978-11-24 | 1982-12-04 | Hoffmann La Roche | |
| US4444744A (en) * | 1980-03-03 | 1984-04-24 | Goldenberg Milton David | Tumor localization and therapy with labeled antibodies to cell surface antigens |
| EP0160446B1 (en) * | 1984-05-01 | 1992-06-17 | Ciba Corning Diagnostics Corp. | Breast tumor-associated antigen and monoclonal antibodies specific thereto |
-
1986
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| ＴｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎＰｒｏｃｅｅｄｉｎｓ，１６［２（１９８４）Ｐ．３５５−３６０ |
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